CZ194598A3 - Immortalizované buněčné linie a živné prostředí - Google Patents

Immortalizované buněčné linie a živné prostředí Download PDF

Info

Publication number
CZ194598A3
CZ194598A3 CZ981945A CZ194598A CZ194598A3 CZ 194598 A3 CZ194598 A3 CZ 194598A3 CZ 981945 A CZ981945 A CZ 981945A CZ 194598 A CZ194598 A CZ 194598A CZ 194598 A3 CZ194598 A3 CZ 194598A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
keratinocytes
medium
immortalized
melanocytes
cells
Prior art date
Application number
CZ981945A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ297289B6 (cs
Inventor
Markus Baur
Catherine Mace
Armand Malnoe
Andrea M. A. Pfeifer
Marcelle Regnier
Original Assignee
Societe Des Produits Nestle S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Societe Des Produits Nestle S. A. filed Critical Societe Des Produits Nestle S. A.
Publication of CZ194598A3 publication Critical patent/CZ194598A3/cs
Publication of CZ297289B6 publication Critical patent/CZ297289B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides or bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/80—Neurotransmitters; Neurohormones
    • C12N2501/81—Adrenaline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Předkládaný vynález se týká zlepšených kontinuálních (imortalizovaných) buněčných linií odvozených z normálních lidských kožních tkání, zvláště keratinocytů a melanocytů, které si zachovávají schopnost exprimovat diferenciační proteiny charakteristické pro diferencované melanocyty nebo keratinocyty, dokonce i po velkém počtu pasáží. Předkládaný vynález se také týká nového bezsérového média, které nevyžaduje použití podnožových buněk (feeder cells).
Dosavadní stav techniky
Produkce imortalizovaných buněčných linií odvozených z kožních tkání člověka byla již dříve popsána. Tyto metody obecně zahrnují transfekci nebo transformaci lidských kožních buněk, například keratinocytů a melanocytů, kultivovaných in vitro, prostředky které zabezpečí jejich imortalizaci.
Imortalizace označuje produkci buněk, které jsou schopny kultivace po delší časová období in vitro, v ideálním případě donekonečna. Tyto buňky jsou také označovány jako kontinuální
2o buněčné linie. Naopak neimortalizované buňky jsou schopny růstu pouze po omezený počet buněčných dělení in vitro. Imortalizované buňky jsou vysoce žádané, protože poskytují stabilní, potenciálně neomezený zdroj buněk s definovanými vlastnostmi. Běžné prostředky pro vytváření imortalizovaných buněčných linií a imortalizovaných linií buněk lidské kůže zahrnují například viry, rekombinantní viry a plazmidy, které obsahují sekvence DNA, jimiž se dosáhne imortalizace.
Pravděpodobněji nejběžnější způsob vytváření imortalizovaných lidských buněčných linií zahrnuje použití sekvencí SV40 a konkrétněji DNA velkého T antigenu SV40 jako imortalizačního prostředku. Použití vektorů SV40 a vektorů obsahujících sekvenci velkého T antigenu
SV40 pro vytváření imortalizovaných linií lidských buněk se popisují například v Steinberg a další, J. Cell Phvs.. 123: 117 - 125 (1985); Reddel a další, US patent No. 4,885,238 z 5. 12. 1989; Major, US patent No. 4,707,448 ze 17. listopadu 1987; Stoner a další, Cancer Res,, 51: 365 - 371 (1991); Chopra a další, ln Vitro Cell Dev. Biol., ίο 30A: 539 - 546 (1994); Chopra a další, ln vitro Cell Dev. Biol., 27A: 773 - 765 (1991); Christian a další, Cancer Res., 47: 6066 - 6073 (1987); Rhim a další, Science, 227: 1250 - 1252 (1985); a Grubman a další, Gastrointest. Liver Physiol., 29: G1060 - G1070 (1994). Zavádění těchto sekvencí se obecně uskutečňuje infekcí použitím viru
SV40 nebo hybridního viru hybridní adenovirus-12 SV40 nebo transfekcí buněk rekombinantním plazmidem obsahujícím dlouhou koncovou repetici viru Rousova sarkomu a časnou oblast Ori-SV40 pomocí koprecipitace fosforečnanem strontnatým (viz Brash a další, Mol, Cell Biol.. 7: 2031 - 2034, (1987).
2o Další známá metoda produkce imortalizovaných buněčných linií a imortalizovaných lidských keratinocytů zvláště zahrnuje transfekci nebo Infekci buněk sekvencemi DNA lidského papilomaviru. Například US patent No. 5,376,542, Schlegel, 27. 12. 1994, popisuje imortalizaci lidských epiteliálních buněk izolovanými geny HPV-16, 18, 31, 33 nebo 35 E6 a E7 nebo samotným genem E7 za vytvoření netumorogenních imortalizovaných buněčných linií. Rovněž Barbosa a další, Oncogene. 4: 1529 - 1532 (1989); a Můnger a další, J. Virol., 63 (10): 4417 - 4421 (1989) ukazují použití genů HPV-16 a HPV-18 E6 a E7 pro produkci imortalizovaných lidských keratinocytů.
I když však mnoho dalších skupin ohlásilo imortalizované keratinocytové buněčné linie a jejich použití v testech in vitro, dosud • · · · ·· ···· • · ·· ·· ·· ···· · ··· · · · · ··· ·· ··· ·· ·· ·· ·* používané imortalizované keratinocytové buněčné linie a melanocytové měly typicky jednu nebo více vlastností, kvůli nimž bylo jejich použití nevýhodné. Například výše uvedené imortalizované keratinocyty měly jednu nebo více z následujících vlastností: (i) snížení nebo ztrátu exprese diferenciačních markérů, například proteinů, které jsou exprimovány normálními diferenciovanými keratinocyty a (ii) změna růstových vlastností ve tkáňové kultuře.
Například Jetten a další, J. Invest. Dermatol., 92: 203 - 209 (1989) uvádí keratinocyty imortalizované virem SV40 získané po io vysokém počtu pasáží (více než 12 pasáží) s použitím vektoru NHEKSV40-T8-1, které nejsou schopny diferenciace. Podobně Bernard a další, Cancer Res.. 45: 1707 - 1716 (1985) uvádějí izolaci imortalizované buněčné linie keratinocytů označované jako SVK14, která je údajně téměř úplně neschopna diferenciace. Také u těchto is buněčných linií nenastává žádná exprese keratinů K1/10 (> 53 kD) a keratinů 50 kD (keratin K14), jejichž proteiny jsou diferenciovanými keratinocyty normálně exprimovány.
Ještě dále uvádějí Steinberg a další, J. Cell Phvsiol., 123: 117 125 (1985) keratinocyty transformované SV40, které postupně ztrácejí schopnost exprimovat keratiny, které jsou pro normální keratinový buněčný skelet charakteristické. Tato ztráta normální exprese keratinů se vyskytuje po přibližně 10 až 15 pasážích. Rovněž Hronis a další, Cancer Res,. 44: 5797 - 5804 (1984) uvádějí, že SV40 DNA imortalizované keratinocyty ztratily schopnost produkovat keratiny K5,
K6, K14/15, K16 a K17 a involucrin, což jsou proteiny charakteristické pro normální diferenciované keratinocyty. Ještě dále Morris a další, Proč. Nati, Acad. Sci. USA. 82: 8498 - 8502 (1985) popisuje keratinocyty imortalizované SV40, které při větším počtu pasáží (> 14) mají podstatně sníženou expresi keratinů třídy II a třídy I. Tyto keratinocyty například téměř neexprimují K13 (Id).
• 9
Rovněž Banks-Schlegel a další, J. Cell. Biol.. 96: 330 - 337 (1983) popisují keratinocyty imortalizované SV40, které mají ve tkáňové kultuře změněné růstové vlastnosti. Například na rozdíl od normálních keratinocytú, tyto imortalizované buňky vyžadují pro svůj růst vrstvu podnožových buněk 3T3.
Výše popisované metody produkce imortalizovaných lidských keratinocytú a melanocytů typicky používaly techniky podnožových buněk (kde jako „podnožové“ buňky slouží obvykle fibroblasty) a obvykle se prováděla kultivace buněk v médiu s obsahem séra. io Například Sexton a další, „Stable transfection of human keratinocytes; HPV immortalization,“ Keratinocyte Methods, eds., Leigh, I. M. a další, University Press, 179 - 180, (1994); Garlick, „Retroviral Vectors“, Keratinocyte methods, (eds. Leigh, I. M. a další, Cambridge University Press, 181 - 183 (1994) uvádějí použití média obsahujícího fetální telecí sérum a podnožových buněk při izolaci a produkci imortalizovaných keratinocytú.
Použití bezsérového média při izolaci a produkci imortalizovaných epiteliálních buněk a konkrétně lidských keratinocytú bylo již dříve popsáno. Například Barbosa a další, Oncoqene, 4: 1529
2o - 1532 (1989) popisují počáteční kultivaci lidských keratinocytú transfekovaných elektroporací nebo lipofekcí v bezsérovém médiu s nízkým obsahem vápníku až do konfluence.
Bez ohledu na to, co bylo uváděno dříve, stále existuje výrazná potřeba imortalizovaných lidských keratinocytú a melanocytů, které mají zlepšené vlastnosti, a které zvláště zachovávají diferenciační schopnost normálních keratinocytú a melanocytů a které exprimují diferenciační proteiny charakteristické pro diferenciované melanocyty a keratinocyty i po velkém počtu pasáží. Tyto buňky by byly velmi prospěšné pro mnoho použití, zvláště při testech, které vyžadují diferenciované kožní buňky. Dále existuje v oboru potřeba zlepšeného kultivačního média, které je schopné udržovat primární ···· · ·· ·· ·· ··. ··· · ·· · · · · · β · · · ·· ···· • · ·· ·· ·· ··· · · • · · · · · · · · ·
- 5 a imortalizované keratinocyty a melanocyty, stejně jako potřeba zlepšených kultivačních metod, které by nevyžadovaly použití podnožových buněk.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je tedy produkovat zlepšené kontinuální (imortalizované) buněčné linie odvozené z normální kožní tkáně člověka, zvláště buněčné linie imortalizovaných keratinocytů a/nebo melanocytů odvozených z normální lidské kožní tkáně, které zachovávají schopnost diferenciace a exprese diferenciačních proteinů i po velkém počtu pasáží. Předmětem vynálezu je konkrétněji získání imortalizovaných keratinocytů, které si zachovávají schopnost exprimovat keratiny, cytochromy, stejně jako jiné diferenciační proteiny, například involukrin, filagrin a loricrin, které jsou běžnými imortalizovanými buněčnými liniemi keratinocytů exprimovány špatně nebo nejsou exprimovány vůbec. Ještě dalším předmětem vynálezu je získat imortalizované keratinocyty a melanocyty, exprimující enzymy, které jsou normálně exprimovány diferenciovanými keratinocyty a melanocyty, zvláště enzymy fáze II, jako jsou glutathion-S20 transferázy, stejně jako enzymy a/nebo proteiny, které se účastní při buněčné oxidaci a odpovědích na záněty.
Dalším předmětem vynálezu je poskytnout nové bezsérové médium pro kultivaci, produkci a udržování normálních nebo kontinuálních keratinocytů a/nebo melanocytů v tkáňové kultuře. Tato nová bezsérová média jsou také použitelná pro izolaci, vytvoření a imortalizaci buněk lidské kůže pro získání kontinuálních melanocytů a keratinocytů podle vynálezu. Konkrétním předmětem vynálezu je tedy poskytnout úplně definované kultivační médium (bez neznámých nebo špatně definovaných doplňujících složek) pro kultivaci
3o keratinocytů bez podnožových buněk obsahující epinefrin, u kterého • · · ·
-6bylo překvapivě zjištěno značné zesílení růstu normálních keratinocytů v bezsérovém médiu.
Dalším předmětem vynálezu je poskytnout nový způsob izolace, vytvoření a imortalizace buněk lidské kůže pro získání kontinuálních buněčných linií melanocytů a keratinocytů odvozených z normální kožní tkáně, kde uvedený způsob používá bezsérového média, jmenovitě média podle vynálezu, a směsi pro přichycení buněk obsahující fibronectin, BSA a kolagen typu I bez „podnožových buněk“ (např. fibroblastů).
Dalším předmětem vynálezu je poskytnout primární keratinocyty nebo melanocyty produkované za podmínek bez přítomnosti séra bez použití jakýchkoliv podnožových buněk, kde uvedené primární keratinocyty a melanocyty se používají pro kožní štěpy a genetickou terapii ex vivo.
is Dalším předmětem vynálezu je poskytnout způsoby použití těchto nových a zlepšených kontinuálních buněčných linií keratinocytů a melanocytů, například pro testy imunologické, farmakologícké, fotoa chemotoxikologické kožní reakce a pro expresi heterologních genů.
Předkládaný vynález poskytuje kontinuální (imortalizované) buněčné linie odvozené z tkání normální lidské kůže, tj. imortalizované keratinocyty a melanocyty, které si zachovávají schopnost diferenciace a které si zachovávají schopnost exprimovat diferenciační proteiny, exprimované normálními keratinocyty nebo melanocyty, dokonce i při velkém počtu pasáží. Velkým počtem pasáží se míní alespoň deset pasáží v kultuře, s výhodou alespoň dvacet až třicet pasáží, výhodněji alespoň padesát pasáží a ideálně nekonečný počet pasáží. Například imortalizované keratinocyty produkované podle vynálezu exprimují diferenciační proteiny keratin K1/10, keratin K14, involukrin, filagrin a loricrin i po velkém počtu pasáží ve tkáňové kultuře. To je rozdíl proti dříve uváděným imortalizovaným • · • ·
-7 keratinocytům, které buď neexprimují tyto diferenciační proteiny vůbec, nebo exprimují tyto diferenciační proteiny špatně.
Předkládaný vynález také poskytuje primární keratinocyty a melanocyty produkované za podmínek bez přítomnosti séra a bez podnožových buněk, které si zachovávají schopnost diferenciace a exprese proteinů charakteristických pro diferenciované melanocyty a keratinocyty.
Imortalizované keratinocyty podle vynálezu mají profil cytochromu p450 (CYP450), který je podobný nebo shodný s profilem normálních keratinocytů. Například buňky podle vynálezu exprimují CYP450 3A5 a nikoliv CYP450 3A4. Imortalizované keratinocyty podle vynálezu také exprimují enzymy fáze II, například glutathion-Stransferázu (GST), konkrétněji GSTa, GSTp a GSTk srovnatelně s normálními neimortalizovanými keratinocyty.
Imortalizované keratinocyty podle vynálezu dále exprimují proteiny a enzymy účastnící se buněčné oxidace a reakcí při zánětu, například superoxiddismutázu (SOD) a kolagenázu typ I a tumorový nekrózní faktor alfa (TNFa) po vystavení účinku esterů forbolu podobně nebo stejně jako normální diferenciované keratinocyty.
S těmito vlastnostmi poskytují tyto buněčné linie vysoce stabilní reprodukovatelný zdroj buněk pro studia imunologické, farmakologické, zánětlivé, foto- a chemotoxikologické kožní reakce.
Imortalizované melanocyty podle vynálezu exprimují endogenně proteiny spojené s melaninem (viz příklady 14 až 15 dále).
Buněčné linie imortalizovaných keratinocytů a melanocytů podle vynálezu také poskytují při kultivaci v organotypické kultivační formě vysoce rozvrstvený a polarizovaný epitel se zrohovatělými povrchovými vrstvami (stratům corneum). Toho bylo dříve dosahováno pouze za běžných podmínek kultivace, tj. v médiu s obsahem séra a
-8vrstvy podnožových buněk (viz např. Lechner a další, Virology, 185; 536 - 571, 1991).
Imortalizované keratinocyty a melanocyty podle vynálezu se získávají z normální kůže za bezsérových podmínek a bez použití jakýchkoliv podnožových buněk. Obecně se imortalizované keratinocyty a melanocyty podle vynálezu získávají následujícími kroky:
(i) získání vzorku lidské kožní tkáně;
(ii) příprava vzorku uvedené kůže pro kultivaci in vitro', io (iii) získání keratinocytů a/nebo melanocytů z uvedeného připraveného vzorku kůže a vysetí uvedených keratinocytů a/nebo melanocytů do bezsérového růstového média, s výhodou buď média NR-3 nebo NR-4 (pro melanocyty) (popsáno dále) na kultivační plotny opatřené povlakem, který umožňuje přichycení a růst buněk, kde uvedený povlak obsahuje fibronectin, kolagen typu 1 a BSA;
(iv) výměna média podle nutnosti pro optimalizaci konfluentního růstu kultivovaných buněk při trvalém udržování povlaku na kultivačních plotnách;
(v) převedení keratinocytů nebo melanocytů do selekčního 20 média, s výhodou bezsérového média na kultivační plotny s podobným povlakem;
(vi) infekce keratinocytů nebo melanocytů retrovirálním konstruktem, s výhodou konstruktem založeným na SV40 nebo papilomaviru 16, jako je SV40 plazmid pLXSHD+SV40(#328), který obsahuje velký T antigen (T Ag) viru Simian virus 40, nebo plazmid pLXSHD+E6/E7, který obsahuje gen E6/E7 papilomaviru 16 (HPV16) (popsaný dále);
(vii) převedení výsledných imortalizovaných keratinocytů nebo melanocytů do proliferačního média vhodného pro proliferaci
3o imortalizovaných keratinocytů nebo melanocytů na kultivační plotny • ·
- 9 opatřené podobným povlakem a obsahující s výhodou médium NR-2 nebo NR-3 (popsané dále) a melanocytové médium M2 (zdroj M. Olsson, Inst. of Dermatology, Uppsala, Švédsko); a (viii) převedení výsledných proliferovaných keratinocytů na 5 diferenciační médium, s výhodou NR-2 (popsané dále) nebo modifikované médium MCDB 153 (popsané dále), které obsahuje vysokou koncentraci vápníku, s výhodou 1,5 mM, na kultivační disky opatřené podobným povlakem (Boyce a další, J. Tissue Cult. Meth., 9: 83 - 93, 1985; Pittlekow a další, J. Invest. Dermatol., 86: 410 - 417, ío 1986).
Konkrétněji, krok (i) bude typicky obsahovat získání vzorků lidské kožní tkáně od lidských dárců, například získané v chirurgii nebo pediatrii. Imortalizace vzorku jediné kožní buňky, tj. vzorku autologní kožní buňky, dovoluje vytváření imortalizovaných buněčných linií keratinocytů a melanocytů, které mají definované vlastnosti, například konkrétní receptorový profil charakteristický pro konkrétního dárce.
Vzorek kůže bude potom připraven v kroku (ii), takže je vhodný pro kultivaci in vitro. Příprava se bude s výhodou uskutečňovat nejprve praním vzorku kůže, například použitím stejného média, jaké se použije pro kultivaci. S výhodou se provádí v médiu NR-2, bezsérovém médiu, jehož přesné složení se popisuje dále, které se ukázalo jako výhodné pro kultivaci normálních keratinocytů a melanocytů. Po promytí bude kožní vzorek s výhodou oholen, například pomocí dermatomu, a potom rozřezán na malé kousky.
Získané kožní řezy se potom rozdělí na dermis a epidermis. Toho může být dosaženo fyzikálními a/nebo enzymatickými prostředky. Je to možno uskutečnit například trypsinizací, například plovoucích kožních řezů v roztoku trypsinu (například přibližně 0,5 %) obsahujícím EDTA (např. přibližně 0,1 %) po dostatečnou dobu pro
uskutečnění separace buněk, například přibližně 30 až 60 minut při 37 °C nebo přes noc při 4 °C.
Dermis se oddělí (pro izolaci fibroblastů viz příklad 2) a epidermis se potom umístí do suspenzního média. Suspenzní médium bude s výhodou obsahovat roztok sojového inhibitoru trypsinu (SBTI) a bude ve styku s buňkami po dostatečně dlouhou dobu, typicky 5 minut, aby došlo k inaktivaci trypsinu a uvolnění buněk. Potom bude přidáno tkáňové kultivační médium, s výhodou bezsérové médium NR-2 (popsané dále) a filtr (například filtr 100 mm) pro io získání požadovaných buněk, například keratinocytů a/nebo melanocytů.
Výsledná primární kultura keratinocytů/melanocytů získaná do kroku (ii) se potom vyseje do bezsérového média, s výhodou média NR-3 (popisovaného podrobně dále) při vhodné koncentraci buněk, s výhodou přibližně 1,2 x 104 buněk/cm2 na kultivační plotny předem opatřené povlakem. Tato koncentrace buněk však může být měněna v širokých mezích. Kultivační plotny jsou s výhodou kontinuálně potaženy prostředkem, u kterého bylo překvapivě zjištěno zvýšení jak přichycení, tak i růstu keratinocytů a melanocytů, konkrétně roztokem fibronectinu, BSA a kolagenu typu 1. Tento potahovací prostředek pro kultivaci buněk byl dříve popsán pro použití u bronchiálních buněk (Lechner a další, J, Tissue Cult. Meth. 9: 43 - 48 (1985), který je zařazen odkazem.
Krok (iv) zahrnuje výměnu kultivačního média tak často, aby došlo k optimalizaci růstu buněk. S výhodou bude médium měněno přibližně každý druhý den. To se však může měnit v závislosti na jednotlivém vzorku kůže. Po dosažení téměř úplné konfluence, například konfluence 90 %, která nastane typicky po přibližně 10 až 14 dnech, se keratinocyty a melanocyty oddělí. Toho je možno dosáhnout jakýmkoliv prostředkem, který poskytuje dostatečné oddělení buněk bez nepříznivého ovlivňování melanocytů a/nebo keratinocytů.
• ·
- 11 Oddělení múze být uskutečněno například diferenciální trypsinizací. Na melanocyty nebo keratinocyty se bude s výhodou působit roztokem trypsin/EDTA a buňky budou potom převedeny do selekčního média. V případě keratinocytů se na buňky s výhodou působí přibližně 5 až
10 minut roztokem trypsin/EDTA (0,025 %/0,01 %) a potom se v kroku (v) vysejí do média NR-3 na plotny předem opatřené povlakem. Důležité je uvést, že médium NR-3 podporuje růst keratinocytů proti melanocytúm. V případě melanocytů se na buňky s výhodou působí přibližně 2 až 4 minuty roztokem trypsin/EDTA (0,025 %/0,01 %) io a potom se v kroku (v) vysejí do média NR-4 na kultivační plotny opatřené podobným povlakem. Je důležité si uvědomit, že médium
NR-4 specificky inhibuje růst keratinocytů.
Na buňky se potom bude působit imortalizačním činidlem. Alternativně mohou být buňky až do provedení imortalizace zamraženy, například v kapalném dusíku. Infekce a imortalizace se s výhodou uskutečňuje s použitím konstruktu SV40 identifikovaného jako pLXSHD+SV40(#328), který je ukázán na obr. 2a a který byl popsán v Stockshlaeder a další (GeneBank, depozitní číslo M64753; Stockshlaeder a další, Human Gen. Therapy, 2, 33 - 39, 1991) nebo konstruktu HPV16 identifikovaného jako pLXSHD+E6/E7, který je ukázán na obr. 2b. Konstrukt pl_XSHD+SV40(#328) obsahuje mimo jiné sekvence sekvenci T-Ag viru SV40, sekvence 5’ a 3’ LTR SV40, sekvence pBR322 umožňující replikaci v E. coli, vícenásobné klonovací místo a polyadenylační sekvenci viru SV40. Konstrukt pLXSHD+E6/E7 obsahuje namísto T-Ag fragment Ncol/Cfol genu E6/E7 lidského papilomaviru 16. Způsob konstrukce plazmidu E6/E7 je založen na práci: Důrst a další, 1987, Oncogene 1: 251 - 256. Po imortalizaci se buňky pasážují tak jak je v průběhu kultivace nutné a získané imortalizované buňky se potom převedou v kroku (vii) na
3o proliferační médium. V případě keratinocytů se tento přenos s výhodou provádí při druhé pasáži.
- 12V kroku (viii) expandují imortalizované buňky v proliferačním médiu pro imortalizované keratinocyty nebo melanocyty, kterým bude bezsérové médium, s výhodou médium NR-2 nebo NR-3 a médium M2 pro melanocyty (popsané dále). Imortalizované buňky se opět kultivují na kultivačních plotnách opatřených souvislým povlakem, kde povlak opět obsahuje roztok fibronectinu, BSA a kolagen typu 1.
Po expanzi imortalizovaných buněk v proliferačním médiu se buňky převedou v kroku (viii) na médium umožňující diferenciaci normálních a imortalizovaných keratinocytů. Tímto médiem bude io s výhodou NR-2 nebo modifikované médium MCDB 153 obsahující vysokou koncentraci vápníku, s výhodou přibližně 1,5 mM, kde kultivace bude opět prováděna na kultivačních plotnách kontinuálně potažených roztokem fibronectinu, BSA a kolagenu typu I.
Jak bylo uvedeno výše, bylo překvapivě zjištěno, že si 15 imortalizované buněčné linie keratinocytů a melanocytů vytvořené podle předkládaného vynálezu zachovávají schopnost diferenciace a exprese diferenciačních proteinů, které jsou charakteristické pro normální diferenciované keratinocyty a melanocyty, dokonce i po velkém počtu pasáží v tkáňové kultuře, tj. po alespoň deseti pasážích.
Například uvedené imortalizované keratinocyty exprimují keratiny stejně jako další proteiny, například involucrin, fiiagrin a loricrin po velkém počtu pasáží, přičemž tyto proteiny nebyly exprimovány dříve uváděnými keratinocyty imortalizovanými SV40 vůbec nebo byly exprimovány pouze špatně.
Konkrétněji, několik imortalizovaných buněčných linií keratinocytů vytvořených podle vynálezu, DK2-NR, DK3-NR a FK2-NR (viz tabulky 7 a 8 dále) exprimují diferenciační proteiny keratin 1/10, keratin 14, involucrin, fiiagrin a loricrin i po velkém počtu pasáží (větší než 30.
3o Imortalizované keratinocyty vytvořené podle vynálezu mají profil
CYP450, který je podobný, pokud není přímo identický, s profilem • · · ·
- 13 normálních lidských keratinocytů. Například imortalizované keratinocyty podle vynálezu exprimují CYP450 1A1, 2C, 2E1 a 3A5, ale neexprimují CYP450 1A2, 2A6, 2B6 a 2D6, které jsou charakteristické pro profil cytochromu 450 u normálních keratinocytů.
Poprvé tedy mohlo být ukázáno, že normální a imortalizované lidské keratinocyty exprimují CYP450 3A5 a nikoliv CYP450 3A4.
Imortalizované buněčné linie keratinocytů podle vynálezu také exprimují enzymy fáze II, například glutathion-S-transferázy (GST) srovnatelným způsobem jako normální diferenciované keratinocyty. io Konkrétněji exprimují imortalizované buněčné linie keratinocytů podle vynálezu srovnatelně s normálními keratinocyty GSTa, GSTp a GSTk.
Imortalizované keratinocyty podle vynálezu dále exprimují enzymy a další proteiny, které se účastní buněčné oxidace a odpovědí na záněty srovnatelně s normálními keratinocyty. Například imortalizované keratinocyty produkované podle vynálezu exprimují superoxiddismutázu (SOD). Imortalizované keratinocyty podle vynálezu také exprimují jako odpověď na estery forbolu kolagenázu typu I (mediátor zánětu) a TNF-α (tumorový nekrózní faktor alfa).
Melanocyty podle vynálezu mají schopnost exprimovat
2o s melaninem spojené proteiny a vimentin.
Navíc vytvářejí imortalizované buněčné linie podle vynálezu při růstu v organotypické kultuře vysoce rozvrstvené a polarizované epitelium se zrohovatělými povrchovými vrstvami (stratům corneum) i při velkém počtu pasáží (větší než 20). To bylo dosud uváděno pouze u imortalizovaných buněčných linií keratinocytů vytvořených za běžných podmínek kultivace, tj. v médiu obsahujícím sérum a s použitím podnožových buněk.
Imortalizované buněčné linie podle vynálezu se získávají za zcela bezsérových podmínek bez použití jakýchkoliv vrstev
3o podnožových buněk při kultivaci.
• · ·· ·· • · · • · ··
- 14 ····
Navíc, jak bude podrobněji popsáno dále, bylo překvapivě zjištěno, že epinefrin je silný růstový faktor normálních keratinocytů, pokud se použije v bezsérovém médiu. Zjistilo se, že zvláště médium NR-3 popsané níže obsahuje epinefrin, který zvyšoval růst normálních keratinocytů (viz obr. 1). To je překvapující zjištění v souvislosti se skutečností, že epinefrin byl dříve pokládán za inhibitor růstu keratinocytů (Halprin, J. Invest. Dermatol., 81: 553 557 (1983) nebo měl pouze mírný účinek na růst buněk keratinocytů (Koizumi a další, J. Invest. Dermatol.. 96: 234 - 237, 1991).
io Bylo také překvapivě zjištěno, že souvislý povlak kultivačních misek nebo ploten použitý pro kultivaci primárních a imortalizovaných keratinocytů a/nebo melanocytů, zvláště povlak nebo „koktejl“ obsahující fibronectin, BSA a kolagen typu I zlepšuje jak přichycení keratinocytů a melanocytů na kultivační plotny nebo kultivační misky, tak i zvyšuje růst buněk. Použití takového povlékacího materiálu dosud nebylo pro použití s imortalizovanými keratinocyty a/nebo melanocyty popsáno.
Jak již bylo diskutováno, předkládaný vynález dále specificky poskytuje nové bezsérové médium označované jako médium NR-3.
Toto médium dovoluje kultivaci a izolaci normálních keratinocytů a/nebo melanocytů z lidské kůže za bezsérových podmínek bez použití podnožových buněk. Zjistilo se, že toto médium zlepšuje růst normálních keratinocytů a dovoluje vytvoření normálních keratinocytových kultur bez jakéhokoliv kontaktu se sérem nebo podnožovými buňkami.
Přesné složení média NR-3 je udáno v tabulce 1. Toto médium obsahuje různé aminokyseliny, anorganické soli a stopové prvky, vitaminy, růstové faktory a další substituenty. Například toto médium obsahuje jako růstové faktory epidermální růstový faktor
3o (rekombinantní EGF), inzulín, hydrokortizon, transferin (lidský), extrakt ···· ··
- 15 z hovězích hypofýz a epinefrin. Jak již bylo uvedeno, epinefrin překvapivě zvyšoval růst primárních keratinocytú ve tkáňové kultuře.
Jako aminokyseliny obsahuje toto médium L-alanin, L-argininHCI, L-asparagin-H2O, kyselinu L-asparagovou, L-cystein-HCI-H2O, kyselinu L-glutamovou, glutamin, glycin, L-histidin-HCI-H2O, Lizoleucin, L-leucin, L-lyzin-HCI, L-methionin, L-fenylalanin, L-prolin, Lserin, L-threonin, L-tryptofan, L-tyrozin a L-valin.
Jako anorganické soli jsou v médiu obsaženy metavanadičnan amonný, molybdenan amonný, chlorid vápenatý, síran měďnatý, síran železnatý, chlorid hořečnatý, chlorid manganatý, síran nikelnatý, chlorid draselný, octan sodný, hydrogenuhličitan sodný, chlorid sodný, hydrogenfosforečnan sodný, pyrohroznan sodný, seleničitan sodný, křemičitan sodný, chlorid cínatý a síran zinečnatý,
V médiu NR-3 jsou obsaženy jako vitaminy d-biotin, d15 pantothenan vápenatý, chlorid cholinu, kyankokalbumin, kyselina listová, i-inozitol, nikotinamid, pyridoxin a riboflavin.
Médium dále obsahuje adenin, ethanolamin, fosfoethanolamin, sodnou sůl fenolčerveni, putrescin.2HCI, thiamin.HCI, kyselina thioktová, thymidin, glukóza, HEPES a antibiotika (fungizon, penicilín
2o a streptomycin).
Výhodné složení média NR-3 je uvedeno v tabulce 12. Očekává se však, že koncentrace substituentů obsažených v médiu NR-3 může být v širokých mezích měněna. Konkrétně se očekává, že množství různých substituentů může kolísat v mezích ± 50 až ± 0,1 %, výhodněji od ± 10 do ± 0,1 %, vztaženo na koncentrace uvedené v tabulce 12. Navíc se očekává, že jeden nebo více uvedených substituentů může být odstraněno a mohou být přidány další substituenty, za předpokladu že tyto substituenty nemají podstatný nepříznivý účinek na izolaci a vytvoření primárních buněčných kultur a imortalizovaných • ·
buněčných linií keratinocytů a melanocytů. To může odborník zjistit pokusy a analýzou chyb.
Jak bylo uvedeno, podstatným substituentem v uváděném bezsérovém médiu NR-3 je epinefrin. Bylo zjištěno, že epinefrin velmi silně podporuje růstovou aktivitu primárních lidských keratinocytů. Důvod zvyšování proliferace keratinocytů epinefrinem je nejasný. Bylo udáváno, že lidské keratinocyty exprimují enzymy pro systém epinefrinu a exprimují také beta 2-adrenoreceptory s vysokou hustotou (Schallreuther a další, „Production of catecholamines in the human epidermis“, Biochem. & Biophys. Res. Commun.. 189: 72 - 98 (1992). Tyto enzymy se účastní v biochemické cestě syntézy katecholaminů, a to zvláště fenylethanolamin-N-methyltransferáza a na biopterinu závislá tyrozin hydroxyláza. Naopak tuto enzymatickou aktivitu není možno detekovat u melanocytů a fibroblastů.
Enzymatická aktivita a/nebo exprese receptorů může vysvětlit schopnost epinefrinu modulovat proliferaci keratinocytů.
Existuje hypotéza současných autorů, že médium NR-3 zvyšuje izolaci a vytváření primárních buněčných kultur a buněčných linií, protože potlačuje diferenciaci buněk vedoucí k obohacení buněk, které zachovávají schopnost diferenciace a exprese proteinů a enzymů, exprimovaných normálními diferenciovanými keratinocyty a melanocyty.
Navíc se předpokládá, že růst keratinocytů nebo melanocytů v médiu s obsahem séra upřednostňuje diferenciaci při první pasáži. To však není výhodné (v průběhu počátečního období kultivace), protože diferenciované buňky příliš dobře nerostou. To naopak vede k přerůstání a selekci proliferativních kožních buněk, které mají pouze slabou schopnost diferenciace. V důsledku toho se sníží počet buněk s vysokou schopností diferenciace, jestliže se do média před
3o imortalizaci přidá sérum.
• · · ·
- 17Naopak v předkládaném vynálezu se kultivují keratinocyty a melanocyty v bezsérovém médiu a za podmínek, které inhibují diferenciaci melanocytů a keratinocytů. V předkládaném vynálezu se bezsérové médium používá s výhodou v průběhu celého období kultivace, před imortalizací i během ní, stejně jako v průběhu proliferace a diferenciace.
Jak bylo uvedeno, médium NR-3 bez séra inhibuje diferenciaci keratinocytů a tím dovoluje zlepšenou izolaci primárních buněčných kultur keratinocytů a z nich odvozených imortalizovaných buněčných linií. Navíc obsahuje bezsérové médium nízké koncentrace vápníku, který selektivně inhibuje růst spoluizolovaných fibroblastů. To vede k vysoce selektivnímu růstovému médiu, které upřednostňuje produkci kultur obsahujících převážně melanocyty a keratinocyty. Předmětné bezsérové médium NR-3 je tedy výhodné, protože inhibuje diferenciaci keratinocytů a inhibuje také růst fibroblastů.
Jak již bylo uvedeno, buněčná suspenze vytvořená z jediného vzorku kůže, která obsahuje disociované melanocyty, keratinocyty a fibroblasty se bude s výhodou kultivovat v uvedeném médiu NR-3. Kultivace se bude uskutečňovat vysetím těchto buněk na kultivační plotny pokryté souvislou vrstvou prostředku, který umožňuje jejich přichycení. Tento povlak bude s výhodou obsahovat směs fibronectinu, bovinního sérového albuminu a kolagenu typu 1. Tento povlak nebo „koktejlový“ povlak byl již dříve popsán pro bronchiální buňky (Lechner a další, J. Tiss. Cult. Meth., 9: 43 - 48 (1985). Autoři vynálezu zjistili, že tento koktejl také zlepšuje přichycení keratinocytů a melanocytů na plastové kultivační misky. Navíc bylo překvapivě zjištěno, že tento spojitý povlak kultivačních ploten používaných pro kultivaci primárních a imortalizovaných keratinocytů dále zlepšuje růst buněk. Pro imortalizované keratinocyty nebo melanocyty nebyl tento
3o spojitý povlak kultivačních ploten ještě popsán.
V průběhu kultivace se primární buněčné kultury s výhodou děli při dosažení nebo téměř dosažení konfluence a potom expandují na další povlečené kultivační misky. Typicky se buněčné kultury budou dělit přibližně každých 10 až 14 dní.
Po kultivaci a expanzi primárních melanocytů a/nebo keratinocytů v bezsérovém médiu NR-3 na požadované množství buněk s použitím popsaných potažených kultivačních misek se buňky imortalizují. S výhodou se imortalizují melanocyty a keratinocyty, které dosáhly nejlepšího růstu. Alternativně však mohou být expandované io primární melanocyty nebo keratinocyty použity před imortaiizací, například v testech, kožních štěpech nebo při genové terapii.
Imortalizace jak melanocytů tak keratinocytů může být uskutečněna pomocí vektoru, který poskytuje expresi T-antigenu SV40 nebo expresi genu E6/E7 lidského papilomaviru 16 (HPV16).
Imortalizace se s výhodou uskutečňuje infekcí melanocytů nebo keratinocytů retroviráiním konstruktem, který poskytuje expresi Tantigenu SV40 nebo genu E6/E7 HPV16. Buněčná infekce T-Ag se provádí podle protokolu Pfeifer a další, Meth. Cell Sci. 17: 83 - 89, 1995 (s tím rozdílem, že virus byl získán z buněčné linie v médiu
DMEM s 10 % fetálního telecího séra). Během infekce může být použito médium obsahující sérum. Pro melanocyty a keratinocyty je však výhodné bezsérové médium, s výhodou například médium PC-1 popsané v práci Pfeifer a další, Meth. Cell. Sci., 14, 83 - 89 (1995), která je zde zařazena odkazem. Nejvýhodněji se imortalizace provádí s použitím retrovirálního konstruktu označovaného jako pLXSHD + SV40 (#328) ukázaného na obr. 2a a založeného na Pfeifer a další a Stockshlaeder a další (GeneBank, depozitní číslo M64753) nebo jako pLXSHD + E6/E7 uvedeného v obr. 2b a založeného na Důrst a další 1987, Oncogene 1, 251 - 256.
3o Po imortaiizací jsou imortalizované buněčné linie převedeny do proliferačního média, s výhodou NR-2 nebo NR-3 nebo M2 (pro • 9
9 melanocyty) s použitím předem potažených kultivačních misek. Po proliferaci buněk na požadovaný počet buněk se buňky převádějí do diferenciačního média vhodného pro kultivaci normálních a imortalizovaných keratinocytů. Tímto médium bude s výhodou NR-2 nebo modifikované MCDB 153 s vysokou koncentrací vápníku (1,5 mM) nebo M2 (pro melanocyty) s použitím předem potažených kultivačních ploten (stejný povlak složený z BSA, kolagenu typu I a fibronectinu).
Jak bylo uvedeno dříve, diferenciované imortalizované buněčné io linie keratinocytů a melanocytů podle vynálezu mají zlepšené vlastnosti, pro které jsou tyto buňky vhodné pro použití při testech vyžadujících diferenciované lidské kožní buňky. Zvláště bylo zjištěno, že tyto buněčné linie exprimují proteiny charakteristické pro normální diferenciované melanocyty a keratinocyty i po velkém počtu pasáží.
Jestliže se například imortalizované keratinocyty vyprodukované podle vynálezu testují metodami westernového blotování a RT-PCR, mají profil cytochromu p450 (CYP450) podobný, pokud ne stejný jako normální keratinocyty. Ještě konkrétněji, imortalizované keratinocyty vytvořené podle vynálezu exprimují CYP450 1A1, 2C, 2E1, 3A5 a
2o neexprimují CYP450 1A2, 2A6, 2B6 a 2D6. Tento profil CYP450 je v souladu s normálními keratinocyty. Takový metabolický profil nebyl dříve pro imortalizované keratinocyty popsán. Poprvé mohlo být ukázáno, že normální a imortalizované keratinocyty exprimují CYP450 3A5 a ne CYO450 3A4. Bylo také zjištěno, že imortalizované keratinocyty vytvořené podle vynálezu exprimují při analýze s použitím protilátek specifických na markéry diferenciace další diferenciační proteiny i po velkém počtu pasáží. Uvedené buněčné linie konkrétně exprimují diferenciační proteiny K1/10, keratin K14, involucrin, filagrin a loricrin i při velkém počtu pasáží, tj. po deseti pasážích i podstatně vyšším počtu.
• · · ·
Imortalizované keratinocyty a melanocyty podle vynálezu také odebírají exogenní esenciální mastné kyseliny (EFA) a provádějí desaturaci a prodloužení řetězců EFA ve velké shodě s normálními melanocyty a keratinocyty.
Jak bude podrobněji popsáno dále, imortalizované keratinocyty podle vynálezu při působení esterů forbolu exprimují TNFa a zánětlivou mediátorovou kolagenázu typu I srovnatelně s normálními keratinocyty. Imortalizované keratinocyty podle vynálezu také exprimují superoxiddismutázu, což je enzym účastnící se buněčné oxidace, podobným způsobem jako normální diferenciované keratinocyty.
Imortalizované melanocyty vyprodukované podle vynálezu odpovídají také podobně jako normální melanocyty na působení induktorů melanogeneze (tj. theofylin a tyrozin) a inhibitorů melanogeneze (kyselina kojová).
Na základě těchto vlastností jsou imortalizované keratinocyty a melanocyty podle vynálezu vhodné pro studia imunologické, farmakologické, foto- a chemotoxikologické reakce kůže.
Imortalizované buněčné linie keratinocytů a melanocytů podle 2o vynálezu mohou být například použity při testech, které vyžadují diferenciované kožní buňky, například při studiu bariérové funkce (rohovatění), rekonstruované kůže, metabolických studiích diferencovaných keratinocytů (metabolismus mastných kyselin, metabolismus antioxidantů), studiích týkajících se účinků ultrafialového záření na buňky kůže, studiích týkajících se účinků potenciálních látek dráždících kůži a látek zvyšujících citlivost na buňky kůže, testech zjišťujících účinky sloučenin na produkci melaninu, testech metabolismu lipidů, místního působení xenobiotik (např. kosmetických olejů, hledání domnělých ochranných sloučenin,
3o například fotoprotektivních látek), zánětů kůže a podráždění kůže.
• · • · ···· * « * Λ ··· · ·· · · · · * • « · · β · »··· • · 9 9 · · · ♦ ···· ·
·..··..· .··’···
-21 Imortalizované buněčné linie keratinocytů a melanocytů a primární melanocyty a keratinocyty vytvořené podle vynálezu jsou použitelné pro screening potenciálních sloučenin pro léčbu rakoviny a sloučenin pro léčení kožních chorob. Ten bude typicky zahrnovat vystavení buněčné linie nebo primárních buněk těmto sloučeninám po určité časové období a zjišťování, zda indukují nějaké nepříznivé účinky, například genetickou toxicitu, tvorbu adduktů s DNA, mutagenicitu, transformaci buněk nebo cytotoxicitu.
Buněčné linie melanocytů a keratinocytů jsou také vhodné pro io expresi rekombinantních proteinů, například lidských proteinů a polypeptidů, stejně jako pro produkci RNA a DNA.
Imortalizované buněčné linie podle vynálezu také naleznou možné použití při genetické terapii ex vivo. Buněčné linie podle vynálezu by měly poskytnout užitečný nástroj pro zjišťování genů a vývoj buněk připravených genetickým inženýrstvím, které exprimují požadované genové produkty, například pro lékařské použití, nebo pro studia buněčné toxicity/mutagenicity. Na základě toho, že buněčné linie podle vynálezu těsně napodobují normální kožní buňky, mohly by být navíc velmi vhodné pro testy biologické citlivosti.
Navíc mohou být primární keratinocyty a melanocyty vytvořené podle předkládaného vynálezu za předpokladu, že jsou vytvořeny za bezsérových podmínek, použitelné při genové terapii. Protože nejsou tyto buňky přivedeny do styku se sérem, například bovinním nebo jiným zvířecím sérem (s výjimkou při virové infekci a skladování v kapalném dusíku), měly by být méně přístupné potenciální kontaminaci viry nebo jinými patogeny. To by tedy mělo minimalizovat riziko přenosu patogenních nebo infekčních faktorů těmito buňkami v průběhu genové terapie. Takové genové terapie ex vivo je možno použít při léčení poruch jako je epidermolysis bullosa (mutační porucha keratinu), vitiligo (porucha týkající se genů syntetizujících melanin), karcinomy a melanomy, alergické poruchy a poruchy • ·
-22spojené se záněty. Vzhledem k terapeutickému účinku je jediným potenciálním zdrojem kontaminace extrakt z hovězích hypofýz, bovinní inzulín, kolagen, sérový albumin nebo lidský fibronectin a lidský transferin.
Buněčné linie imortalizovaných melanocytů a keratinocytů podle vynálezu a primární melanocyty a keratinocyty jsou použitelné při testech mutageneze DNA, screeningových testech mutace kůže, testech pro identifikaci látek poškozujících chromozom, testech maligní transformace, a studiích biochemie buněk (např. testy aktivace CYP450), screeningu sloučenin a prostředků, například směsí esenciálních mastných, které mají funkci při zánětlivých a alergických reakcích, testech aktivace kolagenázy (ve vztahu k zánětu) zahrnujících TNFa, detekci interleukinu.
Významná potenciální aplikace primárních keratinocytů nebo melanocytů vytvořených podle vynálezu daná jejich dostupností a způsobem získávání jsou kožní štěpy. Protože tyto primární keratinocyty a melanocyty jsou produkovány za bezsérových podmínek, měly by mít minimální riziko kontaminace patogeny (např. viry) a infekčními prostředky. Navíc, protože uvedené melanocyty a
2o keratinocyty mohou být odvozeny od autologního hostitele, tj. pacienta s rozsáhlým poraněním, mělo by to minimalizovat nebo odstranit riziko odmítnutí kožního štěpu nebo jiné nepříznivé imunologické reakce, stejně jako riziko infekce.
Příklady konkrétních imortalizovaných buněčných linií keratinocytů vytvořených podle vynálezu jsou FK2-NR, DK2-NR a DK3-NR, které byly uloženy 5. 10. 1995 ve sbírce DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und ZelIKulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b D-38124 Braunschweig, Německo, a které byly uloženy pod depozitními čísly DSM ACC2240, DSM ACC2238, popř.
3o DSM ACC2239. Dalším příkladem konkrétních linií imortalizovaných lidských melanocytů vytvořených podle vynálezu je DM2-NR, která je
-23 uložena od 11. 12. 1996 v Pasteurově institutu, 25 rue de Docteur Roux 75724, Paříž, Francie, a která byla označena depozitním číslem CNCM 1-1796. Všechna tato uložení byla provedena v souladu s Budapešťskou smlouvou. Všechna omezení týkající se dostupnosti těchto buněčných linií budou neodvolatelně odstraněna po získání patentu na tuto přihlášku nebo další přihlášky, jejichž nároky mají prioritu z této přihlášky.
Další rysy vynálezu budou zřejmé z následujících příkladů, které jsou uvedeny pro ilustraci vynálezu a nemají být pokládány za ío omezující.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 porovnává růst (jako počet buněk) neimortalizovaných keratinocytů DKO-NR ve třech rozdílných médiích, tj. NR-3, modifikované médium MCDB 153 doplněné epinefrinem a médium MCDB 153 po šesti dnech.
Obr. 2a ukazuje retrovirální konstrukt SV40 pl_XSHD+SV40(#328) používaný s výhodou pro imortalizaci uvedených melanocytů a/nebo keratinocytů.
Obr. 2b ukazuje retrovirální konstrukt HPV16 pLXSHD+E6/E7.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Charakterizace vytvořených kožních buněk
Tabulka 1 ukazuje všechny vzorky kůže, které byly zpracovány 25 pro virovou infekci. Izolované keratinocyty, které dosáhly nejlepšího růstu byly použity pro imortalizaci.
Tabulka 1
Vzorky kůže použité pro izolaci buněk v médiu NR-3
Původ tkáně Název buněčné linie Věk Pohlaví Růst buněk1
Stehno OS1 36 ž ++
Stehno OS2 68 ž -
Stehno OS3 51 ž +
Oční víčko EL1 46 ž +
Oční víčko EL2 49 ž +
Břicho Thorl 58 ž -
Předkožka FK1-NR 5 m +++
Předkožka FKO-NR 13 m ++++
Břicho GK0-NR 26 ž +++
Prs DKO-NR 29 ž +++
1 Metoda: Buňky byly sklizeny roztokem trypsin/EDTA (0,05 %/0,01 %) a počítány použitím hemocytometru, výsledky jsou průměrem z triplikátů.
Lidské fibroblasty byly izolovány ze vzorků kůže FKO-NR, GK0NR, DKO-NR. Po oddělení dermální a epidermální části byla dermis io nařezána na malé kousky 0,2 x 0,2 mm a fixována na šesticentimetrovou kultivační plotnu se sérem. Po 2 až 4 hod bylo přidáno Dulbecco’s minimální esenciální médium (DMEM, 10 % FCS). Kultura explantátu byla potom inkubována až do viditelného růstu fibroblastů. Konfluentní kultury fibroblastů byly rozděleny a expandovány pro zamražené zásobní roztoky.
• ··
-25 Příklad 2
1) Charakterizace růstu keratinocytů v bezsérovém médiu:
Primární buněčné kultury byly kultivovány v modifikovaném
MCDB 153 (Boyce a další, J. Tissue Cult. Meth., 9: 83 - 93 (1985); a Pittlekow a další, J. Invest. Dermatol., 86: 410 - 417, 1986) a médiu NR-3. Nejlepší růst byl pozorován v médiu NR-3 (obr. 1). Zlepšený růst buněk byl také pozorován v úplně definovaném médiu NR-3 (NR3 bez extraktu z bovinních hypofýz, BPE) ve srovnání io s modifikovaným MCDB 153 bez BPE.
Obr. 1 ukazuje růst buněk v médiu NR-3 a v modifikovaném médiu MCDB 153 doplněném epinefrinem (růstové médium pro keratinocyty) po šesti dnech. Keratinocyty byly sklizeny roztokem trypsin/EDTA (0,05 %/0,01 %) a počítány použitím hemocytometru.
Výsledky uvedené v obr. 1 jsou střední hodnoty z triplikátů.
2) Vliv povlaku na přisedání a růst buněk:
Bylo zjištěno, že povlak kultivačních ploten zlepšuje přisedání a růst buněk normálních keratinocytů. Výsledky uvedené v tabulce 2 porovnávají růst keratinocytů v potahovaných a nepotahovaných kultivačních plotnách. Na plotny 3,5 cm s obsahem média NR-3 bylo vyseto 100 000 keratinocytů.
>···
Tabulka 2
Vliv povlaku na povrchu na přisedání buněk
Přichycené buňky 24 h po vysetí1 Počet buněk po 4 dnech2
Nepotažené % Potažené % Nepotažené Potažené
DK0-NR po izolaci 21,4 68,2 44 600 143 800
DK0-NR 2. pasáž 73,8 86,8 175 500 282 300
1 Počty přichycených buněk dělené počty buněk zaočkovaných.
Přichycené buňky byly sklizeny roztokem trypsin/EDTA (0,05 %/0,01 %) a počítány pomocí hemocytometru.
2 Buňky byly sklizeny roztokem trypsin/EDTA (0,05 %/0,01 %) a počítány použitím hemocytometru, výsledky jsou střední hodnoty z tripiikátů.
Příklad 3
1) Imortalizace keratinocytů:
Buněčná suspenze vytvořená ze vzorků kůže popsaných v příkladu 1 obsahující disociované melanocyty, keratinocyty a fibroblasty se kultivuje v uvedeném médiu NR-3. Toho se dosáhne vysetím těchto buněk na kultivační misky, které jsou souvisle potaženy „koktejlem“, který byl již popsán pro bronchiální buňky (Lechner a další, J. Tiss. Cult. Meth.. 9: 43 - 48 (1985). Během kultivace primárních buněčných kultur, když dosáhnou nebo v podstatě dosáhnou konfluence, se na buňky působí 4 min roztokem trypsin/EDTA (0,025 %/0,01 %). V průběhu tohoto působení se melanocyty odpojí z kultury keratinocytů a odděleně se shromáždí. V tomto stupni se tedy oddělí primární melanocyty a keratinocyty. Po
kultivaci a expanzi primárních keratinocytů na požadované počty buněk v bezsérovém médiu NR-3 s použitím popsaných potažených kultivačních misek (to podporuje růst keratinocytů proti melanocytům) se potom imortalizují. Imortalizace keratinocytů se provádí retrovirálním konstruktem pLXSHD+SV40(#328), který poskytuje expresi T-antigenu SV40 (viz Pfeifer a další, Meth. Cell Sci. 17: 83 89, 1995; s tím rozdílem, že virus byl oddělen z buněčné linie rostoucí v DMEM s 10 % fetálního telecího séra). V průběhu infekce se používá bezsérové médium PC-1 popsané v práci Pfeifer a další, Meth. Cell. io Sci,. 14, 83 - 89 (1995). Po imortalizaci se imortalizované buněčné linie převedou do proliferačního média NR-2 nebo NR-3 s použitím předem potažených kultivačních misek. Po proliferaci buněk na požadované počty buněk se buňky převedou do diferenciačního média vhodného pro kultivaci normálních a imortalizovaných keratinocytů.
2) Buněčná proliferace imortalizovaných keratinocytů s velkým počtem pasáží:
Imortalizované keratinocyty vykazují zlepšený růst buněk při vysokém počtu pasáží. To je ukázáno v tabulce 3 níže. Tato skutečnost byla ukázána odhadem doby zdvojení populace (PDT: čas pro jedno zdvojení buněčné populace během logaritmické růstové fáze). Metoda: Keratinocyty byly sklizeny v roztoku trypsin/EDTA (0,05 %/0,01 %) a počítány použitím hemocytometru, přičemž výsledky jsou střední hodnotou z triplikátú.
• ·
- 28 Tabulka 3
Doba zdvojení populací (PDT) keratinocvtovych linií rostoucích v NR-3
Keratinocyty Počet pasáží PDT (h) Krize* při pasáži
FK2-NR 15 48,00 16 - 18
FK2-NR 39 21,16
DK1-NR 12 23,20
DK1-NR 15 31,05 25 - 30
DK1-NR 31 32,99
DK2-NR 15 22,26 20 - 21
DK3-NR 40 24,34 -
Krize: Buněčný růst se sníženou rychlostí proliferace.
3) Exprese CYP450 v imortalizovaných liniích buněčných keratinocytů:
Imortalizované a normální keratinocytové kožní buňky byly testovány na expresi CYP4501A1, 1A2, 3A5, 2E1, 2B6, 2A6 a 2D6 westernovými bloty (exprese proteinů) a RT-PCR (exprese mRNA, viz tabulka 4). Exprimovaná CYP450 u imortalizovaných keratinocytů je io podobná jako u normálních keratinocytů. Rychlost exprese je mírně snížena. Buněčná linie DK2-NR však vykazuje téměř normální rychlost exprese CYP450. Metoda RT-PCR (polymerázová řetězová reakce s reverzní transkriptázou) byla prováděna se specifickým prímerem pro CYP450 (Mace a další, připraveno k publikaci).
Tabulka 4
Exprese CYP mRNA u lidských keratinocytů
Keratino cyty Počet pasáží 1A1* 2C** 2E1 3A5 1A2,2A6, 2B6.2D6
FKO-NR 4 + + + + -
FK2-NR 36 + + + + -
DKO-NR 3 + + + + -
DK1-NR 31 + + + + -
DK2-NR 13 + + + + -
Exprese 1A1 mRNA u imortalizovaných buněčných linií se zvýšila po 5 indukci benz(a)pyrenem (1,5 μΜ; Amersham lne.). Přírůstek byl srovnatelný s normálními buňkami.
“ 2C17/19 a 2C18
4) Odezva na induktorv CYP450;
io Buněčné linie odpovídaly na induktor CYP450 benz(a)pyren jako neimortalizované buňky i po větším počtu pasáží (viz tabulka 5). Tato indukce není popisována pro T-Ag imortalizovaných keratinocytů.
- 30 Tabulka 5
Aktivita 7-ethoxyresorufin-O-deethylázv (EROD; Sigma lne.) u lidských keratinocytů po indukci benzpyrenem (B(a)PÍ
Keratinocyty Počet pasáží EROD (pmol/mg proteinu)
FKO-NR 2 nedetekovatelné
FK0-NR+B(a)P 2 0,58
FK2-NR 37 0,01
FK2-NR+B(a)P 37 1,05
DKO-NR 1 0,02
DK0-NR+B(a)P 1 1,03
DK1-NR 32 0,04
DK1-NR+B(a)P 32 1,78
DK2-NR 14 0,02
DK2-NR+B(a)P 14 0,69
DK3-NR 39 0,01
DK3-NR+B(a)P 39 1,86
* Keratinocyty byly inkubovány 24 hod s B(a)P (1,5 μΜ). Aktivita
EROD byla měřena po inkubaci při 37 °C fluorescenční detekcí resorufinového produktu (excitace 560 nm, emise 586 nm).
5) Diferenciace buněk:
io Diferenciační markéry byly analyzovány pomocí specifických protilátek. Použité specifické protilátky jsou identifikovány v tabulce 6. Nejvyšší schopnost diferenciace mohla být ukázána u klonů DK2-NR a DK1-NR (tabulky 7, 8).
Tabulka 6
Protilátky použité pro detekci proteinů specifických pro keratinocyty
Specificita Název protilátky Firma/Odkaz
T-Ag Ab-2 Oncogene, Manhassat, NY
Involucrin BTI BT-576 bti, Stoughton, MA
Filagrin Filagrin Paesel+Lorei, Frankfurt, Německo
Loricrin aAg 73 Magnaldo a další 1992
Vimetin V9 Dako, Glostrup, Dánsko
Keratin K4 6B10 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K7 LDS-68 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K8 M20 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K10/1 K8.60 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K13 KS-1A3 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K14 CKB1 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K17 CK-E3 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K18 CY-90 Sigma, St. Louis, USA
Keratin K19 A53-B/A2 Sigma, St. Louis, USA
-32Tabulka 7
Detekce T-Ag a diferenciačních produktů epidermálních keratinocytů
Keratinocyt Počet pasáží T-Ag Involucrin Filagrin Loricrin Vimentin
FKO-NR 3 - +++ ++ + ++
FK2-NR 25 +++ ++ ++ + ++
DKO-NR 2 - +++ +++ ++ +++
DK1-NR 13 +++ +++ ++ ++ ++
DK1-NR 30 +++ ++ ++ + ++
DK2-NR 11 +++ +++ +++ ++ +++
DK3-NR 36 +++ ++ ++ + ++
Tabulka 8
Detekce keratinů (K) v keratinocytech
Kerati- nocyty Počet pasáží K4 K7 K8 K10/1 K13 K14 K17 K18 K19
FKO-NR 2 ++ - ++ ++ +++ ++ ++ + +
FK2-NR 25 +++ - ++ ++ +++ ++ ++ + +
DKO-NR 2 ++ - - +++ +++ +++ +++ - +
DK1-NR 13 ++ - ++ +++ +++ ++ ++ + +
DK1-NR 30 + - ++ ++ ++ ++ + ++ +
DK2-NR 11 +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++
DK3-NR 36 + - +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++
- 33 Metoda pro tabulky 7 a 8: Keratinocyty rostoucí na komorových sklech byly barveny po fixaci v čistém methanolu s protilátkami uvedenými v tabulce 6.
+++: Nejvyšší koncentrace proteinu, kvantifikováno fluorescenčním 5 mikroskopem.
-: exprese proteinů neprobíhá.
6) Exprese qlutathion-S-transferázy:
Fáze II enzymu glutathion-S-transferázy (GST) byla ío analyzována technikami northernových a westernových blotů. Všechny linie keratinocytů silně exprimují mRNA pro GSTtu, ale ne GSTa a GSTp (tabulka 9: použitá metoda northernový blot). Profil exprese proteinů GSTa, GSTp a GSTk v buněčných liniích byla podobná jako u normálních keratinocytů.
Tabulka 9
Exprese proteinů enzymu GST
Keratinocyty GSTa GSTp GSTk
FK2-NR - - +++
DKO-NR - - +++
DK1-NR - - +++
DK2-NR - - +++
DK3-NR - - +++
7) Metabolismus esenciálních mastných kyselin (EFA):
Pro analýzu a porovnání desaturace a prodlužování přidaných EFA v keratinocytech byly testovány imortalizované keratinocyty ·· ·· > · ♦ « > · ·· ··· · « • · 1 ·· ·· (DK1-NR, FK2-NR) a normální keratinocyty s kyselinou linolovou (LA, 15 μΜ) a kyselinou α-linolenovou (LN, 15 μΜ). Pro tyto experimenty bylo použito EFA-deficientní médium NR-2 (Biofluids lne.). Buněčné kultury byly ošetřeny po dosažení konfluence a převedení do média
NR-2 vysokou koncentrací vápníku (1,5 mM). Na buňky bylo působeno 4 dny EFA (obnova po dvou dnech).
Analýza EFA byla prováděna extrakcí a separací fosfolipidů TLC (chromatografie na tenké vrstvě) a kvantifikací methylesteru mastné kyseliny GLC (chromatografie plyn-kapalina). Mohlo být prokázáno io vytvoření desaturačních a elongačních produktů LA (20:4n-6 a 22:4n6) a LN (20:5n-3, 22:5n-3 a 22:6n-3). Tento metabolický profil byl v souladu s profilem pozorovaným u normálních keratinocytů. Tento metabolický profil byl v souladu s profilem pozorovaným u normálních keratinocytů.
8) Určení karyotypu:
Všechny buněčné linie byly hypodiploidní s většinou napočítaných chromozomů v diploidní oblasti (kromě DK2-NR, kde jsou napočítané chromozomy také v hypotetraploidní oblasti). Jiné buňky než buňky analyzovaných buněčných linií nebyly v kulturách detekovány. Tyto výsledky potvrzují čistotu buněčných linií a nepřítomnost buněčné kontaminace z jiných zdrojů.
9) Charakterizace in vivo:
Tumorogenicita imortalizovaných keratinocytů byla určována podkožní injekcí (1-2mio keratinocyty) nahé myši. Testované linie keratinocytů DK2-NR, DK3-NR, FK2-NR nejsou u nahé myši tumorogenní (4 měsíce inkubace). Po pěti měsících inkubace byla linie DK3-NR slabě tumorogenní u šesti zvířat z deseti.
• ••0
00 00 00 0000
0 0 0· • 0 0 0 0 0 0 • 0 0 0 0
000 «0 0«
0·
0 0 0
0 00
000 0 0
0 0
0·
10) Odpověď na látky dráždící kůži:
Metodou northernových blotů a biologickými testy (tabulka 10) byla testována indukce „stresového genu“ TNFa (tumorový nekrózní faktor alfa) po působení látek dráždících kůži PMA (forbol-12-myristát13-acetát), SDS (dodecylsulfát sodný), DMSO (dimethylsulfoxid), ILΙβ (interleukin 1 beta) a UV-B (ultrafialové záření B). Linie keratinocytů odpovídaly na PMA a UV-B a exprimovaly protein TNFa i po velkém počtu pasáží.
io Po působení forbolových esterů (PMA) na imortalizované keratinocyty byl pozorován přírůstek exprese kolagenázy (typ I).
Tabulka 10
Sekrece TNFa v keratinocytech po indukci látkami dráždícími kůži 15 Test aktivity proteinu: Inkorporace 3H-thymidinu do buněk citlivých na
TNFa*
Sekrece TNFa po indukci:
Keratino cyty Počet pasáží PMA SDS DMSO IL-Ιβ UV-B
DK0-NR 3 + - - nt +
DK1-NR 20-22 + + - + +
DK1-NR 32 + - - nt +
DK2-NR 16 + - - - +
DK2-NR 31 + - - nt +
nt: nebylo testováno *: citlivé buňky: buněčná linie myšího fibrosarkomu WEHI 164 klon 20 1.14 (ATCC).
• · • ·
- 36 11) Organotypické kultivace:
Byla také provedena kultivace lidských keratinocytů na organotypických podmínek (keratinocyty rostoucí na vzduchu vystavené působení kolagenového gelu s podnožními buňkami).
Všechny linie keratinocytů vykázaly ve srovnání s normálními keratinocyty hyperproliferativní morfologii. Tyto studie byly prováděny v kultivačním médiu se sérem. Hyperproliferativní růst buněk byl snížen za podmínek bez séra (NR-2 s vysokou koncentrací vápníku (1,5 mM) na plastických kultivačních miskách bez kolagenového gelu io a bez podnožních buněk).
Příklad 4
1) Imortalizace melanocytů:
Buněčná suspenze vytvořená ze vzorku kůže DKO-NR popsaná v příkladu 1 obsahující disociované melanocyty, keratinocyty a fibroblasty se kultivuje v uvedeném médiu NR-3. Kultivace se provádí vysetím těchto buněk na kultivační misky, které jsou pokryty spojitou vrstvou „koktejlového“ povlaku popsaného dříve pro bronchiální buňky (Lechner a další, J. Tiss. Cult. Meth., 9: 43 - 48
2o (1985). V průběhu kultivace primárních buněčných kultur při dosažení v podstatě úplné konfluence se na buňky působí 4 min roztokem trypsin/EDTA (0,025 %/0,01 %). Tímto působením jsou melanocyty uvolněny z keratinocytové kultury a jsou odděleně shromážděny. V tomto kroku jsou tedy odděleny primární melanocyty a keratinocyty.
Spojené primární melanocyty se potom vysévají do bezsérového média NR-4, které specificky inhibuje růst keratinocytů. Po kultivaci a expanzi primárních melanocytů na požadované počty buněk v bezsérovém médiu NR-4 s použitím uvedené kultivace na povlaku, jsou buňky imortalizovány. Imortalizace keratinocytů se provádí
3o retrovirálním konstruktem pLXSHD+SV40(#328), který poskytuje expresi T-antigenu SV40 (viz Pfeifer a další, Meth. Cell Sci. 17: 83 -3789, 1995; s tím rozdílem, že virus byl oddělen z buněčné linie rostoucí v DMEM, 10 % fetálního telecího séra. Během infekce se používá bezsérové médium PC-1 popsané v práci Pfeifer a další, Meth. Cell, Sci.. 14, 83 - 89 (1995). Po imortalizaci jsou imortalizované buněčné linie převedeny do proliferačního a diferenciačního média M2 (DMEM/F12, Biofluids, No148; možno také získat u M. Olssen, Uppsala, Švédsko).
2) Charakterizace lidských melanocytů exprimujících T-Ag:
io Byla porovnávána exprese s melaninem spojených proteinů imortalizovaných melanocytů vyprodukovaných podle vynálezu (zvláště DM2-NR) s normálními melanocyty. Bylo ukázáno, že imortalizované buňky exprimovaly s melaninem spojené proteiny, s melanomem spojený antigen (MAA) a HMB45 podobně jako normální buňky, i když s menší mírou exprese.
3) Indukce syntézy melaninu:
Tvorba melaninu melanocytové buněčné linie exprimující T-Ag (zvláště linie DM2-NR) byla porovnávána s normálními melanocyty. Na melanocyty bylo působeno induktory melanogeneze tyrozinem a theofylinem a inhibitorem melanogeneze kyselinou kojovou. Melanocytové linie (zvláště DM2-NR) odpovídaly na modulátor melanogeneze srovnatelným způsobem jako normální buňky. Bylo také ukázáno, že indukce/inhibice melanogeneze je závislá na dávce.
Příklad 5
Kmen DKO-NR popisovaný v příkladu 1 byl imortalizován jak bylo popsáno výše s retrovirovým konstruktem pLXSHD+E6/E7 založeném na HPV16, který je zobrazen na obr. 2b. Bylo vybráno ··· ···· · · · tt ··· · · ·· * · · ·
-38několik kontinuálních linií keratinocytů. Výsledky analýz těchto linií na produkty diferenciace (cytokeratiny, GST, TNFa, involucrin, filagrin, loricrin, vimentin) jsou podobné výsledkům získaným pro linie DK2-NR a DK3-NR.
Příklad 6
Dále je uvedeno složení nového média NR-3 podle vynálezu a několika dalších bezsérových médií podle předkládaného vynálezu, tj. NR-1, NR-2 a NR-4.
1) Složení média NR-1 (viz tabulka níže)
NR1 (mg/l)
Aminokyseliny
L-alanin 9,0000
L-arginin, HCl 316,0000
Asparagin, H2O 15,0000
Kyselina L-asparagová 4,0000
L-cystein, HCl, H2O 42,0000
Kyselina L-glutamová 14,8000
Glutamin 877,0000
Glycin 7,6000
L-histidin, HCl, H2O 50,4000
L-izoleucin 98,4000
L-leucin 131,2000
L-lyzin, HCl 36,6000
L-methionin 13,4000
• ··· · · · ·
-39L-fenylalanin 14,9000
L-prolin 34,6000
L-serin 126,2000
L-threonin 23,8000
L-tryptofan 9,2000
L-tyrozin 13,6000
L-valin 70,2000
Anorganické soli
Metavanadičnan amonný [NH4VO3] 0,0006
Molybdenan amonný [(NH4)6MO7O24x4H2O] 0,0010
Chlorid vápenatý [CaCI2x2H2O] 16,2000
Síran měďnatý [CuSO4x5H2O] 0,0025
Síran železnatý [FeSO4x7H2O] 1,4000
Chlorid hořečnatý [MgCI2x6H2O] 122,0000
Chlorid manganatý [MnCI2x4H20] 0,0002
Síran nikelnatý [NiSO4x6H2O] 0,0003
Chlorid draselný [KCI] 112,0000
Octan sodný 301,5000
Hydrogenuhličitan sodný [NaHCO3] 1088,0000
Chlorid sodný [NaCI] 5200,0000
Hydrogenfosforečnan sodný 536,0000 [Na2HPO4x7H2O]
Pyrohroznan sodný 55,5000
Seleničitan sodný [Na2SeO3] 0,0050
Křemičitan sodný [Na2SiO3x9H2O] 0,1420 • ·
-40 Chlorid cínatý [SnCI2x2H2O]
Síran zinečnatý [ZnSO4x7H2O]
Vitaminy d-biotin d-pantothenan vápenatý
Chlorid cholinu
Kyanokobalamin (B12)
Kyselina listová i-inozitol
Nikotinamid (B3)
Pyridoxin (B6xH2O)
Riboflavin (B2)
Další složky
Adenin
Epidermální růstový faktor (EGF, lidský rekombinantní
Ethanolamin
Glukóza
HEPES
Hydrokortizon
Inzulín (bovinní)
Fenolčerveň
Fosfoethanolamin
Putrescin 2HCI
Thiamin HCI • · · · · · · • · · · · · · ··
0,0001
0,5100
0,0200
0,2600
28,0000
0,4100
0,7900
18,0000
0,0400
0,0600
0,0400
27,3000
0,0010
0,0310
1080,0000
6000,0000
0,5000
5,0000
1,2000
0,0710
0,1600
0,3400 • · · ·
-41 0,2100
0,7300
10,0000
280-285 mOsm/kg
Kyselina thioktová Thymidin
Transferin (lidský)
Osmolarita
2) Složení média NR-2:
Stejné jako NR-1, ale doplněné hovězím extraktem hypofýz (Biofluid lne.) v koncentraci 35 mg/l a antibiotiky (Gibco BRL, Life
Technologies lne.) fungizon (0,25 mg/l) penicilín (10,00 jednotek/l) a streptomycin (10 mg/l).
3) Složení média NR-3:
Stejné substituce jako NR-2, ale doplněno epinefrinem (Biofluid io lne.) v koncentraci 250 pg/l.
4) Složení média NR-4:
Stejné substituenty jako NR-2, ale doplněno 3FGF (3 pg/l) (bázický růstový faktor fibroblastů získaný od firmy Sigma lne.) a forbol 12-myristát-13-acetátem (10 pg/l) (PMA) (C.C.R. lne.).
Ačkoliv vynález byl popsán velmi podrobně ve vztahu k některým výhodným provedením, jsou možná v rámci předkládaného vynálezu také jiná provedení. Ani popis ani nároky, které následují, nejsou ani zamýšleny ani by neměly být pokládány za limitující výše uvedeným popisem výhodných provedení.

Claims (5)

1. Imortalizované buněčná linie lidských keratinocytů nebo melanocytů vyznačující se tím, že si
5 zachovává schopnost diferenciace a exprese proteinů a enzymů exprimovaných normálními diferenciovanými keratinocyty nebo melanocyty i po vysokém počtu pasáží v tkáňové kultuře.
io
2. Imortalizované buněčná linie keratinocytů podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená buněčná linie exprimuje keratinové proteiny a jiné proteiny, které jsou exprimovány normálními diferenciovanými keratinocyty.
15
3. Imortalizované buněčná linie keratinocytů podle nároku 2, vyznačující se tím, že uvedené keratinové proteiny zahrnují keratin K1/10, keratin K14 a uvedené další proteiny zahrnují involucrin, filagrin a loricrin.
2o
4. Imortalizované buněčná linie keratinocytů podle nároku 1, vyznačující se tím, že vykazuje profil CYP450, který je identický nebo v podstatě identický s profilem normálních diferenciovaných keratinocytů.
25 5. Imortalizované buněčná linie keratinocytů podle nároku 4, vyznačující se tím, že exprimuje CYP450 1A1, 2C, 2E1 a 3A5, ale neexprimuje CYP450 1A2, 2A6, 2B6 a 2D6.
• · · ·
-436. Imortalizovaná buněčná linie lidských keratinocytů podle nároku 1, vyznačující se tím, že je vytvořena za bezsérových podmínek bez použití podnožových buněk.
7. Imortalizovaná buněčná linie lidských melanocytů podle nároku 1, vyznačující se tím, že je vytvořena za bezsérových podmínek bez použití podnožových buněk.
8. Lidská buněčná linie imortalizovaná antigenem T SV40, vyznačující se tím, že je zvolena ze skupiny keratinocytové linie DK2-NR (DSM ACC2238), DK3-NR (DSM ACC2239) a FK2-NR (DSM ACC2240) a melanocytové linie
15 DM2-NR (CNCM 1-1796).
9. Imortalizovaná keratinocytová buněčná linie podle nároku 1, vyznačující se tím, že exprimuje mRNA kódující glutathion-S-transferázu GST-π, GST-μ a GST-a.
10. Imortalizovaná buněčná linie keratinocytů podle nároku 1, vyznačující se organotypické kultuře a polarizované epitelium tím, že při vytváří vysoce se zrohovatělými kultivaci v rozvrstvené povrchovými buňkami v nepřítomnosti séra nebo podnožových buněk.
11. Imortalizovaná keratinocytová buněčná linie podle nároku 1, vyznačující se tím, že působením forbolových esterů exprimuje kolagenázu typu I a TNF-a.
• · · · • · • ·
12. Zlepšený způsob imortalizace buněk lidské kůže pro získání imortalizovaných keratinocytů a melanocytů vyznačující se tím, že zahrnuje následující
5 kroky:
(i) získání vzorku lidské kožní tkáně;
(ii) příprava vzorku lidské kůže pro kultivaci in vitro;
(iii) získání keratinocytů a/nebo melanocytů z uvedeného připraveného vzorku kůže a vysetí uvedených keratinocytů io a/nebo melanocytů do bezsérového růstového média na kultivační plotny opatřené povlakem obsahujícím fibronectin, kolagen I a BSA, který umožňuje přichycení buněk a růst;
(iv) výměna média podle potřeba pro optimalizaci konfluentního růstu kultivovaných buněk s průběžným
15 udržováním povlaku na kultivačních deskách;
(v) převedení keratinocytů nebo melanocytů do bezsérového selekčního média na kultivační desky opatřené podobným povlakem;
(vi) infekce keratinocytů nebo melanocytů retrovirálním
20 konstruktem;
(vii) převedení výsledných imortalizovaných keratinocytů nebo melanocytů do bezsérového proliferativního média vhodného pro proliferaci imortalizovaných keratinocytů nebo melanocytů na podobně potažených kultivačních deskách; a
25 (viii) převedení získaných proliferovaných keratinocytů na bezsérové diferenciační médium, které obsahuje vysokou koncentraci vápníku na podobně předem potažené kultivační misky.
• ·
-45 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, ž e retrovirálním konstruktem je SV40 konstrukt pl_XSHD+SV40(#328) nebo konstrukt HPV16 pLXSHD+E6/E7.
5 14. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, ž e bezsérové médium v kroku (iii) je médium NR-3.
15. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, ž e médium v kroku (v) je médium NR-3 nebo NR-4.
16. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, ž e proliferační médium v kroku (vii) je médium NR-2 nebo NR-3 a médium M2 pro melanocyty.
15 17. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, ž e diferenciačním médiem v kroku (viii) je médium NR-2 nebo modifikované médium MCDB 153 obsahující koncentraci vápníku alespoň 1,5 mM.
2o 18. Nové bezsérové kultivační médium vhodné pro izolaci a produkci lidských keratinocytů a melanocytů, které zachovává schopnost diferenciace a exprese proteinů a enzymů diferenciovaných lidských keratinocytů a melanocytů i po vysokém počtu pasáží, vyznačující se tím,
2s že obsahuje: aminokyseliny nebo soli aminokyselin:
anorganické soli; vitaminy; adenin, ethanolamin, glukózu, HEPES, fenolčerveň, putrescin 2HCI, kyselinu thioktovou, thiamin HCI, thymidin, epidermální růstový faktor; inzulín;
-46hydrokortizon; transferin; fosfoethanolamin; a extrakt z hovězí hypofýzy.
19. Médium podle nároku 18, vyznačující se tím,
5 že dále obsahuje epinefrin.
20. Médium podle nároku 19, vyznačující se tím, ž e koncentrace epinefrinu je dostatečná pro zvýšení růstu keratinocytů.
21. Médium podle nároku 18, vyznačující se tím, ž e aminokyseliny obsažené v médiu jsou zvoleny ze skupiny:
L-alanin, L-arginin-HCI, asparagin-H2O, kyselina l-arparagová, L-cystein-HCI-H2O, kyselina L-glutamová, glutamin, glycin, L15 histidin-HCI-H2O, L-izoleucin, L-leucin, L-lyzin-HCI, Lmethionin, L-fenylalanin, L-prolin, L-serin, L-threonin, Ltryptofan, L-tyrozin, L-valin a jejich soli.
22. Médium podle nároku 18, vyznačující se tím,
2o že uvedené anorganické soli jsou zvoleny ze skupiny:
metavanadičnan amonný, molybdenan amonný, chlorid vápenatý, síran měďnatý, síran železnatý, chlorid hořečnatý, chlorid manganatý, síran nikelnatý, chlorid draselný, octan sodný, hydrogenuhličitan sodný, chlorid sodný,
2s hydrogenfosforečnan sodný, pyrohroznan sodný, seleničitan sodný, křemičitan sodný, chlorid cínatý a síran zinečnatý.
23. Médium podle nároku 18, vyznačující se tím, ž e vitaminy jsou zvoleny ze skupiny:
• ·
-47d-biotin, d-pantothenan vápenatý, cholinchlorid, kyanokobalamin, kyselina listová, i-inozitol, nikotinamid, pyridoxin a riboflavin.
5 24. Nové bezsérové médium pro izolaci, produkci a/nebo udržování imortalizovaných keratinocytů a/nebo melanocytů, vyznačující se tím, že je zvoleno ze skupiny médium NR-2, médium NR-3 a médium NR-4.
io 25. Zlepšený test využívající diferenciovaných keratinocytů a/nebo melanocytů, vyznačující se tím, že zlepšení zahrnuje použití imortalizovaných keratinocytů a/nebo melanocytů podle nároku 1.
15 26. Test podle nároku 25, vyznačující se tím, ž e buňky jsou zvoleny ze skupiny DK2-NR (DSM ACC2238), DK3-NR (DSM ACC2239), DM2-NR (CNCM 1-1796) a FK2-NR (DSM ACC2240).
2o 27. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, ž e uvedeným testem je test zánětu.
28. Zlepšený test využívající primárních melanocytů nebo keratinocytů, vyznačující se tím, že zlepšení
25 zahrnuje použití primárních melanocytů nebo keratinocytů získaných podle nároku 12 (iii).
29. Test podle nároku 28, vyznačující se tím, ž e uvedeným testem je test zánětu.
• ·
-48 30. Zlepšený způsob vytváření kožních štěpů, vyznačující se tím, že zlepšení zahrnuje použití primárních keratinocytů nebo melanocytů vytvořených
5 podle nároku 12 (iii) jako kožní tkáně.
CZ0194598A 1995-12-21 1996-12-19 Imortalizované bunecné linie a zivné médium CZ297289B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US57648395A 1995-12-21 1995-12-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ194598A3 true CZ194598A3 (cs) 1998-11-11
CZ297289B6 CZ297289B6 (cs) 2006-10-11

Family

ID=24304605

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0194598A CZ297289B6 (cs) 1995-12-21 1996-12-19 Imortalizované bunecné linie a zivné médium

Country Status (23)

Country Link
US (2) US6423540B2 (cs)
EP (2) EP0780469B1 (cs)
JP (1) JP4404965B2 (cs)
KR (1) KR100455006B1 (cs)
CN (1) CN1154717C (cs)
AT (1) ATE199390T1 (cs)
AU (1) AU730222B2 (cs)
BR (1) BR9612256B1 (cs)
CA (1) CA2234118C (cs)
CZ (1) CZ297289B6 (cs)
DE (1) DE69611894T2 (cs)
DK (1) DK0780469T3 (cs)
ES (1) ES2155166T3 (cs)
GR (1) GR3035719T3 (cs)
HU (1) HU226195B1 (cs)
IL (1) IL124191A (cs)
NO (1) NO326190B1 (cs)
NZ (1) NZ325814A (cs)
PL (1) PL195108B1 (cs)
PT (1) PT780469E (cs)
RU (1) RU2215030C2 (cs)
SK (1) SK283314B6 (cs)
WO (1) WO1997023602A1 (cs)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE199390T1 (de) * 1995-12-21 2001-03-15 Nestle Sa Unsterbliche humane hautzell-linien und serumfreies medium für ihre herstellung
SK286870B6 (sk) * 1998-04-17 2009-06-05 Soci�T� Des Produits Nestl� S.A. Ľudská keratinocytová bunková línia, in vitro spôsob imortalizácie ľudských kožných buniek, použitie ľudskej bunkovej línie a umelá koža s jej obsahom
US6964869B2 (en) 1998-07-13 2005-11-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Method and composition for skin grafts
CN1087778C (zh) * 1999-03-02 2002-07-17 华东理工大学 杂交瘤细胞无血清培养基
DE19912798C1 (de) * 1999-03-10 2000-02-17 Andreas Jordan Verfahren zur Kultivierung von Krebszellen aus Humangewebe und Vorrichtung zur Aufbereitung von Gewebeproben
AUPR298901A0 (en) 2001-02-07 2001-03-08 McComb Foundation, Inc., The Cell suspension preparation technique and device
ATE368856T1 (de) * 2001-04-24 2007-08-15 Wisconsin Alumni Res Found Verfahren und zusammensetzung für hauttransplantate
WO2002091999A2 (en) 2001-05-09 2002-11-21 Geron Corporation Treatment for wounds
US20030022369A1 (en) * 2001-05-18 2003-01-30 Helen Fillmore Differentiation of specialized dermal and epidermal cells into neuronal cells
CA2452660A1 (en) * 2001-07-06 2003-01-16 Lipomics Technologies, Inc. Generating, viewing, interpreting, and utilizing a quantitative database of metabolites
GB0208041D0 (en) 2002-04-08 2002-05-22 Lonza Biologics Plc Method of culturing animal cells
US20050025737A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Sebagh Jean Louis Compositions containing melon extracts
JP4532493B2 (ja) * 2003-09-18 2010-08-25 レイベン バイオテクノロジーズ，インコーポレイティド 細胞培養培地
WO2005071065A1 (en) * 2004-01-26 2005-08-04 Cognis France S.A.S Method for studying functional interactions between sensory neurons and keratinocytes or melanocytes
ES2622508T3 (es) 2005-03-17 2017-07-06 Stratatech Corporation Sustitutos de piel con pureza mejorada
EP1818392B1 (en) * 2006-02-14 2010-08-25 Genetix Limited Cell culture medium
WO2010065907A2 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Use of a rock inhibitor to sustain primary human keratinocytes in a proliferative state
WO2010134619A1 (ja) * 2009-05-18 2010-11-25 国立大学法人東北大学 人工多能性幹細胞からの上皮系前駆細胞・幹細胞群及び角膜上皮細胞群の分化誘導方法
KR101768632B1 (ko) * 2011-05-18 2017-08-17 (주)아모레퍼시픽 칼슘 펄스를 통한 배양상피세포층의 분리방법
ES2627342T3 (es) 2011-07-12 2017-07-27 Foodchek Systems, Inc. Medio de cultivo, método para cultivar Salmonella y E. coli y método para detectar Salmonella y E. coli
WO2013129885A1 (ko) * 2012-02-28 2013-09-06 건국대학교 산학협력단 세포 배양액
WO2014142038A1 (ja) 2013-03-11 2014-09-18 Ｊｃｒファーマ株式会社 ヒト角膜上皮シートの製造法
AU2013205148B2 (en) 2013-03-14 2014-10-30 AVITA Medical Americas, LLC Systems and methods for tissue processing and preparation of cell suspension therefrom
WO2016085304A1 (ko) * 2014-11-28 2016-06-02 (주)아모레퍼시픽 멜라닌 세포주 계대배양계 및 이를 이용한 노화 수준 판단, 미용 정보 제공, 또는 스크리닝 방법
WO2016122438A1 (en) * 2015-01-26 2016-08-04 Halliburton Energy Services, Inc. Rotating superhard cutting element
CN105238739A (zh) * 2015-11-11 2016-01-13 朱宁文 临床治疗级细胞治疗用黑色素细胞(melanocytes)规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法
CN106520674A (zh) * 2016-12-24 2017-03-22 严志海 一种用于表皮黑素细胞体外培养的无血清培养基
CN107115219A (zh) * 2017-05-12 2017-09-01 青岛赛欧凯普图乐生物医药有限公司 一种纤维芽母细胞活化液面膜配方
CN114058565A (zh) * 2020-07-31 2022-02-18 上海尚瑞生物医药科技有限公司 一种无血清的黑素母细胞培养液及其培养方法
KR102583179B1 (ko) * 2020-11-27 2023-09-26 (주)엑셀세라퓨틱스 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포 수립 또는 배양용 배지 조성물

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4940666A (en) * 1983-07-15 1990-07-10 University Patents, Inc. Process and defined medium for growth of human epidermal keratinocyte cells
US4885238A (en) 1987-10-30 1989-12-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Immortalized human bronchial epitherial mesothelial cell lines
US5292655A (en) * 1990-01-29 1994-03-08 Wille Jr John J Method for the formation of a histologically-complete skin substitute
US5376542A (en) 1992-04-27 1994-12-27 Georgetown University Method for producing immortalized cell lines using human papilluma virus genes
EP0757558A4 (en) * 1994-04-12 1999-06-16 Alza Corp METHOD FOR DETECTING AGENTS THAT MODULATE AN INFLAMMATORY SKIN REACTION
DE19617261A1 (de) 1995-04-21 1996-11-28 Naeher Helmut Dr Med Priv Doz Hautverträglichkeitstest
ATE199390T1 (de) * 1995-12-21 2001-03-15 Nestle Sa Unsterbliche humane hautzell-linien und serumfreies medium für ihre herstellung

Also Published As

Publication number Publication date
CZ297289B6 (cs) 2006-10-11
DE69611894T2 (de) 2001-09-13
JP4404965B2 (ja) 2010-01-27
PL195108B1 (pl) 2007-08-31
NZ325814A (en) 2000-10-27
AU730222B2 (en) 2001-03-01
NO326190B1 (no) 2008-10-13
US6949381B2 (en) 2005-09-27
JP2000506374A (ja) 2000-05-30
CN1205737A (zh) 1999-01-20
DK0780469T3 (da) 2001-03-26
US6423540B2 (en) 2002-07-23
SK283314B6 (sk) 2003-05-02
CA2234118A1 (en) 1997-07-03
GR3035719T3 (en) 2001-07-31
CN1154717C (zh) 2004-06-23
DE69611894D1 (de) 2001-04-05
KR19990071817A (ko) 1999-09-27
BR9612256B1 (pt) 2010-08-10
EP0780469B1 (fr) 2001-02-28
IL124191A (en) 2004-06-01
US20020012993A1 (en) 2002-01-31
KR100455006B1 (ko) 2005-01-13
EP0877797A1 (en) 1998-11-18
HU226195B1 (hu) 2008-06-30
BR9612256A (pt) 1999-07-13
EP0780469A1 (fr) 1997-06-25
ES2155166T3 (es) 2001-05-01
NO982810L (no) 1998-08-21
WO1997023602A1 (en) 1997-07-03
HUP9903742A3 (en) 2000-10-30
AU1305497A (en) 1997-07-17
SK83598A3 (en) 1999-01-11
ATE199390T1 (de) 2001-03-15
PT780469E (pt) 2001-06-29
RU2215030C2 (ru) 2003-10-27
HUP9903742A2 (hu) 2000-03-28
NO982810D0 (no) 1998-06-18
PL327320A1 (en) 1998-12-07
US20020042129A1 (en) 2002-04-11
CA2234118C (en) 2009-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6423540B2 (en) Immortalized human skin cell lines and novel serum-free medium useful for the production thereof
JP2000506374A5 (cs)
AU621972B2 (en) Cell culture medium for human liver epithelial cell line
US5529920A (en) Human liver epithelial cell line and culture media therefor
RU98113400A (ru) Улучшенные иммортализованные клеточные линии кожи человека и не содержащая сыворотки среда для их получения
AU756151B2 (en) Immortalised cell lines derived from normal human skin tissues
MXPA00009558A (en) Immortalised cell lines derived from normal human skin tissues

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 19961219