DE69611894T2 - Unsterbliche humane Hautzell-Linien und serumfreies Medium für ihre Herstellung - Google Patents

Unsterbliche humane Hautzell-Linien und serumfreies Medium für ihre Herstellung

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue, immortalisierte Zell-Linien, die von normalen, menschlichen Hautgeweben abgeleitet sind, ein neues Verfahren zur Herstellung dieser Zell- Linien sowie ein neues, serumfreies Medium, das zur Isolierung, Produktion und Erhaltung von Zellen, die von menschlichen Hautgeweben abgeleitet sind, angepaßt ist.
  • Die Herstellung von immortalisierten Zell-Linien, die von menschlichen Hautgeweben abgeleitet wurden, ist bereits beschrieben worden. Im allgemeinen umfassen die zu diesem Zweck verwendeten Verfahren die Transfektion oder die Transformation menschlicher Hautzellen, beispielsweise von Keratinozyten und Melanozyten, die in vitro mit Mitteln gezüchtet wurden, mit denen die Zellen immortalisiert werden können. Die Immortalisierung betrifft die Herstellung von Zellen, die für längere, theoretisch für unbegrenzte Zeit in vitro gezüchtet werden können. Diese Zellen werden auch als Dauer-Zell-Linien bezeichnet. Im Gegensatz dazu, sind die nicht-immortalisierten Zellen lediglich dazu in der Lage, eine bestimmte Anzahl von Teilungen in vitro durchzuführen. Die immortalisierten Zellen sind äußerst vorteilhaft, da sie eine stabile, potentielle nicht versiegende Quelle für Zellen mit definierten Eigenschaften liefern. Die klassischen Mittel zur Herstellung immortalisierter Zell-Linien und insbesondere immortalisierter, menschlicher Haut-Zell-Linien umfassen beispielsweise Viren, rekombinante Viren und Plasmide, die DNA-Sequenzen enthalten, die die Eigenschaft der Immortalisierung verleihen.
  • Das gängigste Verfahren, um immortalisierte, menschliche Zell-Linien herzustellen, umfaßt wahrscheinlich die Verwendung von SV40-Sequenzen, insbesondere der DNA des großen T-Antigens von SV40 als Mittel zur Immortalisierung. 5o offenbaren beispielsweise Steinberg et al. J. Cell Phys 123 : 117-125 (1985); U54,885,238 (Reddel et al.); US4,707,448 (Major); Stoner et al., Cancer Res., 51 : 365-371 (1991); Chopra et al., In vitro Cell Dev. Biol. 30A:539-546 (1994); Chopra et al., In Vitro Cell Dev. Biol., 27A: 763-765 (1991); Christian et al. Cancer Res., 47 : 6066-6073 (1987); Rhim et al., Science, 227 : 1250-1252 (1985); und Grubman et al. Gastrointest. Liver Physiol., 29: G1060-G1070 (1994) die Verwendung von SV40 Vektoren sowie von Vektoren mit der Sequenz des großen T-Antigens von SV40 zur Herstellung immortalisierter, menschlicher Zell-Linien. Die Einführung derartiger Sequenzen wird im allgemeinen durch Infektion mit dem SV40 Virus oder einem Adenovirus-12/SV40 Hybridvirus erreicht oder durch Transfektion von Zellen mit einem rekombinanten Plasmid, das das Long Terminal Repeat des Rous Sarkomvirus und die Early Region Ori-SV40 enthält, mit Hilfe einer Copräzipitation in Gegenwart von Strontiumphosphat (siehe Brash et al., Mol. Cell. Biol., 7 : 2031-2034 (1987)).
  • Ein anderes bekanntes Verfahren zur Herstellung immortalisierter Zell-Linien, und insbesondere immortalisierter, menschlicher Keratinozyten, beinhaltet die Transfektion oder die Infektion von Zellen mit DNA-Sequenzen des humanen Papillomvirus. 5o beschreibt beispielsweise die US5,376,542 (Schlegel) die Immortalisierung menschlicher Epithelzellen mit den E6- und E7-Genen, die aus HPV-16, 18, 31, 33 oder 35 isoliert wurden oder mit dem E7- Gen alleine, um immortalisierte, nicht tumorigene Zell-Linien zu erzeugen. Andererseits offenbaren Barbosa et al., Oncogene, 4 : 1529-1532 (1989); und Münger et al., J. Virol. 63 (10): 4417-4421 (1989) die Verwendung der Gene E7 und E8 von HPV-16 und HPV-18 zur Herstellung von menschlichen Keratinozyten.
  • Obwohl viele Gruppen immortalisierte Keratinozyten-Zell-Linien und deren Verwendung in in vitro Experimenten beschrieben haben, wiesen die Keratinozyten-Linien und immortalisierten Melanozyten-Linien des Standes der Technik in der Regel eine oder mehrere Eigenschaften auf, die für deren Verwendung nachteilig war. 5o wiesen beispielsweise die zuvor beschriebenen, immortalisierten Keratinozyten eine oder mehrere der folgende Eigenschaften auf (i) Verminderung oder Verlust der Expression von Differenzierungsmarkern, beispielsweise von Proteinen, die von normalen, differenzierten Keratinozyten exprimiert werden, und (ii) veränderte Wachstiunseigenschaften in der Gewebekultur.
  • So beschreiben beispielsweise Jetten et al., J. Invest. Dermatol., 92 : 203-209 (1989), daß mittels des SV40 Virus immortalisierte Keratinozyten, die nach einer großen Anzahl von Passagen (mehr als 12 Passagen) mit Hilfe des Vektors NHEK-SV40-T8-1 gewonnen wurden, sich nicht differenzieren können. Ähnlich dazu beschreiben Bernard et al., Cancer Res.; 45: 1707-1716 (1985) die Isolierung einer als SVK14 bezeichneten immortalisierten Keratinozyten-Linie und die, wie angeführt, sich im wesentlichen nicht ausdifferenzieren kann. Zudem zeigt diese Zell-Linie keine Expression der Keratine K1/10 (> 53 kD) und des Keratins von 50 kD (Keratin K14), Proteine, die normalerweise von differenzierten Keratinozyten exprimiert werden.
  • Darüber hinaus beschreiben Steinberg et al., J. Cell. Physiol. 123 : 117-125 (1985) mit Hilfe des SV40 Virus transformierte Keratinozyten, die allmählich die Fähigkeit verlieren, die Keratine zu exprimieren, die für ein normales Keratin-Zytoskelett kennzeichnend sind. Dieser Verlust der Expression des normalen Keratins stellt sich nach ca. 10-15 Passagen ein. Darüber hinaus berichten Hronis et al., Cancer Res., 44 : 5797-5804 über mit der DNA von SV40 immortalisierte Keratinozyten, die die Fähigkeit verloren haben, die Keratine K5, K6, K14/15, K16 und K17 sowie das Jnvolucrin zu produzieren, Proteine, die für differenzierte, normale Keratinozyten kennzeichnend sind. Weiterhin beschreiben Morris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 8498-8502 (1985) mit dem SV40-Virus immortalisierte Keratinozyten, die nach einer größeren Anzahl von Passagen (nach mehr als 14 Passagen) eine stark verringerte Expression von Keratinen der Kategorie II und der Kategorie I aufweisen. 5o zeigen diese Keratinozyten praktisch keine Expression von K13 (idem).
  • Zudem beschreiben Banks-Schlegel et al., J. Cell Biol. 96 : 330-337 (1983) mit dem SV40-Virus immortalisierte Keratinozyten, die in der Zellkultur veränderte Wachstumseigenschaften aufweisen. 5o benötigen beispielsweise diese immortalisierten Zellen im Gegensatz zu normalen Keratinozyten für ihr Wachstum eine Schicht von 3T3 Nährzellen.
  • Bei den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren zur Herstellung von immortalisierten Keratinozyten und menschlichen Melanozyten wurde in der Regel eine Technik eingesetzt, bei der Nährzellen verwendet wurden (wobei gewöhnlich die Fibroblasten die Rolle der "Nährzellen" spielen) wobei die Zellkultur im allgemeinen in einem serumhaltigen Milieu durchgeführt wurde. So beschreiben beispielsweise Sexton et al. "Stable transfection of human keratinocytes: HPV immortalization", Keratinocyte Methods, eds., Leigh, IM et al., University Press 179-180, (1994); Garlick, "Retroviral Vectors", Keratinocyte Methods (eds. Leigh LM. et al., Cambridge University Press, 181-183 (1994)) die Verwendung eines fötales Kälberserum enthaltenden Mediums sowie von Nährzellen, um immortalisierte Keratinozyten zu isolieren und zu produzieren.
  • Die Verwendung eines serumfreien Mediums während der Isolierung und Produktion immortalisierter epithelialer Zellen, insbesondere humaner Keratinozyten, ist bereits beschrieben worden. So beschreiben beispielsweise Barbosa et al., Oncogene, 4 : 1529-1532 (1989) die Primärkultur von humanen Keratinozyten, die durch Elektroporation oder Lipofektion in einem serumfreien, kalziumarmen Medium transfiziert wurden, bis hin zur Konfluenz.
  • Pfeifer et al. beschreiben in Methods in Cell Science 17 (1995), 83-89, ein Verfahren zur Immortalisierung von Hepatozyten. Zu diesem Zweck wird ein serumhaltiges Medium verwendet.
  • Im Dokument Mayo Clinic 61 (1986), 771-777 wird ein Verfahren beschrieben, um in vitro Keratinozyten zu erhalten, die für Hauttransplantationen verwendet werden können. Das besagte Verfahren umfaßt zwei Phasen. In der ersten Phase der Kultur werden die Zellen in einem serumfreien Medium gezüchtet und in der darauffolgenden Phase werden die in der ersten Phase gewonnenen Zellen in einem serumhaltigen Medium gezüchtet.
  • Trotz der Beschreibungen im Stand der Technik gibt es nach wie vor einen erheblichen Bedarf in der Praxis, über immortalisierte, humane Keratinozyten und Melanozyten zu verfügen, die verbesserte Eigenschaften aufweisen, insbesondere die, die das Potential von normalen Keratinozyten und Melanozyten zur Differenzierung beibehalten, und Differenzierungsmarker, die für differenzierte Melanozyten und Keratinozyten kennzeichnend sind, exprimieren; und dies auch nach einer großen Anzahl von Passagen. Derartige Kulturen würden für eine Reihe von Anwendungen äußerst vorteilhaft sein, inbesondere in Analysen, bei denen differenzierte Hautzellen benötigt werden. Es besteht zudem ein Bedarf in der Praxis nach verbesserten Zellkulturmedien, die es erlauben, primäre und immortalisierte Keratinozyten und Melanozyten aufrechtzuerhalten sowie nach verbesserten Zellkulturverfahren, bei denen der Einsatz von Nährzellen nicht erforderlich ist.
  • Eine erfindungsgemäße Aufgabe besteht darin, von normalem, menschlichem Hautgewebe abgeleitete, verbesserte, Dauer-(immortalisierte)-Zell-Linien herzustellen, insbesondere Keratinozyten- und Melanozyten-Dauer- (immortalisierte) Zell-Linien, die von normalem, menschlichem Hautgewebe abgeleitet sind, und die, die Fähigkeit zur Differenzierung und zur Expression von Differenzierungsmarkern, und dies auch nach einer großen Anzahl von Passagen, beibehalten. So besteht eine erfindungsgemäße Aufgabe insbesondere darin, immortalisierte Keratinozyten zu erhalten, die die Fähigkeit beibehalten haben, Keratine, Zytochrome sowie andere Differenzierungsmarker zu exprimieren, beispielsweise das Involucrin, das Filaggrin und das Loricrin, die von den klassischen, immortalisierten Keratinozyten-Linien nicht bzw. wenig exprimiert werden. Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe besteht darin, immortalisierte Keratinozyten und Melanozyten zu erhalten, die Enzyme exprimieren, die normalerweise von differenzierten Keratinozyten und Melanozyten exprimiert werden, wie beispielsweise die Enzyme der Phase 11 wie beispielsweise die Glutathion-S-Transferasen sowie Enzyme und/oder Proteine, die an der zellulären Oxidation und Entzündungsreaktionen beteiligt sind.
  • Eine andere erfindungsgemäße Aufgabe besteht darin, neue Kulturmedien bereitzustellen, die derart angepaßt sind, daß darin normale oder Dauer-Melanozyten- und/oder Keratinozyten-Linien gezüchtet, hergestellt und beibehalten werden können. Diese Medien sind darüber hinaus insbesondere dazu angepaßt, menschliche Hautzellen zu isolieren, zu etablieren und zu immortalisieren. Eine spezifische erfindungsgemäße Aufgabe besteht darin, genau definierte Zellkulturmedien (d. h. ohne unbekannte oder ungenügend definierte Zusätze) bereitzustellen, um darin Keratinozyten in Abwesenheit von Nährzellen zu züchten, wobei die vorstehend aufgeführten Medien Adrenalin enthalten, das überraschenderweise das Wachstum von Keratinozyten in einem serumfreien Medium stark verstärkt.
  • Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe besteht darin, ein neues Verfahren zur Herstellung von immortalisierten, von normalen Hautgeweben abgeleiteten Melanozyten- und Keratinozyten-Linien bereitzustellen, wobei ein serumfreies Medium verwendet wird, und zwar ein erfindungsgemäßes Medium, und ein Cocktail zur zellulären Fixierung, das Fibronektin, SAB und Kollagen vom Typ I enthält, bei gleichzeitiger Abwesenheit von "Nährzellen" (beispielsweise von Fibroblasten).
  • Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe besteht in der Verwendung von primären Keratinozyten und Melanozyten, die in einem erfindungsgemäßen serumfreien Medium sowie in Anwesenheit eines Cocktails zur zellulären Fixierung gezüchtet werden, um damit eine Hauttransplantation und eine ex vivo Gentherapie zu ermöglichen.
  • Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe besteht darin, erfindungsgemäße Verfahren zur Verwendung dieser Keratinozyten- und Melanozyten-Linien bereitzustellen, beispielsweise zwecks immunologischer, pharmakologischer, photo- und chemotoxikologischer Untersuchungen von Hautreaktionen und zwecks Expression von heterologen Genen.
  • Die Abb. 1 vergleicht das Wachstum (im Sinne der Zellzahl) von nicht- immortalisierten Keratinozyten DKO-NR in drei verschiedenen Medien, d. h. dem Medium NR-3, dem modifizierten Medium MCDB 153, dem Adrenalin zugesetzt wurde, und dem Medium MCDB 153 am Ende von 6 Tagen.
  • Die Abb. 2a zeigt das retrovirale Konstrukt des auf dem SV40-Virus basierenden Vektors, d. h. das Plasmid pLXSHD+SV40 (#328), das vorzugsweise zur Immortalisierung der erfindungsgemäßen Melanozyten und/oder Keratinozyten eingesetzt wird.
  • Die Abb. 2b zeigt das retrovirale Konstrukt des auf dem menschlichen Papillom- Virus 16 basierenden Vektors, d. h. das Plasmid pLXSHD+E6/E7, das zur Immortalisierung der erfindungsgemäßen Melanozyten und/oder Keratinozyten der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung stellt von menschlichen Hautgeweben abgeleitete Dauer- (immortalisierte) Zell-Linien bereit, d. h. immortalisierte Keratinozyten und Melanozyten, die gemäß einem Verfahren erhältlich sind, das folgende Schritte umfaßt:
  • (i) Gewinnen einer menschlichen Hautprobe;
  • (ii) Präparieren der besagten Probe für die in vitro Zellkultur;
  • (iii) Gewinnen der Keratinozyten und/oder Melanozyten ausgehend von der besagten Hautgewebeprobe und Aussäen der besagten Keratinozyten und/oder Melanozyten in ein serumfreies Medium auf Zellkulturplatten, die mit einer Beschichtung ausgestattet wurden, der Fibronektin, Typ I Kollagen und SAB umfaßt und die die Fixierung und das Wachstum der Zellen erleichtert;
  • (iv) Ersetzen des Mediums auf die nötige Weise, um ein optimales konfluentes Wachstum der Zellen in Kultur zu erreichen, währenddessen man ständig die Beschichtung auf den Zellkulturplatten aufrechterhält;
  • (v) Überführen der Keratinozyten und Melanozyten in ein serumfreies Medium, das dermaßen angepaßt ist, daß es unter den Keratinozyten oder den Melanozyten auf den zuvor ähnlich beschichteten Zellkulturplatten ausliest;
  • (vi) Infizieren der Keratinozyten oder der Melanozyten mit einer retroviralen Konstruktion:
  • (vii) Überführen der daraus gewonnenen immortalisierten Keratinozyten oder Melanozyten in ein serumfreies Proliferationsmedium, das geeignet ist für die Proliferation von immortalisierten Keratinozyten oder Melanozyten auf Zellkulturplatten, die zuvor auf ähnliche Weise beschichtet worden sind; und
  • (viii) Überführen der hiermit erhaltenen Keratinozyten, die sich vermehrt haben, in ein serumfreies Differenzierungsmedium, das einen hohen Gehalt an Kalzium besitzt, in Zellkulturflaschen, die zuvor auf ähnliche Weise beschichtet worden sind.
  • Diese Zellen behalten die Fähigkeit bei, Differenzierungsproteine zu exprimieren, die von den normalen Keratinozyten und Melanozyten exprimiert werden, und dies auch nach einer großen Anzahl von Passagen. Der Ausdruck "große Anzahl von Passagen" bezeichnet mindestens 10 Passagen in Kultur, vorzugsweise mindestens 20 bis 30 Passagen, vorzugsweise mindestens 50 Passagen und theoretischerweise eine unendliche Zahl von Passagen. Die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten beispielsweise exprimieren Differenzierungsproteine, und zwar das Keratin 1/10, das Keratin K14, das Involucrin, das Filaggrin und das Loricrin, selbst nach einer großen Anzahl von Passagen in der Gewebekultur. Dies steht im Gegensatz zu den im Stand der Technik beschriebenen, immortalisierten Keratinozyten, die keines dieser Differenzierungsproteine exprimieren bzw. diese Differenzierungsproteine mäßig exprimieren.
  • Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung primäre Keratinozyten und Melanozyten, die in Abwesenheit von Serum und in Abwesenheit von Nährzellen hergestellt wurden, und die die Fähigkeit zur Differenzierung und Expression von Proteinen beibehalten, die für differenzierte Melanozyten und Keratinozyten kennzeichnend sind.
  • Die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten weisen ein Profil des Zytochroms p450 (CYP450) auf, das zu dem normaler Keratinozyten ähnlich, wenn nicht identisch ist. Die erfindungsgemäßen Zellen exprimieren beispielsweise das CYP450 3A5 und nicht das CYP450 3A4. Darüber hinaus exprimieren die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten die Enzyme der Phase 11, beispielsweise die Glutathion-S-Transferase (GST), genauer die GSTα, die GSTu und die GSTπ, in einer zu der normaler, nicht immortalisierter Keratinozyten vergleichbaren Art und Weise.
  • Zudem exprimieren die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten nach Behandlung mit Phorbolestern Proteine und Enzyme, die an der zellulären Oxidation und an Entzündungsreaktionen beteiligt sind, beispielsweise die Superoxiddismutase (SOD) und die Kollagenase vom Typ I sowie den Tumornekrosefaktor alpha (TNFα), in einer zu der normaler, differenzierter Keratinozyten vergleichbaren Art und Weise. Angesichts dieser Merkmale liefern diese Zell-Linien eine reproduzierbare und äußerst stabile Quelle von Zellen für immunologische und pharmakologische Untersuchungen, sowie für Untersuchungen von Entzündungen und für photo- und chemotoxikologische Untersuchungen von Hautreaktionen.
  • Weiterhin exprimieren die erfindungsgemäßen immortalisierten Melanozyten natürlicherweise Melanin und/oder Proteine, die mit der Expression von Melanin assoziiert sind (siehe die folgenden Beispiele 14-15).
  • Außerdem bilden die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten- und Melanozyten-Zell-Linien, wenn sie in einer organotypischen Kultur gezüchtet werden, ein äußerst schichtreiches und polarisiertes Epithel, das oberflächliche, keratinisierte Schichten (Stratum corneum) umfaßt. Dies ist zuvor lediglich unter klassischen Zellkulturbedingungen, d. h. über ein Verfahren, das ein serumhaltiges Medium und eine Schicht mit Nährzellen enthielt (siehe beispielsweise Lechner et al. Virology, 185 : 536-571 (1991)), realisiert worden.
  • Die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten und Melanozyten werden aus einer normalen Haut in Abwesenheit von Serum und ohne die Verwendung irgendwelcher Nährzellen gewonnen. Im allgemeinen können die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten und Melanozyten über das folgende Verfahren gewonnen werden:
  • (i) Gewinnen einer menschlichen Hautprobe;
  • (ii) Präparieren der besagten Probe für die in vitro Zellkultur;
  • (iii) Gewinnen der Keratinozyten und/oder Melanozyten ausgehend von der besagten Hautgewebeprobe und Aussäen der besagten Keratinozyten und/oder Melanozyten in ein serumfreies Medium auf Zellkulturplatten, die mit einer Beschichtung ausgestattet wurden, der Fibronektin, Typ I Kollagen und SAB umfaßt und die die Fixierung und das Wachstum der Zellen erleichtert;
  • (iv) Ersetzen des Mediums auf die nötige Weise, um ein optimales konfluentes Wachstum der Zellen in Kultur zu erreichen, währenddessen man ständig die Beschichtung auf den Zellkulturplatten aufrechterhält;
  • (v) Überführen der Keratinozyten und Melanozyten in ein serumfreies Medium, das dermaßen angepaßt ist, daß es unter den Keratinozyten oder den Melanozyten auf den zuvor ähnlich beschichteten Zellkulturplatten ausliest;
  • (vi) Infizieren der Keratinozyten oder der Melanozyten mit einer retroviralen Konstruktion:
  • (vii) Überführen der daraus gewonnenen immortalisierten Keratinozyten oder Melanozyten in ein serumfreies Proliferationsmedium, das geeignet ist für die Proliferation von immortalisierten Keratinozyten oder Melanozyten auf Zellkulturplatten, die zuvor auf ähnliche Weise beschichtet worden sind; und
  • (viii) Überführen der hiermit erhaltenen Keratinozyten, die sich vermehrt haben, in ein serumfreies Differenzierungsmedium, das einen hohen Gehalt an Kalzium besitzt, in Zellkulturflaschen, die zuvor auf ähnliche Weise beschichtet worden sind.
  • Der Schritt (i) umfaßt gewöhnlich insbesondere die Gewinnung von menschlichen Hautproben von normalen, menschlichen Spendern, beispielsweise von Proben, die während eines chirurgischen Eingriffs oder einer Operation in der Kinderheilkunde gewonnen werden. Die Immortalisierung einer einzigen Probe von Hautzellen, d. h. einer autologen Probe von Hautzellen erlaubt die Herstellung von immortalisierten Linien von Keratinozyten und Melanozyten, die definierte Merkmale aufweisen, beispielsweise ein bestimmtes Rezeptorprofil, die für einen bestimmten Spender charakteristisch ist.
  • Die Hautgewebeprobe wird anschließend im Schritt (ii) dermaßen verarbeitet, daß sie für die in vitro Kultur geeignet ist. Diese Verarbeitung wird vorzugsweise so durchgeführt, daß man zunächst die Hautgewebeprobe wäscht, beispielsweise indem man das Medium verwendet, das für die Kultur verwendet wird. Vorzugsweise wird dieser Schritt im NR-2 Medium durchgeführt, das ein serumfreies Medium darstellt und dessen genaue Zusammensetzung weiter unten beschrieben wird, denn dieses Medium hat sich als vorteilhaft für die Kultur von normalen Keratinozyten und Melanozyten erwiesen. Nach dem Waschen wird die Hautgewebeprobe vorzugsweise rasiert, beispielsweise mit Hilfe eines Dermatoms, und anschließend in kleine Stücke geschnitten.
  • Die sich daraus ergebenden Hautschnitte werden anschließend vorzugsweise zu Dermis und Epidermis getrennt. Dies kann mit einem physischen und/oder enzymatischen Mittel erreicht werden. Letzteres kann beispielsweise über eine Trypsinbehandlung erreicht werden, beispielsweise indem man die Hautgewebeproben in eine Trypsinlösung (beispielsweise von ca. 0,5%), die EDTA enthält (beispielsweise ca. 0,1%), für eine Zeit eintaucht, die ausreicht, um die Abtrennung der Zellen zu bewirken, beispielsweise für eine Zeit von ca. 30 bis 60 Minuten bei einer Temperatur von 37ºC oder aber für eine Nacht bei 4ºC.
  • Die Dermis wird abgelöst (um die Fibroblasten zu isolieren, siehe das Beispiel 2) und die Epidermis wird anschließend in ein Suspensionsmedium gelegt. Vorzugsweise enthält das Suspensionmedium eine Lösung mit einem Sojatrypsininhibitor (SBTI) und wird in Kontakt gebracht mit den Zellen für eine ausreichende Zeit, üblicherweise für ca. 5 Minuten, um das Trypsin zu inaktivieren und die Lösung der Zellen zu bewirken. Ein Gewebekulturmedium, vorzugsweise das (weiter unten beschriebene) serumfreie NR-2 Medium und ein Filter (beispielsweise ein Filter von 100 mm) werden anschließend hinzugefügt, um die gewünschten Zellen zu gewinnen, d. h. die Keratinozyten und/oder die Melanozyten. Die sich daraus ergebenden primären Keratinozyten und/oder Melanozyten, die im Schritt
  • (ii) gewonnen wurden, werden anschließend in ein serumfreies Medium ausgesät, vorzugsweise in das (weiter unten ausführlich beschriebene) NR-3 Medium, und zwar in einer geeigneten Zelldichte, vorzugsweise ca. 1,2 · 10&sup4; Zellen/cm², und zwar auf zuvor beschichteten Zellkulturplatten. Allerdings ist es möglich, diese Zellkonzentration in einer großen Bandbreite zu variieren. Die Zellkulturplatten werden vorzugsweise mit einer Dauerbeschichtung, dessen Zusammensetzung die Fixierung und das Wachstum von Keratinozyten und Melanozyten überraschenderweise gesteigert hat, genauer einer Lösung von Fibronektin, von SAB und vom Typ I Kollagen ausgestattet. Diese Zusammensetzung einer zellulären Beschichtung ist zuvor beschrieben worden, und zwar wegen seiner Verwendung für Bronchialepithelzellen (Lechner et al., J. Tissue Cult. Meth. 9 : 43-48 (1985)), um eine Literaturstelle zu nennen.
  • Im Schritt (iv) wird das Kulturmedium so oft wie nötig ersetzt, um ein optimales Zellwachstum zu gewährleisten. Vorzugsweise wird das Medium alle zwei Tage ersetzt. Allerdings kann dies in Abhängigkeit von der bestimmten Hautgewebeprobe variieren. Nachdem eine quasi vollständige Konfluenz erreicht worden ist, beispielsweise ca. 90% Konfluenz, was nach einer Zeit von ca. 10 bis 14 Tagen passiert, werden die Keratinozyten und Melanozyten voneinander getrennt. Dies kann durch beliebige Mittel erreicht werden, die eine angemessene Abtrennung der Zellen erlauben, d. h. ohne eine ungünstige Wirkung auf die Melanozyten und/oder Keratinozyten. Dies kann beispielsweise über eine differenzierte Behandlung mit dem Trypsin durchgeführt werden. Vorzugsweise werden die Melanozyten und Keratinozyten mit einer Trypsin/EDTA Lösung behandelt, und anschließend in das Auslesemedium überführt. Im Falle der Keratinozyten werden die Zellen vorzugsweise während einer Zeit von ca. 5-10 Minuten mit einer Trypsin/EDTA-Lösung (0,025%/0,01%) behandelt und werden anschließend im Schritt (v) verwendet, um dann in das NR-3 Medium auf zuvor beschichtete Platten ausgesät zu werden. Im Falle der Melanozyten werden die Zellen vorzugsweise während einer Zeit von ca. 2-4 Minuten mit einer Trypsin/EDTA-Lösung (0,025%/0,01%) behandelt und werden anschließend im Schritt (v) verwendet, um dann in das NR-3 Medium auf zuvor beschichtete Platten ausgesät zu werden.
  • Diese Zellen werden anschließend mit dem Immortalisierungsmittel behandelt. Die Zellen können bis zur Durchführung der Immortalisierung auch eingefroren werden, beispielsweise in flüssigem Stickstoff. Die Infektion und die Immortalisierung werden vorzugsweise durchgeführt, indem eine retrovirale Konstruktion, die auf dem SV40 Virus oder dem menschlichen Papillomvirus 16 verwendet wird, und zwar so wie der retrovirale Vektor pLXSHD+SV40 (#328), der in der Abb. 2a dargestellt ist und der von Stockshlaeder et al beschrieben wurde (Geneßank, Accession Nr. M64753; Stockshlaeder et al., Human Gen. Therapy, 2, 33-39, 1991) oder (2) der retrovirale Vektor pLXSHD+E6/E7, der in der Abb. 2b dargestellt ist. Der retrovirale Vektor pLXSHD+SV40 (#328) enthält die Sequenz T-Ag von SV40, die Long Terminal Repeat Sequenzen 5' und 3' von SV40; die Sequenzen von pBR322, die die Replikation von E.coli vermitteln, einen multiplen Klonierungszyklus, eine Polyadenylierungssequenz von SV40, unter anderen Sequenzen. Der Vektor pLXSHD-E61E7 enthält statt des für das T-Antigen kodierenden Gens das Fragment NcoI/CfoI des E6/E7-Gens, die vom Humanpapillomvirus 16 stammt. Die Konstruktion dieses Plasmids wird von Dürst et al. in Oncogene, 1 : 251-256, 1987 beschrieben.
  • Nach der Immortalisierung werden die Zellen der während der Zellkultur nötigen Zahl von Passagen unterzogen und die sich daraus ergebenden immortalisierten Zellen werden anschließend in ein Proliferationsmedium im Schritt (vii) überführt. Im Falle der Keratinozyten wird diese Überführung vorzugsweise mit der zweiten Passage durchgeführt.
  • Im Schritt (viii) werden die immortalisierten Zellen in einem Proliferationsmedium für immortalisierte Keratinozyten oder Melanozyten, welches ein serumfreies Medium und vorzugsweise das Medium NR-2 oder NR-3 und das Medium M2 für Melanozyten (weiter unten beschrieben) umfaßt, vermehrt. Die immortalisierten Zellen werden erneut gezüchtet auf Zellkulturplatten, die zuvor dauerhaft beschichtet worden sind, wobei die Beschichtung erneut eine Lösung umfaßt.
  • Nach Vermehrung der immortalisierten Zellen im Proliferationsmedium werden die Keratinozyten im Schritt (viii) in ein Medium überführt, das die Differenzierung der normalen und immortalisierten Keratinozyten fördert. Vorzugsweise umfaßt dieses Medium das Medium NR-2 oder MCDB 153, das so verändert ist, das es einen hohen Gehalt an Kalzium hat, vorzugsweise einen Kalziumgehalt von ca. 1,5 mM, wobei die Zellkultur wieder auf Zellkulturplatten durchgeführt wird, die dauerhaft mit einer Lösung aus Fibronektin, SAB und Typ I Kollagen beschichtet sind.
  • Auf die vorgenannte Weise wurde überraschenderweise gefunden, daß die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten- und Melanozyten-Zell-Linien die Fähigkeit zur Differenzierung und zur Expression von Differenzierungsproteinen beibehalten, die für normale, differenzierte Keratinozyten und Melanozyten kennzeichnend sind, und dies auch nach einer großen Anzahl von Passagen in der Gewebekultur, d. h. nach mindestens 10 Passagen. Nach einer hohen Anzahl von Passagen exprimieren beispielsweise die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten Keratine sowie andere Proteine, beispielswiese das Involucrin, das Filaggrin und das Loricrin, die nicht oder kaum exprimiert werden von den im Stand der Technik beschriebenen, mit SV40 immortalisierten Keratinozyten exprimiert werden.
  • Mehrere der erfindungsgemäßen Zell-Linien von immortalisierten Keratinozyten DK2- NR, DK3-NR und FK2-NR (siehe die Tabellen 7 und 8 weiter unten) exprimieren insbesondere Differenzierungsproteine wie das Keratin K1/10, das Keratin K14, das Involucrin, das Filaggrin und das Loricrin, und dies auch nach einer hohen Zahl von Passagen (> 30 Passagen).
  • Zudem haben die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten ein CYP450 Profil, das ähnlich, wenn nicht identisch mit dem normaler menschlicher Keratinozyten ist. 5o exprimieren die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten die CYP450 1A1, 2C, 2E1 und 3A5, aber nicht die CYP450 1A2, 2A6, 2B6 und 2D6, was charakteristisch ist für das Zytochrom 450-Profil normaler Keratinozyten ist. Dies ist das erste Mal, daß demonstriert werden konnte, daß normale und immortalisierte menschliche Keratinozyten CYP450 3A5 und nicht CYP450 3A4 exprimieren.
  • Außerdem exprimieren die Zell-Linien von erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten Enzyme der Phase II, beispielsweise die Glutathion-S-Transferasen (GST) auf eine Weise, die der normaler differenzierter Keratinozyten vergleichbar ist. Genauer gesagt exprimieren die Zell-Linien Linien von erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten GSTα, GSTu und GSTπ auf eine Weise, die der normaler differenzierter Keratinozyten vergleichbar ist.
  • Darüber hinaus exprimieren die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten Enzyme und andere Proteine, die an der zellulären Oxidation und an Entzündungsreaktionen beteiligt sind, und zwar auf eine Weise, die der normaler Keratinozyten vergleichbar ist. So exprimieren die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten die Superoxiddismutase (SOD). Als Reaktion auf die Zugabe von Phorbolestern exprimieren zudem die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten die Typ I Kollagenase (ein Entzündungsbotenstoff) und den Faktor TNFα (Tumornekrosefaktor-α).
  • Im Falle einer organotypischen Zellkultur bilden die erfindungsgemäßen immortalisierten Zell-Linien ein schichtreiches und polarisiertes Epithel, das keratinisierte, oberflächliche Schichten (Stratum corneum) trägt. Dies ist zuvor lediglich beschrieben worden für immortalisierte Keratinozyten-Zell-Linien, die unter klassischen Zellkulturbedingungen etabliert wurden, beispielsweise mit einem serumhaltigen Medium und unter Verwendung einer Schicht von Nährzellen.
  • Die erfindungsgemäßen immortalisierten Zell-Linien werden auf überraschende Weise in der vollständigen Abwesenheit von Serum sowie mangels Verwendung irgendwelcher Schichten von Nährzellen während der Zellkultur gewonnen.
  • Zudem ist auf überraschende, weiter unten ausführlich beschriebene Weise gefunden worden, daß das Adrenalin ein starker Wachstumsfaktor für das Wachstum normaler Keratinozyten ist, wenn man es in einem serumfreien Medium verwendet. Das weiter unten beschriebene NR-3 Medium enthält insbesondere Adrenalin, von dem gezeigt werden konnte, daß es das Wachstum normaler Keratinozyten verstärkt (siehe Abb. 1). Dies ist vollkommen unerwartet, denn das Adrenalin ist früher als ein Faktor beschrieben worden, der das Wachstum der Keratinozyten hemmt (Halprin, J. Invest. Dermatol., 81, 553-557 (1983)) sowie wie ein Faktor, der nur einen mäßigen Einfluß auf das Wachstum von Keratinozyten ausübt (Koizumi et al., J. Invest. Dermatol., 96 : 234-237 (1991)).
  • Weiterhin ist auf überraschende Weise gefunden worden, daß die dauerhafte Beschichtung der Zellkulturflaschen oder- platten, die für die Kultur primärer und immortalisierter Keratinozyten und/oder Melanozyten verwendet werden, insbesondere mit einer Beschichtung oder einem "Cocktail" aus Fibronektin, SAB und dem Typ I Kollagen, die Fixierung der Keratinozyten und Melanozyten an die Zellkulturplatten oder -flaschen verbessert und auch das Zellwachstum steigert. Die Verwendung einer derartigen Beschichtungssubstanz ist zuvor nicht beschrieben worden zwecks Verwendung mit immortalisierten Keratinozyten und/oder Melanozyten.
  • Auf die beschriebene Weise stellt weiterhin die vorliegende Erfindung ausdrücklich ein neues serumfreies Medium mit der Bezeichnung NR-3 Medium vor. Dieses Medium erlaubt auf überraschende Weise die Kultur und Isolierung von normalen Keratinozyten und/oder Melanozyten, die aus einem menschlichen Hautgewebe stammen, in Abwesenheit von Serum und mangels Verwendung einer Schicht von Nährzellen. Dieses Medium hat sich dabei als ein Medium erwiesen, das das Wachstum von normalen Keratinozyten verbessert und die Etablierung von Kulturen normaler Keratinozyten erlaubt, ohne daß ein Kontakt mit Serum oder Nährzellen erfolgt.
  • Die genaue Zusammensetzung des NR-3 Mediums ist in der Tabelle 11 beschrieben. Dieses Medium enthält verschiedene Aminosäuren, inorganische Salze in Form von Oligoelement-Salzen, Vitamine, Wachstumsfaktoren und andere Ersatzstoffe. Beispielsweise enthält dieses Medium als Wachstumsfaktoren den epidermalen Wachstumsfaktor (rekombinanten EGF), Insulin, Hydrocortison, (humanes) Transferrin, einen bovinen Hypophysenextrakt und Adrenalin. Auf die beschriebene Weise ist überraschenderweise gefunden worden, daß das Adrenalin das Wachstum von primären Keratinozyten in der Gewebekultur steigert.
  • Was die Aminosäuren angeht, enthält dieses Medium L-Alanin, L-Arginin-HCl, L- Asparagin-H&sub2;O, L-Asparaginsäure, L-Cystein-HCl-H&sub2;O, L-Glutaminsäure, Glutamin, Glycin, L-Histidin-HCl-H&sub2;O, L-Isoleuzin, L-Leuzin, L-Lysin-HCl, L-Methionin, L-Phenylalanin, L- Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Valin.
  • Die inorganischen Salze, die in diesem Medium vorhanden sind, sind Ammoniumvanadat, Ammoniummolybdat, Calciumchlorid, Kupfersulfat, Eisensulfat, Magnesiumchlorid, Manganchlorid, Nickelsulfat, Kaliumchlorid, Natriumazetat, Natriumbicarbonat, Natriumchlorid, dibasisches Natriumphosphat, Natriumpyruvat, Natriumselenit, Natriumsilikat, Zinnchlorid und Zinksulfat.
  • Die im NR-3 Medium vorhandenen Vitamine sind D-Biotin, Kalzium-D-Pantothenat, Cholinchlorid, Cyanocobalamin, Folsäure, I-Inositol, Nikotinamid; Pyridoxin und Riboflavin. Das Medium enthält zudem Adenin, Ethanolamin, Phosphoethanolamin, das Natriumsalz des Phenokots, Putreszin · 2HCl, Thiamin · HCl, Thioctsäure, Thymidin, Glukose, HEPES und Antibiotika (Fungizon, Penizillin und Streptomyzin).
  • Die bevorzugte Zusammensetzung von NR-3 ist in der Tabelle 11 beschrieben. Allerdings ist vorgesehen, daß man in der Lage ist, innerhalb weiter Grenzen die Konzentration der vorhandenen Substituenten im NR-3 Medium zu variieren. Insbesondere ist vorgesehen, in der Lage zu sein; die Mengen der verschiedenen Substituenten von einem Wert von ±50 bis ±0,1% zu variieren, vorzugsweise von ±10 bis ±1% im Vergleich zu den in der Tabelle 12 beschriebenen Konzentrationen Außerdem ist vorgesehen, einen oder mehrere Substituenten auszulassen und dafür andere Substituenten hinzuzufügen, unter der Voraussetzung, daß diese Substituenten keinen nennenswerten ungünstigen Effekt haben auf die Isolierung und die Etablierung von Kulturen von primären Keratinozyten oder Melanozyten und auf die immortalisierten Zell-Linien. Dies kann vom Fachmann mittels aufeinanderfolgenden Approximationsanalysen bestimmt werden.
  • Auf die beschriebene Weise ist ein wesentlicher erfindungsgemäßer Substituent des serumfreien NR-3 Mediums das Adrenalin. Es ist gefunden worden, daß das Adrenalin eine sehr starke Aktivität der Aktivierung des Wachstums gegenüber primären humanen Keratinozyten entfaltet.
  • Der Grund, warum das Adrenalin die Proliferation von Keratinozyten steigert, ist nicht vollständig geklärt. Es ist gezeigt worden, daß die humanen Keratinozyten Enzyme exprimieren zwecks Synthese des Adrenalins und zudem in hoher Dichte die Beta-2-Adrenorezeptoren exprimieren (Schallreuther et al. "Production of catecholaxnines in the human epidermis", Biochem & Biophys Res Commun 189 : 72-78 (1992)). Diese Enzyme sind beteiligt am Prozeß der Biosynthese der Katecholamine, insbesondere die Phenylethanolamin- N-Methyltransferase und die Tyrosinhydroxylase in Abhängigkeit von Biopterin. Im Gegensatz dazu wird diese enzymatische Aktivität in den Melanozyten und den Fibroblasten nicht gefunden. Folglich kann diese enzymatische Aktivität und/oder die Expression der Rezeptoren die Fähigkeit des Adrenalins, die Proliferation von Keratinozyten zu modulieren, erklären.
  • Es wird von den hiesigen Erfindern die Hypothese aufgestellt; daß das NR-3 Medium die Isolierung und die Etablierung der Kulturen von primären Zellen und von Zell-Linien verbessert, denn es hemmt die zelluläre Differenzierung, was zu einer Anreicherung von Zellen führt, die ihre Fähigkeit zur Differenzierung und der Expression von Proteinen und Enzymen, die von normalen differenzierten Keratinozyten und Melanozyten exprimiert werden, beibehalten.
  • Insbesondere wird davon ausgegangen, daß das Wachstum der Keratinozyten und Melanozyten in einem Medium, das Serum enthält, die Differenzierung in der ersten Passage fördert. Allerdings ist dies nachteiling (während der initialen Zellkulturzeit) denn die differenzierten Zellen teilen sich nicht auf passende Weise. Dies führt deshalb zu einem übermäßigen Wachstum und einer Auslese von proliferierenden Hautzellen, die lediglich eine verminderte Fähigkeit zur Differenzierung besitzen. Folglich ist die Zahl der Zellen, die eine stark ausgesprägte Fähigkeit zur Differenzierung besitzen, vermindert, wenn vor der Immortalisierung Serum dem Medium zugegeben wird.
  • Im Gegensatz dazu werden erfindungsgemäß Keratinozyten und Melanozyten in einem serumfreien Medium und unter Bedingungen gezüchtet, die die Differenzierung der Melanozyten und Keratinozyten hemmen. Erfindungsgemäß wird ein serumfreies Medium vorzugsweise während der gesamten Zellkulturzeit verwendet, und zwar vor und nach der Immortalisierung, sowie während der Proliferation und der Differenzierung.
  • Auf die beschriebene Weise hemmt das erfindungsgemäße serumfreie NR-3 Kulturmedium die Differenzierung der Keratinozyten und erlaubt somit eine verbesserte Isolierung von primären Keratinozytenkulturen und von immortalisierten Zell-Linien, die davon isoliert sind. Zudem enthält dieses serumfreie Medium geringe Kalziumkonzentrationen, was auf selektive Weise das Wachstum der mitisolierten Fibroblasten hemmt. Es resultiert daraus ein hochselektives Wachstumsmedium, das die Herstellung von Kulturen bevorzugt, die überwiegend Melanozyten und Keratinozyten enthalten. Folglich ist das erfindungsgemäße serumfreie NR-3 Medium vorteilhaft, denn es hemmt die Differenzierung von Keratinozyten und es hemmt ebenfalls das Wachstum von Fibroblasten.
  • Auf die beschriebene Weise wird vorzugsweise im erfindungsgemäßen NR-3 Medium eine Zellsuspension gezüchtet, die aus einer einzigen Hautgewebeprobe, die dissozijerte Melanozyten, Keratinozyten und Fibroblasten enthält, gewonnen wurde. Diese Kultur wird so durchgeführt, daß diese Zellen ausgesät werden in Kulturflaschen, die auf dauerhafte Weise mit einer Mischung beschichtet sind, die die Fixierung dieser Zellen erleichtert.
  • Vorzugsweise enthält diese Beschichtung eine Mischung aus Fibronektin, bovinem Serumalbumin und Typ I Kollagen. Diese Beschichtung oder "Cocktail"-Beschichtung ist im Stand der Technik beschrieben worden für Bronchialepithelzellen (Lechner et al., J. Tissue Cult. Meth. 9 : 43-48 (1985)). Dieser Cocktail steigert auch die Fixierung der Keratinozyten und Melanozyten an die Kulturflaschen aus Kunststoff. Zudem ist auf überraschende Weise gefunden worden, daß besagte Beschichtung der Kulturplatten, die für die Kultur der primären Keratinozyten und der immortalisierten Keratinozyten verwendet werden, zusätzlich das Wachstum der Zellen verbessert. Die Dauerbeschichtung der Kulturplatten ist zuvor nicht für immortalisierte Keratinozyten oder Melanozyten beschrieben worden.
  • Während der laufenden Kultur werden die Kulturen der primären Zellen vorzugsweise geteilt, wenn sie die Konfluenz erreichen oder so gut wie erreichen, anschließend werden sie in anderen, beschichteten Kulturflaschen vermehrt. Üblicherweise werden die Zellkulturen ungefähr alle 10 bis 14 Tage geteilt.
  • Nach der in den beschriebenen beschichteten Kulturflaschen erfolgten Kultur und Vermehrung der primären Melanozyten und/oder Keratinozyten in einem serumfreien NR-3 Medium bis zu den gewünschten Zellzahlen, werden diese Zelle immortalisiert. Vorzugsweise werden die Melanozyten und Keratinozyten, die das beste Wachstum zeigen, immortalisiert. Als eine Variation können allerdings die primären, vermehrten Melanozyten oder Keratinozyten vor der Immortalisierung verwendet werden, beispielsweise zwecks Analysen, als Hauttransplantat oder zur Gentherapie.
  • Die Immortalisierung der Melanozyten und Keratinozyten kann durchgeführt werden mit einem Vektor, der die Expression des T-Antigens von SV40 oder die Expression des E61E7 Gens des Humanpapillomvirus 16 (HPV 16) erlaubt. Vorzugsweise wird die Immortalisierung über eine Infektion der Melanozyten oder Keratinozyten mit Hilfe eines retroviralen Zusammensetzungsprodukts durchgeführt, das die Expression des T-Antigens von SV40 oder des E61E7 Gens von HPV16 auslöst.
  • Die zelluläre Infektion mit dem T-Ag ist erreicht worden, indem das Protokoll von Pfeiffer et al. Meth Cell Sci, 17 : 83-89, 1995 befolgt wurde (abgesehen davon, daß das Virus nach der Kapsidbildung in einer im DMEM-Medium mit 10% foetalem bovinem Serum wachsenden Zell-Linie gewonnen wurde). Während der Infektion kann ein serumhaltiges Medium verwendet werden. Allerdings bevorzugt man ein serumfreies Medium für die Melanozyten und die Keratinozyten, wobei dieses Medium vorzugsweise aus dem PC-1 Medium; das im Artikel von Pfeiffer et al, Meth Cell Sci, 17 : 83-89, 1995 beschrieben wird, das, um ein Beispiel zu nennen, in der hiesigen Beschreibung zitiert wird. Vorzugsweise wird die Immortalisierung so durchgeführt, daß das retrovirale Zusammensetzungsprodukt, das die Bezeichung pLXSHD+SV40 (#328) trägt, in der Abb. 2a dargestellt und von Pfeiffer et al und von Stockshlaeder et al. (Geneßank, Accession # M64753) beschrieben wird, verwendet wird oder das retrovirale Zusammensetzungsprodukt mit dem Namen pLXSHD+E61E7, das in der Abb. 2b dargestellt und von Dürst et al. 1987, Oncogene 1, 251-256 beschrieben wird.
  • Nach der Immortalisierung werden die immortalisierten Zell-Linien in ein Proliferationsmedium überführt, das vorzugsweise aus dem NR-2 oder NR-3 oder M2 (für Melanozyten) Medium besteht, indem Kulturflaschen, die zuvor beschichtet worden sind, verwendet werden. Nach der Proliferation der Zellen bis zu den gewünschten Zellzahlen werden die Zellen überführt in ein Differenzierungsmedium, das geeignet ist für die Kultur von normalen und immortalisierten Keratinozyten. Vorzugsweise umfaßt dieses Medium ein NR-2 oder modifiziertes MCDB mit hohem Kalziumgehalt (1,5 mM) oder M2 (für die Melanozyten) Medium enthält, wobei Kulturplatten verwendet werden, die zuvor beschichtet worden sind (die gleiche Beschichtung mit SAB, Typ I Kollagen und Fibronektin).
  • Auf die vorgenannte Weise zeigen die erfindungsgemäßen differenzierten, immortalisierten Keratinozyten- und Melanozyten-Zell-Linien verbesserte Eigenschaften, die diese Zell-Linien vollkommen geeignet machen für eine Verwendung in den Analysen, die differenzierte menschliche Hautzellen benötigen. Insbesondere hat sich gezeigt, daß diese Zell-Linien für normale differenzierte Melanozyten und Keratinozyten charakteristische Proteine exprimieren, und dies auch nach einer großen Anzahl von Passagen.
  • Beispielsweise wenn erfindungsgemäße immortalisierte Keratinozyten nach dem Western Blot-Verfahren und über die DNA-Polymerase-Kettenreaktion bei Zimmertemperatur analysiert werden, besitzen sie ein Zytochrom p450 (CYP450) Profil, das ähnlich, wenn nicht identisch, ist mit dem von normalen Keratinozyten. Genauer gesagt exprimieren die produzierten erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten CYP450 1A1, 2C, 2E1 und 3A5, aber nicht CYP450 1A2, 2A6 2B6 und 2D6, was charakteristisch ist für das Zytochrom 450-Profil normaler Keratinozyten ist. Ein derartiges metabolisches Profil ist zuvor für immortalisierte Keratinozyten nicht beschrieben worden. In der Tat ist dies das erste Mal, daß gezeigt werden konnte, daß normale und immortalisierte Keratinozyten das CYP450 3A5 und nicht das CYP450 3A4 exprimieren. Zudem ist festzustellen, daß die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten bei ihrer Analyse mittels spezifischer Antikörper gegen Differenzierungsmarker, selbst nach einer großen Zahl von Passagen andere Differenzierungsproteine exprimieren. Insbesondere exprimieren die erfindungsgemäßen Zell- Linien die Differenzierungproteine K1/10, das Keratin K14, das Involucrin, das Filaggrin und das Loricrin selbst nach einer großen Zahl von Passagen, d. h. nach einer Zahl gleich oder weit über 10 Passagen.
  • Die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten und Melanozyten absorbieren auch exogene essentielle Fettsäuren und zeigen eine Desaturation und eine Kettenverlängerung der essentiellen Fettsäuren, die in völliger Übereinstimmung mit den Vorgängen in normalen Melanozyten und Keratinozyten ist.
  • Zudem exprimieren auf die weiter unten ausführlich beschriebene Weise die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten, wenn sie mit Phorbolestern behandelt werden, den TNFα und den Entzündungsbotenstoff Typ I Kollagenase, vergleichbar den normalen Keratinozyten. Außerdem exprimieren die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten die Superoxiddismutase, die ein Enzym ist, das ähnlich dem Geschehen in normalen differenzierten Keratinozyten an der zellulären Oxidation beteiligt ist.
  • Darüber hinaus zeigen die erfindungsgemäßen immortalisierten Melanozyten nach Behandlung mit Induktoren der Melanogenese (beispielsweise Theophyllin und Tyrosin) und Inhibitoren der Melanogenese (Kojisäure), eine Reaktion, die der normaler Melanozyten ähnlich ist.
  • Unter Berücksichtigung dieser Eigenschaften sind die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten und Melanozyten vollkommen geeignet für immunologische, pharmakologische, photo- und chemotoxikologische Untersuchungen von Hautreaktionen.
  • So können beispielsweise die erfindungsgemäßen immortalisierten Keratinozyten- und Melanozyten-Zell-Linien für Analysen verwendet werden, die differenzierte Hautzellen benötigen, beispielsweise für Studien zur Barrierefunktion (Keratinisation) eines rekonstruierten Hautgewebes, für Untersuchungen des Stoffwechsels von differenzierten Keratinozyten (Fettsäurestoffwechsel, antioxidativer Stoffwechsel), für Untersuchungen zu den Auswirkungen der UV-Strahlung auf Hautzellen, für Untersuchungen, die die reizenden und sensibilierenden Effekte von Substanzen auf die Hautzellen betreffen, für Analysen, die die Wirkung von Substanzen auf die Melaninproduktiori messen, für Untersuchungen des Fettstoffwechsels, für eine topische Behandlung mit xenobiotischen Mitteln (beispielsweise mit kosmetischen Ölen; indem die eventuell schützenden Substanzen, beispielsweise Lichtschutzsubstanzen, ausgelesen werden), für Untersuchungen des Entzündungsvorgangs und der Hautirritation, etc.
  • Zudem sind die erfindungsgemäßen immortalisierten Linien von Keratinozyten und Melanozyten und die erfindungsgemäßen primären Melanozyten und Keratinozyten nützlich, um potentielle antineoplastische Substanzen auszuwählen und potentielle Mittel zur Behandlung von Hauterkrankungen. Dies beinhaltet üblicherweise, daß man derartige Substanzen in Kontakt bringt mit der Zell-Linie oder den Primärzellen während einer gewissen Zeit und dabei bestimmt, ob eventuell ungünstige Wirkungen induziert werden, beispielsweise Genotoxizität, die Bildung eines DNA-Addukts, eine Mutagenizität, eine zelluläre Transformation oder eine Zytotoxizität.
  • Zudem sind die erfindungsgemäßen Melanozyten- und Keratinozyten-Linien geeignet dazu, rekombinante Protein zu exprimieren, beispielsweise menschliche Proteine und Polypeptide, sowie RNA und DNA zu produzieren.
  • Darüber hinaus haben die erfindungsgemäßen Zell-Linien einen potentiellen Nutzen für die ex vivo Gentherapie. Die erfindungsgemäßen Zell-Linien dürften ein nützliches Werkzeug sein, um eine genetische Zielscheibe anzugehen und genetisch veränderte Zellen zu entwickeln, die die gewünschten Genprodukte exprimieren, beispielsweise für eine therapeutische Anwendung, für Untersuchungen der zellulären Toxizität/Mutagenität. Angesichts der Tatsache, daß die erfindungsgemäßen Zell-Linien normale Hautzellen besonders gut nachahmen, sollten sie außerdem ganz geeignet sein für Untersuchungen der Biosensibilität.
  • Zudem können die erfindungsgemäßen primären Keratinozyten und Melanozyten angesichts der Tatsache, daß sie in Abwesenheit von Serum hergestellt wurden, für die Gentherapie nützlich sein. Im Grunde dürften diese Zellen, da sie nicht dem Serum ausgesetzt wurden, beispielsweise dem bovinen Serum oder dem Serum eines anderen Tieres (abgesehen von einer viralen Infektion oder einer Lagerung in flüssigem Stickstoff), weniger empfindlich sein gegenüber einer potentiellen Kontamination durch Viren oder durch andere pathogene Erreger. Folglich dürfte dies das Risiko einer Übertragung von pathogenen oder infektiösen Faktoren durch diese Zellen im Verlaufe einer Gentherapie auf ein Minimum reduzieren. Eine derartige ex vivo Gentherapie bietet eine Möglichkeit an, um derartige Erkrankungen zu behandeln, wie beispielsweise die bullöse Epidermolyse (eine Erkrankung, die auf einer Mutation des Keratins beruht), die Vitiligo (eine Erkrankung, die die Gene für die Synthese des Melanins betrifft), Karzinome und Melanome, allergische Erkrankungen und Störungen im Zusammenhang mit entzündlichen Vorgängen. Was die therapeutische Behandlung angeht, besteht die einzige potentielle Kontaminationsquelle in dem bovinen Hypophysenextrakt, dem bovinen Insulin, dem bovinen Kollagen, dem bovinen Serum-Albumin oder dem humanen Fibronektin und dem humanen Transferrin.
  • Außerdem haben die immortalisierten Melanozyten- und Keratinozyten-Linien der vorliegenden Erfindung und die primären Melanozyten und Keratinozyten eine Nützlichkeit bei den Untersuchungen zur DNA-Mutagenese, den Tests zur Selektion von mutagenen Mitteln an der Haut, den Tests zur Identifikation von Mitteln, die Chromosomen verändern, Untersuchungen zur malignen Transformation, Studien der zellulären Biochemie (beispielsweise Tests der Aktivierung von CYP450), der Selektion von Substanzen und Zusammensetzungen, beispielsweise Cocktails von essentiellen Fettsäuren, die an allergischen Reaktionen und an Entzündungsreaktionen beteiligt sind, Studien zur Aktivierung der Kollagenase (im Zusammenhang mit der Entzündung), an der TNFα beteiligt ist, und bei der Detektion von Interleukin.
  • Eine potentielle, wichtige Anwendung der erfindungsgemäßen primären Keratinozyten oder Melanozyten betrifft, angesichts ihrer Verfügbarkeit und ihres Herstellungsverfahrens, die Hauttransplantate. Diese primären Keratinozyten und Melanozyten dürften, da sie in Abwesenheit von Serum hergestellt wurden, ein minimales Risiko der Kontamination mit pathogenen Erregern (beispielsweise Viren) und infektiösen Erregern aufweisen. Da die erfindungsgemäßen Melanozyten und Keratinozyten von einem autologen Wirt abgeleitet werden könnten, d. h. einem Patienten mit einer wesentlichen Verletzung, dürfte dies außerdem auf ein Minimum das Risiko reduzieren, daß das Hauttransplantat abgestoßen wird bzw. das Risiko einer unglücklichen immunologischen Reaktion und zudem dürfte dies das Infektionsrisiko auf ein Minimum absenken.
  • Beispiele für erfindungsgemäße spezifische immortalisierte Keratinozyten-Linien sind die Linien FK2-NR, DK2-NR und DK3-NR, die am 5. Oktober 1995 bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, deren Adresse lautet: Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, deponiert worden sind und denen die Depotnummern DSM ACC2240, DSM ACC2238 und DSM ACC2239 zugewiesen wurden. Ein weiteres Beispiel für eine erfindungsgemäße Melanozyten-Linie ist die Linie DM2-NR, die am 11. Dezember 1996 beim Institut Pasteur, dessen Adresse lautet: 25 rue de Docteur Roux, 75724 Paris, Frankreich; deponiert wurde und der die Depot-Nr. CNCM I-1796 zugewiesen wurde. Diese Depots wurden gemäß dem Budapester Vertrag durchgeführt. Alle Beschränkungen bezüglich die Verfügbarkeit dieser Zell-Linien werden unwiderruflich aufgehoben werden, sobald das Patent bezüglich der vorliegenden Anmeldung erlassen wird oder einer anderen Anmeldung, die das Vorrecht der Priorität auf diese Anmeldung beansprucht.
  • Andere erfindungsgemäße Kennzeichen werden im Laufe der folgenden Beschreibungen von Ausführungsbeispielen erscheinen, die zum Zwecke der Veranschaulichung erfindungsgemäß geliefert werden und die nicht einschränkend gemeint sind.
    • BEISPIEL 1: Charakerisierung der verwendeten Hautzellen
  • Die Tabelle 1 benennt alle Hautgewebeproben, die mittels viraler Infektion behandelt wurden. Die isolierten Keratinozyten, die das beste Wachstum zeigen, wurde für die Immortalisierung benutzt. TABELLE 1 Hautgewebe, die für die Isolierung von Zellen im NR-3 Medium verwendet wurden
  • ¹ Verfahren: die Zellen wurden in eine Trypsin/EDTA-Lösung (0,05%/0,01%) aufgenommen und mittels eines Hemozytometers gezählt, wobei die Ergebnisse den Mittelwert dreier Zählungen darstellen.
  • Menschliche Fibroblasten wurden aus den Hautgewebeproben FKO-NR, GKO-NR, DKO-NR isoliert. Nach der Trennung des dermalen Kompartiments und des epidermalen Kompartiments, wurde die Dermis in kleine Fragmente von 0,2 · 0,2 mm geschnitten und auf einer Kulturplatte von 6 cm mit Serum fixiert. Dulbeccos minimales essentielles Medium (DMEM, 10% fetales Kälberserum) wurde nach 2 bis 4 Studen hinzugegeben. Diese Explant- Kultur wurde anschließend inkubiert, bis ein übermäßiges Wachstum von Fibroblasten beobachtet werden konnte. Die konfluenten Fibroblast-Kulturen wurden geteilt and vermehrt, um eingefrorene Reservekulturen zu erhalten.
    • BEISPIEL 2:
  • 1) Charakterisierung des Keratinozytenwachstums: die Kulturen der primären Zellen wurden in dem modifizierten MCDB 153 Medium (Boyce et al., J. Tissue Cult Meth 9 : 83-93 (1985); and Pittlekow et al., J. Invest. Dermatol. 86 : 410-417, 1986) und im NR-3 Medium gezüchtet. Das beste Zellwachstum wurde im NR-3 Medium beobachtet (Abb. 1). Ein gegenüber dem modifizierten MCDB 153 Medium, dem das bovine Hypophysenextrakt fehlt,. verbessertes Zellwachstum wurde ebenfalls im gänzlich definierten NR-3 Medium (NR-3 Medium ohne bovines Hypophysenextrakt) beobachtet.
  • Abb. 1 zeigt das Zellwachstum im NR-3 Medium und im modifizierten MCDB 153 Medium, dem Adrenalin hinzugesetzt wurde (Wachstumsmedium für Keratinozyten), nach 6 Tagen. Das modifizierte MCDB 153 Medium besteht aus dem modifizierten MCDB 153 Medium (Boyce et al., J. Tissue Cult Meth 9 : 83-93 (1985); and Pittlekow et al., J. Invest. Dermatol. 86 : 410-417, 1986). Die Keratinozyten wurden in eine Trypsin/EDTA-Lösung (0,05%10,01%) aufgenommen und mittels eines Hemozytometers gezählt. Die in der Abb. 1 gezeigten Ergebnisse stellen den Mittelwert dreier Zählungen dar.
  • 2) Wirkung der Beschichtung der Kulturplatten auf das Wachstum und Adhärenz der Keratinozyten: es ist festgestellt worden, daß die Beschichtung der Platten die Fixierung der Zellen und das Zellwachstum normaler Keratinozyten verbessert. Genauer gesagt, vergleichen die in der Tabelle 2 vorgestellten Ergebnisse das Wachstum der Keratinozyten auf beschichteten Kulturplatten und auf nicht beschichteten Kulturplatten. 100.000 Keratinozyten wurden für das Aussäen auf Platten von 3,5 cm, die das Medium NR-3 enthielten, verwendet. TABELLE 2 Auswirkung der Oberflächenbeschichtung auf die Fixierung der Zellen
  • ¹ Anzahl der fixierten Zellen geteilt durch die Anzahl der ausgesäten Zellen. Die fixierten Zellen wurden in eine Trypsin/EDTA-Lösung (0,05%/0,01%) aufgenommen und mittels eines Hemozytometers gezählt.
  • ² Die Keratinozyten wurden in eine Trypsin/EDTA-Lösung (0,05%/0,01%) aufgenommen und mittels eines Hemozytometers gezählt. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert dreier Zählungen dar.
    • BEISPIEL 3:
  • 1) Immortalisierung der Keratinozyten: eine Zellsuspension, die ausgehend von den im Beispiel 1 beschriebenen Hautgewebeproben hergestellt wurde, die dissoziierte Melanozyten, Keratinozyten und Fibroblasten enthält, wird in einem NR-3 Medium gezüchtet (siehe weiter unten). Diese Kultur wird durchgeführt, indem diese Zellen in Kulturflaschen ausgesät werden, die auf kontinuierliche Weise mit einer "Cocktail"-Beschichtung versehen wurden, die zuvor für Bronchialzellen beschrieben wurde (Lechner et al., J. Tissue Cult. Meth. 9 : 43-48 (1985)). Nachdem eine nahezu vollständige Konfluenz erreicht wird, d. h. eine Konfluenz von ca. 90%, welche üblicherweise nach einer Zeit von ca. 10 bis 14 Tagen sich einstellt, werden die Keratinozyten und Melanozyten voneinander getrennt. Zu diesem Zweck wird die Kultur mit einer Trypsin/EDTA-Lösung (0,05%/0,01%) für 5 Minuten behandelt und anschließend werden diejenigen Melanozyten geerntet, die sich als erste von den Keratinozyten getrennt haben. Die primären Keratinozyten werden anschließend mittels der beschriebenen, beschichteten Kulturflaschen im serumfreien NR-3 Medium bis zu den gewünschten Zellzahlen gezüchtet (das NR-3 Medium begünstigt das Wachstum der Keratinozyten im Vergleich zu den Melanzyten) und anschließend werden die Zellen mittels des Vektors pLXSHD+SV40 (#328) gemäß des Protokolls von Pfeiffer et al. Meth Cell Sci, 17 : 83-89 (mit der Ausnahme, daß das Virus nach der Kapsidbildung in einer Zell-Linie gewonnen wurde; die im Medium DMEM mit 10% bovinem fetalem Serum wächst) immortalisiert. Während der Infektion, wird das serumfreie PC-1 Medium, welches im Artikel von Pfeiffer et al., Meth. Cell. Sci., 14, 83-89 (1995) beschrieben wurde, verwendet. Nach der Immortalisierung werden die immortalisierten Keratinozyten in das Proliferationsmedium NR-2 oder NR-3 transferiert, wobei die zuvor beschichteten Kulturflaschen benutzt werden. Nach der Proliferation der Zellen bis zu den gewünschten Zellzahlen, werden die Zellen in ein Differenzierungsmedium übergeführt, das für die Kultur normaler und immortalisierter Keratinozyten geeignet ist (NR-2).
  • 2) Wachstum der immortalisierten Keratinozvten nach einer großen Anzahl von Passagen: es ist gezeigt worden, daß immortalisierte Keratinozyten bei höheren Passagezahlen ein verbessertes Zellwachstum zeigen. Darauf weist die untenstehende Tabelle 3 hin. Dies ist nachgewiesen worden, indem die Populationsverdopplungszeit (PVZ: die Zeit, die für eine Verdoppelung der Population während der logarithmischen Wachstumsphase erforderlich ist) bestimmt wurde. Verfahren: Die Keratinozyten wurden in eine Trypsin/EDTA-Lösung (0,05%/0,01%) aufgenommen und mittels eines Hemozytometers gezählt, wobei die Ergebnisse den Mittelwert dreier Zählungen darstellen. TABELLE 3 Populationsverdopplungszeit (PVZ) der im Medium NR-3 gezüchteten Keratinozyten- Zell-Linien
  • *Krise: Zellwachstum bei niedriger Proliferationsrate.
  • 3) Zytochrom p450 (CYP450)-Expression in den immortalisierten, humanen Keratinozyten-Linien: die Expression von CYP450 1A1, 1A2, 3A5, 2E1, 2B6, 2A6 and 2D6 wurde in den Hautzellen bestehend aus normalen und immortalisierten Keratinozyten mittels Western Blots (Protein-Expression) und mittels DNA-Polymerase-Kettenreaktion bei Raumtemperatur (Expression von mRNAs, vgl. Tabelle 4) untersucht. Das CYP450, das in den immortalisierten Keratinozyten exprimiert wird, ist ähnlich dem normaler Keratinozyten. Die Expressionsrate ist leicht vermindert. Die Linie DK2-NR zeigt dennoch eine quasi normale Expressionsrate von CYP450. Verfahren: RT-PCR (Polymerase-Kettenreaktion mittels einer Polymerase/inversen Transkriptase) mit Primern, die spezifisch sind für CYP450. TABELLE 4 Expression von mRNAs von CYP in humanen Keratinozyten
  • *Die mRNA 1A1-Expression in den immortalisierten Zell-Linien war nach Induktion mit Benzpyren (1,5 mM; Amersham Inc.) erhöht. Der Anstieg war vergleichbar dem normaler Zellen.
  • **2C17/19 und 2C18
  • 4) Reaktion auf CYP450-Induktoren: Die Zell-Linien reagieren auf den CYP450-Induktor bestehend aus Benzpyren ähnlich den nicht immortalisierten Zellen selbst nach einer großen Anzahl von Passagen (vgl. Tabelle 5). Diese Induktion ist für mit dem T Ag immortalisierte Keratinozyten nicht beschrieben. TABELLE 5 Aktivität der 7-Ethoxyresorufin-O-desethylase (EROD; Sigma Inc.) in humanen Keratinozyten nach Induktion mit Benzpyren (B(a)P)*
  • *Keratinozyten wurden für 24 Stunden mit Benzpyren (1,5 mM) inkubiert. Die EROD Aktivität wurde nach einer Inkubation bei 37ºC mit Hilfe der Fluoreszenz eines Produkts bestehend aus Resorufin (Anregung bei 560 nm, Emission bei 586 nm) gemessen.
  • 5) Zelldifferenzierung: Die Differenzierungsmarker konnten mittels spezifischer Antikörper untersucht werden. Die verwendeten spezifischen Antikörper sind in der Tabelle 6 angegeben. Die ausgeprägteste Fähigkeit zur Differenzierung konnte für die Klone DK2-NR und DK1-NR (Tabellen 7,8) nachgewiesen werden. TABELLE 6 Antikörper, die für die Detektion der für Keratinozyten spezifischen Proteine verwendet wurden TABELLE 7 Detektion des T-Ag Proteins und von Differenzierungsprodukten epidermaler Keratinozyten TABELLE 8 Detektion der Keratine (K) in Keratinozyten
  • Verfahren (Tabellen 7 und 8): Auf Zählkammer-Deckgläsern gezüchtete Keratinozyten wurden nach der Fixierung in reinem Methanol mittels den in der Tabelle 6 angegebenen Antikörpern gefärbt.
  • +++: höchste Proteinkonzentration, mittels eines Fluoreszenzmikrokops quantifiziert.
  • - : keine Proteinexpression.
  • 6) Expression der Glutathion-S-Transferase durch immortalisierte Keratinozyten: Das Enzym der Phase II bestehend aus der Glutathion-S-Transferase (GST) wurde mittels der Western Blot- and Northern Blot-Verfahren untersucht. Alle Keratinozyten-Linien exprimieren in hohem Maße die RNAs für GSTα, GSTu und GSTπ. Das Expressionsprofil für GSTα, GSTu and GSTπ in den Zell-Linien ist ähnlich dem normaler Keratinozyten (Tabelle 9: Verfahren: Western Blot). TABELLE 9 Expression des GST-Proteins
  • 7) Stoffwechsel essentieller Fettsäuren: Um die Desaturierung und Verlängerung der essentiellen Fettsäuren, die den Keratinozyten zugegeben wurden, zu untersuchen und zu vergleichen, wurden immortalisierte Keratinozyten (DK1-NR, FK2-NR) und normale Keratinozyten mit Linolsäure (LA, 15 uM) und mit Linolensäure (LN, 15 uM) behandelt. Für diese Experimente wurde das NR-2 Medium (Biofluids Inc.) verwendet, in dem die essentiellen Fettsäuren fehlen. Die Zellkulturen wurden nach Erreichen der Konfluenz behandelt und wurden passagiert vom Medium in ein NR-2 Medium mit hohem Kalziumgehalt (1,5 mM). Die Zellen wurden 4 Tage lang mit den essentiellen Fettsäuren (nach 2 Tagen erneuert) behandelt.
  • Die Untersuchung der essentiellen Fettsäuren ist mittels Extraktion und Separation der Phospholipide mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie und Quantifizierung der Methylster der Fettsäuren mittels Flüssiggaschromatographie durchgeführt worden. Die Entstehung der Desaturierung und der Elongationsprodukte von LA (20 : 4n-6 and 22 : 4n-6) and of LN (20 : 5n- 3, 22 : 5n-3 and 22 : 6n-3) konnte nachgewiesen werden. Dieses metabolische Profil war vereinbar mit demjenigen Profil, welches man bei normalen Keratinozyten beobachtet hat.
  • 8) Bestimmung des Karyotyps: Alle Zell-Linien waren hypodiploid, wobei die Mehrheit der Chromosomenzählungen (mit Ausnahme von DK2-NR, wo die Chromosomenzählungen im Bereich hypotetraploider Zellen lag) im Bereich diploider Zellen angesiedelt war. Andere Zellen als die der untersuchten Zell-Linien sind nicht festgestellt worden. Dieses Ergebnis bestätigt die Einheitlichkeit der Zell-Linien und das Fehlen von Zellkontaminationen aus anderen Quellen.
  • 9) In vivo-Charakterisierung: Die Tumorigenität der immortalisierten Keratinozyten ist über subkutane Injektionen (1-2 Millionen Keratinozyten) in Nacktmäusen ermittelt worden. Die getesteten Keratinozyten-Linien DK2-NR, DK3-NRS, FK2-NR waren nicht tumorigen bei den Nacktmäusen (4 Monate Inkubation). DK3-NR erwies sich allerdings als schwach tumorigen in 6 von 10 Tieren nach 5 Monaten Inkubation.
  • 10) Reaktion auf Hautreize: Die auf die Behandlung mit Hautreizen bestehend aus PMA (12-Myristate-13-Phorbol-Azetat), SDS (Natriumdodecylsulfat), DMSO (Dimethylsulfoxid), IL-1 β (Interleukin 1 beta) and UV-B (ultraviolette Strahlen B) folgende Induktion des "Stress-Gens" TNFα (Tumor Nekrose Faktor alpha) wurde mittels des Northern Blot Verfahrens biologischer Assays untersucht (Tabelle 10). Die Zell-Linien DK1-NR and DK2-NR reagieren auf PMA und auf UV-B und exprimieren das TNFα-Protein selbst nach einer großen Anzahl von Passagen.
  • Nach der Behandlung der immortalisierten Keratinozyten mit Phorbolestern (PMA) ist ein Anstieg der Expression der (Typ I) Kollagenase beobachtet worden. TABELLE 10 Sekretion von TNFα in den Keratinozyten nach Induktion mit Hautreizen Aktivitätsmessung: ³H-Thymidin-Einbau in Zellen, die auf TNFα ansprechen*.
  • nt: nicht getestet
  • *: Reagierende Zellen: Maus-Fibrosarkom-Zell-Linie WEHI 164, Klon 1.14 (ATCC)
  • 11) Organotypische Kulturen: Die Kultur humaner Keratinozyten unter organotypischen Bedingungen (Keratinozytenkultur mit Luftexposition auf einem Kollagengel in Anwesenheit von Nährzellen) wurde ebenfalls durchgeführt. Alle Keratinozyten-Linien haben im Vergleich zu normalen Keratinozyten eine hyperproliferative Morphologie gezeigt. Diese Untersuchungen wurden in einem serumhaltigen Medium durchgeführt. Das hyperproliferative Wachstum der Zellen ist unter serumfreien Bedingungen (NR-2 mit einem erhöhten Kalziumgehalt (1, 5 mM) in Kunststoff-Kulturflaschen ohne Kollagen und ohne Nährzellen) vermindert.
    • BEISPIEL 4:
  • 1) Immortalisierung von Melanozen: eine Zellsuspension, die ausgehend von den im Beispiel 1 beschriebenen Hautgewebeproben hergestellt wurde, die dissoziierte Melanozyten, Keratinozyten und Fibroblasten enthält, wird in einem NR-3 Medium gezüchtet (siehe weiter unten). Diese Kultur wird durchgeführt, indem diese Zellen in Kulturflaschen ausgesät werden, die auf kontinuierliche Weise mit einer "Cocktail"-Beschichtung versehen wurden, die zuvor für Bronchialzellen beschrieben wurde (Lechner et al., J. Tissue Cult. Meth. 9 : 43-48 (1985)). Nachdem eine nahezu vollständige Konfluenz erreicht wird, d. h. eine Konfluenz von ca. 90%, welche üblicherweise nach einer Zeit von ca. 10 bis 14 Tagen sich einstellt, werden die Keratinozyten und Melanozyten voneinander getrennt. Zu diesem Zweck wird die Kultur mit einer Trypsin/EDTA-Lösung (0,05%/0,01%) 5 Minuten lang behandelt und anschließend werden diejenigen Melanozyten geerntet, die sich als erste von den Keratinozyten getrennt haben. Die primären Melanozyten werden anschließend mittels der beschriebenen, beschichteten Kulturflaschen im serumfreien NR-4 Medium bis zu den gewünschten Zellzahlen gezüchtet (das NR-4 Medium begünstigt das Wachstum der Keratinozyten im Vergleich zu den Melanzyten) und anschließend werden die Zellen mittels des Vektors pLXSHD+5V40 (#328) gemäß des Protokolls von Pfeiffer et al. Meth Cell Sci, 17 : 83-89 (mit der Ausnahme, daß das Virus nach der Kapsidbildung in einer Zell-Linie gewonnen wurde, die im Medium DMEM mit 10% bovinem fetalem Serum wächst) immortalisiert. Während der Infektion, wird das serumfreie PC-1 Medium, das im Artikel von Pfeiffer et al., Meth. Cell. Sci., 14, 83-89 (1995) beschrieben ist, verwendet. Nach der Immortalisierung werden die immortalisierten Melanozyten in das Proliferations- und Differenzierungsmedium M2 transferiert, wobei die zuvor beschichteten Kulturflaschen benutzt werden. (M2 = DMEM/F12 Medium zu beziehen von Biofluids, No148 und von Olssen Inc. Uppsala, Sweden).
  • 2) Charakterisierung menschlicher Melanozyten, die das T-Antigen exprimieren: Die Expression von Proteinen, die mit dem Melanin assoziiert sind, durch erfindungsgemäße immortalisierte Melanozyten (insbesondere die Linie DM2-NR) ist mit der normaler Melanozyten verglichen worden. Es wurde gezeigt, daß die immortalisierten Zellen Melaninassoziierte Proteine, ein Melanom-assoziiertes Antigen (AAM) und HMB45 exprimieren, und zwar auf eine Weise, die der normaler Zellen ähnlich ist, wenn auch in geringerem Ausmaß.
  • 3) Induktion der Melaninsynthese: Die Melanogenese der Melanozyten-Linien, die das T Ag exprimieren (und zwar die LinieDM2-NR), ist mit der normaler Melanozyten verglichen worden. Die Melanozyten wurden mit Melanogenese-Induktoren behandelt bestehend aus Tyrosin und Theophyllin und dem Melanogeneseinhibitor Kojisäure: Die Melanozyten- Linien, insbesondere die Linie DM2-NR, reagieren auf den Melanogenesemodulator auf eine Weise, die der normaler Zellen ähnlich ist. Es wurde weiterhin gezeigt, daß die Induktion/Inhibition der Melanogenese dosisabhängig ist.
    • BEISPIEL 5:
  • Eine Keratinozytenschicht, die vom in Beispiel 1 beschriebenen Gewebe DK0-NR abgeleitet wurde, wurde immortalisiert, so wie in Beispiel 3 beschrieben, mittels des retroviralen Konstrukts pLXSHD+E6/E7, das auf dem Humanpapillomvirus 16 (HPV 16) basiert und das in Abb. 2b beschrieben ist. Mehrere immortalisierte Keratinozyten- Linien wurden auf diese Weise ausgelesen. Die Ergebnisse der Untersuchungen dieser Linien hinsichtlich Differenzierungsprodukten (Zytokeratine, GST, TNFα; Involucrin, Filaggrin, Loricrin, Vimentin, etc.) sind ähnlich den mit den Linien DK2-NR und DK3-NR erzielten.
    • BEISPIEL 6:
  • Die Bestandteile des neuartigen erfindungsgemäßen NR-3 Mediums und einiger anderer erfindungsgemäßer serumfreier Medien, und zwar der NR-1, NR-2 and NR-4 Medien, werden weiter unten miteinander verglichen.
    • TABELLE 11 Zusammensetzung des NR-1 Mediums
  • Aminosäuren NR-1 [Milligramm/Liter]
  • L-Alanin 9,0000
  • L-Arginin, HCl 316,0000
  • Asparagin, H&sub2;O 15,0000
  • L-Asparaginsäure 4,0000
  • L-Cystein, HCl, H&sub2;O 42,0000
  • L-Glutaminsäure 14,8000
  • Glutamin 877,0000
  • Glycin 7,6000
  • L-Histidin, HCl, H&sub2;O 50,4000
  • L-Isoleucin 98,4000
  • L-Leucin 131,2000
  • L-Lysin, HCl 36,6000
  • L-Methionin 13,4000
  • L-Phenylalanin 14,9000
  • L-Prolin 34,6000
  • L-Serin 126,2000
  • L-Threonin 23,8000
  • L-Tryptophan 9,2000
  • L-Tyrosin 13,6000
  • L-Valin 70,2000
    • Anorganische Salze
  • Ammoniumvanadat [NH&sub4;VO&sub3;] 0,0006
  • Animoniummolybdat [(NH&sub4;)6Mo&sub7;O&sub2;&sub4; · 4H&sub2;O] 0,0010
  • Calciumchlorid [CaCl&sub2; · 2H&sub2;O] 16,2000
  • Kupfersulfat [CuSO&sub4; · 5H&sub2;O] 0,0025
  • Eisensulfat [FeSO&sub4; · 7H&sub2;O] 1,4000
  • Magnesiumchlorid [MgCl&sub2; · 6H&sub2;O] 122,0000
  • Manganchlorid [MnCl&sub2; · 4H&sub2;O] 0,0002
  • Nickelsulfat [NiSO&sub4; · 6H&sub2;O] 0,0003
  • Kaliumchlorid [KCl] 112,0000
  • Natriumazetat 301,5000
  • Natriumbicarbonat [NaHCO&sub3;] 1088,0000
  • Natriumchlorid [NaCl] 5200,0000
  • dibasisches Natriumphosphat [Na&sub2;HPO&sub4; · 7H&sub2;O] 536,0000
  • Natriumpyruvat 55,5000
  • Natriumselenit [Na&sub2;SeO&sub3;] 0,0050
  • Natriumsilikat [Na&sub2;SiO&sub3; · 9H&sub2;O] 0,1420
  • Zinnchlorid [SnCl&sub2; · 2H&sub2;O] 0,0001
  • Zinksulfat [ZnSO&sub4; · 7H&sub2;O] 0,5100
    • Vitamine
  • D-Biotin 0,0200
  • Kalcium D-panthotenat 0,2600
  • Cholinchlorid 28,0000
  • Cyanocobalamin (B12) 0,4100
  • Folsäure 0,7900
  • i-Inositol 18,0000
  • Nicotinamid (B3) 0,0400
  • Pyridoxin (B6 · H&sub2;O) 0,0600
  • Riboflavin (B2) 0,0400
    • Andere Bestandteile
  • Adenin 27,300
  • Epidermaler Wachstumsfaktor (Rekombinanter Humaner EGF) 0,0010
  • Ethanolamin 0,0310
  • Glukose 1080,0000
  • HEPES 6000,0000
  • Hydrocortison 0,5000
  • Insulin (Bovines) 5,0000
  • Phenolrot 1,2000
  • Phosphoethanolamin 0,0710
  • Putreszin · 2HCl 0,1600
  • Thiamin · Hcl 0,3400
  • Thioctsäure 0,2100
  • Thymidin 0,7300
  • Transferrin (Human) 10,0000
  • Osmolarität 280-285 mOsm/kg
  • 1) Zusammensetzung des NR-2 Mediums: das Medium ist identisch mit dem NR-1 Medium, außer daß es zusätzlich ein bovines Hypophysenextrakt (Biofluid Inc.) (35 mg/l) und daß es Antibiotika (Gibco BRL, Life Technologies Inc.) bestehend aus Fungizon (0,25 mg/l), Penizillin (10,000 units/l) und Streptomyzin (10 mg/l) enthält.
  • 2) Zusammensetzung des NR-3 Mediums: es umfaßt die gleichen Bestandteile wie das NR-2 Medium, außer daß es zusätzlich 250 ug/l Adrenalin (Biofluid Inc.) enthält.
  • 3) Zusammensetzung des NR-4 Mediums: es umfaßt die gleichen Bestandteile wie das NR-2 Medium, außer daß es zusätzlich ßFGF (3 ug/l) (basic fibroblast growth factor erhalten von Sigma Inc.) und Phorbol 12-Myristat-13-Azetat (PMA) (10 ug/l) (C. C. R. Inc.) enthält.

Claims (29)

1. Modifiziertes Verfahren zur Immortalisierung menschlicher Hautzellen zur Gewinnung immortalisierter Keratinozyten und Melanozyten, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
(i) Gewinnen einer menschlichen Hautgewebeprobe,
(ii) Präparieren der Hautprobe zur in vitro Kultur,
(iii) Gewinnen von Keratinozyten und/oder Melanozyten von der präparierten Hautgewebeprobe und Animpfen eines Serumfreien Wachstumsmediums mit den Keratinozyten und/oder Melanozyten auf Kulturplatten, die mit einer, Fibronectin, Typ 1-Kollagen und BSA umfassenden Beschichtung versehen sind, die die Fixierung und das Wachstum der Zellen fördert,
(iv) Ersetzen des Mediums derart, daß ein optimales konfluentes Wachstum der Zellen in Kultur erreicht wird, wobei die Beschichtung auf den Kulturplatten kontinuierlich beibehalten wird,
(v) Überführen der Keratinozyten oder Melanozyten in ein Serum-freies Medium, das für die Selektion von Keratinozyten oder Melanozyten ausgelegt ist, auf zuvor in gleichartiger Weise beschichtete Kulturplatten,
(vi) Infizieren der Keratinozyten oder Melanozyten mit einem retroviralen Konstrukt,
(vii) Überführen der so erhaltenen immortalisierten Keratinozyten oder Melanozyten in ein Serum-freies Proliferationsmedium, das für die Proliferation der immortalisierten Keratinozyten oder Melanozyten geeignet ist, auf zuvor in gleichartiger Weise beschichtete Kulturplatten, und
(viii) Überführen der so erhaltenen Keratinozyten nach erfolgter Proliferation in ein Serum-freies Differenzierungs-Medium mit hohem Calciumgehalt, auf zuvor in gleichartiger Weise beschichtete Kulturgefäße.
2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß das retrovirale Konstrukt der auf dem SV40-Virus basierende Vektor pLXSHD+SV40(#328) oder der auf dem menschlichen Papilloma-Virus 16 (HPV 16) basierende Vektor pLXSHD+E6/E7 ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß das Serum-freie Medium des Schritts (iii) das Medium NR-3 ist, das die in Tafel 11 angegebenen Verbindungen und einen Rinderhypophysen-Extrakt (35 mg/ml), Fungizone (0,25 mg/l), Penicillin (10000 Einheiten/l) und Streptomycin (10 mg/l) enthält, und mit Epinephrin (250 ug/l) ergänzt ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium des Schritts (v) das Medium NR-3 nach Anspruch 3 oder das Medium NR-4 ist, das die in Tafel 11 angegebenen Verbindungen und einen Rinderhypophysen-Extrakt (35 mg/ml), Fungizone (0,25 mg/l), Penicillin (10000 Einheiten/l) und Streptomycin (10 mg/l) enthält, und mit ßFGF (3 ug/l) und mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (10 ug/l) ergänzt ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß das Proliferations-Medium des Schritts (vii) das, die in Tafel 11 angegebenen Verbindungen und einen Rinderhypophysen- Extrakt (35 mg/ml), Fungizone (0,25 mg/l), Penicillin (10000 Einheiten/l) und Streptomycin (10 mg/l) umfassende Medium NR-2 oder das Medium NR-3 nach Anspruch 3 und das Medium M2 für die Melanozyten ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß das Differenzierungs-Medium des Schritts (viii) das Medium NR-2 oder das modifizierte Medium MCDB 153 mit einem Calciumgehalt von mindestens 1,5 mM ist.
7. Immortalisierte Zellinie menschlicher Keratinozyten oder Melanozyten, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6.
8. Immortalisierte Keratinozyten Zellinie nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie Proteine vom Keratin-Typ im wesentlichen gleich wie die normalen differenzierten Keratinozyten exprimiert.
9. Immortalisierte Keratinozyten Zellinie nach Anspruch 8, bei der die Proteine vom Keratin- Typ Keratin K1/10, Keratin K14 umfassen und die anderen Proteine Involukrin, Filaggrin und Loricrin umfassen.
10. Immortalisierte Keratinozyten Zellinie nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein CYP450-Profil aufweist, das identisch oder im wesentlichen identisch mit dem normaler differenzierter Keratinozyten ist.
11. Immortalisierte Keratinozyten Zellinie nach Anspruch 10, die CYP450, 1A1, 2C, 2EI und 3A5 exprimiert, aber CYP450, 1A2, 2A6, 2B6 und 2D6 nicht exprimiert.
12. Menschliche Hautzellinie, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Keratinozyten- Linien DK2-NR (DSM ACC2238), DK3-NR (DSM ACC2239) und FK2-NR (DSM ACC2240), und der Melanozyten-Linie DM2-NR (CNCM I-1796).
13. Immortalisierte Keratinozyten Zellinie nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine für die Glutathion-S-transferase GSTα, GST-u und GSTπ kodierende mRNA exprimiert.
14. Immortalisierte Keratinozyten Zellinie nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie bei Züchtung in organotypischer Kultur ein hochgradig schichtenartiges und polarisiertes Epithel bildet, das keratinisierte Oberflächenschichten in Abwesenheit von Serum oder Nährzellen aufweist.
15. Immortalisierte Keratinozyten Zellinie nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie bei Behandlung mit Phorbolestern die Typ I-Kollagenase und TNF-α exprimiert.
16. Immortalisierte Keratinozyten Zellinie nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie, im wesentlichen gleich wie die normalen Keratinozyten, ein Protein exprimiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Involukrin, Filaggrin und Loricrin.
17. Modifiziertes, Serum-freies Kuturmedium, das für die Isolierung und die Herstellung von menschlichen Keratinozyten und Melanozyten gemäß den Ansprüchen 1-6 geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß es enthält: Aminosäuren oder Salze von Aminosäuren; anorganische Salze, Vitamine; Adenin, Ethanolamin, Glucose, HEPES, Phenolrot, Putrescin · 2HCl, Thiamin · HCl, Thymidin, Epidermis-Wachstumsfaktor; Insulin; Hydrocortison; Phosphoethanolamin; und Rinderhypophysen-Extrakt, dadurch gekennzeichnet, daß es Thioctansäure und Transferrin in einer zum Isolieren und Herstellen menschlicher Keratinozyten oder Melanozyten gemäß den Ansprüchen 7-16 ausreichenden Menge enthält.
18. Medium nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es weiter Epinephrin enthält.
19. Medium nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Epinephrin zur Steigerung des Keratinozyten-Wachstums ausreichend ist.
20. Medium nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die im Medium vorliegenden Aminosäuren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus L-Alanin, L-Arginin · HCl, Asparagim · H&sub2;O, L-Asparaginsäure, L-Cystein-HCl · H&sub2;O, L-Glutaminsäure, Glutamin, Glycin, L-Histidim·HCl·H&sub2;O, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin·HCl, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin, L-Valin und deren Salzen.
21. Medium nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die anorganischen Salze aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Ammonium-meta-vanadat, Ammoniummolybdat, Calciumchlorid, Kupfer(II)sulfat, Eisen(II)sulfat, Magnesiumchlorid, Manganchlorid, Nickelsulfat, Kaliumchlorid, Natriumacetat, Natrimbicarbonat, Natriumchlorid, Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumpyruvat, Natriumselenit, Natriumsilicat, Zinnchlorid und Zinksulfat.
22. Medium nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Vitamine ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus d-Biotin, d-Calciumpantothenat, Cholinchlorid, Cyanocobalamin, Folsäure, i-Inositol, Nicotinamid, Pyridoxin und Riboflavin.
23. Modifiziertes, Serum-freies Medium zur Isolierung, Herstellung und/oder Haltung immortalisierter Keratinozyten und/oder Melanozyten, dadurch gekennzeichnet, daß es ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Medium NR-2, dem Medium NR-3 und dem Medium NR-4 nach einem der Ansprüche 4 oder 5.
24. Modifiziertes Analyseverfahren, bei dem differenzierte Keratinozyten und/oder Melanozyten verwendet werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifizierung die Verwendung immortalisierter Keratinozyten und/oder Melanozyten nach Anspruch 7 umfaßt.
25. Analyseverfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den Zellen DK2-NR (DSM ACC2238), DK3-NR (DSM ACC2239), DM2-NR (CNCM I-1796) und FK2-NR (DSM ACC2240).
26. Analyseverfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer Entzündungsreaktions-Analyse besteht.
27. Modifiziertes Analyseverfahren, bei dem primäre Melanozyten oder Keratinozyten verwendet werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifizierung die Verwendung von gemäß Anspruch 1 (iii) erhaltenen, primären Melanozyten oder Keratinozyten umfaßt.
28. Analyseverfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer Entzündungsreaktions-Analyse besteht.
29. Modifiziertes Haut-Transplantations-Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbesserung umfaßt, daß als transplantiertes Hautgewebe primäre Keratinozyten oder Melanozyten verwendet werden, die gemäß Anspruch 1 (iii) hergestellt wurden.
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