WO2016085304A1 - 멜라닌 세포주 계대배양계 및 이를 이용한 노화 수준 판단, 미용 정보 제공, 또는 스크리닝 방법 - Google Patents

멜라닌 세포주 계대배양계 및 이를 이용한 노화 수준 판단, 미용 정보 제공, 또는 스크리닝 방법 Download PDF

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WO2016085304A1
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melanin
late
electric
tyrosinase
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이은경
고명진
최현정
조은경
이태룡
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(주)아모레퍼시픽
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • Disclosed herein is a novel melanin cell line passage system and a method for determining aging level and providing cosmetic information using the same.
  • Cells are removed from the animals and cultured in a culture dish or test tube by transferring them to a new culture dish for cell proliferation and subsequently culturing the cells.
  • the cells grow as a layer on the bottom of the petri dish.
  • the cells grow as a layer on the bottom of the petri dish.
  • the cells continue to divide in this state, they no longer have enough space to grow on the culture dish and stop proliferating.
  • some of the cells must be removed from the culture dish and transferred to a new culture dish, which is called subculture.
  • Separation enzymes, experimental temperature, and humidity are important for subculture, and in particular with regard to isolating enzymes, it is necessary to process a separating enzyme, such as trypsin, which can separate cells from the culture vessel. Since most of these isoproteinases are proteolytic enzymes, they can cause lasting damage to the cells over time, causing them to be negatively affected by growth or, in severe cases, to die. Therefore, in the passage of cells, it is very important to treat the separating enzyme at an appropriate concentration for a suitable time, and for this, it is common to continuously monitor how the cells are separated from the culture vessel while observing the shape of the cells under a microscope. .
  • a separating enzyme such as trypsin
  • Patent Document 1 KR10-1999-0071817 A
  • Non-Patent Document 1 J. Invest. Dermatol. (2005) 124, 1053-1061
  • an object of the present invention is to provide a melanocyte cell line passage system embodying the in vivo environment.
  • an object of the present invention is to provide a method for determining senescence levels using melanin cell line passage system.
  • an object of the present invention is to provide a method for providing cosmetic information to a subject using a melanocyte cell line passage system.
  • an electric melanin comprising any one or more of PA2, PA3, PA4, PA5 and PA6 cell lines, which are melanocyte blast lines PA1 cell line and the melanocyte blast line 1, 2, 3, 4, and 5 passages, respectively Cell lines; And melanin, including melanin cell lines comprising any one or more of PA7, PA8, PA9, PA10, PA11 and PA12 cell lines, each of which has been passaged 6, 7, 8, 9, 10 and 11 times of the melanocyte blast line Provide a subculture of cells.
  • a melanin cell line passaged n times wherein n is one or more.
  • tyrosinase tyrosinase, microphthalmia-associated tranion factor (MITF), tyrosinase-associated protein- in a cell line corresponding to one or more passages of the passage system; Tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2), histone deacetylase 5 (enhancer of zeste homolog 1), p16 and p21 Measuring at least one expression range selected from the group consisting of; b) tyrosinase, microphthalmia-associated tranion factor (MITF), tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase Measuring at least one expression amount selected from the group consisting of related protein-2 (TRP-2), histone deacetylase 5, enhancer of zeste homolog 1 (EZH1), p16 and p21; And c) determining which of the passage passages of
  • step i) selecting a cosmetic or cosmetic method suitable for each passage subculture; And ii) providing beauty information on cosmetics, health food or beauty methods according to step i) to the subject whose aging level is determined.
  • a) treating a candidate with one or more melanocyte cell lines of the passage system b) tyrosinase, microphthalmia-associated tranion factor (MITF), tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase-related protein -2 (TRP-2), group 1 consisting of EZH1 (enhancer of zeste homolog 1), p16 and p21; And detecting at least one expression change selected from the second group consisting of Histonedeacetylase 5; And c) selecting a substance that reduces one or more expressions selected from the first group or increases the expression of the second group.
  • MITF microphthalmia-associated tranion factor
  • TRP-1 tyrosinase related protein-1
  • TRP-2 tyrosinase-related protein -2
  • group 1 consisting of EZH1 (enhancer of zeste homolog 1), p16 and p21
  • EZH1 enhancer
  • the passage system of the present invention provides a passage system comprising melanocyte blast lines, passaged electric melanocytes and late melanocytes.
  • the passage system of the present invention provides an in vitro environment in which various factors, enzymes, and the like are expressed similarly to the in vivo environment, thereby allowing the passage of cells passaged a specific number of times to various experiments. It is useful for determining the level of aging, providing cosmetic information and screening of cell rejuvenation inducing substances.
  • Figure 1 shows the change in phenotype of melanocytes by passage (left: initial passage, right: late passage).
  • FIG. 2 shows the change in the expression of melanin pigment formation capacity-related factors in melanocytes by passage (PA means each passage).
  • Figure 3 shows the aging index of melanocytes by passage (PA means each passage, upper: p16 mRNA expression amount, p21: mRNA expression amount of p21).
  • FIG 4 shows the change in expression of melanin pigment formation related enzymes by passage (PA means each passage).
  • the present invention is an electric melanin cell line comprising any one or more of the PA2, PA3, PA4, PA5 and PA6 cell lines, each melanocyte cell line and melanocyte cell line passage 1, 2, 3, 4 and 5 times ; And a late melanin cell line comprising any one or more of PA7, PA8, PA9 PA10, PA11, and PA12 cell lines, each of which has been melaninated 6, 7, 8, 9, 10, and 11 times. Subculture system.
  • cell line may refer to a clone of cultured melanocytes, which may continue to divide or proliferate through culturing melanocytes and join the stem.
  • melanocyte blast line means a melanin cell line before subculture.
  • passage system may refer to a system including any one or more of cell lines passaged one to several times.
  • “early (or early)” and “late” are classified according to the number of passages of melanin cell lines, for example, “electrical melanin cell line” refers to melanin blast line 1, 2, 3, 4 and May refer to any one or more of the PA2, PA3, PA4, PA5 and PA6 cell lines, passaged five times, and the “late melanin cell line” refers to melanin blast line 6, 7, 8, 9, 10 and 11 passages, respectively. It may mean any one or more of the cultured, PA7, PA8, PA9, PA10, PA11 and PA12 cell line.
  • the late melanin cell line may include a first late melanin cell line and a second late melanin cell line.
  • the first electric melanin cell line may include one or more of PA1, PA2 and PA3 cell lines
  • the second electric melanin cell line may include one or more of PA4, PA5 and PA6 melanin cell lines.
  • the first late melanin cell line may include one or more of PA7, PA8, and PA9 cell lines
  • the second late melanin cell line may include one or more of PA10, PA11, and PA12 melanin cell lines.
  • the electric melanin cell line may be a PA3 cell line
  • the late melanin cell line may be a PA11 cell line.
  • the electric melanin cell line may be a cell line of Accession No. KCTC12906BP
  • the late melanin cell line may be a cell line of Accession No. KCTC12907BP
  • the PA3 cell line is a cell line of Accession No. KCTC12906BP
  • the PA11 cell line is a cell line of Accession No. KCTC12907BP.
  • n passage or passage n means a cell line passaged n-1 times the parent cell line.
  • three passages or PA3 means a cell line passaged two times in the parent cell line.
  • N is an integer.
  • the passage culture system is composed of melanin cells composed of PA1, PA2, PA3, PA4, PA5, PA6, PA7, PA8, PA9, PA10, PA11, and PA12 cell lines. It may be a subculture system of.
  • n melanin cell line passaged n times, wherein n may be a cell line of one or more.
  • n may be 1 to 11, but is not limited thereto. Specifically, 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 11 or more, 12 or more, 13 or more, 13 or less, 12 or less, 11 or less, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, 2 or less, 1 or less, but are not limited thereto.
  • n may be a cell line of 2 or 10, but is not limited thereto.
  • the cell line may be a cell line of Accession No. KCTC12906BP or KCTC12907BP.
  • the PA3 cell line may be an accession number KCTC12906BP cell line and the PA11 cell line may be an accession number KCTC12907BP cell line.
  • the present invention provides a) tyrosinase, a microphthalmia-associated tranion factor (MITF), a tyrosinase-related protein in a cell line corresponding to one or more passages of the subculture.
  • MITF microphthalmia-associated tranion factor
  • Tyrosinase related protein-1 TRP-1
  • TRP-2 tyrosinase related protein-2
  • histone deacetylase 5 EZH1 (enhancer of zeste homolog 1), p16 and p21 Measuring at least one expression range selected from the group consisting of; b) tyrosinase, microphthalmia-associated tranion factor (MITF), tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase Measuring at least one expression amount selected from the group consisting of related protein-2 (TRP-2), histone deacetylase 5, enhancer of zeste homolog 1 (EZH1), p16 and p21; And c) determining which of the passage passages of step a) belongs to the passage.
  • MITF microphthalmia-associated tranion factor
  • TRP-1 tyrosinase related protein-1
  • EZH1 enhancer of zeste homolog 1
  • the expression level measurement of the subject may be to measure the expression level in the melanocytes of the subject, but is not limited thereto.
  • aging may mean a phenomenon in which a structure and a function of a cell, a tissue, or a living body decline with time, and may include, for example, skin aging.
  • skin aging may mean a change in the type and intangible of the skin appearance that will appear on the skin over time, and may specifically include apparent changes and functional disorders, endogenous aging and exogenous aging. It may include.
  • subject may mean, but is not limited to, a tissue, a cell constituting a tissue, an intracellular substance, and a body fluid (eg, blood).
  • body fluid eg, blood
  • the aging may be photoaging, and specifically, may include aging by ultraviolet rays.
  • the expression amount measurement of the said subject may be measuring the expression amount in the melanocyte of a subject.
  • the present invention in another aspect, i) selecting a cosmetic, health food or beauty method suitable for each passage subculture; And ii) providing beauty information on cosmetics, health foods or beauty methods according to step i) to the subject whose aging level is determined.
  • cosmetics may refer to any material that may have a medical function in addition to the cosmetic function.
  • the cosmetic composition may include, for example, a basic cosmetic, a makeup cosmetic, a hair cosmetic, a body cosmetic, and the like, and its formulation is not particularly limited and may be appropriately selected as desired.
  • the cosmetic composition is formulated into solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing, oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations, sprays, and the like. It may be, but is not limited thereto.
  • Basic cosmetics such as (O / W) and water-in-oil (O / W), color cosmetics such as lipstick, makeup base or foundation, cleaning agents such as shampoo, rinse, body cleanser, toothpaste or mouthwash, hair tonic
  • a cosmetic composition for hair such as a hair dressing agent such as a gel or a mousse, a wool or a hair dye.
  • health food is prepared by using nutrients or ingredients (functional ingredients) having useful functions for the human body, which are easily deficient in a daily meal, and maintaining the normal function of the human body or activating physiological functions. It may mean a food that maintains and improves health, but is not limited thereto.
  • the health food may be manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, and the like, but is not limited thereto and may be manufactured and processed in any form according to the law.
  • “beauty” is to perform physical and chemical techniques to the body, and may include, for example, skin beauty.
  • the skin care may mean maintaining the beautiful and healthy skin by directly or indirectly using the physical and chemical methods to increase the physiological function and activate the metabolism to supply nutrition, skin tissue or It may include improving the aging or inducing rejuvenation of the individual cells that make up skin tissue.
  • cell rejuvenation may mean returning aged cells to young and healthy cells.
  • the cell rejuvenation may mean that the late passage cells return to the same or similar state as the cells in the previous period.
  • a PA12 cell line is in a PA1 cell line
  • a PA12 cell line is in a PA2 cell line
  • a PA12 cell line is in a PA3 cell line
  • a PA12 cell line is in a PA4 cell line
  • a PA12 cell line is in a PA5 cell line state
  • a PA12 cell line is In the state of the PA6 cell line, in the state of the PA11 cell line, in the state of the PA1 cell line, in the state of the PA11 cell line, in the state of the PA2 cell line, in the state of the PA11 cell line, in the state of the PA11 cell line, and in the state of the PA5 cell line.
  • PA11 cell line to PA6 cell line PA10 cell line to PA1 cell line, PA10 cell line to PA2 cell line, PA10 cell line to PA3 cell line, PA10 cell line to PA4 cell line, PA10 cell line to PA5 cell line
  • PA10 cell line in the state of PA6 cell line PA9 cell line in the state of PA1 cell line, PA9 cell line in the state of PA2 cell line, PA9 cell line in the state of PA3 cell line, PA9 cell line in the state of PA4 cell line Attention state may mean that the PA9 cell line returns to the state of the PA5 cell line, and the PA9 cell line returns to the state of the PA6 cell line.
  • the present invention provides a method for treating a melanocyte cell line comprising: a) treating a candidate substance with at least one melanocyte cell line in the passage system; b) tyrosinase, microphthalmia-associated tranion factor (MITF), tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase-related protein -2 (TRP-2), group 1 consisting of EZH1 (enhancer of zeste homolog 1), p16 and p21; And detecting at least one expression change selected from the second group consisting of Histonedeacetylase 5; And c) selecting a substance that decreases the expression of one or more selected from the first group or increases the expression of the second group.
  • MITF microphthalmia-associated tranion factor
  • TRP-1 tyrosinase related protein-1
  • TRP-2 tyrosinase-related protein -2
  • group 1 consisting of EZH1 (enhancer of zest
  • the method is, after treatment of the candidate substance to the late melanin cell line, when at least one expression level selected from the first group is lower than the expression level in the electric melanin cell line, or the agent When the at least one expression level selected from the group 2 is higher than the expression level in the electric melanin cell line, the method may further include determining the cell rejuvenation inducing substance.
  • the electric melanin cell line may be a PA3 cell line
  • the late melanin cell line may be a PA11 melanin cell line.
  • the PA3 cell line may be a cell line of Accession No. Accession No. KCTC12906BP, and the PA11 cell line may be a cell line of Accession No. KCTC12907BP.
  • M-254 medium (Gibco BRL) with human primary melanocytes (Life Technologies, CA, USA) added human melanocyte growth supplement (HMGS), Gibco BRL, NY, USA , NY, USA)) is used to change the medium in a 100 mm culture dish every two days, incubated in a 5% CO 2 incubator at room temperature until the cell density occupies 80% of the plate area, another 100 mm culture The following subcultures were carried out in a dish at a ratio of 1: 4.
  • HMGS human melanocyte growth supplement
  • the phenotype of early and late melanocytes was observed with an optical microscope (magnification: 400x).
  • the phenotype of the cells was observed 40 times magnified by light microscopy in the living state containing the medium. As a result, FIG. 1 was obtained.
  • TRP-1 tyrosinase, microphthalmia-associated tranion factor (MITF), tyrosinase related protein-1 -1, TRP-1) and Q-PCR were performed to confirm the relationship between changes in expression levels of tyrosinase-related protein-2 (TRP-2)).
  • TRP-2 tyrosinase-related protein-2
  • Primers are TaqMan products manufactured by Applied Biosystems, respectively: tyrosinase (TYR, product number: Hs01099965_m1), MITF (product number: Hs01117294_m1), TRP1 (product number: Hs00167051_m1), TRP2 (product number: Hs01095856_m1) .
  • FIG. 2 tyrosinase, microphthalmia-associated tranion factor (MITF), tyrosinase related protein-1 (TRP-1), and The expression of mNRA of tyrosinase-related protein-2 (TRP-2) was increased in the late passage.
  • the graph shows the vertical axis of the gene as the amount of mRNA expression / GAPDH mRNA expression of each gene. to be).
  • FIG. 3 it can be seen that the mRNA expression levels of p16 and p21 were significantly increased in the late passage of the culture (Fig. 1, the vertical axis of the graph is the amount of mRNA expression / GAPDH mRNA expression of each gene and the relative expression amount of the gene). to be).
  • HDAC5 histone deacetylase 5
  • EZH1 zeste homolog 1
  • Primers are TaqMan products manufactured by Applied Biosystems, respectively: HDAC5 (product number: Hs00608366_m1) and EZH1 (product number: Hs00940463_m1).
  • HDAC5 histone deacetylase 5
  • EZH1 promoted melanin pigment formation.
  • the graph vertical axis in the figure is the relative expression level of the gene as mRNA expression level / GAPDH mRNA expression amount of each gene. ).

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Abstract

본 명세서에는 신규한 멜라닌 세포주 계대배양계가 개시된다. 상기 계대배양계는 계대배양된 전기 멜라닌 세포 및 후기 멜라닌 세포를 포함하는 계대배양계를 제공한다. 이에, 상기 계대배양계는 생체 내 환경(in vivo)과 유사한 생체 외(in vitro)환경을 제공함으로써, 노화 수준 판단, 미용 정보 제공 및 세포 회춘 유도물질을 스크리닝하는데 유용하다.

Description

멜라닌 세포주 계대배양계 및 이를 이용한 노화 수준 판단, 미용 정보 제공, 또는 스크리닝 방법
본 명세서에는 신규한 멜라닌 세포주 계대배양계와 이를 이용한 노화 수준 판단 방법 및 미용 정보 제공방법이 개시된다.
세포 증식을 위해 새로운 배양접시에 옮겨 세포의 대(代)를 계속 이어서 배양하는 방법으로 세포를 동물로부터 떼어내어 배양접시나 시험관에서 배양하게 된다. 배양접시에서 세포를 배양하면, 세포는 배양접시의 바닥에 한 층으로 붙어서 자라게 된다. 이 상태에서 세포들이 계속 분열하다 보면 더 이상 배양접시에 붙어 증식할 수 있는 공간이 부족하여 증식을 멈추게 된다. 이러한 세포들을 계속하여 증식하게 하려면 세포의 일부를 배양접시에서 떼어서 새로운 배양접시에 옮겨주어야 하는데, 이를 계대배양이라고 한다.
일반적으로, 정상에 가까운 세포에는 접촉저지(contact inhibition)의 성질이 있으므로, 이러한 성질을 유지하기 위해서는 배양접시에 가득하게 되기 전에 혹은 가득하게 되면 곧바로 계대하는 것이 일반적이다. 합류(Confluent)로 된 상태에서 계속 배양하면, 그러한 상태에서도 증식하는 세포가 점차로 증가하여 접촉저지의 성질이 없어지기도 한다.
계대배양을 위해서는 분리 효소, 실험 온도, 습도 등이 중요하며 특히 분리 효소와 관련하여, 세포를 배양 용기에서 분리할 수 있는 트립신과 같은 분리 효소를 처리하게 되는데(단, 부유하는 세포는 이러한 처리가 필요하지 않다), 이러한 분리 효소의 대부분이 단백질 분해 효소이므로, 적정한 시간이 경과되면 세포에 지속적인 손상을 주게 되어, 세포는 생장에 부정적인 영향을 받거나 심한 경우 사멸하게 된다. 따라서 세포를 계대배양하는데 있어서, 분리 효소를 적정한 농도로 적절한 시간 동안 처리하는 것이 대단히 중요하며, 이를 위해 현미경으로 세포의 형상을 관찰하면서 세포가 배양 용기에서 얼마나 분리되었는가를 지속적으로 모니터링하는 것이 일반적이다.
한편, 대부분의 세포는 계대배양에도 불구하고, 무한 증식하지 않고 일정 횟수에 다다르면, 노화되어 사멸하게 되는데 이를 계대 배양 유도성 노쇠 또는 노화라고 한다.
(특허문헌 1) KR10-1999-0071817 A
(비특허문헌 1) J. Invest. Dermatol.(2005) 124, 1053-1061
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 생체 내 환경을 구현한 멜라닌 세포주 계대배양계를 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 멜라닌 세포주 계대배양계를 이용하여, 노화 수준을 판단하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 멜라닌 세포주 계대배양계를 이용하여, 대상에게 미용 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 멜라닌 모세포주인 PA1 세포주 및 상기 멜라닌 모세포주를 각각 1, 2, 3, 4, 및 5회 계대배양한, PA2, PA3, PA4, PA5 및 PA6 세포주 중 어느 하나 이상을 포함하는 전기 멜라닌 세포주; 및 상기 멜라닌 모세포주를 각각 6, 7, 8, 9, 10 및 11회 계대배양한, PA7, PA8, PA9, PA10, PA11 및 PA12 세포주 중 어느 하나 이상을 포함하는 후기 멜라닌 세포주를 포함하는, 멜라닌 세포의 계대배양계를 제공한다.
다른 측면에서, n회 계대배양된 멜라닌 세포주로서, 상기 n은 1 이상인, 세포주를 제공한다.
다른 측면에서, a) 상기 계대배양계의 하나 이상의 계대에 해당하는 세포주에서, 타이로시나아제(tyrosinase), 마이크로프탈미아 연관 전사인자(microphthalmia-associated tranion factor, MITF), 티로시나아제 관련 단백질-1(tyrosinase related protein-1, TRP-1), 티로시나아제 관련 단백질-2(TRP-2), 히스톤탈아세틸화효소 5(Histonedeacetylase 5), EZH1(enhancer of zeste homolog 1), p16 및 p21로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현양 범위를 측정하는 단계; b) 대상의 타이로시나아제(tyrosinase), 마이크로프탈미아 연관 전사인자(microphthalmia-associated tranion factor, MITF), 티로시나아제 관련 단백질-1(tyrosinase related protein-1, TRP-1), 티로시나아제 관련 단백질-2(TRP-2), 히스톤탈아세틸화효소 5(Histonedeacetylase 5), EZH1(enhancer of zeste homolog 1), p16 및 p21로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현양을 측정하는 단계; 및 c) 대상이 상기 a) 단계의 계대배양계 계대들 중 어느 계대에 속하는지 결정하는 단계를 포함하는, 노화 수준 판단 방법을 제공한다.
다른 측면에서, i) 상기 계대배양계 각 계대에 적합한 화장료 또는 미용 방법을 선정하는 단계; 및 ii) 상기 노화 수준이 결정된 대상에게 상기 i) 단계에 따라, 화장료, 건강식품 또는 미용 방법에 대한 미용 정보를 제공하는 단계를 포함하는, 미용 정보 제공 방법을 제공한다.
다른 측면에서, a) 상기 계대배양계의 하나 이상의 계대의 멜라닌 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계; b) 타이로시나아제(tyrosinase), 마이크로프탈미아 연관 전사인자(microphthalmia-associated tranion factor, MITF), 티로시나아제 관련 단백질-1(tyrosinase related protein-1, TRP-1), 티로시나아제 관련 단백질-2(TRP-2), EZH1(enhancer of zeste homolog 1), p16 및 p21로 이루어진 제 1군; 및 히스톤탈아세틸화효소 5(Histonedeacetylase 5)로 이루어진 제 2군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현 변화를 검출하는 단계; 및 c) 상기 제 1군에서 선택된 하나 이상의 발현을 감소시키거나, 상기 제 2군의 발현을 증가시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 세포 회춘 유도 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
일 측면에 있어서, 본 발명의 계대배양계는 멜라닌 모세포주, 계대배양된 전기 멜라닌 세포 및 후기 멜라닌 세포를 포함하는 계대배양계를 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 계대배양계는 각종 인자, 효소 등이 생체 내 환경(in vivo)과 유사하게 발현한 생체 외(in vitro)환경을 제공함으로써, 특정 횟수로 계대배양된 세포를 각종 실험에 제공할 수 있으며, 노화 수준의 판단, 미용 정보의 제공 및 세포 회춘 유도 물질의 스크리닝에 유용하다.
도 1은 계대배양에 의한 멜라닌 세포의 표현형 변화를 관찰한 것이다(좌측: 초기계대, 우측: 후기 계대).
도 2는 계대배양에 의한 멜라닌 세포의 멜라닌 색소 형성능 증가 관련 인자의 발현 변화를 관찰한 것이다(PA는 각 계대를 의미).
도 3은 계대배양에 의한 멜라닌 세포의 노화 지표를 관찰한 것이다(PA는 각 계대를 의미, 위: p16의 mRNA 발현양, 아래: p21의 mRNA 발현양).
도 4는 계대배양에 의한 멜라닌 색소 형성 관련 효소의 발현 변화를 관찰한 것이다(PA는 각 계대를 의미).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, 멜라닌 모세포주 및 멜라닌 모세포주를 각각 1, 2, 3, 4 및 5회 계대배양한, PA2, PA3, PA4, PA5 및 PA6 세포주 중 어느 하나 이상을 포함하는 전기 멜라닌 세포주; 및 멜라닌 세포주를 각각 6, 7, 8, 9, 10, 및 11회 계대배양한, PA7, PA8, PA9 PA10, PA11 및 PA12 세포주 중 어느 하나 이상을 포함하는 후기 멜라닌 세포주를 포함하는, 멜라닌 세포의 계대배양계이다.
본 명세서에서, "멜라닌 세포주(cell line)"는 멜라닌 세포의 배양을 통해 계속 분열 또는 증식하여 대를 이을 수 있는, 배양 멜라닌 세포의 클론을 의미할 수 있다.
본 명세서에서, "멜라닌 모세포주"는, 계대배양 전의 멜라닌 세포주를 의미한다.
또한, 본 명세서에서 "계대배양계"는, 특정 세포주를 1회 내지 수회 계대배양한 세포주 중 어느 하나 이상을 포함하는 계를 의미할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 "전기(또는 초기)" 및 "후기"는 멜라닌 세포주의 계대배양 횟수에 따라 분류한 것으로, 예컨대, "전기 멜라닌 세포주"는 멜라닌 모세포주를 각각 1, 2, 3, 4 및 5회 계대배양한, PA2, PA3, PA4, PA5 및 PA6 세포주 중 어느 하나 이상을 의미할 수 있고, "후기 멜라닌 세포주"는 멜라닌 모세포주를 각각 6, 7, 8, 9, 10 및 11회 계대배양한, PA7, PA8, PA9, PA10, PA11 및 PA12 세포주 중 어느 하나 이상을 의미할 수 있다.
상기 전기 멜라닌 세포주는, 제1전기 멜라닌 세포주 및 제2전기 멜라닌 세포
주를 포함할 수 있고, 상기 후기 멜라닌 세포주는, 제1후기 멜라닌 세포주 및 제2후기 멜라닌 세포주를 포함할 수 있다. 상기 제1전기 멜라닌 세포주는, PA1, PA2 및 PA3 세포주 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 상기 제2전기 멜라닌 세포주는, PA4, PA5 및 PA6 멜라닌 세포주 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 상기 제1 후기 멜라닌 세포주는, PA7, PA8 및 PA9 세포주 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 상기 제2후기 멜라닌 세포주는, PA10, PA11 및 PA12 멜라닌 세포주 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 전기 멜라닌 세포주는 PA3 세포주이고, 상기 후기 멜라닌 세포주는 PA11 세포주일 수 있다.
또한, 상기와 같은 측면에서, 상기 전기 멜라닌 세포주는 기탁번호 KCTC12906BP의 세포주일 수 있고, 상기 후기 멜라닌 세포주는 기탁번호 KCTC12907BP의 세포주일 수 있다. 구체적으로, 상기 PA3 세포주는, 기탁번호 KCTC12906BP의 세포주이고, 상기 PA11 세포주는 기탁번호 KCTC12907BP의 세포주이다.
본 명세서에서, n계대 또는 계대 n(passage n 또는 PA n)은 모세포주를 n-1회 계대배양한 세포주를 의미한다. 예컨대, 3계대 또는 PA3은, 모세포주를 2회 계대배양한 세포주를 의미한다. 상기 n은 정수이다.
본 발명의 일 관점인 멜라닌 세포의 계대배양계에 있어서, 상기 계대배양계는, PA1, PA2, PA3, PA4, PA5, PA6, PA7, PA8, PA9, PA10, PA11 및 PA12 세포주로 구성된, 멜라닌 세포의 계대배양계 일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, n회 계대배양된 멜라닌 세포주로서, 상기 n은 1 이상인 세포주일 수 있다.
본 발명의 일관점인 세포주에 있어서, 상기 n은, 1 내지 11일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상일 수 있고, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 2 이하, 1 이하일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일관점인 세포주에 있어서, 상기 n은 2 또는 10인인 세포주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같은 측면에서, 상기 세포주는 기탁번호 KCTC12906BP 또는 KCTC12907BP의 세포주일 수 있다. 예컨대, PA3 세포주는 기탁번호 KCTC12906BP 세포주일 수 있고, PA11 세포주는 기탁번호 KCTC12907BP세포주일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 a) 상기 계대배양계의 하나 이상의 계대에 해당하는 세포주에서 타이로시나아제(tyrosinase), 마이크로프탈미아 연관 전사인자(microphthalmia-associated tranion factor, MITF), 티로시나아제 관련 단백질-1(tyrosinase related protein-1, TRP-1), 티로시나아제 관련 단백질-2(TRP-2), 히스톤탈아세틸화효소 5(Histonedeacetylase 5), EZH1 (enhancer of zeste homolog 1), p16 및 p21로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현양 범위를 측정하는 단계; b) 대상의 타이로시나아제(tyrosinase), 마이크로프탈미아 연관 전사인자(microphthalmia-associated tranion factor, MITF), 티로시나아제 관련 단백질-1(tyrosinase related protein-1, TRP-1), 티로시나아제 관련 단백질-2(TRP-2), 히스톤탈아세틸화효소 5(Histonedeacetylase 5), EZH1(enhancer of zeste homolog 1), p16 및 p21로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현양을 측정하는 단계; 및 c) 대상이 상기 a) 단계의 계대배양계 계대들 중 어느 계대에 속하는지 결정하는 단계를 포함하는, 대상의 노화 수준 판단 방법이다.
상기와 같은 관점에서, 상기 대상의 발현양 측정은, 대상의 멜라닌 세포 내의 발현양을 측정하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "노화"는, 시간이 흐름에 따라 세포, 조직 또는 생체의 구조와 기능이 쇠퇴하는 현상을 의미할 수 있고, 예컨대, 피부 노화를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "피부 노화"는, 시간이 흐름에 따라 피부에 나타나게 되는 피부상의 유형과 무형상의 변화를 의미할 수 있으며, 구체적으로 외견상의 변화와 기능적 장애를 포함할 수 있고, 내인성 노화 및 외인성 노화를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "대상"은, 개체의 조직, 조직을 구성하는 세포, 세포내 물질, 체액(예컨대, 혈액)을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점인 노화 수준 판단 방법에 있어서, 상기 노화는 광노화일 수 있고, 구체적으로, 자외선에 의한 노화를 포함할 수 있다.
또한, 상기와 같은 관점에 있어서, 상기 대상의 발현양 측정은, 대상의 멜라닌 세포 내의 발현양을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, i) 상기 계대배양계 각 계대에 적합한 화장료, 건강식품 또는 미용 방법을 선정하는 단계; 및 ii) 상기 노화 수준이 결정된 대상에게 상기 i) 단계에 따라 화장료, 건강식품 또는 미용 방법에 대한 미용 정보를 제공하는 단계를 포함하는, 대상에게 미용 정보를 제공하는 방법이다.
본 명세서에서 "화장료"는, 미용 기능뿐만 아니라, 미용 기능 외에 추가적으로 의학적 기능을 가질 수 있는 모든 물질을 의미할 수 있다.
구체적으로, 화장료 조성물로는 예를 들어, 기초 화장료, 메이크업 화장료, 모발용 화장료, 바디용 화장료 등이 있을 수 있고, 그 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다.
예를 들면, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연화장수, 영양화장수, 로션, 바디로션, 영양 크림, 마사지 크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 젤, 패치, 수중유(O/W)형, 유중수(O/W)형 등의 기초 화장료, 립스틱, 메이크업베이스 또는 파운데이션 등의 색조 화장료, 샴푸, 린스, 바디클렌저, 치약 또는 구강 청정제 등의 세정료, 헤어토닉, 젤 또는 무스 등의 정발제, 양모제 또는 염모제 등의 모발용 화장료 조성물로 제형화 될 수 있다.
본 명세서에서, "건강식품"은, 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분(기능성원료)을 사용하여 제조한 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 건강식품은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조, 가공될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 법률에 따라 어떤 형태로든지 제조, 가공될 수 있다
본 명세서에서, "미용"은, 신체에 물리적, 화학적 기교를 행하는 것으로, 예컨대, 피부 미용을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 피부 미용은 피부에 직간접적으로 물리적, 화학적 방법을 이용하여, 생리 기능을 높이고 신진 대사를 활성화시켜 영양을 공급함으로써 아름답고 건강한 피부를 유지시켜 주는 것을 의미할 수 있고, 피부 조직 또는 피부 조직을 구성하고 있는 개개의 세포의 노화를 개선하거나 회춘(rejuvenation)을 유도하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "세포 회춘"은, 노화된 세포를 젊고 건강한 세포로 되돌리는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 관점인 미용 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 세포 회춘은, 후기 계대배양 세포가 전기의 세포와 동등 또는 유사한 상태로 되돌아가는 것을 의미할 수 있다. 예컨대, PA12 세포주가 PA1 세포주의 상태로, PA12 세포주가 PA2 세포주의 상태로, PA12 세포주가 PA3 세포주의 상태로, PA12 세포주가 PA4 세포주의 상태로, PA12 세포주가 PA5 세포주의 상태로, PA12 세포주가 PA6 세포주의 상태로, PA11 세포주가 PA1 세포주의 상태로, PA11 세포주가 PA2 세포주의 상태로, PA11 세포주가 PA3 세포주의 상태로, PA11 세포주가 PA4 세포주의 상태로, PA11 세포주가 PA5 세포주의 상태로, PA11 세포주가 PA6 세포주의 상태로 PA10 세포주가 PA1 세포주의 상태로, PA10 세포주가 PA2 세포주의 상태로, PA10 세포주가 PA3 세포주의 상태로, PA10 세포주가 PA4 세포주의 상태로, PA10 세포주가 PA5 세포주의 상태로, PA10 세포주가 PA6 세포주의 상태로, PA9 세포주가 PA1 세포주의 상태로, PA9 세포주가 PA2 세포주의 상태로, PA9 세포주가 PA3 세포주의 상태로, PA9 세포주가 PA4 세포주의 상태로, PA9 세포주가 PA5 세포주의 상태로, PA9 세포주가 PA6 세포주의 상태로, 되돌아가는 것을 의미할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, a) 상기 계대배양계의 하나 이상의 계대의 멜라닌 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계; b) 타이로시나아제(tyrosinase), 마이크로프탈미아 연관 전사인자(microphthalmia-associated tranion factor, MITF), 티로시나아제 관련 단백질-1(tyrosinase related protein-1, TRP-1), 티로시나아제 관련 단백질-2(TRP-2), EZH1(enhancer of zeste homolog 1), p16 및 p21로 이루어진 제 1군; 및 히스톤탈아세틸화효소 5(Histonedeacetylase 5)로 이루어진 제 2군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현 변화를 검출하는 단계; 및 c) 상기 제 1군에서 선택된 하나 이상의 발현을 감소시키거나, 상기 제 2군의 발현을 증가시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 세포 회춘 유도 물질 스크리닝 방법이다.
상기와 같은 측면에서, 상기 방법은, 상기 방법은, 후기 멜라닌 세포주에 후보 물질을 처리한 후, 상기 제1군에서 선택된 하나 이상의 발현 정도가 전기 멜라닌 세포주에서의 발현 정도보다 낮을 때, 또는 상기 제2군에서 선택된 하나 이상의 발현 정도가 전기 멜라닌 세포주에서의 발현 정도보다 높을 때, 세포 회춘 유도 물질로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 전기 멜라닌 세포주는 PA3 세포주일 수 있고, 상기 후기 멜라닌 세포주는 PA11 멜라닌 세포주일 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 PA3 세포주는 기탁번호 기탁번호 KCTC12906BP의 세포주일 수 있고, 상기 PA11 세포주는 기탁번호 KCTC12907BP의 세포주일 수 있다.
이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시에는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.
[실시예 1] 멜라닌 세포의 계대배양
인간 1차 멜라닌 세포(human primary melanocyte, Life Technologies, CA, USA)를 인간 멜라닌 세포 성장 보충물(human melanocyte growth supplement(HMGS), Gibco BRL, NY, USA)를 첨가한 M-254 배지(Gibco BRL, NY, USA))를 이용하여 100mm 배양접시에서 2일 간격으로 배지를 교환하며, 상온, 5% CO2 배양기에서 세포의 밀도가 플레이트 면적의 80%를 차지할때까지 배양하고, 또다른 100mm 배양접시에 1:4의 비율로 다음 계대배양을 수행하였다.
상기 멜라닌 세포를 배양하기 위해 처음 100mm 배양접시에 담았을 때, 이 세포의 계대를 1계대(passage 1, PA1)으로 간주하였고, 계대배양은 최종 11회(PA12)까지 진행하였다.
[실시예 2] 멜라닌 세포의 계대배양에 따른 표현형 관찰
광학 현미경(배율:400배)로 초기, 후기 멜라닌 세포의 표현형을 관찰하였다. 세포의 표현형은 배지가 포함되어 있는 살아있는 상태에서 광학현미경으로 40배 확대하여 관찰하였다. 그 결과, 도 1을 얻었다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 멜라닌 세포를 계대배양을 거듭한 결과, 멜라닌 세포의 표현형이 초기에 비하여, 평평해지고, 세포체(cell body)의 크기가 증가하였고, 가지돌기(dendrite)의 갯수 및 이질성(heterogeniety)이 증가하였으며, 멜라닌 색소의 형성이 증가하는 것을 알 수 있었다.
[실시예 3] 계대배양에 의한 멜라닌 세포의 멜라닌 색소 형성능 증가 관련 인자의 발현 변화 관찰
계대배양과, 멜라닌 색소 형성과 관련이 있다고 알려진 인자들(타이로시나아제(tyrosinase), 마이크로프탈미아 연관 전사인자(microphthalmia-associated tranion factor, MITF), 티로시나아제 관련 단백질-1(tyrosinase related protein-1, TRP-1) 및 티로시나아제 관련 단백질-2(TRP-2))의 발현양 변화의 관계를 확인하기 위하여, Q-PCR을 수행하였다.인간 멜라닌 세포에서 분리한 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 각각의 프라이머를 이용하여 Q-PCR(Applied biosystems, 7500 Fast)로 mRNA양의 변화를 측정하였다. Q-PCR의 실험은 95℃에서 15초, 60℃ 60초 싸이클을 총 40회 반복하였으며, 대조군의 유전자 발현에 비해 해당 유전자 발현이 얼마나 증가하였는지 상대적인 값을 측정하였다. 프라이머는 Applied Biosystems에서 제조한 TaqMan 제품으로 각각 다음과 같다: 티로시나아제 (TYR, 제품번호:Hs01099965_m1), MITF (제품번호:Hs01117294_m1), TRP1 (제품번호:Hs00167051_m1), TRP2 (제품번호:Hs01095856_m1).
그 결과(도 2), 타이로시나아제(tyrosinase), 마이크로프탈미아 연관 전사인자(microphthalmia-associated tranion factor, MITF), 티로시나아제 관련 단백질-1(tyrosinase related protein-1, TRP-1) 및 티로시나아제 관련 단백질-2(TRP-2)의 mNRA 발현양이 계대배양 후기에서 증가했음을 알 수 있었다(도면상의 그래프 세로축은 각 유전자의 mRNA 발현량/GAPDH mRNA 발현량으로써 해당 유전자의 상대적 발현량이다).
[실시예 4] 계대배양에 의한 멜라닌 세포의 노화 지표 관찰
계대배양으로 인해, 노화된 세포에서 다량 발견되는 p16 및 p21의 발현양이 증가하는지 확인하기 위하여, 다양한 계대의 멜라닌 세포에서 RNA를 수득하여 cDNA를 제작하였고 p16, p21 특이적 프라이머를 이용하여 Q-PCR(Applied biosystems, 7500 Fast)로 mRNA양의 변화를 측정하였다. 프라이머는 Applied Biosystems에서 제조한 TaqMan 제품으로 각각 다음과 같다:p16 (제품번호:Hs00923894_m1), p21 (제품번호:Hs00355782_m1).
그 결과(도 3), 계대배양 후기에서 p16 및 p21의 mRNA 발현양이 크게 증가하였음을 알 수 있었다(도면상의 그래프 세로축은 각 유전자의 mRNA 발현량/GAPDH mRNA 발현량으로써 해당 유전자의 상대적 발현량이다).
[실시예 5] 계대배양에 의한 멜라닌 색소 형성 관련 효소의 발현 변화 관찰
히스톤탈아세틸화효소(Histonedeacetylase 5, HDAC5)과 EZH1(enhancer of zeste homolog 1)의 발현양이 멜라닌 색소 형성에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 벡터 세포 내 과발현 시스템을 이용하여 HDAC5 단백질을 과다 발현하거나 siRNA를 이용하여 세포 내 EZH1의 mRNA량을 결핍시켜 EZH1의 세포 내 단백질 발현을 저해하였다. HDAC5 과발현을 위한 벡터는 GeneCopoeia에서 구매하였으며 제품 번호는 EX-U1372-M09 이다. EZH1을 위한 siRNA는 Dharmacon에서 주문하였으며,제품 번호는 L-004217-00-0005이다. 멜라닌 색소 형성능의 저해 혹은 증가를 관찰하고자, 세포는 4000 rpm에서 원심분리를 하여 침전시켰고, 침전된 세포의 색을 대조군과 비교하여 각각의 효소의 멜라닌 색소 형성에 대한 영향을 관찰하였다.
이후, 상기 효소들이 멜라닌 세포의 계대배양 경과에 따라 변화하는지 확인하기 위하여, 다양한 계대의 멜라닌 세포에서 RNA를 수득하여 cDNA를 제작하였고 HDAC5, EZH1 특이적 프라이머를 이용하여 Q-PCR(Applied biosystems, 7500 Fast)로 mRNA양의 변화를 측정하였다. 프라이머는 Applied Biosystems에서 제조한 TaqMan 제품으로 각각 다음과 같다: HDAC5 (제품번호: Hs00608366_m1), EZH1 (제품번호: Hs00940463_m1).
그 결과(도 4), 히스톤탈아세틸화효소5(HDAC5)는 멜라닌 색소 형성을 억제하고, EZH1은 멜라닌 색소 형성을 촉진함을 알 수 있었다. 또한, 계대배양 초기보다 후기에 HDAC5의 발현양은 감소하였고, EZH1의 발현양은 증가하였음을 알 수 있었다 (도면상의 그래프 세로축은 각 유전자의 mRNA 발현량/GAPDH mRNA 발현량으로써 해당 유전자의 상대적 발현량이다).
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC12906BP
수탁일자 : 20150917
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC12907BP
수탁일자 : 20150917
[미생물 기탁증]
Figure PCTKR2015012883-appb-I000001
Figure PCTKR2015012883-appb-I000002
Figure PCTKR2015012883-appb-I000003
Figure PCTKR2015012883-appb-I000004

Claims (17)

  1. 멜라닌 모세포주인 PA1 세포주 및 상기 멜라닌 모세포주를 각각 1, 2, 3, 4 및 5회 계대배양한, PA2, PA3, PA4, PA5 및 PA6 세포주 중 어느 하나 이상을 포함하는 전기 멜라닌 세포주; 및
    상기 멜라닌 모세포주를 각각 6, 7, 8, 9, 10 및 11회 계대배양한, PA7, PA8, PA9, PA10, PA11 및 PA12 세포주 중 어느 하나 이상을 포함하는 후기 멜라닌 세포주를 포함하는, 멜라닌 세포의 계대배양계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 전기 멜라닌 세포주는, 제1전기 멜라닌 세포주 및 제2전기 멜라닌 세포주를 포함하고,
    상기 후기 멜라닌 세포주는, 제1후기 멜라닌 세포주 및 제2후기 멜라닌 세포주를 포함하며,
    상기 제1전기 멜라닌 세포주는, PA1, PA2 및 PA3 세포주 중 하나 이상을 포함하며,
    상기 제2전기 멜라닌 세포주는, PA4, PA5 및 PA6 세포주 중 하나 이상을 포함하며,
    상기 제1후기 멜라닌 세포주는, PA7, PA8 및 PA9 세포주 중 하나 이상을 포함하며,
    상기 제2후기 멜라닌 세포주는, PA10, PA11 및 PA12 세포주 중 하나 이상을 포함하는, 멜라닌 세포의 계대배양계.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 전기 멜라닌 세포주는 PA3 세포주이고,
    상기 후기 멜라닌 세포주는 PA11 세포주인, 멜라닌 세포의 계대배양계.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 전기 멜라닌 세포주는 기탁번호 KCTC12906BP의 세포주이고,
    상기 후기 멜라닌 세포주는 기탁번호 KCTC12907BP의 세포주인, 멜라닌 세포의 계대배양계.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 계대배양계는,
    PA1, PA2, PA3, PA4, PA5, PA6, PA7, PA8, PA9, PA10, PA11 및 PA12 세포주로 구성된, 멜라닌 세포의 계대배양계.
  6. n회 계대배양된 멜라닌 세포주로서,
    상기 n은 1 이상인, 세포주.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 n은 1 내지 11인, 세포주.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 n은 2 또는 10인, 세포주.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 세포주는,
    기탁번호 KCTC12906BP 또는 KCTC12907BP인, 세포주.
  10. 대상의 노화 수준 판단 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 계대배양계의 하나 이상의 계대에 해당하는 세포주에서, 타이로시나아제(tyrosinase), 마이크로프탈미아 연관 전사인자(microphthalmia-associated tranion factor, MITF), 티로시나아제 관련 단백질-1(tyrosinase related protein-1, TRP-1), 티로시나아제 관련 단백질-2(TRP-2), 히스톤탈아세틸화효소 5(Histonedeacetylase 5), EZH1(enhancer of zeste homolog 1), p16 및 p21로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현양 범위를 측정하는 단계;
    b) 대상의 타이로시나아제(tyrosinase), 마이크로프탈미아 연관 전사인자(microphthalmia-associated tranion factor, MITF), 티로시나아제 관련 단백질-1(tyrosinase related protein-1, TRP-1), 티로시나아제 관련 단백질-2(TRP-2), 히스톤탈아세틸화효소 5(Histonedeacetylase 5), EZH1(enhancer of zeste homolog 1), p16 및 p21로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현양을 측정하는 단계; 및
    c) 대상이 상기 a) 단계의 계대배양계 계대들 중 어느 계대에 속하는지 결정하는 단계를 포함하는, 노화 수준 판단 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 대상의 발현양 측정은, 대상의 멜라닌 세포 내의 발현양을 측정하는 것인, 노화 수준 판단 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 노화는, 광노화인, 노화 수준 판단 방법.
  13. 대상에게 미용 정보를 제공하는 방법으로서,
    i) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 계대배양계 각 계대에 적합한 화장료, 건강식품 또는 미용 방법을 선정하는 단계; 및
    ii) 상기 제10항에 의해 노화 수준이 결정된 대상에게 상기 i) 단계에 따라, 화장료, 건강식품 또는 미용 방법에 대한 미용 정보를 제공하는 단계를 포함하는, 미용 정보 제공 방법.
  14. a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 계대배양계의 하나 이상의 계대의 멜라닌 세포주에 후보 물질을 처리하는 단계;
    b) 타이로시나아제(tyrosinase), 마이크로프탈미아 연관 전사인자(microphthalmia-associated tranion factor, MITF), 티로시나아제 관련 단백질-1(tyrosinase related protein-1, TRP-1), 티로시나아제 관련 단백질-2(TRP-2), EZH1(enhancer of zeste homolog 1), p16 및 p21로 이루어진 제 1군; 및
    히스톤탈아세틸화효소 5(Histonedeacetylase 5)로 이루어진 제 2군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현 변화를 검출하는 단계; 및
    c) 상기 제 1군에서 선택된 하나 이상의 발현을 감소시키거나, 상기 제 2군의 발현을 증가시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 세포 회춘 유도 물질 스크리닝 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 방법은,
    후기 멜라닌 세포주에 후보 물질을 처리한 후,
    상기 제1군에서 선택된 하나 이상의 발현 정도가 전기 멜라닌 세포주에서의 발현 정도보다 낮을 때, 또는
    상기 제2군에서 선택된 하나 이상의 발현 정도가 전기 멜라닌 세포주에서의 발현 정도 보다 높을 때, 세포 회춘 유도 물질로 판정하는 단계를 더 포함하는, 세포 회춘 유도 물질 스크리닝 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 전기 멜라닌 세포주는 PA3 세포주이고,
    상기 후기 멜라닌 세포주는 PA11 세포주인, 세포 회춘 유도 물질 스크리닝 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 PA3 세포주는 기탁번호 KCTC12906BP 인 세포주이고, 상기 PA11 세포주는 기탁번호 KCTC12907BP인, 세포 회춘 유도 물질 스크리닝 방법.
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