JP2018070638A - 生体親和性高分子多孔質体の製造方法、生体親和性高分子多孔質体、生体親和性高分子ブロック並びに細胞構造体 - Google Patents
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Abstract
Description
さらに、特許文献1および特許文献2には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とをモザイク状に3次元配置することによって製造される細胞3次元構造体が記載されている。この細胞3次元構造体においては、外部から細胞3次元構造体の内部への栄養送達が可能であり、十分な厚みを有するとともに、構造体中で細胞が均一に存在している。また、特許文献1の実施例においては、リコンビナントゼラチンや天然ゼラチン素材からなる高分子ブロックを用いて高い細胞生存活性が実証されており、特許文献2には、細胞3次元構造体を移植後に移植部位に、血管を形成し得ることが開示されている。
(a)溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が2.5℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
(b)工程(a)で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、および
(c)工程(b)で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む、生体親和性高分子多孔質体の製造方法が提供される。
好ましくは、工程(a)において、溶液内で最も液温の低い部分の温度が、溶媒融点−5℃以下である。
好ましくは、ラインプロファイルのベースのバラつき値をσとした場合、ラインプロファイル上のxの最大値の半分のところに、2.0σ以上のピークが検出されない場合を、ピークが存在しないとする。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、
式:A−[(Gly−X−Y)n]m−B
(式中、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、nは3〜100の整数を示し、mは2〜10の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。)で示される。
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質;
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質;又は
(c)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質;
の何れかである。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、配列番号1に記載のアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質である。
好ましくは、生体親和性高分子ブロック一つの大きさが50μm以上120μm以下である。
好ましくは、本発明の細胞構造体は、細胞1個当り0.0000001μg以上1μg以下の生体親和性高分子ブロックを含む。
好ましくは、細胞は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞および成熟細胞からなる群から選択される細胞である。
好ましくは、細胞は、非血管系の細胞のみである。
好ましくは、細胞は、非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む。
好ましくは、中心部の血管系の細胞の割合が、血管系の細胞の全面積に対し、60%〜100%である領域を有する。
好ましくは、細胞構造体の内部において血管形成されている。
(1)生体親和性高分子多孔質体の製造方法
本発明の生体親和性高分子多孔質体の製造方法は、
(a)溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が2.5℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
(b)工程(a)で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、および
(c)工程(b)で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む。
工程(a)の冷却は、例えば、水よりも熱伝導率の低い素材(好ましくは、テフロン(登録商標))を介して冷却することが好ましく、溶液内で最も液温の高い部分は、冷却側から最も遠い部分と擬制することができ、溶液内で最も液温の低い部分は、冷却面の液温と擬制することができる。
好ましくは、工程(a)において、溶液内で最も液温の低い部分の温度は、溶媒融点−5℃以下であり、より好ましくは溶媒融点−5℃以下かつ溶媒融点−20℃以上であり、更に好ましくは溶媒融点−6℃以下かつ溶媒融点−16℃以上である。なお、溶媒融点の溶媒とは、生体親和性高分子の溶液の溶媒である。
本発明によれば、上記した生体親和性高分子多孔質体の製造方法により製造される生体親和性高分子多孔質体が提供される。
さらに本発明によれば、生体親和性高分子多孔質体の断面構造の画像の1.5mm平方視野に対して2次元フーリエ変換を施すことにより得られる2次元フーリエ変換画像を対して、2次元フーリエ変換画像のy軸下端から、画像ピクセルサイズの10分の1ピクセル幅について、x軸座標辺りの輝度値を平均してy軸にプロットしたラインプロファイルを作成した場合に、ラインプロファイルのxが最大値の半分のところにピークが存在しない、生体親和性高分子多孔質体が提供される。
本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性材料で構成されることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、および、MPC(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)の群から選択される少なくとも1つの材料である。生分解性材料としては、具体的にはポリペプチド(例えば、以下に説明するゼラチン等)、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー(PLGA)、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、および、キトサンの群から選択される少なくとも1つの材料である。上記の中でも、ポリペプチドが特に好ましい。尚、これら高分子材料には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよく、具体的な方法としては1.「基材表面に対する細胞接着基質(フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン)や細胞接着配列(アミノ酸一文字表記で現わされる、RGD配列、LDV配列、REDV配列、YIGSR配列、PDSGR配列、RYVVLPR配列、LGTIPG配列、RNIAEIIKDI配列、IKVAV配列、LRE配列、DGEA配列、及びHAV配列)ペプチドによるコーティング」、2.「基材表面のアミノ化、カチオン化」、3.「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法が利用され得る。
本発明で用いる高分子のGRAVY値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明の細胞3次元構造体(モザイク細胞塊;モザイク状になっている細胞塊)における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれであっても構わないが、好ましくはI型、II型、III型、IV型、およびV型である。より好ましくは、I型、II型、III型である。別の形態によると、該コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラットである。より好ましくはヒトである。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン用材料である。
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質;
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質;又は
(c)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上(より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質;
の何れかである。
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するタンパク質;又は
(c)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上(より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するタンパク質;
の何れかである。
生体親和性高分子ブロック(生体親和性高分子を含有する塊)の製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕機(ニューパワーミルなど)を用いて粉砕することにより生体親和性高分子ブロックを得ることができる。
本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、20μm以上200μm以下であることが好ましい。より好ましくは20μm以上120μm以下であり、さらに好ましくは50μm以上120μm以下である。生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、より優れた細胞生存率を達成することができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
本発明で用いる細胞は、本発明の細胞構造体の目的である、細胞移植を行えるものであれば任意の細胞を使用することができ、その種類は特に限定されない。また、使用する細胞は1種でもよいし、複数種の細胞を組合せて用いてもよい。また、使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞(特に、ヒト由来細胞)の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、又は成熟細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、ES細胞、GS細胞、又はiPS細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞(MSC)、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、又は神経幹細胞を使用することができる。前駆細胞及び成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、又は毛に由来する細胞を使用することができる。ヒト由来細胞としては、例えば、ES細胞、iPS細胞、MSC、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、又は造血幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。
本発明の細胞構造体は、上記した本発明の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体である。本発明の細胞構造体は、細胞移植のために使用することができる。
本発明の細胞構造体は、本発明の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロック(生体親和性高分子からなる塊)と、細胞とを交互に配置することにより製造できる。製造方法は特に限定されないが、好ましくは高分子ブロックを形成したのち、細胞を播種する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、本発明の細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性基材からなるモザイク状の配列形成を、促進、制御することが好ましい。
(a)別々に調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる、又は
(b)分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる、
などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造することができる。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。
(a)は非血管系の細胞を用いて前述の方法で細胞構造体を形成した後、血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法である。ここで、「血管系の細胞および高生体親和性分子ブロックを加える工程」とは、前述した、調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる方法、および、分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる方法、いずれも含むものである。この方法により、(i)細胞構造体の中心部では、血管系の細胞と比較して、非血管系の細胞の面積が多く、周辺部では、非血管系の細胞と比較して、血管系の細胞の面積が多い細胞構造体、(ii)細胞構造体の、中心部の非血管系の細胞の面積が、周辺部の非血管系の細胞の面積より多い細胞構造体、(iii) 細胞構造体の、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より少ない細胞構造体、を製造することが可能となる。
(b)は血管系の細胞を用いて前述の方法で細胞構造体を形成した後、非血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法である。ここで、「非血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程」とは、前述した、調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる方法、および、分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる方法、いずれも含むものである。この方法により、(i)細胞構造体の中心部では、非血管系の細胞と比較して、管系の細胞の面積が多く、周辺部では、血管系の細胞と比較して、非血管系の細胞の面積が多い細胞構造体、(ii)細胞構造体の、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い細胞構造体、(iii) 細胞構造体の、中心部の非血管系の細胞の面積が、周辺部の非血管系の細胞の面積より少ない細胞構造体、を製造することが可能となる。
(c)は、非血管系の細胞および血管系の細胞を実質的に同時に使用し、前述の方法で細胞構造体を形成させる製造方法である。この方法では、細胞構造体のいずれの部位も、非血管系の細胞および血管系の細胞のいずれかが、大きく偏在することのない細胞構造体を製造することが可能となる。
同様の理由で、血管系の細胞により細胞構造体を形成した後、非血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法が好ましい。そして、血管系の細胞数を多くすることがさらに好ましい。
本発明の細胞構造体は、例えば、重症心不全、重度心筋梗塞等の心臓疾患、脳虚血・脳梗塞といった疾患部位に細胞移植の目的で使用できる。また、糖尿病性の腎臓、膵臓、末梢神経、眼、四肢の血行障害などの疾患に対しても用いることが出来る。移植方法としては、切開、注射、内視鏡といったものが使用可能である。本発明の細胞構造体は、細胞シートといった細胞移植物とは異なり、構造体のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
[リコンビナントペプチド(リコンビナントゼラチン)]
リコンビナントペプチド(リコンビナントゼラチン)として以下記載のCBEを用意した(WO2008-103041に記載)。
CBE3
分子量:51.6kD
構造: GAP[(GXY)63]3G
アミノ酸数:571個
RGD配列:12個
イミノ酸含量:33%
ほぼ100%のアミノ酸がGXYの繰り返し構造である。CBE3のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。CBE3はERGD配列を有している。
等電点:9.34、GRAVY値:-0.682、1/IOB値:0.323
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
底面厚さ3mm、直径51mm、側面厚さ8mm、高さ25mmのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は8mmのPTFEで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も3mmのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は43mmになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。
厚さ1mm、直径47mmのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は1mmのアルミで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も1mmのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚1mmのテフロン(登録商標)を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は45mmになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に2.2mmの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。
[差温の小さい凍結工程、および乾燥工程]
PTFE厚・円筒形容器、アルミ硝子板・円筒形容器、にCBE3水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機(TF5−85ATNNN:宝製作所)内で冷却棚板を用いて底面からCBE3水溶液を冷却した。
この際の容器、CBE3水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。
「イ」 アルミ・硝子板・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量4mL。 棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
「ウ」 PTFE厚・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量10mL。 棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
[差温の大きい凍結工程、および乾燥工程]
アルミ硝子板・円筒形容器にCBE3水溶液を4mL流し込み、冷凍庫内で冷却棚板を用いて底面からCBE3水溶液を冷却した。この際の容器、CBE3水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。また、棚板温度は予め設定温度になるまで十分冷却しておいたところへ、CBE3水溶液入りの容器を設置することで凍結を実施した。
「オ」 アルミ硝子板・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度7.5質量%、水溶液量4mL。 棚板温度の設定は、予め−60℃に冷却しておいたところへCBE3水溶液入りのアルミ硝子板・容器を置く形にし、棚板温度はそのまま−60℃を維持して、凍結を行った。本凍結品に対して、その後、凍結乾燥を行い、多孔質体を得た。
「カ」 アルミ硝子板・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量4mL。 棚板温度の設定は、予め−40℃に冷却しておいたところへCBE3水溶液入りのアルミ硝子板・容器を置く形にし、棚板温度はそのまま−40℃を維持して、凍結を行った。本凍結品に対して、その後、凍結乾燥を行い、多孔質体を得た。
[各凍結工程での差温測定]
「ア」〜「カ」のそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温(非冷却面液温)として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温(冷却面液温)として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその差温のプロファイルは図1〜図6の通りとなった。
この図1、図2、図3から「ア」、「イ」、「ウ」では棚板温度−10℃設定区間(−20℃度に下げる前)において液温が融点である0℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない(未凍結・過冷却)状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の差温が2.5℃以下となっていた。その後、棚板温度を−20℃へ更に下げていくことによって、液温が0℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認出来た。その後、温度は0℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後0℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている。従って、測定している温度は氷内部の固体温度となり、つまり液温ではなくなる。
非冷却面液温が融点(0℃)になった時の差温:1.1℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の差温:0.2℃
凝固熱発生直前の差温:1.1℃
非冷却面液温が融点(0℃)になった時の差温:1.0℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の差温:0.1℃
凝固熱発生直前の差温:0.9℃
非冷却面液温が融点(0℃)になった時の差温:1.8℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の差温:1.1℃
凝固熱発生直前の差温:2.1℃
以下に、「エ」、「オ」、「カ」について、非冷却面液温が融点(0℃)になった時の差温と、凝固熱発生直前の差温を記載する。
非冷却面液温が融点(0℃)になった時の差温:5.4℃
凝固熱発生直前の差温:4.2℃
非冷却面液温が融点(0℃)になった時の差温:6.9℃
凝固熱発生直前の差温:5.3℃
非冷却面液温が融点(0℃)になった時の差温:5.9℃
凝固熱発生直前の差温:3.3℃
[1質量%エタノール含有溶液での、差温の小さい凍結工程、および乾燥工程]
PTFE厚・円筒形容器、およびアルミ硝子板・円筒形容器に1%(w/w)エタノール含有CBE3水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機(TF5−85ATNNN:宝製作所)内で冷却棚板を用いて底面からCBE3水溶液を冷却した。最終濃度1質量%エタノール含有水溶液とすることで、融点は−0.4℃となる。エタノール/水濃度比における融点変化は文献「Pickering S.U.: A Study of the Properties of some Strong Solutions. J.Chem.Soc.London 63 (1893) 998-1027」から計算した。
この際の容器、CBE3水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。
「アア」、「イイ」について、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温(非冷却面液温)として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温(冷却面液温)として容器内の底部の液温を測定した。尚、ここでは1質量%エタノールが溶媒となる為、溶媒融点は−0.4℃となる。エタノール/水濃度比における融点変化は文献「Pickering S.U.: A Study of the Properties of some Strong Solutions. J.Chem.Soc.London 63 (1893) 998-1027」から計算した。
この図7、8から「アア」、「イイ」では、棚板温度−10℃設定区間において液温が融点である−0.4℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない(未凍結・過冷却)状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の差温が2℃以下となっていた。その後、棚板温度を−20℃へ更に下げていくことによって、液温が−0.4℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認出来た。その後、温度は−0.4℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後0℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている。従って、測定している温度は氷内部の固体温度となり、つまり液温ではなくなる。
非冷却面液温が融点(−0.4℃)になった時の差温:0.8℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の差温:0.3℃
凝固熱発生直前の差温:0.8℃
非冷却面液温が融点(−0.4℃)になった時の差温:1.3℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の差温:0.0℃
凝固熱発生直前の差温:1.3℃
[多孔質体の構造均一性評価]
「ア」、「イ」、「ウ」、「エ」、「オ」、「カ」、「アア」、「イイ」で得られたCBE3多孔質体について、多孔質の構造均一性評価を実施した。得られた多孔質体を160℃、20時間の熱架橋を施し、不溶化したのち、十分時間、生理食塩水で膨潤。その後、ミクロトームで凍結組織切片を作製し、HE(ヘマトキシリン・エオシン))染色標本を作製した。得られた標本画像を図9〜12に示す。得られた標本画像中の1.5mm四方視野に対して、画像解析ソフトImageJにより、2次元フーリエ変換(FFT)を施すと図9〜12に示される2次元フーリエ変換画像が得られる。この2次元フーリエ変換によって、製剤に不均一な方向性が確認される場合は、特に軸方向に強いパワースペクトルが観測されることとなる。この不均一性の評価手法は、非特許文献「コンクリート工学年次論文集、vol.22、No.1,2000、p.211、 2次元フーリエ変換によるコンクリートの汚れの評価手法に関する基礎的研究、兼松学、北垣亮馬、野口貴文、友澤史紀」などで知られる手法を多孔質体の均一性評価に応用したものである。
実施例1(差温測定は実施例2)で得られた「ア」、「イ」のCBE3多孔質体をニューパワーミル(大阪ケミカル、ニューパワーミルPM−2005)で粉砕した。粉砕は、s最大回転数で1分間×5回、計5分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、25〜53μm、53〜106μm、106μm〜180μmの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下160℃で熱架橋(架橋時間は8時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間の6種類を実施した)を施して、試料CBE3ブロックを得た。以下、48時間架橋を施した「ア」の多孔質体由来ブロックをE、48時間架橋を施した「イ」の多孔質体由来ブロックをFと呼称する。つまり、E,Fが差温の小さい凍結工程・多孔質体から作られた差温小ブロックである。尚、架橋時間の違いは本願の評価においては性能に影響が見られない為、ここでは48時間架橋したものを代表として使用している。
比較例1(差温測定は実施例2)で得られた「エ」、「オ」、「カ」のCBE3多孔質体をニューパワーミル(大阪ケミカル、ニューパワーミルPM−2005)で粉砕した。粉砕は、最大回転数で1分間×5回、計5分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、25〜53μm、53〜106μm、106μm〜180μmの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下160℃で熱架橋(架橋時間は24時間、48時間を実施した)を施して、試料CBE3ブロックを得た。以下、48時間架橋を施した「エ」の多孔質体由来ブロックをA、48時間架橋を施した「オ」の多孔質体由来ブロックをB、48時間架橋を施した「カ」の多孔質体由来ブロックをCと呼称する。つまり、A,B,Cが差温の大きい凍結工程・多孔質体から作られた差温大ブロックである。尚、架橋時間の違いは本願の評価においては性能に影響が見られない為、ここでは48時間架橋したものを代表として使用している。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)を増殖培地(タカラバイオ:MSCGM BulletKitTM)にて10万cells/mLに調整し、実施例5で作製したCBE3ブロック53−106μmを0.1mg/mLとなるように加えた後、200μLをスミロンセルタイトX96Uプレート(住友ベークライト、底がU字型)に播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置し、直径1mmの球状の、CBE3ブロックとhMSC細胞からなるモザイク細胞塊を作製した(細胞1個当たり0.001μgのブロック)。なお、U字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。また、これはE、Fいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)を増殖培地(タカラバイオ:MSCGM BulletKitTM)にて10万cells/mLに調整し、比較例2で作製したCBE3ブロック53−106μmを0.1mg/mLとなるように加えた後、200μLをスミロンセルタイトX96Uプレート(住友ベークライト、底がU字型)に播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置し、直径1mmの球状の、CBE3ブロックとhMSC細胞からなるモザイク細胞塊を作製した(細胞1個当たり0.001μgのブロック)。なお、U字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は、球状であった。また、これはA,B,Cいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
ヒト血管内皮前駆細胞(hECFC)を増殖培地(Lonza:EGM−2+ECFC serum supplement)にて10万cells/mLに調整し、実施例5で作製したCBE3ブロック53−106μmを0.05mg/mLとなるように加えた後、200μLをスミロンセルタイトX96Uプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置し、扁平状の、ECFCとCBE3ブロックからなるモザイク細胞塊を作製した。その後、培地を除去し、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)を増殖培地(タカラバイオ:MSCGM BulletKitTM)にて10万cells/mLに調整し、実施例5で作製したCBE3ブロック53−106μmを0.1mg/mLとなるように加えた後、hECFCモザイク細胞塊がある200μLをスミロンセルタイトX96Uプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置し、直径1mmの球状の、hMSCとhECFCとCBE3ブロックからなるモザイク細胞塊を作製した。また、これはE、Fいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
ヒト血管内皮前駆細胞(hECFC)を増殖培地(Lonza:EGM−2+ECFC serum supplement)にて10万cells/mLに調整し、比較例2で作製したCBE3ブロック53−106μmを0.05mg/mLとなるように加えた後、200μLをスミロンセルタイトX96Uプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置し、扁平状の、ECFCとCBE3ブロックからなるモザイク細胞塊を作製した。その後、培地を除去し、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)を増殖培地(タカラバイオ:MSCGM BulletKitTM)にて10万cells/mLに調整し、比較例2で作製したCBE3ブロック53−106μmを0.1mg/mLとなるように加えた後、hECFCモザイク細胞塊がある200μLをスミロンセルタイトX96Uプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置し、直径1mmの球状の、hMSCとhECFCとCBE3ブロックからなるモザイク細胞塊を作製した。また、これはA,B,Cいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
実施例6で作製した2日目のモザイク細胞塊(本発明のCBE3ブロックを使用)5個をスミロンセルタイトX96Uプレート中で並べ、24時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。また、これはE、Fいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
実施例7で作製した2日目のモザイク細胞塊(本発明のCBE3ブロックを使用)5個をスミロンセルタイトX96Uプレート中で並べ、24時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。また、これはE、Fいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
比較例3で作製した2日目のモザイク細胞塊(比較用のCBE3ブロック由来)5個をスミロンセルタイトX96Uプレート中で並べ、24時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。また、これはA,B,Cいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
比較例4で作製した2日目のモザイク細胞塊(比較用のCBE3ブロック由来)5個をスミロンセルタイトX96Uプレート中で並べ、24時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。また、これはA,B,Cいずれのブロックでも上記と同様に作成できた。
マウスはNOD/SCID(チャールズリバー)のオス、4〜6週齢のものを用いた。麻酔下でマウス腹部の体毛を除去し、上腹部の皮下に切れ込みを入れ、切れ込みからはさみを差し込み、皮膚を筋肉からはがした後、実施例8、実施例9、比較例5、及び比較例6で作成したhMSCモザイク細胞塊およびhMSC+hECFCモザイク細胞塊をピンセットですくい、切れ込みから1.5cmほど下腹部寄りの皮下に移植し、皮膚の切れ込み部を縫合した。
解剖は移植から2週後に行った。腹部の皮膚をはがし、モザイク細胞塊が付着した皮膚を、約1平方cmの正方形の大きさに切り取った。モザイク細胞塊が腹部の筋肉にも付着している場合は、筋肉と共に採取した。
モザイク細胞塊が付着した皮膚片および、移植前のモザイク細胞塊について組織切片を作製した。皮膚を4質量%パラホルムアルデヒドに浸漬し、ホルマリン固定を行った。その後、パラフィンで包埋し、モザイク細胞塊を含む皮膚の組織切片を作製した。切片はHE染色(ヘマトキシリン・エオシン染色)を行った。
図13ではAおよびBの差温大ブロックを用いたhMSCモザイク細胞塊での結果を示している。Aの差温大ブロックでは、平均細胞数は122cells、平均血管数は12本/mm2であり、それぞれのCV値は、59%と137%であった。Bの差温大ブロックでは、平均細胞数は119cells、平均血管数は10本/mm2であり、それぞれのCV値は、31%と155%であった。切片像からも、モザイク細胞塊どうしでばらつきがあることが伺える。
図16では、AおよびBの差温大ブロックを用いたhMSC+hECFCモザイク細胞塊での結果を示している。Aの差温大ブロックでは、平均細胞数は84cells、平均血管数は34本/mm2であり、それぞれのCV値は、70%と173%であった。Bの差温大ブロックでは、平均細胞数は158cells、平均血管数は51本/mm2であり、それぞれのCV値は、39%と87%であった切片像からも、モザイク細胞塊どうしでばらつきがあることが伺える。
一方、差温小ブロックを用いた場合では、モザイク細胞塊間の個体差が小さく、ばらつきが少ないことが分かる。平均細胞数および平均血管数についても、差温大ブロックよりも大幅に高い値を示しており、差温小ブロックの方が、血管を形成しやすく、多くの細胞を生存させられると言える。これらは、実施例4で示されたように、差温の小さい凍結工程で得られた多孔質体は構造が均一であったがゆえに、その多孔質体から作られた差温小ブロックでは、生体内での性能にばらつきが少なくなったと考えられる。さらには、予想もしていなかったことに、そのことが血管の形成能力、細胞の生存能力にも寄与することが分かった。また、移植細胞の性能を発揮する上では、血管の形成能力と移植細胞の生存能力は、ともに高めることが非常に重要であり、この二つをともに向上させられるという点で、本発明の多孔質体は高い効果を発揮していた。
実施例7の内、代表的なEを用いたモザイク細胞塊は、切片をhECFC染色用にCD31抗体(EPT Anti CD31/PECAM-1)にDAB発色を用いたキット(ダコLSAB2キット ユニバーサル K0673 ダコLSAB2キット/HRP(DAB) ウサギ・マウス一次抗体両用)による免疫染色を行った。画像処理ソフトImageJ、CD31抗体による染色方法を使用し、中心部のhECFC(血管系の細胞)の面積の割合を求めた。なお、ここでいう「中心部」とは前記定義したものである。
Claims (23)
- 生体親和性高分子多孔質体の断面構造の画像の1.5mm平方視野に対して2次元フーリエ変換を施すことにより得られる2次元フーリエ変換画像に対して、2次元フーリエ変換画像のy軸下端から、画像ピクセルサイズの10分の1ピクセル幅について、x軸座標辺りの輝度値を平均してy軸にプロットしたラインプロファイルを作成した場合に、ラインプロファイル上のxが最大値の半分のところにピークが存在しない、生体親和性高分子多孔質体。
- ラインプロファイルのベースのバラつき値をσとした場合、2次元フーリエ変換画像のラインプロファイル上のxが最大値の半分のところに、2.0σ以上のピークが検出されない場合を、ピークが存在しないとする、請求項1に記載の生体親和性高分子多孔質体。
- 生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、又はキトサンである、請求項1又は2に記載の生体親和性高分子多孔質体。
- 生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、請求項1から3の何れか一項に記載の生体親和性高分子多孔質体。
- リコンビナントゼラチンが、
式:A−[(Gly−X−Y)n]m−B
(式中、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、nは3〜100の整数を示し、mは2〜10の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。)で示される、請求項4に記載の生体親和性高分子多孔質体。 - リコンビナントゼラチンが、
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質;
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質;又は
(c)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質;
の何れかである、請求項4に記載の生体親和性高分子多孔質体。 - リコンビナントゼラチンが、配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質である、請求項4に記載の生体親和性高分子多孔質体。
- リコンビナントゼラチンが、配列番号1に記載のアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するタンパク質である、請求項4に記載の生体親和性高分子多孔質体。
- 多孔質体中の生体親和性高分子が熱、紫外線または酵素により架橋されている、請求項1から8の何れか一項に記載の生体親和性高分子多孔質体。
- 請求項1から9の何れか一項に記載の生体親和性高分子多孔質体を粉砕することにより得られる生体親和性高分子ブロック。
- 請求項10に記載の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体。
- 生体親和性高分子ブロック一つの大きさが20μm以上200μm以下である、請求項11に記載の細胞構造体。
- 生体親和性高分子ブロック一つの大きさが50μm以上120μm以下である、請求項11又は12に記載の細胞構造体。
- 厚さ又は直径が400μm以上3cm以下である、請求項11から13の何れか一項に記載の細胞構造体。
- 細胞1個当り0.0000001μg以上1μg以下の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項11から14の何れか一項に記載の細胞構造体。
- 血管新生因子を含む、請求項11から15の何れか一項に記載の細胞構造体。
- 細胞が、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞および成熟細胞からなる群から選択される細胞である、請求項11から16の何れか一項に記載の細胞構造体。
- 細胞が、非血管系の細胞のみである、請求項11から17の何れか一項に記載の細胞構造体。
- 細胞が、非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む、請求項11から17の何れか一項に記載の細胞構造体。
- 細胞構造体において、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い領域を有する、請求項19に記載の細胞構造体。
- 前記中心部の血管系の細胞の割合が、血管系の細胞の全面積に対し、60%〜100%である領域を有する請求項20に記載の細胞構造体。
- 細胞構造体の、中心部の血管系の細胞密度が、1.0×10−4cells/μm3以上である領域を有する、請求項19から21の何れか一項の何れか一項に記載の細胞構造体。
- 細胞構造体の内部において血管形成されている、請求項19から22の何れか一項に記載の細胞構造体。
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