JP2013517292A - 生物工学によって作られた組織コンストラクトならびにそれを生成および使用するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2010年5月24日に出願された米国特許仮出願第61/347,725号、2010年2月12日に出願された米国特許仮出願第61/337,938号、および2010年1月14日に出願された米国特許仮出願第61/295,073号に対し優先権の恩典を主張し、これらの各々の内容は全て、明確に参照により本明細書に組み込まれる。
XCL1は、線維芽細胞よりもMSCにより産生されるECM中でより多量に産生されるように思われる(例えば、図7を参照されたい)。
ECMの厚さはインビボでの特定の使用ために最適化させることができる。例えば、生物工学によって作られたコンストラクトの厚さが厚いほど、身体的撹拌を経験する体内の部位(例えば、膝)に対し、またはコンストラクトが長期間インビボで持続することが望まれる任意の適用に対し、有用となり得る。
間葉幹細胞(MSC;また、間葉前駆細胞としても知られている)は、培養下で拡大し、間葉組織細胞、例えば骨、軟骨、腱、靱帯、筋肉、脂肪、および骨髄基質に分化することができる細胞である。MSCは、正常な培養条件下で細胞外マトリクス構成要素を非効率的に合成、分泌、および/または組織化する(すなわち、内在性細胞外マトリクス産生)。しかしながら、さらに本明細書で記載される培養条件下では、効率的に分泌される細胞外マトリクス内にそれ自体を含むことができ、外因性マトリクス構成要素を有さない(すなわち、マトリクス構成要素は、培養された細胞により産生されないが、他の手段により導入される)。
−90%の間とすることができる。また、細胞は、低酸素条件下で培養させることができる。細胞は、給餌、播種、または他の細胞操作中に周囲室温、空気および湿度に一時的に暴露され得る。
ogy, 58:44-93 (1979)、Bottenstein et al. , Meth. Enzym, 58:94-109 (1979)を参照されたい、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。例えば、MSC由来の生物工学によって作られたコンストラクトは、細胞によるマトリクス合成および堆積を促進する作用物質が補充された培地中で培養させることができる。未決定の動物器官または組織抽出物、例えば血清、下垂体抽出物、視床下部抽出物、胎盤抽出物、または胚抽出物またはフィーダー細胞に分泌されたタンパク質および因子を含まない合成培地を使用することができる。そのような培地は、外来動物または異種間ウイルス汚染および感染の危険を減少させるために、未決定の構成要素および非ヒト動物起源に由来する生物学的構成要素を含まないものとすることができる。合成または組換え機能等価物は、そのような動物器官または組織抽出物の使用に取って代わることができる。
L、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、20030ng/mL以上である。
5ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL以上のbFGF補充は、細胞外マトリクスの厚さおよび組成を調節するために使用されることができる。
きる。GlutaMAX−1(商標)はL−アラニル−L−グルタミンの安定なジペプチド形態であり、L−グルタミンと同じ意味で使用することができ、L−グルタミンの代わりとして等モル濃度で提供される。ジペプチドは、L−グルタミンに、培地でのL−グルタミンの有効濃度における不確かさにつながる可能性がある、貯蔵中およびインキュベーション中の経時的な分解に対する安定性を提供する。典型的には、基本培地は約1mM〜約6mM、より好ましくは約2mM〜約5mM、もっとも好ましくは4mMのL−グルタミンまたはGlutaMAX−1(商標)が補充される。
レードおよび細胞適合性作用物質は、当業者によく知られている。
規定された直径を有する多孔性膜(すなわち、カルチャーインサート)上への細胞の播種は、細胞外マトリクスが産生される速度を増強させることにより、生物工学によって作られたコンストラクトの厚さを増強させることができ、というのも、これは、培地の栄養分への表面積暴露を最大にするからである。細孔は、膜の上面および底面の両方を介して連絡し、発達中の組織コンストラクトへの培地の両側接触または培地下方のみからの接触を可能にする。培地はまた、形成中の培養された組織コンストラクトの底面のみと接触することができ、そのため、培養された皮膚コンストラクトの開発の場合のように、上面は空気に暴露させることができる。典型的には、膜は、ベース、例えば蓋で覆うことができるペトリまたは培養皿内に挿入され、これと結合するチューブ部材またはフレームワークの一端に固定される。これらの型の培養容器が使用される場合、組織コンストラクトは、膜の1つの表面(例えば、最上の上方接面)上で産生され、培養物は上面および底面の両方で細胞培地と接触する。細孔サイズは、膜を通って細胞を増殖させないようにするのに十分小さいが、培養培地に含まれる栄養分の、例えば、毛管作用による生物工学によって作られたコンストラクトの底面への自由な通行を可能にするのに十分大きいものである。例えば、細孔サイズは、約7μm未満、約0.1μm〜約7μm、約0.2μm〜約6μm、または約0.4μm〜約5μmの直径とすることができる。最大細孔サイズは、細胞サイズだけでなく、細胞のその形状を変化させ、膜を通過する能力に依存する。組織様コンストラクトは、表面に付着するが、基材を組み込み、または包むことはせず、そのため、これは、最小の力による剥皮などによりそれから除去可能であることが重要である。形成された組織コンストラクトのサイズおよび形状は、容器表面またはその上で増殖される膜のサイズにより示される。基材は円形、四角、長方形、または角度のあるものとすることができ、または角丸角度を有する形状、もしくは不規則形状とすることができる。基材はまた平らであり、あるいは、創傷と接するように、または天然組織の物理的構造を模倣するように成形されたコンストラクトを生成するための型として、曲線をつけて作られ得る。増殖基材のより大きな表面積を占めるために、比例的により多くの細胞が、表面に播種され、細胞を十分浸し、栄養供与するためにより大きな体積の培地が必要とされる。生物工学に基づく組織コンストラクトが最終的に形成されると、膜基材からの剥皮により除去される。基材は、表面エネルギーを上昇させることにより基材の接着特性を改善するために、細胞播種前に前処理することができる。前処理としては、COOHおよび長いNH2処理が挙げられるが、これらに限定されない。
ポリ(エーテルスルホン)(PES)、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニリデン、ポリジメチルシロキサン、フルオロポリマ、およびフッ素化エチレンプロピレン;ケイ素基材、例えば石英ガラス、ポリシリコン、またはケイ素結晶は細胞増殖表面として使用することができる。細胞増殖表面材料は、化学的に処理し、修飾させることができ、静電的に帯電させることができ、または生物製剤、例えばポリ−l−リシンまたはペプチドでコートさせることができる。静電的に帯電された表面が得られる化学処理の一例は、COOHおよび長いNH2である。ペプチドコーティングの一例は、RGDペプチドである。
細胞増殖表面は、マトリクス産生細胞の付着を支援する合成またはヒト形態の細胞外マトリクスにより処理することができ、そのため、細胞は、付着、配向、および生物学的合図のための細胞増殖表面を持った自然の接触面を有する。合成またはヒト形態の細胞外マトリクスが、この態様で使用される場合、一時的であり、というのも、培養の時間に伴い、細胞により置換されるからである。合成またはヒト形態の細胞外マトリクスは、細胞増殖表面上に堆積されると、表面全体に分散されたマトリクス分子〜分子厚さ、またはnm〜μmの厚さの連続薄膜の範囲となる。
。絹フィブロインの溶液は、水混和性有機溶媒、例えば、エチルアルコール、メチルアルコール、イソプロピルアルコール、プロパノール、ブタノールからなる群より選択されるアルコール;またはジメチルスルホキシド(DMSO)またはアセトンと混合される。絹フィブロイン溶液はその後、鋳造され、またはモールドに注ぎ入れられ、あるいは直接、膜および多孔性絹フィブロイン足場の平面上方及び下方の両方の培養培地の両側接触を提供する多孔性/透過性培養膜を組み込むカルチャーインサートとされる。溶液は、その後、ある期間凍結され、その後、解凍され、すすがれ、溶媒残留物が除去される。多孔性絹フィブロイン足場はその後、オートクレーブ処理され、γ線照射され、またはe−ビーム滅菌され、滅菌多孔性絹フィブロイン足場が生成される。滅菌後、多孔絹フィブロイン足場は、本明細書で採用される方法を使用して培養された細胞のための培養基材として使用することができる。多孔性絹フィブロイン足場上で細胞を培養した後、細胞はまた、本明細書で採用される方法を使用して失活させることができる。他の特徴を多孔性絹フィブロイン足場コンストラクト、例えばシリコーン層に追加することができる。
超集密度(すなわち、100%集密度を超える)での播種は、細胞増殖相を迂回することにより細胞外マトリクス形成速度を増加させる。よって、細胞は100%コンフルエンスから約900%コンフルエンスまで、例えば約300%〜約600%コンフルエンスの範囲の超コンフルエンスで直接播種することができ、すぐに細胞外マトリクスが産生される。超集密度はまた、細胞播種密度/培養表面積により達成することができ、例えば、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x
105、9x105、1x106以上の細胞/cm2とすることができる。例えば、44cm2の概算培養表面積を有する75mm直径インサートを使用することができる。超コンフ
ルエントな数の細胞(例えば、3x106細胞)をそのようなインサート上で播種すると
、約6.8x105細胞/cm2の初期播種密度が得られる。およそ7.5x106細胞を
、10cmx10cm長方形インサート上に播種し、約7.5x105細胞/cm2の初期播種密度を生成させることができる。
生物工学によって作られたコンストラクトの厚さは、これを培養基材から放出させると増強させることができ、よって拘束なしで収縮させることができる。そのような「制御された収縮」または「無拘束収縮」は、実時間でモニタすることができ、所望の量の収縮および厚さが起きた時に停止させることができる。生物工学によって作られたコンストラクト中の生細胞は、内在性細胞外マトリクスへ生物工学によって作られたコンストラクトの培養基材への接着により軽減される収縮力を及ぼす。無拘束収縮工程では、細胞により付
与されるこれらの収縮力が、活用され、培養後に無拘束収縮を受けていない、同様に調製されたコンストラクトに比べ、コンストラクトの物理的強度および厚さが増加する。制御された収縮は、生物工学によって作られたコンストラクトを培養基材から放出させることにより、例えば物理的手段、例えば基材からの剥皮またはリフティング、基材からの振盪、または基材の屈曲により誘導することができる。生物工学によって作られたコンストラクトの放出はまた、とりわけ、熱応答性基材が使用される場合、培養温度を変化させることにより、または化学的手段を使用することにより達成することができる。
MSC由来の生物工学によって作られたコンストラクトはさらに、細胞外マトリクスを合成し、分泌し、組織化し、細胞外マトリクスの厚さを増強させることができる追加の細胞型を含むことができる。そのような細胞型は、線維芽細胞、ストローマ細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞および間葉起源の他の結合組織細胞とすることができる。線維芽細胞は、多くの起源、例えば限定されないが、新生児雄包皮、真皮、腱、肺、臍帯、軟骨、尿道、角膜実質、口腔粘膜、および腸に由来することができる。2つ以上の起源に由来する正常な細胞のキメラ混合物、例えば自己および同種細胞のキメラ混合物;正常および遺伝子組換えまたはトランスフェクトされた細胞の混合物;異なる組織または器官型に由来する細胞の混合物;または2つ以上の種または組織起源の細胞の混合物は使用することができる。
る。
よびa<1である。例えば、要求される細胞播種密度はZであり、Z=2.1x105細
胞/cm2(およそ)であり、aXおよびbYはそれぞれ、Zにより表される播種される
領域の1平方センチメートルあたりの細胞の総数における線維芽細胞および間葉前駆細胞の数を表す。よって、線維芽細胞およびMSCがそれぞれ、播種される総細胞の50%を占める場合、式は下記として表される:aX+bY=Z細胞/cm2、式中(0.5)(
2.1x105細胞)+(0.5)(2.1x105細胞)=2.1x105総細胞/cm2。この式を解くと、少なくとも2つの細胞型の両方の初期播種密度が決定される:1.05x105線維芽細胞+1.05x105間葉前駆細胞=2.1x105総細胞/cm2。この播種式が採用される場合、下記を使用することができる:a=0およびb=1;a=0.1およびb=0.9;a=0.2およびb=0.8;a=0.3およびb=0.7;a=0.5およびb=0.5;a=0.8およびb=0.2。
が播種時に要求される場合、式は下記として表される:aX+bY=Z、式中(1)(2.1x105細胞)+(0.5)(2.1x105細胞)=Z総細胞/cm2。この式を解
くと、少なくとも2つの細胞型の両方の初期播種密度が決定される:2.1x105線維
芽細胞+1.05x105間葉前駆細胞=3.15x105総細胞/cm2。この播種式が
採用される場合、下記を使用することができる:a=1およびb=2;a=1およびb=1;a=1およびb=0.9;a=1およびb=0.8;a=1およびb=0.7;a=1およびb=0.5;a=1およびb=0.2。
あるコンストラクトは構造が多孔性であってもよい。多孔度は、画像の総表面積に対する組織像中の細孔に起因する表面積によって測定され得る。あるコンストラクトは、少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%以上の多孔度を有することができる。
00℃〜0℃の範囲とすることができ、平均細孔サイズは、凍結温度を温かくするにつれ、5未満から10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100ミクロン(μm)以上のサイズとなる。1つの実施形態では、5、10、15、20、25、または30μm未満のサイズまたはその間の任意の範囲の平均細孔サイズが、−40℃の凍結温度で生成され得る。別の実施形態では、少なくとも30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100μm以上のサイズまたはその間の任意の範囲の平均細孔サイズが−10℃の凍結温度で生成され得る。その凍結温度への到達に向けての速度を減少させると、細孔サイズの均一性を増加させることができる。よって、10、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.3、0.1℃以下/分またはその間の任意の範囲だけ凍結までの速度を減少させると、コンストラクト中の細孔の均一性が増加する。
本発明の生物工学によって作られたコンストラクトの細胞外マトリクスは、創傷を治療し、治癒させるのに有用な構成要素を含む。
本発明の生物工学によって作られたコンストラクトは、被験体を治療する際のそれらの最終用途によって、失活させ、細胞を除去せずに終結させることができ、および/または脱細胞させ、細胞を除去することができる。失活または脱細胞は、カルチャーインサートの膜上で、または生物工学によって作られたコンストラクトがカルチャーインサートから除去された後に起こり得る。
脱細胞により、生物工学によって作られたコンストラクトの内在性細胞外マトリクス構成要素を生成させる細胞外マトリクス産生細胞が完成コンストラクトから除去される。脱細胞のための1つの方法は、一連の化学処理内での浸漬または静かなかき混ぜを使用し、細胞、細胞残遺物、および残留細胞DNAおよびRNAを除去する。他の非コラーゲンおよび非エラスチン細胞外マトリクス構成要素、例えば、ECM中に存在する糖タンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、脂質、および他の非コラーゲンタンパク質はまた、脱細胞するために使用される薬剤および方法を用いて除去または減少させることができる。例えば、生物工学によって作られたコンストラクトは、好ましくは細胞−マトリクスの膨潤を制御可能に制限するように生理学的にアルカリの有効量のキレート化剤と接触させることにより最初に処理することができる。キレート化剤は、二価カチオン濃度を減少させることにより、細胞、細胞片および基底膜構造のマトリクスからの除去を増強する。アルカリ処理は、糖タンパク質およびグリコサミノグリカンをコラーゲン組織から解離させ、脂質をけん化することができる。使用することができる当技術分野で知られているキレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)およびエチレンビス(オキシエチレニトリロ)四酢酸(EGTAが挙げられるが、これらに限定されない。EDTAは、水酸化ナトリウム(NaOH)、水酸化カルシウムCa(OH)2、炭酸ナトリ
ウムまたは過酸化ナトリウムを添加することにより、よりアルカリ性とすることができる。EDTAまたはEGTA濃度は、約1〜約200mM、約50〜約150mM、または約100mMとすることができる。NaOH濃度は約0.001〜約1M、約0.001〜約0.10M、または約0.01M(例えば、水中100mMEDTA/10mMNaOH)とすることができる。キレート溶液のpHを有効塩基性pH範囲内とする他のアル
カリまたは塩基性剤は、当業者によって決定することができる。塩基性キレート溶液の最終pHは、約8〜約12または約11.1〜約11.8とすべきである。
硫酸(H2SO4)が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、塩酸(HCl)は、約0.5〜約2M、約0.75〜約1.25M、または約1Mの濃度で使用することができる。酸/塩溶液の最終pHは、約0〜約1、約0〜0.75、または約0.1〜約0.5であるべきである。塩酸および他の強酸が、核酸分子を分解するには最も効果的であり、より弱い酸は、より効果的ではない。使用することができる塩は、好ましくは無機塩であり、例えば、塩化物塩、例として、塩化ナトリウム(NaCl)、塩化カルシウム(CaCl2)、および塩化カリウム(KCl)が挙げられるが、これらに限定されない。例
えば、塩化物塩は、約0.1〜約2M、約0.75〜約1.25M、および約1M(例えば、水中2M HCl/1M NaCl)の濃度で使用することができる。
、および塩化カリウム(KCl);および窒素塩、例えば硫酸アンモニウム(NH3SO4)が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、塩化物塩は、約0.1〜約2M、約0.75〜約1.25M、または約1Mの濃度で使用することができる。緩衝化剤は当技術分野で知られており、例えば、リン酸塩およびホウ酸塩溶液が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、リン酸緩衝食塩水(PBS)を使用することができ、この場合、リン酸塩は、約0.001〜約0.02Mの濃度および約0.07〜約0.3Mの塩濃度対塩溶液(例えば、1M塩化ナトリウム(NaCl)/10mMリン酸緩衝食塩水(PBS))である。pHは、約5〜約9、約7〜約8、または約7.4〜約7.6であるべきである。化学洗浄処理後、生物工学によって作られたコンストラクトはその後、化学洗浄剤なしで、有効量のリンス剤と接触させることによりすすぐことができる。薬剤、例えば水、等張食塩水溶液(例えば、PBS)および生理的pH緩衝溶液を、生物工学によって作られたコンストラクトと、洗浄剤を除去するのに十分な時間接触させることができる。生物工学によって作られたコンストラクトをアルカリキレート化剤と接触させるおよび生物工学によって作られたコンストラクトを塩を含む酸溶液と接触させる洗浄工程は、どちらの順でも実施することができ、実質的に同じ洗浄効果が達成される。
ECMは架橋剤を使用して架橋させることができ、生体中に移植またはグラフトさせた場合に、生体再構築速度が制御され、その持続性が増加する。これは、架橋させることができ、単層コンストラクトとして使用することができ、または異なる型のコンストラクトを作成するように組み合わされ、操作することができる。架橋は、生物工学によって作られたシートを、またはその一部を共に結合することができる。
る起源またはプロファイルの2つ以上の生物工学によって作られたシートから構成されることを意味する。例えば、生物工学によって作られたコンストラクトは任意の数の層、例えば2〜20の層または2〜10の層を含むことができ、層の数は、コンストラクトの最終使用目的に必要とされる強度および嵩に依存する。また、重ね合わせ配列の最終的なサイズは、マトリクスシートのサイズにより制限され得るので、層は、コラージュ配列でずらして配置することができ、いずれの個々のマトリクスシートの寸法よりも大きな表面積を有するが、配列領域を横切る連続層を有しないシートコンストラクトが形成される。
えばポリウレタン、酢酸ビニルまたはポリエポキシを用いて一緒に結合させることができる。1つの生体適合性接着剤は絹フィブロインであり、これは、メチルアルコールを用いて活性化される組織マトリクスの隣接する層間結合領域に配置される4−8%絹フィブロイン溶液である。生体適合性のりまたは接着剤使用して、架橋された、または架橋されていない層、あるいは両方を一緒に結合させることができる。
きる。最も好ましい方法では、EDCは水中、約0.1mM〜約100mM、約1.0mM〜約10mM、または約1.0mMの濃度で可溶化される。水に加えて、リン酸緩衝食塩水または(2−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸)(MES)緩衝液が、EDCを溶解するために使用することができる。他の薬剤、例えばアセトンまたはアルコールを水中99%v/v、典型的には50%まで、溶液に添加することができ、架橋がより均一で効率的に起こる。これらの薬剤は、水を層から除去し、マトリクス繊維を一緒にし、それらの繊維間の架橋を促進する。架橋剤中の水に対するこれらの薬剤の比は、架橋を調節するために使用することができる。EDC架橋溶液は、EDCとしての使用の直前に調製され、というのも、時間と共にその活性を喪失するからである。架橋剤をマトリクス層に接触させるために、水和され、結合されたマトリクス層は容器、例えば浅皿に移され、架橋剤がしずかに皿にデカントされ、マトリクス層が被覆され自由に動き、気泡がマトリクス層下、または間に存在しないことが確保される。容器は被覆され、マトリクス層は、約4〜約24時間、または8〜約16時間、約4℃〜約20℃の温度で架橋される。架橋は、温度によって調節することができ、そのため、より低い温度では、反応が減速されるので、架橋はより効果的となる。対照的に、より高い温度では、EDCがより不安定となるので、架橋はより効果的でなくなる。
架橋のレベルは、典型的にはコラーゲン繊維の縮み温度、機械的荷重または酵素消化(例えば、コラゲナーゼ、トリプシン、など)に対する感受性により測定される。コラーゲンの乾燥および熱処理の効果はまた、脱水が起きた時の繊維中のコラーゲン分子の軸方向充填の変化を観察するX線回折を用いて観察することができる。層状のおよび/または架橋された生物工学によって作られたコンストラクトは、よく知られた技術(例えば、Parenteauへの米国特許第5,712,163号、PCT公開番号第WO95/31473号、PCT公開番号第WO00/29553号、およびPCT公開番号第WO2009/070720号を参照されたい)に基づき、多くの形状因子例えば管状コンストラクトに成形することができる。
他の材料をECMに追加してもよく、インビボで投与された場合、生理活性または機能がさらに増強される。
再構築可能層を含む。これらのポリマおよびポリマ型のより詳細な記述は、Brannon-Peppas, Lisa, "Polymers in Controlled Drug Delivery," Medical Plastics and Biomaterials, November 1997において説明され、これは本明細書で完全に説明されるかのように、参照により組み込まれる。
yr−Ile−Gly−Ser−Arg)ペプチドおよび環状ペプチド、グリコサミノグリカン(GAG)、ヒアルロン酸(HA)、コンドロイチン−6−硫酸、インテグリンリガンド、セレクチン、カドヘリンおよび免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、神経細胞接着分子(NCAM)、細胞間接着分子(ICAM)、血管細胞接着分子(VCAM−1)、血小板−内皮細胞接着分子(PECAM−1)、L1、およびCHL1が挙げられる。
ECMタンパク質およびペプチドならびに細胞機能における役割
タンパク質 配列 SEQ.ID No: 役割
フィブロネクチン RGDS 接着
LDV 接着
REDV 接着
ビトロネクチン RGDV 接着
ラミニン A LRGDN 接着
IKVAV 神経突起伸展
ラミニン B1 YIGSR 細胞の接着、
67kDラミニン受容体を介する
PDSGR 接着
ラミニン B2 RNIAEIIKDA 神経突起伸展
コラーゲン 1 RGDT ほとんどの細胞の接着
DGEA 血小板および他の細胞の接着
トロンボスポンジン RGD ほとんどの細胞の接着
VTXG 血小板の接着
細胞外マトリクスタンパク質由来のプロテオグリカン結合に特異的なアミノ酸 配列
配列 SEQ.ID.NO. タンパク質
XBBXBX* コンセンサス配列
PRRARV フィブロネクチン
YEKPGSPPREVVPRPRPGV フィブロネクチン
RPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGR ビトロネクチン
rIQNLLKITNLRIKFVK ラミニン
ゼ。
たは所望のインビボの結果を達成するために合成培地に導入してもよい。合成培地は下記を含む:
から突出するナノ構造の組み入れ;(b)生物工学によって作られた表面上に結合され、被覆されまたは直接適用された、追加された生体適合性および生分解性接着材料、例えばフィルム、ゲル、ヒドロゲル、液体、またはのり;あるいは、(c)生物工学によって作られた表面上にオーバーレイされ、またはスピニングされたエレクトロスピニングされた粘着性繊維マトリクス。
治癒の必要のある器官の表面に直接接着することのみを意味する。しかしながら、基底および頂端表面両方が、接着増強手段を含むことができ、これは、組成物の対象とする治療的使用(例えば、意図的に内部組織または器官を互いにぴったりと近接させて保持するため、または、患者の組織を外因性の移植可能な治療装置またはセンサの表面にぴったりと接着させるため)によって、各表面上で同じかまたは異なる手段である。
リの足蹠上で見られるナノスケール剛毛およびスパチュラ組織分布を模倣する形状で形成させることができる。突起は、生物工学によって作られたコンストラクト基底または頂端表面の主突起から延在する第2、第3または追加の組の突起を含むことができる。突起は、生物工学によって作られたコンストラクトの固有の特徴であり、表面上でその形状およびサイズを均一にすることができ、または使用目的および要求される接着性レベルによって、形状およびサイズの組み合わせで配列させることができる。突起は、表面上で様々なパターンおよび様々な密度で配列させることができる。突起密度、または単位面積あたりの突起の数は、およそ10突起/cm2〜およそ1x1010突起/cm2の範囲である。突起は、テープまたはパッチの対象とする適用によって、あるパターンで配列させることができ、または規則的に、不規則に、もしくはランダムに配列させることができる。いくつかの実施形態では突起は、およそ1,000μm未満の平均高さを有する。突起は、およそ0.2μm〜およそ150μmの平均高さを有することができる。突起はおよそ0.05μm〜およそ150μmの平均先端幅を有することができる。突起は、およそ0.05μm〜およそ150μmの平均基底幅を有することができる。突起は、およそ0.2μm〜およそ500μmの平均中心間ピッチを有することができる。突起は、およそ0.1:1〜およそ500:1の平均高さ対基底幅比を有することができる。突起はおよそ1000:1〜およそ0.1:1の平均基底幅対先端幅比を有することができる。いくつかの実施形態では、自己組織化された突起は、外科医によって適用されると、患者の組織を貫通することができる。
生物工学によって作られたコンストラクトはまた、創傷ケアの必要のある被験体にグラフトする前にメッシュ状にすることができる。創傷治癒で使用される場合、メッシュ化は創傷床への適合性を改善し、グラフトの真下から創傷滲出液を排出するための手段を提供する。「メッシュ化」という用語は、機械的方法として規定され、これにより組織は、スリットが開けられ、ネット様配列が形成される。メッシュ化コンストラクトは、皮膚を伸展させることにより拡張させることができ、よって、スリットが開口し、その後、創傷床に適用される。拡張されたメッシュ化コンストラクトは、創傷領域に、最大被覆を提供する。また、メッシュ化コンストラクトは、拡張なしで、単に拡張されていないスリットの配列を有するシートとして提供することができる。メッシュ化コンストラクトは単独で、または身体の別の領域に由来する被験体自体の皮膚と共に適用することができる。コンストラクトはまた、穿孔または開窓および他の手段により提供される細孔を有することができる。開窓は、レーザ、パンチ、小刀、針またはピンを用いて手作業で適用することができる。生物工学によって作られたコンストラクトにはまた、コンストラクトの両方の面間で連絡する穴を設けることができる。穴は、規則または不規則パターンで導入された穿孔である。小刀または針を用いて、手作業で組織をスコア化または穿孔することができる。
コンストラクトは、当技術分野で知られている手段を用いて最後に滅菌することができる。滅菌のための好ましい方法は、米国特許第5,460,962号(その開示は本明細書に組み込まれる)による、コンストラクトを滅菌0.1%過酢酸(PA)処理に接触させ、十分な量の10N水酸化ナトリウム(NaOH)で中和させるものである。除染は振盪機プラットフォーム上の容器、例えば1L Nalge容器中、16−20時間の間(例えば、18時間)実施される。コンストラクトはその後、3体積の滅菌水に、各すすぎにつき10分間接触させることによりすすぐことができる。コンストラクトはγ線照射により滅菌することができる。コンストラクトは、γ線照射に好適な材料製の容器中にパッケージさせ、真空シーラーを用いて密閉することができ、これを15.0〜40.0kGyの間のγ線照射のために気密バッグに入れた。γ線照射は著しく、しかし、有害ではなく、コンストラクト分解への感受性、ヤング率および縮み温度を減少させる。γ線照射後の機械的特性は、依然として適用範囲での使用には十分であり、γ線は移植可能な医療装置の分野で広く使用されるので、滅菌に好ましい手段である。
生物工学によって作られたコンストラクトは、細胞を有するかまたは有さないが、被験体に、例えば、損傷または罹患器官または組織を治療するために、器官または組織を修復するために、および/またはその対象とする機能性を回復させるために送達させることができる。本発明の生物工学によって作られたコンストラクトは、被験体内に治療的有効量で移植された場合、部位に応じた組織修復および再生を誘導する特性を有する。治療的有効量のコンストラクトは、被験体に1つ以上の投与または適用で提供することができる。間葉前駆細胞の分化能力のために、これらの多分化能細胞集団の含有は、骨、軟骨、腱、靱帯、筋肉、および皮膚の治癒速度および品質を改善するであろう)。生物工学によって作られたコンストラクトは、その移植部位に対し適切であるように治療される組織または器官に隣接して、または接触して移植された場合、血管新生性、抗炎症性、骨形成、脂肪生成または線維形成性、またはそれらの組み合わせとなる。
);心筋虚血;脳卒中;末梢動脈疾患;ニューロパチー;冠動脈疾患);神経修復用途;肝臓再生用途(線維症;急性、亜急性および慢性肝炎;肝硬変;劇症肝不全;葉移植後の外表面のカバーリング);急性腎不全中の腎臓再生用途;手術創傷閉鎖;腹部手術癒着防止;心血管、唾液管、または胆管ステントカバーリングが挙げられるが、これらに限定されない。
実施例1:間葉幹細胞(MSC)により生成される、生物工学によって作られたコンストラクト
間葉幹細胞により合成され、構築される細胞外マトリクスの層を生成するための条件下で増殖される間葉幹細胞を含む、生物工学によって作られたコンストラクトの作成は、ヒト臍帯血管周囲細胞(HUCPVC)を使用して例示される。具体的には、当業者はこれまでMSCに細胞外マトリクス構成要素を任意の相当の厚さまで合成し、構築させるための予備条件を規定することができなかった。HUCPVCを播種する前に、培養インサートを約5μg/cm2のヒト血漿由来フィブロネクチンでコートした。生物工学によって
作られたコンストラクトは、最初に3x106HUCPVC/24mmインサートを播種
することにより生成させた。インサート内に多孔性膜を有するカルチャーインサート上に細胞を播種した後、細胞を培養下18日間、下記合成培地において第5、8、12、および15日に新たな培地と交換しながら維持した:
GF−α濃度の関数としての、増加した生物工学によって作られたコンストラクトの厚さの間の相関を示す。図3は、3x106 HUCPVC/24mmインサートを18日間
培養した後、培地中の増加させたプロスタグランジン2濃度の関数としての減少した、生物工学によって作られたコンストラクトの厚さの間の相関を示す。したがって、間葉幹細胞により合成され、構築された細胞外マトリクスの量は、培地構成要素を基本に調節することができ、特に、得られた生物工学によって作られたコンストラクトの相当の厚さが達成され得る。加えて、培地補充は、増加させた播種密度(例えば、3x106〜10x1
06細胞以上/24mmインサートを含む超コンフルエントな密度)と協同することがで
き、MSC由来の生物工学によって作られたコンストラクト、例えばHUCPVCに由来するもの、骨髄由来のMSC、および前脂肪細胞において、さらに厚い細胞外マトリクスが生成される(図4)。特定の実施形態では、超コンフルエントな細胞播種が、30x106細胞/75mmインサートを用いて実施されたが、これは、9.6x106細胞/24mmインサートに等しい。
著しい厚さを有する生物工学によって作られたコンストラクトを生成させるための、間葉幹細胞による相当の量の、合成され、構築された細胞外マトリクスの生成に加えて、そのような生物工学によって作られたコンストラクトは、それらを他の細胞型により形成された細胞外マトリクスから識別する追加の生物物理特性を有する。
たMSC由来の生物工学によって作られたコンストラクトは、同様に培養されたHDF由来の生物工学によって作られたコンストラクト(20ng/mL TGFαを使用することを除く)とは、コラーゲン配列および全体のマトリクス形態において著しい差異を示した。特に、細胞外マトリクスは細孔を含み、より密度が低く、コラーゲン束の凝集物を含む(図5A−5B)。よって、MSC由来の生物工学によって作られたコンストラクトは、組織切片の総面積に対する組織切片中の細孔により表されるパーセンテージ面積として表すことができる多孔度を有する。そのような多孔性細胞外マトリクスは多くの創傷治癒徴候に対し望ましい。というのも、創傷中にグラフトされると、宿主細胞および血管新生関連分子のより大きな移動および浸潤が可能になるからである。しかしながら、そのような多孔性細胞外マトリクスはまた、医師が生物工学によって作られたコンストラクトを最小の困難性で適用することができるように機械的完全性を維持しなければならない。したがって、いくつかの機械的特性を評価するために、MSC由来およびHDF由来の生物工学によって作られたコンストラクトの機械的検査が実施された。具体的には、Fmax(Max負荷/Max力としても知られており、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10N)は、破れるまで材料に適用することができる最大負荷である。最終的な引張強度(UTSとしても知られている、例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50N/cm2)は、破裂前に試料により維持される最大圧力負荷であ
る。弾性率(伸長としても知られる、例えば、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9変位/初期長)は、材料は負荷が除去されると最初の状態に戻る線形領域内の材料の剛性の測定値である。図6A−6Cは、MSC由来の生物工学によって作られたコンストラクトは、より多くの多孔性細胞外マトリクスを有するにも関わらず、HDF由来の生物工学によって作られたコンストラクトと同様の機械的完全性を有し、HUCPVC由来の生物工学によって作られたコンストラクトは、最も類似する機械的完全性および厚さプロファイルを有することを示す。
パク質に基づくアッセイを、製造者プロトコルに従い、(実施例1で規定された方法および培地に従い)超集密度で播種し、18日間培養させたMSC由来の生物工学によって作られたコンストラクトまたは(培地に20ng/mL 長TGFαを補充したことを除き、実施例1で規定された方法および培地に従い)超集密度で播種し、18日間培養させたヒト皮膚線維芽細胞(HDF)由来の生物工学によって作られたコンストラクトを使用して実施した。図8A−8Cは、MSC由来およびHDF由来の生物工学によって作られたコンストラクトにより生成された、条件培地内でのIL−6、IL−8、およびVEGFレベルの経時比較を示す。MSC由来の生物工学によって作られたコンストラクトにおけるIL−6発現は、培養時間経過中早期にピークとなり、HUCPVC由来の生物工学によって作られたコンストラクトの培養の第5日にHDF由来の生物工学によって作られたコンストラクトのものの、9倍超となった(図8A)。免疫応答におけるその役割の他に、IL−6はまた、骨芽細胞により分泌され、破骨細胞形成が促進される。IL−8発現はまた、HDF由来の生物工学によって作られたコンストラクトに対し、培養の長さ全体にわたり、MSC由来の生物工学によって作られたコンストラクトにおいて著しく過発現された(図8B)。免疫応答におけるその役割の他に、IL−8はまた、CXCR1およびCXCRのような受容体への結合を介して強力な血管新生因子として上皮細胞により分泌される。同様に、VEGFは別の強力な血管新生因子であり、培養の初期相中に、HDF由来の生物工学によって作られたコンストラクトに対し、MSC由来の生物工学によって作られたコンストラクトにおいて著しく過発現される(図8C)。培地中の検出可能なVEGFレベルの降下は、HUCPVCおよび他のMSCによる高レベルのKDR発現によるものであり、これは、VEGFに対する受容体であり、生物工学によって作られたコンストラクト内にその分子を隔離し、そのため、培地中での検出を防止すると考えられる。加えて、CSF−3およびビトロネクチンは、HDF由来の生物工学によって作られたコンストラクトに対し、HUCPVC由来の生物工学によって作られたコンストラクトにおいて上方制御される。ELISAアッセイをさらに、HDF由来およびMSC由来の生物工学によって作られたコンストラクトを培養する条件培地試料に対し、実施例1の方法に従い(すなわち、両方の条件に対し10xTGF−α)実施し、5および18日後のヒアルロナン(HA)生成量を定量した。図8Dは、HDF由来の生物工学によって作られたコンストラクトの培地中のHAレベルは、第5日に4,664ng/mLから、第18日に4,085ng/mLまで減少し、HUCPVC由来の生物工学によって作られたコンストラクトの培地中のHAレベルは、第5日に4,333ng/mLから第18日に5,615ng/mLまで増加したことを示す。加えて、MSC由来の生物工学によって作られたコンストラクトは、HDF由来の生物工学によって作られたコンストラクトに対し、38倍多くのビトロネクチン、21倍多くのCSF−3、15倍多くのNCAM1、および4倍多くのCXCL1を示した。
MSCにより生成された生物工学によって作られたコンストラクトから、ならびに天然の生物工学によって作られたコンストラクトの環境内のMSCから単離された細胞の多分化能特性を決定するためにアッセイを実施した。MSC由来の生物工学によって作られたコンストラクトを実施例1で規定された方法および培地に従い、超集密度で播種し、18日間培養させた。第18日に、生物工学によって作られたコンストラクトを、コラゲナーゼで消化させ、多分化能アッセイのために細胞収率および細胞消化を決定するか、あるい
は誘導培地で直接培養させた。細胞および生物工学によって作られたコンストラクトの非誘導MSC対照群を、誘導細胞および生物工学によって作られたコンストラクト群の各々に対し維持し、この場合、10%ウシ胎児血清(FBS)が補充されたαMEM培地が誘導培地の代わりに使用された。培地交換は2〜3日毎に起こった。加えて、細胞および生物工学によって作られたコンストラクトのHDF由来対照群は、誘導細胞および生物工学によって作られたコンストラクト群のそれぞれに対し、維持させた。
12−ウェルプレートにおいて骨形成誘導のために播種した。実施例1で示される限定培地を、培養18日に、下記骨形成誘導培地と置換した:10-3Mデキサメタゾン(DEX)、1M β−グリセロリン酸(BGP)、および50mg/mLアスコルビン酸(AA)が補充された完全DMEM基本培地。骨形成誘導培養が数日間行われ、その後、Runx2(骨芽細胞分化の後期で発現される転写因子)、ALP、およびオステオカルシン(OC)の遺伝子発現を、生物工学によって作られたコンストラクトまたは培養された細胞から単離したRNAを用いて分析した。誘導されていないMSC由来の生物工学によって作られたコンストラクトに対し、誘導されたMSC由来の生物工学によって作られたコンストラクトで、ALPの発現の8倍増加が観察された(図10A)。加えて、骨形成誘導培地において誘導された、単離されたMSC由来の生物工学によって作られたコンストラクト細胞において、骨形成誘導培地で誘導されていないそのような細胞に対し、Runx2の発現の11倍増加が観察された(図10B)。このように、無傷の生物工学によって作られたコンストラクト内のまたはそのようなコンストラクトから単離されたMSCは、環境シグナリングキューに基づく骨形成系統に向かって誘導させることができる。
で、12−ウェルプレートにおいて脂肪生成誘導のために播種した。実施例1で示される限定培地を、培養18日に、下記脂肪生成誘導培地と置換した:10-3Mデキサメタゾン(DEX)、10mg/mLインスリン、および0.5mM 3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX)が補充された完全DMEM基本培地。骨形成誘導培養は数日間行われ、その後、標準オイルレッド−O染色を用いて生物工学によって作られたコンストラクトまたは培養された細胞に由来する中性トリグリセリドおよび脂質を分析した。脂肪生成誘導培地で誘導された、単離されたMSC由来の生物工学によって作られたコンストラクト細胞のみが、脂肪生成誘導培地で誘導されなかったそのような細胞に対し、著しく多くのポジティブ染色された細胞を有することが観察された(図10C)。このように、無傷の生物工学によって作られたコンストラクト内のまたはそのようなコンストラクトから単離されたMSCは、環境シグナリングキューに基づく脂肪生成系統に向かって誘導させることができる。
この研究の目的は実施例1の方法により生成させた生物工学によって作られたコンストラクトをヌードマウスにグラフトさせ、皮下に移植された場合のインビボでのそれらの応答を分析することであった。より特定的には、α−平滑筋アクチン(αSMA)染色を使用し、定性的および定量的にマウス体内のコンストラクト内での血管新生を分析した。ユニットを、8週齢の雌スイスヌードマウスにおける皮下移植モデルにグラフトさせた。
される各群から5匹の動物を屠殺した:
生物工学によって作られたコンストラクトを、5μm細孔を含む血漿処理された(CO
OH)PES膜を有する75mm膜インサート上にヒト新生児包皮線維芽細胞を播種することにより生成させた。初期細胞播種密度は3000万細胞/膜インサートとした。細胞を合成培地(未決定の非ヒト構成要素を含まない)中に懸濁させ、20mlの懸濁液をインサート上に直接播種し、培養リザーバ中110mlの培地とし、細胞の両側栄養補給を可能とした。培地は下記を含んだ:DMEM、2mML−グルタミンのベース3:1混合物(Invitrogen Inc.)、4mM GlutaMAX(Gibco BRL、grand Island、NY)および下記添加物:5ng/mlヒト組換え上皮増殖因子(Upstate Biotechnology、Lake Placid、NY)、1x10-4Mエタノールアミン(Fluka、Ronkonkoma、NY cat.#02400 ACSグレード)、1x10-4M o−ホスホリル−エタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/mlトランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pMトリヨードチロニン(Sigma、St.Louis、MO)、および6.78ng/mlセレン(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company、Milwaukee、WI)、50ng/ml L−アスコルビン酸(WAKO Chemicals USA、Inc.)、0.2ug/ml L−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.1ug/mlグリシン(Sigma、St.Louis、MO)、20ng/ml TGF−α(すなわち、1xTGF−α)および10nM PGE2。細胞をこのように、18日間培養
させ、その後、生物工学によって作られたコンストラクトを収集した。いくつかの実施形態では、2xTGF−α以上が好ましい。いくつかの生物工学によって作られたコンストラクトを、すぐに組織学分析のためにホルマリン固定し、自然収縮を防止し(図12)、一方、残りの生物工学によって作られたコンストラクトは、下記でさらに記載されるように、制御収縮させた。
EDC、5mM EDC、または10mM EDCに浸漬させることができる。EDC架橋後、コンストラクトを逆浸透圧脱イオン(RODI)水で3回すすぎ、排出し、平たくおいた。RODI水ですすいだ後、生物工学によって作られたコンストラクトを室温(約20℃)から0.5℃/分の速度で2時間、−40℃の最終凍結温度に到達するまで、冷却させた。生物工学によって作られたコンストラクトが−40℃の温度に到達した後、生物工学によって作られたコンストラクトを−40℃で少なくとも2時間アニールさせた。生物工学によって作られたコンストラクトを全てその後、凍結乾燥装置内の200mTorrより低い真空環境に供し、24時間0℃で処理した。凍結サイクルは、適切に可能にされた凍結乾燥装置内で、または任意のフリーザー、例えば制御速度フリーザー内で、実施することができることが認識されるべきである。生物工学によって作られたコンストラクトは、本発明の範囲から逸脱することなく、0mTorr〜350mTorrの真空環境に供することができることがさらに認識されるべきである。別の実施形態では、コン
ストラクトを、凍結乾燥(すなわち、フリーズドライ)を受けることなく、EDC架橋後に8時間空気乾燥させた。
陰性対照(コンストラクトなし)および陽性対照(Bioguideの25x25mm標準生体吸収性バリア膜、これは、Osteohealth、One Luitpold
Drive、P.O. Box 9001、Shirley、NY11967製のブタIおよびIII型コラーゲン膜を含む)に加えて、実施例5の方法を用いて生成されるもの(すなわち、EDC架橋した、DHT架橋した、および架橋されていない生物工学によって作られたコンストラクト、この実施例では「試験コンストラクト」と総称される)としての生物工学によって作られたコンストラクトが、Gottingenミニブタの顎の4つの象限の各々(上顎右、上顎左、下顎右および下顎左)に移植された。
の上顎および4つの下顎部位に配置され、欠損の近心、遠位および頂端境界を2−3mmだけ延長させた。結紮糸を使用して、コンストラクト境界を周囲の宿主歯肉軟部組織に結合させた。全ての外科的処置は、無菌条件で、LASC獣医学サービスにより提供される全身麻酔および気管内挿管を使用して実施した。
に埋め込んだ。歯槽骨構造および新たに形成された組織組成物を欠損処理後、定量マイクロコンピュータトモグラフィー(MicroCT)を用いて検査した。マイクロCTスキャンを、Boston大学整形外科および発達生体力学研究所、機械工学科に配置されているScancoマイクロCT80システム(Scanco Medical、Bassersdorf、Switzerland)を用いて実施した。走査直前に、4匹のミニブタの顎を保存から取り出し、室温にキャリブレーションさせた。
本発明の生物工学によって作られたコンストラクトの細胞外マトリクス内の平均細孔サイズは、高密度または多孔性細胞外マトリクスを形成するように操作することができる。架橋の型および/または程度を組み合わせると、規定された平均細孔サイズを選択し、制御することができ、インビボ持続性および/または細胞浸潤の異なる速度を有するコンストラクト、治療的使用への適合された適用性に対し、「急速生体再構築可能」〜「適度に生体再構築可能」〜「長期生体再構築可能」な生物工学によって作られたコンストラクトが得られる(図14A)。実施例5の方法に従い生成されたHDF由来の生物工学によって作られたコンストラクトを、培養下18日後分析し、細孔サイズおよび分布特性を決定した。図13は、凍結乾燥されていないそのような生物工学によって作られたコンストラクトは、本質的には細孔を有さないことを示す。しかしながら、生物工学によって作られたコンストラクトをさらに、制御された収縮、凍結乾燥に供し、架橋されないか、EDCにより架橋され、または実施例5の方法に従いDHT法を用いて架橋させた。Scandium(登録商標)画像分析プログラム(Olympus)の魔法の杖ツールを使用して、代表的な組織切片について細孔の長さおよび面積を統計学的に分析した。細孔は正円ではないので、細孔直径は、ある細孔の測定された面積が、円に由来することを仮定して、逆算した。1群につき2つの組織像を使用し、測定値を生成させた。図14Bは、−40℃の最終凍結温度まで、0.5℃/分で傾斜させると、15〜20μmの間の平均細孔サイズが得られることを示す。加えて、図14Cはさらに、平均細孔サイズは、架橋状態に関係なく最終凍結温度により決定されることを示す。対照的に、図14Dは、生物工学によって作られたコンストラクトを、−10℃の最終凍結温度(−40℃より温かい凍結温度である)まで0.5℃/分の速度で傾斜させると、少なくとも50μm(例えば、30μm〜100μmの範囲)の平均細孔サイズが得られたことを示す。図14Eは平均細孔サイズは、制御された収縮に依存しないことをさらに示す。具体的には、実施例5の方法に従い生成され、制御された収縮後単純に空気乾燥された、HDF由来の生物工学によって作られたコンストラクトは、非常に小さな細孔(あれば)を有する高密度マトリクスを生成した。対照的に、図14Bに示されるもののように処理された、生物工学によって作られたコンストラクトは、15〜20μmの平均細孔サイズを生成した。同様に、実施例1の方法に従い生成された、MSC由来の生物工学によって作られたコンストラクトの平均細孔サイズ(図14F)は、制御収縮、すすぎ、室温から−20℃への凍結、および凍結乾燥で増加させることができる(図14G)。
20ng/mLTGFαを使用したことを除き、実施例1の方法に従い、HDFを超集密度(すなわち、30x106細胞/75mmインサート)で播種し、18日間培養させ
た。ヘパリンもまた、培地に5μg/mLで補充した。得られた生物工学によって作られ
たコンストラクトに対する塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF;Peprotech Inc.)の効果を試験するために、初期播種時または培養下5日後に、bFGFを補充し、培地中で維持した。図15Aは合成培地に20ng/mL bFGFを補充すると生物工学によって作られたコンストラクトの厚さが著しく減少し、対照に比べ、ピンセットで取り扱うと、より簡単に引き裂き可能となることを示す。ヘパリン補充は、生物工学によって作られたコンストラクトの厚さに何の効果もなかった。2ng/mLのbFGFを用いて生成された、生物工学によって作られたコンストラクトは、未処理対照と同様の厚さを有した。
粉砕し、凍結乾燥中に粉砕したが、断片は対照ユニットと同じくらい柔軟なままであった。しかしながら、断片もまた、対照ユニットよりも厚くなく、著しくより多孔性であった。凍結乾燥直前に、bFGF補充された、生物工学によって作られたコンストラクトを−80℃フリーザー内に2時間入れた。bFGF補充された、生物工学によって作られたコンストラクトは、本発明の範囲から逸脱することなく、−10℃〜−80℃の温度範囲のフリーザー内で1時間〜3日まで維持することができることが認識されるべきである。また、bFGF補充された、生物工学によって作られたコンストラクトは、培養物から取り出して、直接凍結乾燥機に入れることができる。全てのbFGF補充された、生物工学によって作られたコンストラクトをその後、凍結乾燥装置内の200mTorrより低い真空環境に供し、24時間0℃で処理した。生物工学によって作られたコンストラクトを、本発明の範囲から逸脱することなく0mTorr〜350mTorrの間の真空環境に供することができることが認識されるべきである。別の実施形態では、bFGF補充された、生物工学によって作られたコンストラクトを、凍結乾燥機での処理の代わりに、一晩中室温で空気乾燥させることができる。
多孔性の絹に基づく足場をBombyx moriカイコ繭の練り絹繊維から作製した。絹繊維を、室内条件下で撹拌しながら、9M LiBr溶液に6−10wt%濃度で6−10時間溶解した。溶液を水に対して、セルロース透析膜を使用して3日間、10時間毎に水を換えて透析した。フィブロイン水溶液をセルロース透析膜中で溶液を放置することにより濃縮した。不溶性部分を、遠心分離により20,000rpmで30分間、除去した。絹溶液の最終濃度は約7.5−8%であった。
また、HDFは、絹足場の上に約5x106の初期播種密度で播種することができること
が認識されるべきである。合成培地は下記を含んだ:DMEM、Hams F−12培地のベース3:1混合物(Quality Biologics、Gaithersburg、MD)、4mM GlutaMAX(Gibco BRL、grand Island、NY)および下記添加物:5ng/mlのヒト組換え上皮増殖因子(Upstate
Biotechnology、Lake Placid、NY)、1x10-4Mのエタノールアミン(Fluka、Ronkonkoma、NY cat.#02400 ACSグレード)、1x10-4Mのo−ホスホリル−エタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5ug/mlトランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、13.5pg/mLのトリヨードチロニン(Sigma、St.Louis、MO)、および6.78ng/mlのセレン(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company、Milwaukee、WI)、50ng/mlのL−アスコルビン酸(WAKO Chemicals USA、Inc.)、0.2ug/mlのL−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.1ug/mlのグリシン(Sigma、St.Louis、MO)、20ng/mlのTGF−αおよび10nMのPGE2。図16で示されるようにヒト皮膚線維芽細胞は、絹足場を通って移動す
ることができ、絹シート全体に均一に配置される。
示されている。より具体的には、図17(d)は、インビトロで失活させた線維芽細胞を有する絹足場上の染色されたヒト臍帯静脈内皮細胞を示す。染色された内皮細胞は絹足場上に整列された細管を形成し、失活させた線維芽細胞を有する絹足場は、効果的な内皮細胞の付着および持続を可能にすることが示される。
cat.#02400 ACSグレード)、1x10-4Mのo−ホスホリル−エタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5ug/mlのトランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、13.5pMのトリヨードチロニン(Sigma、St.Louis、MO)、および6.78ng/mlのセレン(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company、Milwaukee、WI)、50ng/mlのL−アスコルビン酸(WAKO Chemicals USA、Inc.)、0.2ug/mlのL−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.1ug/mlのグリシン(Sigma、St.Louis、MO)、20ng/mlのTGF−αおよび10nMのPGE2。11日の培養後、条件培地を収集し、絹足場
を条件培地に12時間浸漬させた。
ヒト新生児包皮線維芽細胞(Organogenesis、Inc.Canton、MAで創出)を、5x105細胞/162cm2組織培養処理フラスコ(Costar Corp.、Cambridge、MA、cat#3150)で播種し、培地中で増殖させた。増殖培地は、下記から構成した:10%新生仔ウシ血清(NBCS)(HyClone
Laboratories、Inc.、Logan、Utah)および4mMのL−グ
ルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)を補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(高グルコース処方、Lグルタミンなし、BioWhittaker、Walkersville、MD)。細胞を、インキュベータ内、37±1℃で、10±1%CO2の雰囲気を用いて維持した。培地を新たに調製した培地
と、2〜3日毎に交換した。8日培養後、細胞はコンフルエンスまで増殖し、すなわち、細胞は組織培養フラスコの底に沿って充填単層を形成し、培地を培養フラスコから吸引した。単層をすすぐために、滅菌濾過リン酸緩衝食塩水を各培養フラスコの底に添加し、その後、フラスコから吸引した。5mLのトリプシン−ベルセングルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)を各フラスコに添加し、静かに振動させ、確実に単層を完全に被覆させることにより、細胞をフラスコから放出させた。培養物をインキュベータに戻した。細胞が放出されるとすぐに、5mlのSBTI(大豆トリプシン阻害剤)を各フラスコに添加し、懸濁液と混合し、トリプシン−ベルセンの作用を中止させた。細胞懸濁液をフラスコから除去し、滅菌円錐遠心管間で均一に分割した。細胞を遠心分離により、およそ800−1000xgで5分間収集した。
−ウェルトレイ内の0.4μm細孔サイズ、24mm直径の組織培養処理インサート(TRANSWELL(登録商標)、Corning Costar)上に、1.0x106
細胞/インサートの密度で、播種した。75mmインサートが使用される場合、10x106細胞の細胞播種密度が使用されるべきであることが認識されるべきである。24mm
直径インサートが使用される場合、約1x106細胞/24mmインサートが使用される
べきである。HUCPVCの量が、線維芽細胞の量のパーセンテージとして懸濁液に添加されたことが、認識されるべきである。例えば、50%HUCPVCを含む層状24mmコンストラクトを製造するために、5x105HUCPVCを、多孔性膜上に前に播種さ
れた1.0x106ヒト新生児包皮線維芽細胞上に播種させた。線維芽細およびHUCP
VCをどちらも3mlのマトリクス生成培地中に浸し、これは下記を含む:
マトリクス生成培地で11日間、培地を周期的に、3−4日毎に交換して、培養した。
線維芽細胞およびHUCPVC−産生細胞外マトリクス層を有するコンストラクトを完全合成培地系において形成させた。1x105ヒト新生児皮膚線維芽細胞を、混合細胞集
団中で9x105間葉前駆細胞と共に、24mmカルチャーインサート上に播種した。線
維芽細胞の初期播種密度は約1x105〜約9x105の範囲とすることができ、間葉前駆細胞の初期播種密度は、約1x105〜約9x105の範囲とすることができ、本発明の範囲内であることが認識されるべきである。HUCPVCは、継代2で得られ、継代7まで拡張され、その後初めて、カルチャーインサート上に播種された。細胞の多分化能が保存される限り、HUCPVCは任意の他の継代数で使用することができることが認識されるべきである。
ヒト上皮前駆細胞(HEP’s;ケラチノサイト)を実施例1−8のいずれか1つに記載される生物工学によって作られたコンストラクト上に播種する。HEP’sを、生物工学によって作られたコンストラクトが約11間培養された後、播種した。約3.5x105−1.2x106細胞/コンストラクトの播種密度が好ましいが、しかしながら、本発明によれば、他の初期播種密度もまた企図される。第11日に、HEP’sを有する皮膚コンストラクトを、大体下記を含む培地で処理する:
生物工学によって作られた組織コンストラクトは、内因的に産生された組織コンストラクト上の細孔の深いネットワーク内で、細胞付着および細胞浸潤を増強させるために修飾することができる。そのような内因的に産生されたコンストラクトは、最初に約3000万のヒト皮膚線維芽細胞を0.4μm多孔性膜上に播種することにより生成され、合成培地中で11日間培養され得る。合成培地は下記を含む:DMEM、Hams F−12培地のベース3:1混合物(Quality Biologics、Gaithersburg、MD)、4mM GlutaMAX(Gibco BRL、grand Island、NY)および下記添加物:5ng/mlヒト組換え上皮増殖因子(Upstate
Biotechnology、Lake Placid、NY)、1x10-4Mのエタノールアミン(Fluka、Ronkonkoma、NY cat. #02400 ACSグレード)、1x10-4Mのo−ホスホリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5ug/mlのトランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pMのトリヨードチロニン(Sigma、St.Louis、MO)、および6.78ng/mlのセレン(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company、Milwaukee、WI)、50ng/mlのL−アスコルビン酸(WAKO Chemicals USA,Inc.)、0.2ug/mlのL−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.1ug/mlのグリシン(Sigma、St.Louis、MO)、20ng/mlのTGF−αおよび10nMのPGE2。11日の培養後、生物工学によって作られた組織コンストラクトの表面をエッチ
し、細胞片を除去する。これは、1%酢酸の溶液を適用し、コラーゲンの薄層を生物工学によって作られたコンストラクトの上面から除去することにより実施することができる。エッチングにより、細胞浸潤が改善され、これは火傷の徴候において有利となり得る。
Claims (74)
- 細胞外マトリクスの層を生成する条件下で増殖される間葉幹細胞を含み、前記間葉幹細胞により合成および構築される、生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記間葉幹細胞は、骨髄、臍帯、胎盤、羊膜、筋肉、脂肪、骨、腱または軟骨に由来する、請求項1記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記間葉幹細胞は、臍帯間葉幹細胞である、請求項1または2に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記臍帯間葉幹細胞は、臍帯血、臍帯静脈内皮下層、またはワルトン膠様質から単離される、請求項3記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記臍帯間葉幹細胞はヒト臍帯血管周囲細胞(HUCPVC)である、請求項3記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記間葉幹細胞はヒト間葉幹細胞はである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記間葉幹細胞はトランスフェクトされた細胞、組換え細胞、または遺伝子操作細胞である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 間葉幹細胞ではない細胞をさらに含み、任意に非間葉幹細胞は線維芽細胞である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記線維芽細胞は、新生児雄包皮、真皮、腱、肺、尿道、臍帯、角膜実質、口腔粘膜、および腸からなる群より選択される組織に由来する、請求項8記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記線維芽細胞は、ヒト線維芽細胞である、請求項8または9に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記間葉幹細胞および線維芽細胞は混合される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記間葉幹細胞および線維芽細胞は、少なくとも2つの別々の層中に存在する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記細胞外マトリクスは少なくとも60μmの厚さである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは、10μm〜150μmの範囲の直径の細孔を有し、任意に前記細孔は50μm〜100μmまたは80μm〜100μmの範囲にある、請求項1〜13のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは、少なくとも0.4ニュートンの平均Fmaxを有する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは、少なくとも0.4メガパスカルの最大抗張力(UTS)を有する、請求項1〜15のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは、初期長の少なくとも0.4倍の塑性変形許容範囲を有する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトの前記細胞は失活される、請求項1〜17のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは脱細胞される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは脱水される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記細胞外マトリクスは架橋剤によって架橋される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記架橋剤は、カルボジイミド、ゲニピン、トランスグルタミナーゼ、リボースおよび他の糖類、ノルジヒドログアヤレチン酸(NDGA)、酸化剤および紫外(UV)光からなる群より選択される、請求項21記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは、ヒアルロナン、CSF−3、ビトロネクチン、ヘパリン、NCAM1、CXCL1、IL−6、IL−8、VEGFA、VEGFC、PDGFβ、PECAM1、CDH5、ANGPT1、MMP2、TIMP1、およびTIMP3のうちの1つ以上をさらに含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは、抗菌剤、医薬品薬物、増殖因子、サイトカイン、ペプチド、またはタンパク質をさらに含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは、前記生物工学によって作られたコンストラクトを培養基材から放出させることにより、少なくとも50%の表面積の減少まで収縮される、請求項1〜24のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 多孔性絹フィブロイン足場をさらに含み、前記細胞外マトリクスの層を生成する条件下で増殖された前記間葉幹細胞が、前記多孔性絹フィブロイン足場上で培養される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記多孔性絹フィブロイン足場は、10μm〜150μmの範囲の直径の細孔を有する、請求項26記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記多孔性絹フィブロイン足場は2つの側を有し、少なくとも1つの側がシリコーンでコートされる、請求項26または27に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記多孔性絹フィブロイン足場は、抗菌剤、医薬品薬物、増殖因子、サイトカイン、ペプチド、またはタンパク質をさらに含む、請求項26〜28のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは、接着増強手段をさらに含む、請求項1〜29のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは最後に滅菌される、請求項1〜30のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 請求項1〜31のいずれか一項に記載の少なくとも2つの生物工学によって作られたコンストラクトは一緒に結合される、多層の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記結合された生物工学によって作られたコンストラクトは、架橋剤によって架橋される、請求項32記載の多層の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 増加された平均細孔サイズを有する細胞外マトリクスを有する生物工学によって作られたコンストラクトを生成させるための方法であって、方法は:
a)細胞外マトリクス構成要素を培養容器内で合成することができる細胞を播種すること;
b)前記細胞を培養し、細胞外マトリクス構成要素を合成させ、分泌させ、組織化させること;
c)少なくとも得られた細胞外マトリクス構成要素を凍結乾燥させること、
を含み、凍結乾燥は、前記細胞外マトリクス構成要素を最終凍結温度まで凍結させ、その後、前記細胞外マトリクス構成要素を乾燥させることを含み、よって、増加した平均細孔サイズを有する細胞外マトリクスを有する生物工学によって作られた細胞外マトリクスコンストラクトが生成される、方法。 - 前記多孔性細胞外のマトリクスの平均細孔サイズは、前記最終凍結温度を増加させることにより増加される、請求項34記載の方法。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトの平均細孔サイズは、前記最終凍結温度が約−40℃から約−10℃まで増加するにつれ、少なくとも10μmから少なくとも50μmまで増加する、請求項34または35に記載の方法。
- 前記細胞外マトリクス産生細胞は、新生児雄包皮、真皮、腱、肺、臍帯、軟骨、尿道、角膜実質、口腔粘膜、腸、骨髄、胎盤、羊膜、筋肉、脂肪、または骨に由来する、請求項34〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞外マトリクス産生細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞またはヒト臍帯血管周囲細胞である、請求項34〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞外マトリクス産生細胞は、トランスフェクトされた細胞、組換え細胞、または遺伝子操作細胞である、請求項34〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは、前記細胞外マトリクス産生細胞型に加えて、少なくとも1つの細胞型を含む、請求項34〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの追加の細胞型は、線維芽細胞、ストローマ細胞、および間葉幹細胞からなる群より選択される、請求項40記載の方法。
- 前記細胞外マトリクス産生細胞および少なくとも1つの追加の細胞型は混合される、請求項40または41に記載の方法。
- 前記細胞外マトリクス産生細胞および少なくとも1つの追加の細胞型は、少なくとも2つの別々の層に存在する、請求項40〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 各細胞型の前記細胞は1x105細胞/cm2〜6.6x105細胞/cm2の結合密度で播種される、請求項34〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 各細胞型の前記細胞は100%コンフルエンスを超える結合密度で播種される、請求項34〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞外マトリクスは、凍結乾燥前に少なくとも60μmの厚さである、請求項34〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトの前記細胞は、凍結乾燥前に、失活され、または脱細胞される、請求項34〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 約−40℃の最終凍結温度は、少なくとも10μmの平均細孔サイズを生成するために到達される、請求項34〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 約−10℃の最終凍結温度は、少なくとも30μmの平均細孔サイズを生成するために到達される、請求項34〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトの前記細胞外マトリクスは、架橋剤によって架橋される、請求項34〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記架橋剤は、カルボジイミド、ゲニピン、トランスグルタミナーゼ、リボースおよび他の糖類、ノルジヒドログアヤレチン酸(NDGA)、酸化剤、デヒドロサーマル(DHT)、および紫外(UV)光からなる群より選択される、請求項51記載の方法。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは、凍結乾燥前に、前記生物工学によって作られたコンストラクトを培養基材から放出させることにより、少なくとも50%の表面積の減少まで収縮される、請求項34〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞外マトリクス産生細胞を多孔性絹フィブロイン足場上で培養することをさらに含む、請求項34〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記前記多孔性絹フィブロイン足場は、10μm〜150μmの範囲の直径の細孔を有する、請求項53記載の方法。
- 前記多孔性絹フィブロイン足場は2つの側を有し、少なくとも1つの側がシリコーンでコートされる、請求項53または54に記載の方法。
- 前記多孔性絹フィブロイン足場は、抗菌剤、医薬品薬物、増殖因子、サイトカイン、ペプチド、またはタンパク質をさらに含む、請求項53〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも2つの生物工学によって作られたコンストラクトは一緒に結合される、請求項34〜56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合は接着増強手段を介して、または架橋剤による架橋により起こる、請求項57記載の方法。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは、凍結乾燥後に最後に滅菌される、請求項34〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、合成培地で培養される、請求項34〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記合成培地は、未決定の動物器官または組織抽出物を含まない、請求項60記載の方法。
- 前記合成培地はTGF−αを含む、請求項60または61に記載の方法。
- 前記細胞は、多孔性膜上で培養される、請求項34〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多孔性膜は、6μm未満のサイズである細孔を含む、請求項63記載の方法。
- 最終凍結温度に到達する速度は、平均細孔サイズの均一性を増加させるために減少される、請求項34〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 最終凍結温度に到達する速度は、0.1℃〜0.5℃/分である、請求項65記載の方法。
- 細胞外マトリクス産生細胞;
前記細胞外マトリクス産生細胞により産生される内在性細胞外マトリクス;
を含み、
前記細胞外マトリクス産生細胞は失活される、生物工学によって作られたコンストラクト。 - 前記生物工学によって作られたコンストラクトは、10μm〜150μmの範囲の直径の細孔を有し、任意に前記細孔は50μm〜100μmまたは80μm〜100μmの範囲にある、請求項67記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは、合成培地で培養された細胞により形成される、請求項67〜68のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記合成培地はTGF−αを含む、請求項69記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記合成培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)をさらに含む、請求項69〜70のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトの細胞外マトリクスは架橋剤によって架橋される、請求項67〜71のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンスト
ラクト。 - 前記架橋剤は、カルボジイミド、ゲニピン、トランスグルタミナーゼ、リボースおよび他の糖類、ノルジヒドログアヤレチン酸(NDGA)、酸化剤、デヒドロサーマル(DHT)、および紫外(UV)光からなる群より選択される、請求項72記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
- 前記生物工学によって作られたコンストラクトは粉末形態である、請求項67〜73のいずれか一項に記載の生物工学によって作られたコンストラクト。
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