RU2215030C2 - Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов и меланоцитов (варианты), способ иммортализации клеток кожи человека для получения иммортализованных кератиноцитов, способ иммортализации клеток кожи человека для получения иммортализованных меланоцитов, бессывороточная среда (варианты), анализ кожных реакций - Google Patents
Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов и меланоцитов (варианты), способ иммортализации клеток кожи человека для получения иммортализованных кератиноцитов, способ иммортализации клеток кожи человека для получения иммортализованных меланоцитов, бессывороточная среда (варианты), анализ кожных реакций Download PDFInfo
- Publication number
- RU2215030C2 RU2215030C2 RU98113400/13A RU98113400A RU2215030C2 RU 2215030 C2 RU2215030 C2 RU 2215030C2 RU 98113400/13 A RU98113400/13 A RU 98113400/13A RU 98113400 A RU98113400 A RU 98113400A RU 2215030 C2 RU2215030 C2 RU 2215030C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- keratinocytes
- melanocytes
- medium
- immortalized
- serum
- Prior art date
Links
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 230
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 126
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title abstract description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 title abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 142
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 97
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 36
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 35
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 28
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 23
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 21
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 15
- 229930182837 (R)-adrenaline Natural products 0.000 claims description 15
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 claims description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 12
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 12
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 11
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims description 10
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 10
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 10
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 101000693922 Bos taurus Albumin Proteins 0.000 claims description 9
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 9
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M cyanocobalamin Chemical compound N#C[Co+]N([C@]1([H])[C@H](CC(N)=O)[C@]\2(CCC(=O)NC[C@H](C)OP(O)(=O)OC3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)C)C/2=C(C)\C([C@H](C/2(C)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M 0.000 claims description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 claims description 8
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 8
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 8
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 claims description 8
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 claims description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 7
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 7
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 6
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000007747 plating Methods 0.000 claims description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 6
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 5
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 5
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 5
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- AGBQKNBQESQNJD-SSDOTTSWSA-N (R)-lipoic acid Chemical compound OC(=O)CCCC[C@@H]1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 claims description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 claims description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 4
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 claims description 4
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 claims description 4
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 claims description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 claims description 4
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 claims description 4
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N O-phosphoethanolamine Chemical compound NCCOP(O)(O)=O SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 4
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004115 Sodium Silicate Substances 0.000 claims description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 4
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 4
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N alpha-Lipoic acid Natural products OC(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 claims description 4
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 claims description 4
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 claims description 4
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 claims description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 claims description 4
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229940068840 d-biotin Drugs 0.000 claims description 4
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 claims description 4
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 4
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims description 4
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 4
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 claims description 4
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 claims description 4
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims description 4
- LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L nickel sulfate Chemical compound [Ni+2].[O-]S([O-])(=O)=O LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229910000363 nickel(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 4
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 claims description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 4
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 claims description 4
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 4
- NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N sodium silicate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Si]([O-])=O NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052911 sodium silicate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 4
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 4
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 claims description 4
- HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J tin(iv) chloride Chemical compound Cl[Sn](Cl)(Cl)Cl HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 4
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 4
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 4
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 claims description 4
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 claims description 4
- XYPANFGXFLOTDK-CJLNJPJHSA-N 1b-de-l-phenylalanine-insulin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 XYPANFGXFLOTDK-CJLNJPJHSA-N 0.000 claims description 3
- AUNGANRZJHBGPY-MBNYWOFBSA-N 7,8-dimethyl-10-[(2R,3R,4S)-2,3,4,5-tetrahydroxypentyl]benzo[g]pteridine-2,4-dione Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims description 3
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000080590 Niso Species 0.000 claims description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 3
- UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O azanium;oxido(dioxo)vanadium Chemical compound [NH4+].[O-][V](=O)=O UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 229960002104 cyanocobalamin Drugs 0.000 claims description 3
- 235000000639 cyanocobalamin Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011666 cyanocobalamin Substances 0.000 claims description 3
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 claims description 3
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 3
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 claims description 3
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 claims description 3
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 claims description 3
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 claims description 3
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims description 3
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- IFQSXNOEEPCSLW-DKWTVANSSA-N L-cysteine hydrochloride Chemical compound Cl.SC[C@H](N)C(O)=O IFQSXNOEEPCSLW-DKWTVANSSA-N 0.000 claims 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 claims 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 abstract 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 abstract 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 23
- 102000003849 Cytochrome P450 Human genes 0.000 description 23
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 11
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 9
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 9
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 9
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 102000007236 involucrin Human genes 0.000 description 7
- 108010033564 involucrin Proteins 0.000 description 7
- 230000003061 melanogenesis Effects 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 102100028314 Filaggrin Human genes 0.000 description 6
- 101710088660 Filaggrin Proteins 0.000 description 6
- 102100031784 Loricrin Human genes 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 235000004626 essential fatty acids Nutrition 0.000 description 6
- 108010079309 loricrin Proteins 0.000 description 6
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 6
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 5
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 102100040445 Keratin, type I cytoskeletal 14 Human genes 0.000 description 5
- 101710183391 Keratin, type I cytoskeletal 14 Proteins 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 5
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150013359 E7 gene Proteins 0.000 description 4
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 4
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- GEHJBWKLJVFKPS-UHFFFAOYSA-N bromochloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Br GEHJBWKLJVFKPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 150000004633 phorbol derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 4
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150071673 E6 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 2
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- -1 L-cysteine-НСl-Н 2 О Chemical compound 0.000 description 2
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 206010040880 Skin irritation Diseases 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101100289792 Squirrel monkey polyomavirus large T gene Proteins 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 2
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 2
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 2
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 2
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 description 2
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100001223 noncarcinogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000036556 skin irritation Effects 0.000 description 2
- 231100000475 skin irritation Toxicity 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 2
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N Arginine hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N 0.000 description 1
- FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N Benz[a]pyrene Chemical compound C1=C2C3=CC=CC=C3C=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039705 Beta-2 adrenergic receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710152983 Beta-2 adrenergic receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000537222 Betabaculovirus Species 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LHQIJBMDNUYRAM-AWFVSMACSA-N D-erythro-biopterin Chemical compound N1=C(N)NC(=O)C2=NC([C@H](O)[C@H](O)C)=CN=C21 LHQIJBMDNUYRAM-AWFVSMACSA-N 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053177 Epidermolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 101000620359 Homo sapiens Melanocyte protein PMEL Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- LHQIJBMDNUYRAM-UHFFFAOYSA-N L-erythro-Biopterin Natural products N1=C(N)NC(=O)C2=NC(C(O)C(O)C)=CN=C21 LHQIJBMDNUYRAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 description 1
- 239000004165 Methyl ester of fatty acids Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010002822 Phenylethanolamine N-Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100028917 Phenylethanolamine N-methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 1
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000008199 coating composition Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- BEJNERDRQOWKJM-UHFFFAOYSA-N kojic acid Chemical compound OCC1=CC(=O)C(O)=CO1 BEJNERDRQOWKJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004705 kojic acid Drugs 0.000 description 1
- WZNJWVWKTVETCG-UHFFFAOYSA-N kojic acid Natural products OC(=O)C(N)CN1C=CC(=O)C(O)=C1 WZNJWVWKTVETCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- JOPDZQBPOWAEHC-UHFFFAOYSA-H tristrontium;diphosphate Chemical compound [Sr+2].[Sr+2].[Sr+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O JOPDZQBPOWAEHC-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides or bases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/80—Neurotransmitters; Neurohormones
- C12N2501/81—Adrenaline
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения иммортализованных клеток кожи человека. Клеточную линию иммортализованных кератиноцитов человека DK2-NR, DK3-NR, FK2-NR и иммортализованных меланоцитов DM2-NR получают путем посева клеток кожи на бессывороточную среду NR-2, затем кератиноциты переносят на селекционную среду NR-3, а меланоциты - на NR-4 среду. Кератиноциты и меланоциты инфицируют ретровирусной конструкцией, после чего иммортализованные кератиноциты выращивают в пролиферативной среде NR-2 и дифференцируют в среде, содержащей 1,5 мМ кальция, иммортализованные меланоциты пролифирируют на среде М2. Иммортализованные кератиноциты и меланоциты используют для анализа кожных реакций. 9 с. и 3 з. п.ф-лы, 3 ил., 10 табл.
Description
Изобретение относится к улучшенным непрерывным (иммортализованным) клеточным линиям, полученным из нормальных тканей кожи человека, в частности линиям кератиноцитов и меланоцитов, которые сохраняют способность экспрессировать протеины дифференциации, характерные для дифференциированных меланоцитов или кератиноцитов, даже в случае большого числа пассажей. Настоящее изобретение относится также к новой, не содержащей сыворотки среде, которая не требует использования фидерных клеток.
Предпосылки изобретения
Ранее уже было описано получение иммортализованных клеточных линий, полученных из тканей кожи человека. Обычно такие способы включают трансфекцию или трансформацию клеток кожи человека, например кератиноцитов и меланоцитов, культивируемых in vitro агентами, которые обеспечивают иммортализацию.
Ранее уже было описано получение иммортализованных клеточных линий, полученных из тканей кожи человека. Обычно такие способы включают трансфекцию или трансформацию клеток кожи человека, например кератиноцитов и меланоцитов, культивируемых in vitro агентами, которые обеспечивают иммортализацию.
Иммортализация относится к получению клеток, которые способны к культивированию в течение длительного промежутка времени in vitro, в идеале неопределенно долго. Такие клетки также называют непрерывными клеточными линиями. В противоположность неиммортализованным, клетки могут расти в течение конечного числа делений in vitro. Существенная необходимость в иммортализованных клетках объясняется тем, что они обеспечивают стабильный, потенциально неограниченный запас клеток, обладающих определенными характеристикам. Обычные агенты для получения иммортализованных клеточных линий и иммортализованных клеточных линий кожи человека, в частности, включают, например, вирусы, рекомбинантные вирусы и плазмиды, которые содержат ДНК последовательности, которые обеспечивают иммортализацию.
Вероятно, наиболее обычный способ получения иммортализованных клеточных линий человека включает использование S40 последовательностей, и, более конкретно, SV40 крупной Т антигенной ДНК в качестве иммортализующего агента. Так, например, Steiberg et al., J.Cell, Phys., 123:117-125 (1985); Reddel et al. , патент США 4885238, выданный 5 декабря 1989 г; Major, патент США 4707448, выданный 17 ноября 1987 г; Stoner et al., Cancer Res., 51:365-371 (1991); Chopra et al., In Vitro Cell Dev.Biol., 30A: 539-546 (1994); Chopra et al. , Jn Vitro Cell Dev.Biol., 27A:763-765 (1991); Christian et al., Cancer Res., 47:6066-6073 (1987); Rhim et al.. Science 227:1250-1252 (1985), и Grubman et al. , Gastrointest. Liver Physiol., 29:G1060-G1070 (1994), предлагают использование SV40 векторов и SV40 крупной Т антигенной последовательности, содержащей векторы, для получения иммортализованных клеточных линий человека. Введение таких последовательностей обычно осуществляют с помощью инфицирования, используя SV40 вирус или гибридный аденовирус-12 SV40 гибридный вирус, или за счет трансфекции клеток с рекомбинантной плазмидой, содержащей длинный терминальный репит (повтор) вируса саркомы Rous и Ori-SV40 ранний участок за счет совместного осаждения фосфатом стронция (см. Brash et al., Mol. Cell Biol., 7:2031-2034 (1987).
Другим известным способом для получения иммортализованных клеточных линий, в частности иммортализованных кератиноцитов человека, является способ, который включают трансфекцию или инфицирование клеток ДНК последовательностями вируса папилломы человека. Так, например, в патенте США 5376542, выданном 27 декабря 1994 г, описывается иммортализация эпителиальных клеток человека за счет выделенных HPV-16, 18, 31, 33 или 35 Е6 и Е7 генов, или одного только Е7 гена, для получения неонкогенных иммортализованных клеточных линий. Кроме того, Barbosa et al., Oncogene, 4:1529-1532 (1989), и Hunger et al., J.Virol., 63(10):4417-4421 (1989), описывают использование HPV-16 и HPV-18 Е6 и Е7 генов для получения иммортализованных кератиноцитов человека.
Однако, хотя ряд исследовательских групп сообщали о иммортализованных клеточных линиях кератиноцитов и их использовании в In vitro анализах, полученные ранее иммортализованные клеточные линии кератиноцитов и меланоцитов обычно обладали одним или более свойств, которые делали их использование невыгодным. Так, например, иммортализованные кератиноциты, о которых сообщалось ранее, обладают одной или более из следующих характристик: i) снижение или потеря экспрессии диференцирующих маркеров, например протеинов, которые экспрессируются нормальными диференцированными кератиноцитами, и (ii) изменение характеристик роста в тканевой культуре.
Так, например, Jetten et al., J.Invest.Dermatol., 92:203-209 (1989), сообщают о SV40 иммортализованных кератиноцитах, полученных после большого числа пассажей (число пассажей больше 12) с использованием вектора NHEK-SV40-T8-1, которые оказались неспособными к дифференциации. Аналогично Bernard et al., Cancer Res., 45:1707-1716 (1985), сообщают о выделении иммортализованной клеточной линии кератиноцитов, названной как SVK14, которая, как сообщается, почти полностью неспособна к дифференциации. Кроме того, эта клеточная линия не экспрессирует кератины К1/10 ( более 53 кД) и 50 кД кератин (кератин К14), протеины, которые обычно экспрессируются дифференцированными кератиноцитами.
Кроме того, Steinberg et al., J.Cell Physiol., 123:117-125 (1985), сообщает о SV40 трансформированных кератиноцитах, которые постепенно теряют способность экспрессировать кератины, которые характерны для нормального кератинового цитоскелета. Такая потеря нормальной экспрессии кератинов происходит после примерно 10-15 пассажей. Далее, Hronis et al., Cancer Res., 44: 5797-5804 (1984), описывают SV40 ДНК иммортализованные кератиноциты, которые потеряли способность продуцировать К5, К6, К14/15, К16 и К17 кератины и инволюкрин, протеины, которые характерны для нормальных дифференцированных кератиноцитов. Далее, Morris et al., Proc.Natl.Acad. Sci, USA, 82:8498-8502 (1985), описывают SV40 иммортализованные кератиноциты, которые при большом числе пассажей (более 14 пассажей) демонстрируют сильно пониженную экспрессию кератинов класса II и класса I. Так, например, эти кератиноциты почти не экспрессируют K13(Id).
Кроме того, Banks-Schlegel et al., J.Cell Biol., 96: 330-337 (1983), раскрывают SV40 иммортализованные кератиноциты, которые демонстрируют измененные характеристики роста в тканевой культуре. Так, например, в отличие от нормальных кератиноцитов эти иммортализованные клетки требуют для роста 3Т3 фидерный слой.
Описанные ранее способы получения иммортализованных человеческих кератиноцитов и меланоцитов обычно использовали методику фидерных клеток (когда фибробласты обычно функционируют в качестве "фидерных" клеток) и обычно вели культуру клеток в содержащей сыворотку среде. Так, например, Sexton et al., "Stable transfection of human keratinocytes: HPV immortalization", Keratinocyte Methods, eds., Leigh I.M. et al., University Press, 179-180 (1994); Garlick et al., "Retroviral Vectors", Keratinocyte methods, eds. Leigh I.M. et al. , Cambridge University Press, 181-183 (1994), описывают использование среды, содержащей фетальную телячью сыворотку и фидерные клетки, при выделении и продуцировании иммортализованных кератиноцитов.
Использование не содержащей сыворотки среды при выделении и продуцировании иммортализованных эпителиальных клеток было раскрыто ранее. Так, например, Barbosa et al., Oncogene, 4:1529-1532 (1989), описывает начальное культивирование человеческих кератиноцитов, трансфектированных за счет электропорации или липофекции, в не содержащей сыворотку среде с низким содержанием кальция до конфлюэнтности.
Однако вне зависимости от того, что сообщалось ранее, все еще остается существенная необходимость в иммортализованных человеческих кератиноцитах и меланоцитах, которые обладали бы улучшенными характеристиками, в частности, которые сохраняли бы потенциал дифференциации нормальных кератиноцитов и меланоцитов и которые экспрессировали бы протеины дифференциации, характерные для дифференцированных меланоцитов и кератиноцитов, даже после большого числа пассажей. Такие клетки были бы очень выгодны во многих применениях, особенно в анализах, которые требуют дифференцированных клеток кожи. Кроме того, существует необходимость в усовершенствованной культуральной среде, способной поддерживать первичные и иммортализованные кератиноциты и меланоциты, а также в усовершенствованных способах культивирования, в которых не требовалось бы применения фидерных клеток.
Цели изобретения
Целью настоящего изобретения является получение усовершенствованных непрерывных (иммортализованных) клеточных линий, полученных из нормальной ткани кожи человека, особенно иммортализованных клеточных линий кератиноцитов и/или меланоцитов, полученных из нормальной ткани кожи человека, которые сохраняли бы способность дифференцировать и экспрессировать протеины дифференциации даже после большого числа пассажей. Более конкретно, целью настоящего изобретения является получение иммортализованных кератиноцитов, которые сохраняли бы способность экспрессировать кератины, цитохромы, а также другие протеины дифференциации, например инволюкрин, филаггрин и лорикрин, которые либо слабо экспрессируются, либо не экспрессируются вовсе обычными иммортализованными клеточными линиями кератиноцитов. Следующей целью изобретения является получение иммортализованных кератиноцитов и меланоцитов, которые экспрессируют ферменты, которые обычно экспрессируют дифференцированные кератиноциты и меланоциты, особенно такие ферменты фазы II, как глутатион-S-трансфераза, а также ферменты и/или протеины, которые участвуют в клеточном окислении и воспалительных реакциях.
Целью настоящего изобретения является получение усовершенствованных непрерывных (иммортализованных) клеточных линий, полученных из нормальной ткани кожи человека, особенно иммортализованных клеточных линий кератиноцитов и/или меланоцитов, полученных из нормальной ткани кожи человека, которые сохраняли бы способность дифференцировать и экспрессировать протеины дифференциации даже после большого числа пассажей. Более конкретно, целью настоящего изобретения является получение иммортализованных кератиноцитов, которые сохраняли бы способность экспрессировать кератины, цитохромы, а также другие протеины дифференциации, например инволюкрин, филаггрин и лорикрин, которые либо слабо экспрессируются, либо не экспрессируются вовсе обычными иммортализованными клеточными линиями кератиноцитов. Следующей целью изобретения является получение иммортализованных кератиноцитов и меланоцитов, которые экспрессируют ферменты, которые обычно экспрессируют дифференцированные кератиноциты и меланоциты, особенно такие ферменты фазы II, как глутатион-S-трансфераза, а также ферменты и/или протеины, которые участвуют в клеточном окислении и воспалительных реакциях.
Еще одной целью изобретения является создание новой, не содержащей сыворотки среды для культивирования, продуцирования и поддержания нормальных или непрерывных кератиноцитов и/или меланоцитов в тканевой культуре. Эта новая, не содержащая сыворотки среда может также использоваться для выделения, стабилизации и иммортализации клеток кожи человека для получения непрерывных линий меланоцитов и кератиноцитов по способу настоящего изобретения. Таким образом, конкретной целью настоящего изобретения является создание полностью определенной культуральной среды (без неизвестных или плохо определенных дополнений) для культивирования кератиноцитов без фидерных клеток, содержащих эпинефрин, который, как неожиданно было обнаружено, является сильным потенциатором роста нормальных кератиноцитов в не содержащей сыворотки среде.
Другой целью настоящего изобретения является создание нового способа для выделения, установления и иммортализации клеток кожи человека для получения непрерывных клеточных линий меланоцитов и кератиноцитов, полученных из нормальной ткани кожи человека, причем в указанном способе используют не содержащую сыворотки среду по способу настоящего изобретения и дополнительный "коктейль", содержащий фибронектин, BSA и коллаген типа I без "фидерных клеток" (например, фибробластов).
Еще одной целью изобретения является создание первичных кератиноцитов или меланоцитов, полученных в условиях без сыворотки, без использования каких-либо фидерных клеток, причем указанные первичные кератиноциты и меланоциты используют в качестве кожных трансплантатов и в ex vivo генетической терапии.
Еще одной целью изобретения является создание способов использования таких новых и улучшенных непрерывных клеточных линий кератиноцитов и меланоцитов, например, для анализов, иммунологических, фармакологических, фото- и хемотоксикологических кожных реакций и для экспрессии гетерологичных генов.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 сравнивается рост (в единицах числа клеток) неиммортализованных DKO-NR кератиноцитов в трех различных средах, т.е. NR-3, дополненной эпинефрином, модифицированной MCDB 153 и MCDB 153 после 6 дней.
На фиг.1 сравнивается рост (в единицах числа клеток) неиммортализованных DKO-NR кератиноцитов в трех различных средах, т.е. NR-3, дополненной эпинефрином, модифицированной MCDB 153 и MCDB 153 после 6 дней.
Фиг. 2а представляет SV40 ретровирусную конструкцию pLXSHD+SV40( 328), предпочтительно используемую для иммортализации рассматриваемых меланоцитов и/или кератиноцитов.
Фиг.2b представляет HPV16 ретровирусную конструкцию PLXSHD+E6/E7.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении предложены непрерывные (иммортализованные) клеточные линии, полученные из нормальных тканей человеческой кожи, т.е. иммортализованные кератиноциты и меланоцитцы, которые сохраняют способность к дифференциации и которые сохраняют способность экспрессировать протеины дифференциации, которые экспрессируются нормальными кератиноцитами или меланоцитами, даже при большом числе пассажей. Под большим числом пассажей подразумевают, по крайней мере, 10 пассажей в культуре, предпочтительно 20-30 пассажей, более предпочтительно, по крайней мере, 50 пассажей и, в идеале, неопределенное число пассажей. Так, например, иммортализованные кератиноциты, продуцируемые по способу настоящего изобретения, экспрессируют протеины дифференциации кератин К1/10, кератин К14, инволукрин, филаггрин и лорикрин даже после большого числа пассажей в тканевой культуре. Это происходит в противоположность иммортализованным кератиноцитам, о которых сообщалось ранее, которые либо не экспрессировали такие протеины дифференциации, либо слабо экспрессировали эти протеины дифференциации.
В настоящем изобретении предложены непрерывные (иммортализованные) клеточные линии, полученные из нормальных тканей человеческой кожи, т.е. иммортализованные кератиноциты и меланоцитцы, которые сохраняют способность к дифференциации и которые сохраняют способность экспрессировать протеины дифференциации, которые экспрессируются нормальными кератиноцитами или меланоцитами, даже при большом числе пассажей. Под большим числом пассажей подразумевают, по крайней мере, 10 пассажей в культуре, предпочтительно 20-30 пассажей, более предпочтительно, по крайней мере, 50 пассажей и, в идеале, неопределенное число пассажей. Так, например, иммортализованные кератиноциты, продуцируемые по способу настоящего изобретения, экспрессируют протеины дифференциации кератин К1/10, кератин К14, инволукрин, филаггрин и лорикрин даже после большого числа пассажей в тканевой культуре. Это происходит в противоположность иммортализованным кератиноцитам, о которых сообщалось ранее, которые либо не экспрессировали такие протеины дифференциации, либо слабо экспрессировали эти протеины дифференциации.
Далее, в настоящем изобретении предложены первичные кератиноциты и меланоциты, полученные в условиях без сыворотки и без фидерных клеток, которые сохраняют способность дифференцировать и экспрессировать протеины, характерные для дифференцированных меланоцитов и кератиноцитов.
Рассматриваемые иммортализованные кератиноциты имеют профиль цитохрома р450 (CYP450), который аналогичен, если не идентичен, профилю нормальных кератиноцитов. Так, например, рассматриваемые клетки экспрессируют CYP450 3А5, но не CYP450 3А4. Кроме того, рассматриваемые иммортализованные кератиноциты экспрессируют ферменты фазы II, например глутатион-3-трансферазу (GST), и более конкретно, GSTα, GSTμ и GSTπ, сравнимо с нормальными неиммортализованными кератиноцитами.
Далее, рассматриваемые иммортализованные кератиноциты экспрессируют протины и энзимы, участвующие в клеточном окислении и воспалительных реакциях, например супероксиддисмутазу (SOD), и коллагеназу типа I и опухолевый некротический фактор α (TNFα) после обработки сложными эфирами форбола, аналогично или идентично нормальным дифференцированным кератиноцитам. Учитывая эти характеристики, эти клеточные линии обеспечивают высоко стабильный, воспроизводимый источник клеток для исследования иммунологических, фармакологических, воспалительных, фото- и хемотоксилогических кожных реакций.
Далее, рассматриваемые иммортализованные меланоциты экспрессируют эндогенно протеины, ассоциированные с меланином (см. примеры 14-15 далее).
Кроме того, рассматриваемые иммортализованные клеточные линии кератиноцитов и клеточные линии меланоцитов при культивировании в органотипической культуре образуют сильно расслоенный и поляризованный эпителий, содержащий роговичные поверхностные слои (stratum corneum). Только этого удалось достичь ранее в обычных культуральных условиях, т.е. в среде, содержащей сыворотку, с использованием фидерного слоя (см., например, Lechner et al., Virology, 185:536-571, 1991).
Далее, рассматриваемые иммортализованные кератиноциты и меланоциты получают из нормальной кожи в условиях без сыворотки и без использования каких-либо фидерных клеток. Обычно рассматриваемые иммортализованные кератиноциты и меланоциты получают, используя следующие стадии:
(i) получение образца ткани кожи человека;
(ii) подготовка указанного образца кожи для культивирования in vitro;
(iii) получение кератиноцитов и/или меланоцитов из указанного подготовленного образца ткани и посев указанных кератиноцитов и/или меланоцитов в не содержащую сыворотки среду для выращивания, предпочтительно либо в среду NR-3, либо NR-4 (для меланоцитов) (описано ранее) на культуральные пластинки с покрытием, которое облегчает прикрепление и рост клеток, причем указанное покрытие содержит фибронектин, коллаген типа 1 и BSA;
(iv) при необходимости, изменение среды для оптимизации конфлюэнтного роста культивируемых клеток при непрерывном поддержании покрытия на культуральных пластинах;
(v) перенос кератиноцитов или меланоцитов в селекционную среду, предпочтительно не содержащую сыворотки среду, на аналогичным образом предварительно покрытые культуральные пластины;
(vi) инфицирование кератиноцитов или меланоцитов ретровирусной конструкцией, предпочтительно конструкцией на основе SV40 или вируса папилломы 16, например SV40 плазмида pLXSHD+SV40( 328), которая содержит крупный Т антиген (Т Aq) вируса Simian 40, или плазмида pLXSHD+E6/E7, которая содержит Е6/Е7 ген вируса 16 папилломы (HPV16) (см. далее);
(vii) перенос полученных иммортализованных кератиноцитов или меланоцитов на пролиферационную среду, пригодную для пролиферации иммортализованных кератиноцитов или меланоцитов на аналогичным образом предварительно покрытые культуральные пластины, предпочтительно NR-2 или NR-3 среду (описана далее) и меланоцитную среду М2 (источник M.Olsson Inst. of Dermatology, Uppsala, Sweden), и
(viii) перенос полученных пролиферированных кератиноцитов на дифференцирующую среду, предпочтительно NR-2 (описана далее), или модифицированную MCDB 153 среду (описана далее), которая содержит высокую концентрацию кальция, предпочтительно 1,5 мМ, на аналогичным образом предварительно покрытые культуральные диски (Boyce et al. , J.Tissue Cult. Meth., 9:83-93, 1985; Pittlekow et al., J.Invest.Dermatol., 86:410-417, 1986).
(i) получение образца ткани кожи человека;
(ii) подготовка указанного образца кожи для культивирования in vitro;
(iii) получение кератиноцитов и/или меланоцитов из указанного подготовленного образца ткани и посев указанных кератиноцитов и/или меланоцитов в не содержащую сыворотки среду для выращивания, предпочтительно либо в среду NR-3, либо NR-4 (для меланоцитов) (описано ранее) на культуральные пластинки с покрытием, которое облегчает прикрепление и рост клеток, причем указанное покрытие содержит фибронектин, коллаген типа 1 и BSA;
(iv) при необходимости, изменение среды для оптимизации конфлюэнтного роста культивируемых клеток при непрерывном поддержании покрытия на культуральных пластинах;
(v) перенос кератиноцитов или меланоцитов в селекционную среду, предпочтительно не содержащую сыворотки среду, на аналогичным образом предварительно покрытые культуральные пластины;
(vi) инфицирование кератиноцитов или меланоцитов ретровирусной конструкцией, предпочтительно конструкцией на основе SV40 или вируса папилломы 16, например SV40 плазмида pLXSHD+SV40( 328), которая содержит крупный Т антиген (Т Aq) вируса Simian 40, или плазмида pLXSHD+E6/E7, которая содержит Е6/Е7 ген вируса 16 папилломы (HPV16) (см. далее);
(vii) перенос полученных иммортализованных кератиноцитов или меланоцитов на пролиферационную среду, пригодную для пролиферации иммортализованных кератиноцитов или меланоцитов на аналогичным образом предварительно покрытые культуральные пластины, предпочтительно NR-2 или NR-3 среду (описана далее) и меланоцитную среду М2 (источник M.Olsson Inst. of Dermatology, Uppsala, Sweden), и
(viii) перенос полученных пролиферированных кератиноцитов на дифференцирующую среду, предпочтительно NR-2 (описана далее), или модифицированную MCDB 153 среду (описана далее), которая содержит высокую концентрацию кальция, предпочтительно 1,5 мМ, на аналогичным образом предварительно покрытые культуральные диски (Boyce et al. , J.Tissue Cult. Meth., 9:83-93, 1985; Pittlekow et al., J.Invest.Dermatol., 86:410-417, 1986).
Более конкретно, стадия (i) обычно включает получение образцов ткани кожи человека от людей-доноров, например тех, которые получены при хирургических операциях или в педиатрии. Иммортализация одного образца клеток кожи, т.е. автологичного образца клеток кожи, позволяет получить иммортализованные клеточные линии кератиноцитов и меланоцитов, которые демонстрируют определенные характеристики, например конкретный рецепторный профиль, который является характеристикой конкретного донора.
Затем образец кожи подготавливают на стадии (ii) так, чтобы он был пригоден для культивирования in vitro. Это осуществляют, предпочтительно вначале промывая образец кожи, например используя ту же среду, которую использовали для культивирования. Предпочтительно осуществлять это в NR-2 среде, не содержащей сыворотки среде, точный состав которой раскрыт далее, которая, как было обнаружено, удобна для культивирования кератиноцитов и меланоцитов. После промывки образец кожи сбривают, например, с помощью dermatome, а затем иссекают на мелкие кусочки.
Затем полученные срезы кожи предпочтительно разделяют на дермальные и эпидермальные. Это можно осуществить с помощью физических и/или ферментативных способов. Так, например, это можно осуществить за счет триптинизации, например, подвергая флотации "листочки" кожи в растворе трипсина (например, около 0,5%), содержащем ЕДТА (например, около 0,1%) в течение достаточного промежутка времени для того, чтобы осуществить разделение клеток, например около 30-60 минут при 37oС или в течение ночи при 4oС.
Дермис выделяют (для выделения фибробластов см. пример 2) и затем эпидермис помещают в суспензионную среду. Предпочтительно, чтобы суспензионная среда содержала раствор, ингибирующий трипсин сои (SBTI), и чтобы он контактировал с клетками в течение достаточного промежутка времени, обычно около 5 минут, для инактивации трипсина и обеспечения выделения клеток. Затем тканевую культуральную среду добавляют, предпочтительно не содержащую сыворотки NR-2 среду (описана далее), и фильтр (например, 100 мм фильтр) для получения нужных клеток, например кератиноцитов и/или меланоцитов.
Полученную первичную культуру кератиноцит/меланоцитов, полученную на стадии (ii), высевают затем на не содержащую сыворотки среду, предпочтительно NR-3 среду (подробно описанную далее), при подходящей концентрации клеток, предпочтительно около 1,2х104 клет./см2, на предварительно покрытые культуральные пластины. Однако эту концентрацию клеток можно менять в широких пределах. Культуральные пластины предпочтительно постоянно покрыты составом, который, как было неожиданно обнаружено, улучшает как прикрепление, так и рост кератиноцитов и меланоцитов, особенно в растворе фибронектина BSA и коллагена типа 1. Такой состав для покрытия клеток был описан ранее для использования с бронхиальными клетками (Lechner et al., J.Tissue Cult.Meth., 9:43-48 (1985) (включено сюда для ссылки).
На стадии (iv) культуральную среду заменяют так часто, как это необходимо для оптимизации роста клеток. Предпочтительно заменять среду примерно каждый второй день. Однако это может зависеть от конкретного образца кожи. После достижения почти полной конфлюэнтности, например конфлюэнтности около 90%, что обычно происходит после примерно 10-14 дней, кератиноциты и меланоциты затем разделяют. Это можно осуществить любыми способами, которые могут обеспечить соответствующее разделение клеток, не оказывая при этом вредного воздействия на меланоциты и/или кератиноциты. Так, например, это можно осуществить с помощью дифференциальной трипсинизации. Предпочтительно меланоциты или кераноциты обрабатывать раствором трипсин/ЕДТА, а затем переносить на селекционную среду. В случае кератиноцитов клетки предпочтительно обрабатывать около 5-10 минут раствором трипсин/ЕДТА (0,025%/0,01%), а затем на стадии (v) высевать в NR-3 среду на пластины с предварительным покрытием. Важно отметить, что NR-3 среда промотирует рост кератиноцитов, в противоположность меланоцитам. В случае меланоцитов клетки предпочтительно обрабатывать в течение около 2-4 минут раствором трипсин/ЕДТА. (О,025%/0,01%), а затем высевать на стадии (v) на NR-4 среду на аналогичные культуральные пластины с предварительным покрытием. Важно отметить, что NR-4 среда специфически ингибирует рост кератиноцитов.
Эти клетки затем обрабатывают иммортализующим агентом. В другом варианте клетки можно заморозить до осуществления иммортализации, например в жидком азоте. Инфицирование и иммортализацию предпочтительно осуществляют, используя SV40 конструкцию, определяемую как pLXSHD+SV40 ( 328), которая представлена на фиг. 2а и которая была описана Stockshlaeder et al., (GeneBank, регистрационный М64753; Stockslaeder et al. , Human Gen.Therapy, 2, 33-39,1991), или HPV16 конструкцию, определенную как pLXSHD+E6/E7, которая представлена на фиг. 2b. Конструкция pLXSHD+SV40 ( 328) содержит SV40 Т-Аg последовательность, 5' и 3' LTR последовательности SV40, рВР322 последовательности, которые обеспечивают репликацию в Е.соli множественного сайта клонирования, и последовательность полиаденилирования SV40, наряду с другими последовательностями. Конструкция pLXSHD+E6/E7 содержит вместо Т-Аg фрагмент NcoI/CfoI гена Е6/Е7 вируса 16 папилломы человека. Способ конструирования Е6/Е7 плазмиды основан на работе Durst et al. (Durst et al., 1987, Oncogene, 1: 251-256). После имморталиэации, при необходимости, осуществляют несколько пассажей клеток по время культивирования и затем полученные иммортализованные клетки переносят на пролиферационную среду стадии (vii). В случае кератиноцитов этот перенос предпочтительно осуществляют на пассаже 2.
На стадии (viii) иммортализованные клетки размножают в пролиферационной среде для иммортализованных кератиноцитов или меланоцитов, которая содержит NR-2 или NR-3 и М2-среду для меланоцитов (описана далее). Иммортализованные клетки снова культивируют на постоянно предварительно покрытых культуральных пластинах, причем это покрытие снова включает раствор фибронектина, BSA и коллагена типа 1.
После того, как клетки размножены в пролиферационной среде, их переносят на стадии (viii) в среду, которая обеспечивает дифференцирование нормальных и иммортализованных кератиноцитов. Предпочтительно, чтобы эта среда содержала NR-2 или модифицированную MCDB 153 среду с высоким содержанием кальция, предпочтительно около 1,5 мМ кальция, причем снова культивирование осуществляют на культуральных пластинах, постоянно покрытых раствором фибронектина, BSA и коллагеном типа 1.
Как было указано ранее, неожиданно было обнаружено, что иммортализованные клеточные линии кератиноцитов и меланоцитов, полученные таким образом, сохраняют способность к дифференциации и к экспрессии протеинов дифференциации, которые характерны для нормальных дифференцированных кератиноцитов и меланоцитов, даже при большом числе пассажей в тканевой культуре, т.е. после, по крайней мере, 10 пассажей. Так, например, расматриваемые иммортализованные кератиноциты экспрессируют кетатины, а также другие протеины, например инволюкрин, филаггрин и лорикрин, после большого числа пассажей, которые либо вовсе не экспрессировались, либо мало экспрессировались иммортализованными кератиноцитами SV40, о которых сообщалось ранее.
Более конкретно, некоторые иммортализованные клеточные линии кератиноцитов, полученные по способу настоящего изобретения, DK2-NR, DK3-NR и FK2-NR (см. таблицы 7 и 8 далее), экспрессируют протеины дифференциации К1/10, кератин К14, инволюкрин, филаггрин и лорикрин, даже после большого числа пассажей (более 30 пассажей). Кроме того, иммортализованные кератиноциты, полученные по способу настоящего изобретения, имеют CYP450 профиль, который аналогичен, если не идентичен, профилю нормальных кератиноцитов человека. Так, например, рассматриваемые иммортализованные кератиноциты экспрессируют CYP450 1А1, 2С, 2Е1 и 3А5, но не экспрессируют CYP450 1А2, 2А6, 2В6 и 2D6, которые характерны для профиля цитохрома 450 нормальных кератиноцитов. Впервые удалось продемонстрировать, что нормальные и иммортализованные кератиноциты человека экспрессируют CYP450 3А5, а не CYP450 3А4.
Далее, рассматриваемые иммортализованные клеточные линии кератиноцитов экспрессируют ферменты фазы-II, например глутатион-3-трансферазы (GST), сравнимо с нормальными дифференцированными кератиноцитами. Более конкретно, рассматриваемые клеточные линии кератиноцитов экспрессируют GSTα, GSTμ и GSTπ сравнимо с нормальными кератиноцитами.
Далее, рассматриваемые иммортализованные кератиноциты экспрессируют ферменты и другие протеины, которые участвуют в клеточном окислении и воспалительных реакциях сравнимо с нормальными кератиноцитами. Так, например, иммортализованные кератиноциты, полученные по способу настоящего изобретения, экспрессируют супероксиддисмутазу (SOD). Также, в ответ на сложные эфиры форбола иммортализованные кератиноциты, полученные по способу настоящего изобретения, экспрессируют коллагеназу типа 1 (медиатор воспалений) и TNF-α (альфа-фактор некроза опухоли).
Рассматриваемые меланоциты обладают способностью экспрессировать протеины, связанные с меланином, и виментин.
Более того, рассматриваемые иммортализованные клеточные линии при выращивании в органотипической культуре образуют сильно расслоенный и поляризованный эпителий с ороговевшими поверхностными слоями (stratum corneum) даже при большом числе пассажей (более 20 пассажей). Ранее об этом сообщалось только один раз для иммортализованных клеточных линий кератиноцитов, установленных в обычных условиях культивирования, т.е. в среде, содержащей сыворотку, и с использованием фидерного слоя.
Рассматриваемые иммортализованные клеточные линии получают в условиях полного отсутствия сыворотки и без использования какого-либо фидерного слоя во время культивирования.
Более того, как будет подробно раскрыто далее, неожиданно было обнаружено, что эпинефрин является сильным фактором роста для нормальных кератиноцитов, если его используют в среде, не содержащей сыворотки. Более конкретно, NR-3 среда, описанная далее, содержит эпинефрин, который, как было обнаружено, усиливает рост нормальных кератиноцитов (см. фиг.1). Это весьма удивительно, учитывая тот факт, что эпинефрин, как сообщалось ранее, ингибирует рост кератиноцитов (Halprin, J.Invest.Dermatol., 81:553-557 (1983)) или оказывает умеренное действие на рост клеток кератиноцитов (Koizumi et al., J.Invest.Dermatol., 96:234-237, 1991).
Кроме того, неожиданно было обнаружено, что постоянное покрытие культуральных чашек или пластин, используемое для культивирования первичных и иммортализованных кератиноцитов и/или меланоцитов, в частности покрытием или "коктейлем", содержащим фибронектин, BSA и коллаген типа 1, улучшает как прикрепление кератиноцитов и меланоцитов к культуральным пластинам или чашкам, так и усиливает рост клеток. Использование такого кроющего материала ранее не было описано для использования с иммортализованными кератиноцитами и/или меланоцитами.
Как обсуждалось, настоящее изобретение далее специфически предлагает новую, не содержащую сыворотки, среду, называемую NR-3 средой. Эта среда позволяет культивировать и выделять нормальные кератиноциты и/или меланоциты из кожи человека в условиях без сыворотки и без использования фидерного слоя. Как было обнаружено, эта среда усиливает рост нормальных кератиноцитов и позволяет устанавливать (получать) культуры нормальных кератиноцитов без какого-либо контакта с сывороткой или фидерными клетками.
Точный состав среды NR-3 представлен на стр.52. Эта среда содержит различные аминокислоты, неорганические соли в виде следовых элементов, витамины, факторы роста и другие составляющие. Так, например, эта среда содержит в качестве факторов роста эпидермальный фактор роста (EGF рекомбинант), инсулин, гидрокортизон, трансферрин (человеческий), бычий гипофизный экстракт и эпинефрин. Как отмечалось, неожиданно было обнаружено, что эпинефрин усиливает рост первичных кератиноцитов в тканевой культуре.
В качестве аминокислот эта среда содержит L-аланин, L-аргинин-HCl, L-аспарагин-Н2О, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин-НСl-Н2О, L-глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, L-гистидин-НС1-Н2О, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин-НСl, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.
Содержащиеся в среде неорганические соли включают аммонийметаванадат, аммониймолибдат, кальцийхлорид, сульфат меди (2), сульфат железа(2), магнийхлорид, хлорид марганца, сульфат никеля, хлорид калия, ацетат натрия, бикарбонат натрия, натрийхлорид, двухосновной натрийфосфат, пируват натрия, селенит натрия, силикат натрия, хлорид олова и сульфат цинка.
Содержащиеся в среде NR-3 витамины включают d-биотин, d-кальцийпантотенат, холинхлорид, цианкокальбумин, фолевую кислоту, i-инозитол, никотинамид, пиридоксин и рибофлавин.
Далее среда содержит аденин, этаноламин, фосфоэтаноламин, фенол красный Na, путресцин 2НСl, тиамин НСl, тиоктовую кислоту, тимидин, глюкозу, HEPES и антибиотики (фунгизон, пенициллин и стрептомицин).
Предпочтительный состав NR-3 среды представлен на стр. 52. Однако ожидается, что концентрация заместителей, содержащихся в NR-3 среде, может меняться в широких пределах. Более конкретно, ожидается, что количества различных заместителей могут меняться от ±50 до ±0,1%, более предпочтительно от ±10 до ±0,1% от концентраций, представленных на стр.52. Более того, ожидается, что одна или более из указанных составляющих может быть исключена, а другие составляющие могут быть добавлены при условии, что такие замены составляющих не будут оказывать вредного воздействия на выделение и стабилизацию первичных клеточных культур кератиноцитов или меланоцитов и иммортализованных клеточных линий. Это может определить специалист с помощью анализа проб и ошибок.
Как указывалось, существенным составляющим среды NR-3, не содержащей сывортки, является эпинефрин. Было обнаружено, что эпинефрин является очень сильным промотором роста первичных кератиноцитов человека.
Причина, по которой эпинефрин усиливает пролиферацию кератиноцитов, неясна. Сообщалось, что кератиноциты человека экспрессируют ферменты для синтеза эпинефрина, а также экспрессируют с высокой плотностью бета-2-адренорецепторы (Schallreuther et al., "Production of catecholamines in the human epidermis", Biochem. and Biophys. Res. Commun., 189:72-78 (1992)). Эти ферменты вовлечены в схему биосинтеза катехоламина, в частности фенилэтаноламин-N-метилтрансферазы и биоптеринзависимой тирозингидроксилазы. Напротив, такую ферментативную активность нельзя определить у меланоцитов и фибробластов. Соответственно ферментативная активность и/или экспрессия рецепторов может объяснить способность эпинефрина модулировать пролиферацию кератиноцитов.
Авторы изобретения предполагают, что NR-3 среда усиливает выделение и стабилизацию первичных клеточных культур и клеточных линий, так как она подавляет дифференциацию клеток, что ведет к обогащению клеток, что поддерживает их способность дифференцировать и экспрессировать протеины и ферменты, экспрессируемые нормальными дифференцированными кератиноцитами и меланоцитами.
Более конкретно, считают, что рост кератиноцитов или меланоцитов в среде, содержащей сыворотку, способствует дифференциации на первом пассаже. Однако это невыгодно (во время начального периода культивирования), так как дифференцированные клетки растут слабо. Это, в свою очередь, приводит к избыточному росту и селекции пролиферативных кожных клеток, которые обладают лишь слабой способностью к дифференциации. Соответственно число клеток, которые обладают высокой способностью к дифференциации, уменьшено, если сыворотку добавляют к среде до иммортализации.
Напротив, в настоящем изобретении кератиноциты и меланоциты культивируют в не содержащей сыворотки среде и в условиях, которые ингибируют дифференциацию меланоцитов и кератиноцитов. В настоящем изобретении не содержащую сыворотки среду предпочтительно используют на протяжении всего периода культивирования, как до, так и во время иммортализации, а также в процессе пролиферации и дифференциации.
Как было отмечено, рассматриваемая NR-3, не содержащая сыворотки среда, ингибирует дифференциацию кератиноцитов, и, таким образом, обеспечивает выделение первичных клеточных культур кератиноцитов и полученных из них иммортализованных клеточных линий. Более того, эта не содержащая сыворотки среда содержит низкие концентрации кальция, что ингибирует селективно рост совместно выделенных фибробластов. Это приводит к высоко селективной ростовой среде, что благоприятствует получению культур, которые преимущественно содержат меланоциты и кератиноциты. Соответственно рассматриваемая NR-3 среда выгодна благодаря тому, что она ингибирует дифференциацию кератиноцитов и также ингибирует рост фибробластов.
Как обсуждалось ранее, клеточную суспензию, полученную из одного образца кожи, который содержит диссоциированные меланоциты, кератиноциты и фибробласты, предпочтительно культивируют в рассматриваемой NR-3 среде. Это осуществляют, высевая такие клетки на культуральные чашки, которые постоянно покрыты составом, который облегчает их прикрепление. Предпочтительно, чтобы такое покрытие содержало смесь фибронектина, альбумина бычьей сыворотки и коллаген типа 1. Такое прокрытие, или "коктейль" покрытия, ранее было описано для бронхиальных клеток (Lechner et al., J.Tiss.Cult.Meth., 9:43-48 (1985)). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что такой коктейль также усиливает прикрепление кератиноцитов и меланоцитов к пластиковым культуральным чашкам. Более того, неожиданно было обнаружено, что указанное постоянное покрытие культуральных пластин, которые используют для культивирования первичных и иммортализованных кератиноцитов, еще усиливает рост клеток. Такое постоянное покрытие культуральных пластин ранее не было описано для иммортализованных кератиноцитов или меланоцитов.
Во время культивирования первичные клеточные культуры предпочтительно разделяют, когда они достигают, или практически достигают, конфлюэнтности, а затем размножают на других культуральных чашках с покрытием. Обычно клеточные культуры делят примерно каждые 10-14 дней.
После того как было осуществлено культивирование первичных меланоцитов и/или кератиноцитов и их число увеличено до нужного количества в NR-3 среде, не содержащей сыворотки, с использованием описанных культуральных чашек с нанесенным покрытием, их подвергают иммортализации. Предпочтительно, чтобы меланоциты и кератиноциты, которые демонстрируют наилучший рост, были иммортализованы. Однако в другом варианте размноженные первичные меланоциты или кератиноциты можно использовать до иммортализации, например в анализах, при трансплантации кожи или в генной терапии.
Иммортализацию как меланоцитов, так и кератиноцитов можно осуществить с помощью вектора, который обеспечивает экспрессию SV40 Т-антигена или экспрессию Е6/Е7 гена вируса 16 папилломы человека (HPV16). Предпочтительно осуществлять иммортализацию за счет инфицирования меланоцитов или кератиноцитов ретровирусной конструкцией, которая обеспечивает экспрессию SV40 Т-антигена или Е6/Е7 гена HPV16. Клеточное Т-Аg инфицирование основано на протоколе Pfeifer et al., Meth.Cell Sci., 17:83-89, 1995 (за исключением того, что вирус получают из упакованной клеточной линии, присланной в DMEM, 10% фетальной телячьей сыворотке). Во время инфицирования используют содержащую сыворотку среду. Однако для меланоцитов и кератиноцитов предпочтительна не содержащая сыворотки среда, например предпочтительна РС-1 среда, раскрытая в статье Pfeifer et al., Meth.Cell.Sci., 14, 83-89 (1995), которая включена сюда в качестве ссылки. Более предпочтительно осуществлять иммортализацию, используя ретровирусную конструкцию, называемую pLXSHD+SV40 ( 328), представленную на фиг.2а и основанную на конструкции Pfeifer et al. and Stockshlaeder et al. (СепеВаnк, регистрационный M64753), или называемую pLXSHD+E6/E7, представленную на фиг.2b и основанную на конструкции Durst et al., 1987, Oncogene 1, 251-256.
После иммортализации иммортализованные клеточные линии переносят на пролиферационную среду, предпочтительно NR-2 или NR-3, или М2 (для меланоцитов), используя культуральные чашки с предварительно нанесенным покрытием. После того как клетки пролиферируют до нужного количества клеток, их переносят на дифференцирующую среду, подходящую для культивирования нормальных и иммортализованных кератиноцитов. Предпочтительно, чтобы она включала NR-2 или модифицированную MCDB 153 с высоким содержанием кальция (1,5 мМ) или М2 (для меланоцитов), используя культуральные пластины с предварительно нанесенным покрытием (то же самое BSA, коллаген типа 1, фибронектиновое покрытие).
Как было указано ранее, дифференцированные иммортализованные клеточные линии кератиноцитов и меланоцитов, полученные по способу настоящего изобретения, демонстрируют улучшенные свойства, которые делают эти клеточные линии хорошо приспособленными для использования в анализах, в которых нужны дифференцированные клетки кожи человека. В частности, эти клеточные линии, как было обнаружено, экспрессируют протеины, характерные для нормальных дифференцированных меланоцитов и кератиноцитов даже после большого числа пассажей.
Так, например, если иммортализованные кератиноциты, полученные по способу настоящего изобретения, анализируют с помощью Вестерн-блоттинга и RT-PCR, они обладают цитохромным p450 (CYP450) профилем, аналогичным, если не идентичным, нормальным кератиноцитам. Более конкретно, иммортализованные кератиноциты, полученные по способу настоящего изобретения, экспрессируют CYP450 1А1, 2С, 2Е1, 3А5 и не экспрессируют CYP450 1А2, 2А6, 2В6 и 2D6. Такой CYP450 профиль соответствует профилю нормальных кератиноцитов. Такая схема метаболизма ранее не была описана для иммортализованных кератиноцитов. Действительно, впервые появилась возможность продемонстрировать то, что нормальные и иммортализованные кератиноциты экспрессируют CYP450 3А5, но не CYP450 3А4. Далее, иммортализованные кератиноциты, полученные по способу настоящего изобретения, при анализе с помощью антител, специфических для маркеров дифференциации, как было обнаружено, экспрессируют другие протеины дифференциации даже после большого числа пассажей. Более конкретно, рассматриваемые клеточные линии экспрессируют протеины дифференциации К1/10, кератин К14, инволюкрин, филаггрин и лорикрин даже после большого числа пассажей, например после 10 пассажей и после существенно большего числа пассажей.
Рассматриваемые иммортализованные кератиноциты и меланоциты также захватывают экзогенные незаменимые жирные кислоты (EFA) и демонстрируют десатурацию и удлинение цепи EFA значительно, соответствующие нормальным меланоцитам и кератиноцитам.
Далее, как описано более подробно далее, рассматриваемые иммортализованные кератиноциты экспрессируют TNFα и медиатор воспалений коллагеназу типа 1 при обработке сложными эфирами форбола сравнимо с нормальными кератиноцитами. Далее, рассматриваемые иммортализованные кератиноциты экспрессируют супероксиддисмутазу, фермент, который участвует в клеточном окислении аналогично нормальным диференцированным кератиноцитам.
Далее, иммортализованные меланоциты, полученные по способу настоящего изобретения, обработанные индукторами меланогенеза (например, теофиллином и тирозином) и ингибиторами меланогенеза (коджиевой (kojic) кислотой), реагируют аналогично реакциям нормальных меланоцитов.
Учитывая эти свойства, расматриваемые иммортализованные кератиноциты и меланоциты, хорошо приспособлены для иммунологических, фармакологических, фото- и хемотоксикологических исследований кожных реакций.
Так, например, рассматриваемые иммортализованные клеточные линии кератиноцитов и меланоцитов и первичные меланоциты и кератиноциты можно использовать в анализах, которые требуют дифференцированных клеток кожи, например при исследовании барьерных функций (корнификация) восстановленной кожи, при исследованиях метаболизма дифференцированных кератиноцитов (метаболизм жирных кислот, метаболизм антиоксидантов), при исследованиях, касающихся влияния ультрафиолетовой радиации на клетки кожи, при исследованиях, касающихся воздействий
потенциальных кожных ирритантов (веществ, вызывающих раздражение кожи) и сенсибилизаторов на клетки кожи, при исследованиях, в которых измеряют воздействие соединений на продуцирование меланина, при исследованиях метаболизма липидов, поверхностной обработки ксенобиотиками (например, косметическими маслами, при скринировании для выявления предполагаемых защитных соединений, например фотопротекторов), при исследовании воспалений и раздражений кожи, и т.д.
потенциальных кожных ирритантов (веществ, вызывающих раздражение кожи) и сенсибилизаторов на клетки кожи, при исследованиях, в которых измеряют воздействие соединений на продуцирование меланина, при исследованиях метаболизма липидов, поверхностной обработки ксенобиотиками (например, косметическими маслами, при скринировании для выявления предполагаемых защитных соединений, например фотопротекторов), при исследовании воспалений и раздражений кожи, и т.д.
Далее, иммортализованные клеточные линии кератиноцитов и меланоцитов и первичные меланоциты и кератиноциты, полученные по способу настоящего изобретения, можно использовать для скринирования потенциальных противораковых агентов и соединений, полезных при лечении кожных заболеваний. Такие исследования обычно включают экспонирование клеточной линии или первичных клеток таким соединениям в течение определенного промежутка времени и определение того, вызывают ли они какие-либо вредные воздействия, например генотоксичность, образование ДНК аддукта, мутагенность, трансформацию клеток или цитотоксичность.
Далее, рассматриваемые клеточные линии меланоцитов и кератиноцитов можно использовать для экспрессии рекомбинантных протеинов, например человеческих протеинов и полипептидов, а также для получения РНК и ДНК.
Далее, рассматриваемые иммортализованные клеточные линии обладают потенциальной способностью для ex vivo генетической терапии. Рассматриваемые клеточные линии должны предоставлять полезный инструмент для генетического мечения и разработки генетически сконструированных клеток, которые экспрессируют нужные генные продукты, например, для терапевтических применений или для исследования токсичности/мутагенности клеток. Более того, учитывая тот факт, что рассматриваемые клеточные линии близко имитируют клетки нормальной кожи, они должны хорошо подходить для анализов биочувствительности.
Далее, первичные кератиноциты и меланоциты, полученные по способу настоящего изобретения, с учетом того, что их получают в условиях отсутствия сыворотки, могут быть использованы в генной терапии. Существенно то, что, так как эти клетки не экспонировались сыворотке, например бычьей сыворотке или сыворотке какого-либо другого животного (за исключением времени вирусного инфицирования и хранения в жидком азоте), они должны быть менее подвержены потенциальным загрязнениям в виде вирусов или других патогенных агентов. Поэтому их использование должно свести к минимуму риск передачи этими клетками патогенных или инфекционных факторов в процессе генной терапии. Такая ex vivo генная терапия перспективна при лечении таких заболеваний, как эпидермолиз буллоза (нарушение, связанное с мутацией кератина), витилиго (нарушение, включающее гены синтеза меланина), карциномы и меланомы, аллергические нарушения и нарушения, связанные с воспалениями. Что касается терапевтического лечения, то единственным потенциальным источником загрязнений является бычий гипофизный экстракт, бычий инсулин, бычий коллаген, альбумин бычьей сыворотки или человеческие фибронектин и трансферин.
Кроме того, рассматриваемые иммортализованные клеточные линии меланоцитов и кератиноцитов и первичные меланоциты и кератиноциты используют в анализах ДНК мутагенеза, в анализах скринирования для кожного мутагена, в анализах для идентификации агентов, повреждающих хромосомы, в исследованиях превращений злокачественных опухолей, в исследованиях биохимии клеток (например, в анализах активации CYP450), при скринировании для выявления соединений и композиций, например "коктейлей" незаменимых жирных кислот, которые участвуют в воспалительных и аллергических реакциях, в анализах активации коллагеназы (связанных с воспалениями), включая TNFα, детектирование интерлейкина.
Существенным потенциальным применением первичных кератиноцитов или меланоцитов, полученных по способу настоящего изобретения, учитывая их доступность и способ получения, является их использование для кожной трансплантации. Так как эти первичные кератиноциты и меланоциты получают в условиях отсутствия сыворотки, они представляют минимальный риск быть зараженными патогенами (например, вирусами) и инфекционными агентами. Более того, так как рассматриваемые меланоциты и кератиноциты могут быть получены от автологусного хозяина, т.е. пациента с обширным ранением, это должно свести к минимуму или исключить риск отторжения трансплантата, или риск возникновения другой вредной иммунологической реакции, а также свести к минимуму риск инфицирования.
Примерами специфических иммортализованных клеточных линий кератиноцитов, полученных по способу настоящего изобретения, являются FK2-NR, DK2-NR и DK3-NR, которые были депонированы 5 октября 1995 г. в DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZeIlKulturen GmbH, по адресу Mascheroder Weg в D-38124 Branschweig Germany, и которым были присвоены регистрационные номера DSM ACC2240, DSM ACC2238 и DSM АСС2239 соответственно. Кроме того, экземпляры специфических иммортализованных линий меланоцитов человека, полученных по способу настоящего изобретения, представляют DM2-NR, которая депонирована 11 декабря 1996 г. в Pasteur Institut no адресу 25 rue de Docteur Roux 75724 Paris France под регистрационным номером CNCM I-1796. Эти депозиты сделаны в соответствии с Будапештским соглашением. Все ограничения относительно доступности этих клеточных линий будут немедленно сняты после получения патента на эту заявку или на другую заявку с более ранним приоритетом по отношению к рассматриваемой.
Другие особенности настоящего изобретения станут очевидны в процессе рассмотрения предпочтительных вариантов, которые приведены только с целью иллюстрации изобретения и не должны его ограничивать.
ПРИМЕР 1. Характеристика стабилизированных клеток кожи.
В таблице 1 перечислены все образцы кожи, которые были обработаны в отношении вирусной инфекции. Выделенные кератиноциты, которые продемонстрировали наилучший рост клеток, были использованы для иммортализации.
Фибробласты человека выделяют из образцов кожи FKO-NR, GKO-NR, DKO-NR. После разделения дермальной и эпидермальной частей дермис нарезают на маленькие кусочки размером 0,2х0,2 мм и фиксируют на 6 см культуральной пластине с сывороткой. Через 2-4 часа добавляют минимальную поддерживающую среду Дульбекко (DMEM, 10% FCS ).
Эту эксплантатную среду инкубируют до тех пор, пока разрастание фибробластов не становится заметным. Конфлюэнтные фибробластные культуры разделяют и размножают для получения замороженных запасов.
ПРИМЕР 2.
1) Характеристика роста кератиноцитов в среде без сыворотки
Культуры первичных клеток культивируют в модифицированной MCDB 153 (Boyce et al., J.Tissue Cult. Meth., 9:83-93 (1985); и Pittlekow et al., J. Invest.Dermatol., 86:410-417, 1986) и NR-3 среде. Наилучший рост клеток наблюдается в NR-3 среде (фиг.1). Улучшенный рост клеток наблюдается также в полностью определенной NR-3 среде (NR-3 без бычьего гипофизного экстракта, ВРЕ) по сравнению с модифицированной MCDB 153 без ВРЕ.
Культуры первичных клеток культивируют в модифицированной MCDB 153 (Boyce et al., J.Tissue Cult. Meth., 9:83-93 (1985); и Pittlekow et al., J. Invest.Dermatol., 86:410-417, 1986) и NR-3 среде. Наилучший рост клеток наблюдается в NR-3 среде (фиг.1). Улучшенный рост клеток наблюдается также в полностью определенной NR-3 среде (NR-3 без бычьего гипофизного экстракта, ВРЕ) по сравнению с модифицированной MCDB 153 без ВРЕ.
На фиг. 1 представлено сравнение роста клеток в NR-3 и дополненной эпинефрином модифицированной MCDB 153 (среда для выращивания кератиноцитов) через 6 дней. Модифицированная MCDB 153 среда относится к модифицированной MCDB 153. Кератиноциты собирают в трипсин/ЕДТА (0,05%/0,01%) и подсчет ведут с помощью гемоцитометра. Полученные результаты, представленные на фиг.3, являются средними значениями из трех повторов.
2) Влияние покрытия на прикрепление клеток и рост клеток
Было обнаружено, что нанесение покрытия на культуральные пластины улучшает прикрепление клеток и рост клеток нормальных кератиноцитов. В частности, представленные в таблице 2 результаты, сравнивают рост кератиноцитов в культуральных пластинах с нанесенным покрытием или без него. На пластины 3,5 см, содержащие NR-3 среду, высевают 100000 кератиноцитов.
Было обнаружено, что нанесение покрытия на культуральные пластины улучшает прикрепление клеток и рост клеток нормальных кератиноцитов. В частности, представленные в таблице 2 результаты, сравнивают рост кератиноцитов в культуральных пластинах с нанесенным покрытием или без него. На пластины 3,5 см, содержащие NR-3 среду, высевают 100000 кератиноцитов.
ПРИМЕР 3.
1) Иммортализация кератиноцитов
Суспензию клеток, полученную из образцов кожи, описанных в примере 1, которая содержит диссоциированные меланоциты, кератиноциты и фибробласты, культивируют в рассматриваемой NR-3 среде. Это осуществляют, высевая такие клетки на культуральные чашки, которые постоянно покрыты "коктейлем"-покрытием, описанным ранее для бронхиальных клеток (Lechner et al., J.Tiss. Cult. Meth. , 9:43-48 (1985). Во время культивирования первичных клеточных культур, когда они достигают или практически достигают конфлюэнтности, клетки обрабатывают в течение 4 минут трипсин/ЕДТА (0,025%/0,01%). Во время этой обработки меланоциты отделяются от культуры кератиноцитов и их собирают отдельно. Таким образом, первичные меланоциты и кератиноциты разделяют на этой стадии. После того, как первичные кератиноциты были культивированы и размножены до нужного числа клеток в NR-3 среде, не содержащей сыворотки, с использованием описанных культуральных чашек с покрытием (промотирует рост кератиноцитов против меланоцитов), их подвергают иммортализации. Иммортализацию кератиноцитов осуществляют с помощью ретровирусной конструкции pLXSHD+SV40 ( 328), которая обеспечивает экспрессию SV40 Т-антигена (см. Pfeifer et al. , Meth.Cell Sci., 17:83-89, 1995; за исключением того, что вирус получают из упакованной клеточной линии, поставляемой в DMEM, 10% фетальная сыворотка теленка). Во время инфицирования используют PC-1 среду, не содержащую сыворотки, описанную в статье Pfeifer et al., Meth.Cell Sci., 14, 83-89 (1995). После иммортализации иммортализованные клеточные линии переносят на NR-2 или NR-3 пролиферационную среду, используя культуральные чашки с предварительно нанесенным покрытием. После пролиферации клеток до нужного числа клеток их переносят на дифференцирующую среду, пригодную для культивирования нормальных и иммортализованных кератиноцитов.
Суспензию клеток, полученную из образцов кожи, описанных в примере 1, которая содержит диссоциированные меланоциты, кератиноциты и фибробласты, культивируют в рассматриваемой NR-3 среде. Это осуществляют, высевая такие клетки на культуральные чашки, которые постоянно покрыты "коктейлем"-покрытием, описанным ранее для бронхиальных клеток (Lechner et al., J.Tiss. Cult. Meth. , 9:43-48 (1985). Во время культивирования первичных клеточных культур, когда они достигают или практически достигают конфлюэнтности, клетки обрабатывают в течение 4 минут трипсин/ЕДТА (0,025%/0,01%). Во время этой обработки меланоциты отделяются от культуры кератиноцитов и их собирают отдельно. Таким образом, первичные меланоциты и кератиноциты разделяют на этой стадии. После того, как первичные кератиноциты были культивированы и размножены до нужного числа клеток в NR-3 среде, не содержащей сыворотки, с использованием описанных культуральных чашек с покрытием (промотирует рост кератиноцитов против меланоцитов), их подвергают иммортализации. Иммортализацию кератиноцитов осуществляют с помощью ретровирусной конструкции pLXSHD+SV40 ( 328), которая обеспечивает экспрессию SV40 Т-антигена (см. Pfeifer et al. , Meth.Cell Sci., 17:83-89, 1995; за исключением того, что вирус получают из упакованной клеточной линии, поставляемой в DMEM, 10% фетальная сыворотка теленка). Во время инфицирования используют PC-1 среду, не содержащую сыворотки, описанную в статье Pfeifer et al., Meth.Cell Sci., 14, 83-89 (1995). После иммортализации иммортализованные клеточные линии переносят на NR-2 или NR-3 пролиферационную среду, используя культуральные чашки с предварительно нанесенным покрытием. После пролиферации клеток до нужного числа клеток их переносят на дифференцирующую среду, пригодную для культивирования нормальных и иммортализованных кератиноцитов.
2) Клеточная пролиферация иммортализованных кератиноцитов при большом числе пассажей
Иммортализованные кератиноциты, как было показано, демонстрируют улучшенный рост клеток при большом числе пассажей. Это представлено далее в таблице 3. Это демонстрируется с помощью оценки времени удвоения популяции (PDT: время, необходимое для одного удвоения популяции во время логарифмической фазы роста). Метод: кератиноциты собирают в трипсин/ЕДТА (0,05%/ 0,01%) и подсчитывают, используя гемоцитометр. Представленные результаты представляют среднее значение из трех повторов.
Иммортализованные кератиноциты, как было показано, демонстрируют улучшенный рост клеток при большом числе пассажей. Это представлено далее в таблице 3. Это демонстрируется с помощью оценки времени удвоения популяции (PDT: время, необходимое для одного удвоения популяции во время логарифмической фазы роста). Метод: кератиноциты собирают в трипсин/ЕДТА (0,05%/ 0,01%) и подсчитывают, используя гемоцитометр. Представленные результаты представляют среднее значение из трех повторов.
3) СYР450-экспрессия в иммортализованных линиях кератиноцитов человека
CYP4501A1, 1А2, 3А5, 2Е1, 2В6, 2А6 и 2D6 экспрессию анализируют в клеточных линиях нормальных и иммортализованных кератиноцитах кожи с помощью Вестерн-блоттинга (протеин-экспрессия) и RT-PCR (мРНК-экспрессия, см. таблицу 4). Экспрессированный CYP450 в иммортализованных кератиноцитах аналогичен нормальным кератиноцитам. Скорость экспрессии слегка понижена. Однако DК2-NR-линия демонстрирует почти нормальную скорость экспрессии CYP450. Способ: RT-PCR (обратная транскриптаза-полимеразная цепная реакция) со специфическим праймером для CYP450 (Mace et al., готовится к печати).
CYP4501A1, 1А2, 3А5, 2Е1, 2В6, 2А6 и 2D6 экспрессию анализируют в клеточных линиях нормальных и иммортализованных кератиноцитах кожи с помощью Вестерн-блоттинга (протеин-экспрессия) и RT-PCR (мРНК-экспрессия, см. таблицу 4). Экспрессированный CYP450 в иммортализованных кератиноцитах аналогичен нормальным кератиноцитам. Скорость экспрессии слегка понижена. Однако DК2-NR-линия демонстрирует почти нормальную скорость экспрессии CYP450. Способ: RT-PCR (обратная транскриптаза-полимеразная цепная реакция) со специфическим праймером для CYP450 (Mace et al., готовится к печати).
4) Реакция на СYР450-индуктор
Клеточные линии реагируют на СYР450-индуктор бенз(а)пирен подобно неиммортализованным клеткам даже при большом числе пассажей (см. таблицу 5). Такое индуцирование не было описано для Т-Аg иммортализованных кератиноцитов.
Клеточные линии реагируют на СYР450-индуктор бенз(а)пирен подобно неиммортализованным клеткам даже при большом числе пассажей (см. таблицу 5). Такое индуцирование не было описано для Т-Аg иммортализованных кератиноцитов.
5) Диференциация клеток
Маркеры дифференциации анализируют, используя специфические антитела. Использованные специфические антитела представлены в таблице 6. Наивысшую дифференцирующую способность можно продемонстрировать в DK2-NR и DK1-NR клонах (таблицы 7 и 8).
Маркеры дифференциации анализируют, используя специфические антитела. Использованные специфические антитела представлены в таблице 6. Наивысшую дифференцирующую способность можно продемонстрировать в DK2-NR и DK1-NR клонах (таблицы 7 и 8).
6) Экспрессия глутатион-3-трансферазы
Фермент II фазы глутатион-3-трансферазы (GST) анализируют с помощью Норзерн-блоттинга и Вестерн-блоттинга. Все линии кератиноцитов экспрессируют сильно мРНК для GSTπ, но не GSTα и не GSTμ (таблица 9, способ: Норзерн-блоттинг). Профиль экспрессии протеина GSTα, GSTμ и GSTπ в клеточных линиях аналогичен профилю для нормальных кератиноцитов.
Фермент II фазы глутатион-3-трансферазы (GST) анализируют с помощью Норзерн-блоттинга и Вестерн-блоттинга. Все линии кератиноцитов экспрессируют сильно мРНК для GSTπ, но не GSTα и не GSTμ (таблица 9, способ: Норзерн-блоттинг). Профиль экспрессии протеина GSTα, GSTμ и GSTπ в клеточных линиях аналогичен профилю для нормальных кератиноцитов.
7) Метаболизм незаменимых жирных кислот (ЕРА)
Для анализа и сравнения десатурации и удлинения добавленных EFA к кератиноцитам, иммортализованные (DK1-NR, FK2-NR) и нормальные кератиноциты обрабатывают линолевой кислотой (LA, 15 мкМ) и α-линоленовой кислотой (LN, 15 мкМ). Для этих экспериментов используют EFA-дефицитную NR-2 (Biofluids Inc. ). Клеточные культуры обрабатывают после достижения конфлюэнтности и сдвигая NR-2 высоким содержанием кальция (1,5 мМ). Клетки обрабатывают в течение 4 дней EFA (обновляя после 2 дней).
Для анализа и сравнения десатурации и удлинения добавленных EFA к кератиноцитам, иммортализованные (DK1-NR, FK2-NR) и нормальные кератиноциты обрабатывают линолевой кислотой (LA, 15 мкМ) и α-линоленовой кислотой (LN, 15 мкМ). Для этих экспериментов используют EFA-дефицитную NR-2 (Biofluids Inc. ). Клеточные культуры обрабатывают после достижения конфлюэнтности и сдвигая NR-2 высоким содержанием кальция (1,5 мМ). Клетки обрабатывают в течение 4 дней EFA (обновляя после 2 дней).
EFA анализ осуществляют с помощью экстракции и выделения фосфолипидов с помощью ТСХ (тонкослойная хроматография) и количественно определяют метиловые сложные эфиры жирных кислот с помощью GLC (газо-жидкостная хроматография). Образование десатурации и удлинения продуктов LA (20:4н-6 и 22:4н-6) и LN (20:5н-3, 22:5н-3 и 22:6н-3) можно продемонстрировать. Такой профиль метаболизма соответствует профилю, наблюдаемому для нормальных кератиноцитов.
8) Кариотипирование
Все клеточные линии были гиподиплоидными с количеством большинства хромосом в диплоидном интервале (за исключением DK2-NR с количеством хромосом в гипотетраплоидном интервале). Клетки, отличающиеся от клеток анализированных клеточных линий, в культурах не определялись. Этот результат подтверждает чистоту клеточных линий и отсутствие клеточных загрязнений из других источников.
Все клеточные линии были гиподиплоидными с количеством большинства хромосом в диплоидном интервале (за исключением DK2-NR с количеством хромосом в гипотетраплоидном интервале). Клетки, отличающиеся от клеток анализированных клеточных линий, в культурах не определялись. Этот результат подтверждает чистоту клеточных линий и отсутствие клеточных загрязнений из других источников.
9) Характеристика in vivo
Онкогенность иммортализованных кератиноцитов определяют, осуществляя подкожные инъекции (1-2 мио кератиноцитов) голым мышам. Тестированные кератиноцитные линии DK2-NR, DK3-NR, FK2-NR оказались неонкогенными для голых мышей (4 месяца инкубационный период), DK3-NR, однако, оказалась слабо онкогенной для 6 животных из 10 после 5 месяцев инкубационного периода.
Онкогенность иммортализованных кератиноцитов определяют, осуществляя подкожные инъекции (1-2 мио кератиноцитов) голым мышам. Тестированные кератиноцитные линии DK2-NR, DK3-NR, FK2-NR оказались неонкогенными для голых мышей (4 месяца инкубационный период), DK3-NR, однако, оказалась слабо онкогенной для 6 животных из 10 после 5 месяцев инкубационного периода.
10) Реакция на раздражение кожи
Индуцирование "стрессового гена" TNFα (альфа-фактор некроза опухоли) после обработки кожным ирритантом РМА (форбол-12-миристат-13-ацетат), SDS (додецилсульфат натрия), DMSO (диметилсульфоксид), IL-1 β (интерлейкин 1β) и UV-B (ультрафиолет В) анализируют с помощью Норзерн-блоттинга и биологических анализов (см. таблицу 10). Кератиноцитные линии реагируют на РМА и UV-B и экспрессируют TNFα, даже при большом числе пассажей.
Индуцирование "стрессового гена" TNFα (альфа-фактор некроза опухоли) после обработки кожным ирритантом РМА (форбол-12-миристат-13-ацетат), SDS (додецилсульфат натрия), DMSO (диметилсульфоксид), IL-1 β (интерлейкин 1β) и UV-B (ультрафиолет В) анализируют с помощью Норзерн-блоттинга и биологических анализов (см. таблицу 10). Кератиноцитные линии реагируют на РМА и UV-B и экспрессируют TNFα, даже при большом числе пассажей.
После обработки иммортализованных кератиноцитов сложными эфирами форбола (РМА) наблюдается повышение экспрессии коллагеназы (типа I).
11) Органотипические культуры
Проводили также культивирование кератиноцитов человека в органотипических условиях (кератиноциты выращивали с доступом воздуха на коллагеновом геле с фидерными клетками). Все кератиноцитные линии демонстрируют гиперпролиферативную морфологию по сравнению с нормальными кератиноцитами. Эти исследования были проведены в культуральной среде без сыворотки. Гиперпролиферативный рост клеток снижается в условиях без присутствия сыворотки (NR-2 с высоким содержанием кальция (1,5 мМ) на культуральных чашках с пластиковыми вставками без коллагенового геля и фидерных клеток).
Проводили также культивирование кератиноцитов человека в органотипических условиях (кератиноциты выращивали с доступом воздуха на коллагеновом геле с фидерными клетками). Все кератиноцитные линии демонстрируют гиперпролиферативную морфологию по сравнению с нормальными кератиноцитами. Эти исследования были проведены в культуральной среде без сыворотки. Гиперпролиферативный рост клеток снижается в условиях без присутствия сыворотки (NR-2 с высоким содержанием кальция (1,5 мМ) на культуральных чашках с пластиковыми вставками без коллагенового геля и фидерных клеток).
ПРИМЕР 4.
1) Иммортализация меланоцитов
Клеточную суспензию, полученную из образца кожи DKO-NR, описанного в примере 1, которая содержит диссоциированные меланоциты, кератиноциты и фибробласты, культивируют в рассматриваемой NR-3 среде. Это осуществляют, высевая такие клетки на культуральные чашки, которые постоянно покрыты "коктейлем", описанным ранее для бронхиальных клеток (Lechner et al., J. Tiss. Cult.Meth., 9:43-48(1985)). Во время культивирования первичных клеточных культур, когда они достигают или практически достигают конфлюэнтности, клетки обрабатывают в течение 4 минут трипсин/ЕДТА (0,025%/0,01%). Во время такой обработки меланоциты отделяются из культуры кератиноцитов и их собирают отдельно. Первичные меланоциты и кератиноциты, таким образом, разделяют на этой стадии. Затем собранные первичные меланоциты высевают в NR-4, не содержащую сыворотки среду, которая специфически ингибирует рост кератиноцитов. После культивирования первичных меланоцитов и их размножения до нужного числа клеток в NR-4, не содержащей сыворотки среде, с использованием описанного покрытия культуры их подвергают иммортализации. Иммортализацию меланоцитов осуществляют с помощью ретровирусной конструкции pLXSHD+SV40( 328), которая обеспечивает экспрессию SV40 Т-антигена (см. Pfeifer et al., Meth. Cell Sci. , 17:83-89, 1995; за исключением того, что вирус получают из упакованной клеточной линии, поставляемой в DMEM, 10% фетальной сыворотки теленка). Во время инфицирования используют РС-1, не содержащую сыворотки среду, описанную в статье Pfeifer et al., Meth.Cell Sci., 14, 88-89 (1995). После иммортализации иммортализованные клеточные линии переносят на М2 пролиферационную и дифференцирующую среду DMEM/F12 среда, Biofluids, 148; можно также купить у M.Olssen, Uppsala, Sweden).
Клеточную суспензию, полученную из образца кожи DKO-NR, описанного в примере 1, которая содержит диссоциированные меланоциты, кератиноциты и фибробласты, культивируют в рассматриваемой NR-3 среде. Это осуществляют, высевая такие клетки на культуральные чашки, которые постоянно покрыты "коктейлем", описанным ранее для бронхиальных клеток (Lechner et al., J. Tiss. Cult.Meth., 9:43-48(1985)). Во время культивирования первичных клеточных культур, когда они достигают или практически достигают конфлюэнтности, клетки обрабатывают в течение 4 минут трипсин/ЕДТА (0,025%/0,01%). Во время такой обработки меланоциты отделяются из культуры кератиноцитов и их собирают отдельно. Первичные меланоциты и кератиноциты, таким образом, разделяют на этой стадии. Затем собранные первичные меланоциты высевают в NR-4, не содержащую сыворотки среду, которая специфически ингибирует рост кератиноцитов. После культивирования первичных меланоцитов и их размножения до нужного числа клеток в NR-4, не содержащей сыворотки среде, с использованием описанного покрытия культуры их подвергают иммортализации. Иммортализацию меланоцитов осуществляют с помощью ретровирусной конструкции pLXSHD+SV40( 328), которая обеспечивает экспрессию SV40 Т-антигена (см. Pfeifer et al., Meth. Cell Sci. , 17:83-89, 1995; за исключением того, что вирус получают из упакованной клеточной линии, поставляемой в DMEM, 10% фетальной сыворотки теленка). Во время инфицирования используют РС-1, не содержащую сыворотки среду, описанную в статье Pfeifer et al., Meth.Cell Sci., 14, 88-89 (1995). После иммортализации иммортализованные клеточные линии переносят на М2 пролиферационную и дифференцирующую среду DMEM/F12 среда, Biofluids, 148; можно также купить у M.Olssen, Uppsala, Sweden).
2) Харатеристика Т-Аg экспрессирующих меланоцитов человека
Экспрессию связанных с меланином протеинов иммортализованных меланоцитов, полученных по способу настоящего изобретения (особенно DM2-NR), сравнивают с нормальными меланоцитами. Продемонстрировано, что иммортализованные клетки экспрессируют связанные с меланином протеины, связанный с меланомой антиген (МАА) и НМВ45, аналогично с нормальными клетками, хотя и с меньшим уровнем экспрессии.
Экспрессию связанных с меланином протеинов иммортализованных меланоцитов, полученных по способу настоящего изобретения (особенно DM2-NR), сравнивают с нормальными меланоцитами. Продемонстрировано, что иммортализованные клетки экспрессируют связанные с меланином протеины, связанный с меланомой антиген (МАА) и НМВ45, аналогично с нормальными клетками, хотя и с меньшим уровнем экспрессии.
3) Индуцирование синтеза меланина
Меланогенез Т-Аg экспрессирующих меланоцитных клеточных линий (особенно линии DM2-NR) сравнивают с нормальными меланоцитами. Меланоциты обрабатывают индукторами меланогенеза - тирозином и теофиллином, и ингибитором меланогенеза - коджиевой кислотой. Меланоцитные линии (особенно DM2-NR) реагируют на модулятор меланогенеза сравнимо с нормальными клетками. Показано также, что индуцирование/ингибирование меланогенеза происходит дозо-зависимым образом.
Меланогенез Т-Аg экспрессирующих меланоцитных клеточных линий (особенно линии DM2-NR) сравнивают с нормальными меланоцитами. Меланоциты обрабатывают индукторами меланогенеза - тирозином и теофиллином, и ингибитором меланогенеза - коджиевой кислотой. Меланоцитные линии (особенно DM2-NR) реагируют на модулятор меланогенеза сравнимо с нормальными клетками. Показано также, что индуцирование/ингибирование меланогенеза происходит дозо-зависимым образом.
ПРИМЕР 5.
Штамм DKO-NR, описанный в примере 1, подвергают иммортализации, как указано ранее, используя ретровирусную конструкцию pLXSHD+E6/E7 на основе HPV16, которая представлена на фиг.2b. Отбирают несколько непрерывных линий кератиноцитов. Результаты анализа этих линий с точки зрения продуктов дифференциации (цитокератинов, GST, TNFα, инволукрина, филаггрина, лорикрина, виментина) аналогичны результатам, полученным для линий DK2-NR и DK3-NR.
ПРИМЕР 6.
Далее приводится сравнение состава новой NR-3 среды настоящего изобретения и некоторых других, не содержащих сыворотки сред настоящего изобретения, т.е. NR-1, NR-2 и NR-4.
1) Состав среды NR-1 (см. далее)
Аминокислоты - NR-1 (мг/литр)
L-аланин - 9,0000
L-аргинин, НС1 - 316,0000
Аспарагин, Н2О - 15,0000
L-аспарагиновая кислота - 4,0000
L-цистеин, НС1, Н2О - 42,0000
L-глутаминовая кислота - 14,8000
Глутамин - 877,0000
Глицин - 7,6000
L-гистидин, НС1, Н2О - 50,4000
L-изолейцин - 98,4000
L-лейцин - 131,2000
L-лизин, НС1 - 36,6000
L-метионин - 13,4000
L-фенилаланин - 14,9000
L-пролин - 34,6000
L-серин - 126,2000
L-треонин - 23,8000
L-триптофан - 9,2000
L-тирозин - 13,6000
L-валин - 70,2000
Неорганические соли
Метаванадат аммония (NH4VO3) - 0,0006
Молибдат аммония [(NH4)6Mo7О24x4H2О] - 0,0010
Хлорид кальция [СаС12х2Н2О] - 16,2000
Сульфат меди (2) [CuSO4x5H2O] - 0,0025
Сульфат железа (2) [FeSО4x7H2О] - 1,4000
Хлорид марганца [MnCl2xH2O] - 0,0002
Хлорид магния [МgС12х6Н2О] - 122,0000
Сульфат никеля [NiSO4x6H2О] - 0,0003
Хлорид калия [КС1] - 112,0000
Ацетет натрия - 301,5000
Бикарбонат натрия [NаНСО3] - 1088, 0000
Хлорид натрия [NaCI] - 5200, 0000
Двухосновный фосфат натрия [Na2HP04x7H2O] - 536,0000
Пируват натрия - 55,5000
Селенит натрия [Nа2SеО3] - 0,0050
Силикат натрия [Nа2SiO3x9Н2О] - 0,1420
Хлорид олова [SnCl2x2H2O] - 0,0001
Сульфат цинка [ZnS04x7H2O] - 0,5100
Витамины
d-биотин - 0,0200
d-кальцийпантотенат - 0,2600
Холинхлорид - 28,0000
Цианокобаламин (В12) - 0,4100
Фолиевая кислота - 0,7900
i-инозитол - 18,0000
Никотинамид (В3) - 0,0400
Пиридоксин (В6хН2О) - 0,0600
Рибофлавин (В2) - 0,0400
Остальное
Аденин - 27,3000
Эпидермальный фактор роста (EGF, человеческий, рекомб.) - 0,0010
Этаноламин - 0,0310
Глюкоза - 1080, 0000
HEPES - 6000, 0000
Гидрокортизон - 0,5000
Инсулин (бычий) - 5,0000
Фенол красный - 1,2000
Фосфоэтаноламин - 0,0710
Путресцин, 2НС1 - 0,1600
Тиамин, НС1 - 0,3400
Тиоктовая кислота - 0,2100
Тимидин - 0,7300
Трансферрин (человека) - 10,0000
Осмолярность - 280-285 мОсм/кг
2) Состав среды NR-2; тот же, что и NR-1, но дополнен экстрактом бычьего гипофиза (Biofluid Inc.) при 35 мг/л и содержит антибиотики (Gibco BRL, Life Technologies Inc. ) фунгиэон (0,25 мг/л), пенициллин (10000 ед) и стрептомицин (10 мг/л).
Аминокислоты - NR-1 (мг/литр)
L-аланин - 9,0000
L-аргинин, НС1 - 316,0000
Аспарагин, Н2О - 15,0000
L-аспарагиновая кислота - 4,0000
L-цистеин, НС1, Н2О - 42,0000
L-глутаминовая кислота - 14,8000
Глутамин - 877,0000
Глицин - 7,6000
L-гистидин, НС1, Н2О - 50,4000
L-изолейцин - 98,4000
L-лейцин - 131,2000
L-лизин, НС1 - 36,6000
L-метионин - 13,4000
L-фенилаланин - 14,9000
L-пролин - 34,6000
L-серин - 126,2000
L-треонин - 23,8000
L-триптофан - 9,2000
L-тирозин - 13,6000
L-валин - 70,2000
Неорганические соли
Метаванадат аммония (NH4VO3) - 0,0006
Молибдат аммония [(NH4)6Mo7О24x4H2О] - 0,0010
Хлорид кальция [СаС12х2Н2О] - 16,2000
Сульфат меди (2) [CuSO4x5H2O] - 0,0025
Сульфат железа (2) [FeSО4x7H2О] - 1,4000
Хлорид марганца [MnCl2xH2O] - 0,0002
Хлорид магния [МgС12х6Н2О] - 122,0000
Сульфат никеля [NiSO4x6H2О] - 0,0003
Хлорид калия [КС1] - 112,0000
Ацетет натрия - 301,5000
Бикарбонат натрия [NаНСО3] - 1088, 0000
Хлорид натрия [NaCI] - 5200, 0000
Двухосновный фосфат натрия [Na2HP04x7H2O] - 536,0000
Пируват натрия - 55,5000
Селенит натрия [Nа2SеО3] - 0,0050
Силикат натрия [Nа2SiO3x9Н2О] - 0,1420
Хлорид олова [SnCl2x2H2O] - 0,0001
Сульфат цинка [ZnS04x7H2O] - 0,5100
Витамины
d-биотин - 0,0200
d-кальцийпантотенат - 0,2600
Холинхлорид - 28,0000
Цианокобаламин (В12) - 0,4100
Фолиевая кислота - 0,7900
i-инозитол - 18,0000
Никотинамид (В3) - 0,0400
Пиридоксин (В6хН2О) - 0,0600
Рибофлавин (В2) - 0,0400
Остальное
Аденин - 27,3000
Эпидермальный фактор роста (EGF, человеческий, рекомб.) - 0,0010
Этаноламин - 0,0310
Глюкоза - 1080, 0000
HEPES - 6000, 0000
Гидрокортизон - 0,5000
Инсулин (бычий) - 5,0000
Фенол красный - 1,2000
Фосфоэтаноламин - 0,0710
Путресцин, 2НС1 - 0,1600
Тиамин, НС1 - 0,3400
Тиоктовая кислота - 0,2100
Тимидин - 0,7300
Трансферрин (человека) - 10,0000
Осмолярность - 280-285 мОсм/кг
2) Состав среды NR-2; тот же, что и NR-1, но дополнен экстрактом бычьего гипофиза (Biofluid Inc.) при 35 мг/л и содержит антибиотики (Gibco BRL, Life Technologies Inc. ) фунгиэон (0,25 мг/л), пенициллин (10000 ед) и стрептомицин (10 мг/л).
3) Состав среды NR-3: тот же, что и у среды NR-2, но дополнен эпинефрином (Biofluid Inc.) 250 мкг/л.
4) Состав среды NR-4: тот же, что и у среды NR-2, но дополнен βFGF (3 мкг/л) (основной фактор роста фибробластов, полученный от Sigma Inc.) и форбол-12-миристат-13-ацетатом (10 мкг/л (РМА)(C.C.R. Inc.)
Хотя настоящее изобретение описано с существенными деталями в отношении некоторых предпочтительных вариантов, другие варианты в объеме настоящего изобретения также возможны. Соответственно ни раскрытие изобретения, ни приводимая далее формула изобретения, не должны быть ограничены прилагаемыми предпочтительными вариантами.
Хотя настоящее изобретение описано с существенными деталями в отношении некоторых предпочтительных вариантов, другие варианты в объеме настоящего изобретения также возможны. Соответственно ни раскрытие изобретения, ни приводимая далее формула изобретения, не должны быть ограничены прилагаемыми предпочтительными вариантами.
Claims (11)
1. Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов человека DK2-NR (DSM АСС 2238), которая сохраняет способность дифференцировать и экспрессировать протеины и ферменты, которые экспрессируются нормальными дифференцированными кератиноцитами даже после большого числа пассажей в культуре тканей, предназначенная для исследования кожных реакций.
2. Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов человека DK3-NR (DSM ACC 2239), которая сохраняет способность дифференцировать и экспрессировать протеины и ферменты, которые экспрессируются нормальными дифференцированными кератиноцитами даже после большого числа пассажей в культуре тканей, предназначенная для исследования кожных реакций.
3. Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов человека FK2-NR (DSM ACC 2240), которая сохраняет способность дифференцировать и экспрессировать протеины и ферменты, которые экспрессируются нормальными дифференцированными кератиноцитами даже после большого числа пассажей в культуре тканей, предназначенная для исследования кожных реакций.
4. Иммортализованная клеточная линия меланоцитов человека DM2-NR (CNCM 1-1796), предназначенная для исследования кожных реакций.
5. Способ иммортализации клеток кожи человека для получения иммортализованных кератиноцитов, отличающийся тем, что включает следующие стадии: (i) получения образца ткани кожи человека, (ii) подготовки указанного образца кожи для культивирования in vitro, (iii) получения кератиноцитов из указанного подготовленного образца кожи и посева указанных кератиноцитов на не содержащую сыворотки среду NR-3 для выращивания на культуральные пластины, снабженные покрытием, включающим фибронектин, коллаген типа 1 и BSA, которые облегчают прикрепление клеток и их рост, (iv) замену среды при необходимости для оптимизации конфлюэнтного роста культивируемых клеток при постоянном сохранении покрытия на пластинах с культурами, (v) переноса кератиноцитов в не содержащую сыворотки селекционную среду NR-3 на аналогичным образом предварительно покрытые культуральные пластины, (vi) инфицирования кератиноцитов ретровирусной конструкцией, в частности, pLXSHD+Е6/Е7 или pLXSHD+SV40 (N 328), (vii) переноса полученных иммортализованных кератиноцитов на не содержащую сыворотки пролиферативную среду NR-2, подходящую для пролиферации иммортализованных кератиноцитов на аналогичным образом предварительно покрытых культуральных пластинах, и (viii) переноса полученных пролиферированных кератиноцитов на не содержащую сыворотки дифференцирующую среду с высоким содержанием кальция NR-2 или модифицированную среду МСДВ153, содержащую кальций в количестве, по крайней мере, 1,5 мМ на аналогичным образом предварительно покрытые культуральные пластины.
6. Способ иммортализации клеток кожи человека для получения иммортализованных меланоцитов, отличающийся тем, что включает следующие стадии: (i) получения образца ткани кожи человека, (ii) подготовки указанного образца кожи для культивирования in vitro, (iii) получения меланоцитов из указанного подготовленного образца кожи и посева указанных меланоцитов на не содержащую сыворотки среду NR-3 для выращивания на культуральные пластины, снабженные покрытием, включающим фибронектин, коллаген типа 1 и BSA, которые облегчают прикрепление клеток и их рост, (iv) замену среды при необходимости для оптимизации конфлюэнтного роста культивируемых клеток при постоянном сохранении покрытия на пластинах с культурами, (v) переноса меланоцитов в не содержащую сыворотки селекционную среду NR-4 на аналогичным образом предварительно покрытые культуральные пластины, (vi) инфицирования меланоцитов ретровирусной конструкцией, в частности, pLXSHD+SV40 (N 328) или конструкцией pLXSHD+E6/E7, (vii) переноса полученных иммортализованных меланоцитов на не содержащую сыворотки пролиферативную среду М2, подходящую для пролиферации иммортализованных меланоцитов на аналогичным образом предварительно покрытых культуральных пластинах.
7. Бессывороточная среда NR-3, пригодная для выделения и продуцирования кератиноцитов и меланоцитов человека, которые сохраняют способность дифференцировать и экспрессировать протеины и ферменты дифференцированных кератиноцитов и меланоцитов человека даже после большого числа пассажей, которая включает, мг/л среды:
Аминокислоты
L-аланин - 9,0000
L-аргинин, НС1 - 316,0000
Аспарагин, Н2О - 15,0000
L-аспарагиновая кислота - 4,0000
L-цистеин, НСl, H2O - 42,0000
L-глутаминовая кислота - 14,8000
Глутамин - 877,0000
Глицин - 7,6000
L-гистидин, НС1, Н2О - 50,4000
L-изолейцин - 98,4000
L-лейцин - 131,2000
L-лизин, НС1 - 36,6000
L-метионин - 13,4000
L-фенилаланин - 14,9000
L-пролин - 34,6000
L-серин - 126,2000
L-треонин - 23,8000
L-триптофан - 9,2000
L-тирозин - 13,6000
L-валин - 70,2000
Неорганические соли
Метаванадат аммония (NH4VO3) - 0,0006
Молибдат аммония [(NH4)6Мо7O24•4Н2О] - 0,0010
Хлорид кальция [CaCl2•2H2О] - 16,2000
Сульфат меди (2) [CuSO4•5H2O] - 0,0025
Сульфат железа (2) [FeSO4•7H2O] - 1,4000
Хлорид марганца [МnСl2•4Н2О] - 0,0002
Хлорид магния [MgCl2 •6H2O] - 122,0000
Сульфат никеля [NiSO4•6H2O] - 0,0003
Хлорид калия [КС1] - 112,0000
Ацетат натрия - 301,5000
Бикарбонат натрия [NаНСО3] - 1088, 0000
Хлорид натрия [NaCl] - 5200, 0000
Двухосновный фосфат натрия [Nа2НРО4•7H2O] - 536,0000
Пируват натрия - 55,5000
Селенит натрия [NaSeO3] - 0,0050
Силикат натрия [NaSiO3•9H2O] - 0,1420
Хлорид олова [SnCl2•2H2O] - 0,0001
Сульфат цинка [ZnSO4•7H2O] - 0,5100
Витамины
d-биотин - 0,0200
d-кальцийпантотенат - 0,2600
Холинхлорид - 28,0000
Цианокобаламин (В12) - 0,4100
Фолиевая кислота - 0,7900
i-инозитол - 18,0000
Никотинамид (В3) - 0,0400
Пиридоксин (В6•H2O) - 0,0600
Рибофлавин (В2) - 0,0400
Остальное
Аденин - 27,3000
Эпидермальный фактор роста (EGF, человеческий, рекомб. ) - 0,0010
Этаноламин - 0,0310
Глюкоза - 1080, 0000
HEPES - 6000, 0000
Гидрокортизон - 0,5000
Инсулин (бычий) - 5,0000
Фенол красный - 1,2000
Фосфоэтаноламин - 0,0710
Путресцин 2НСl - 0,1600
Тиамин НСl - 0,3400
Тиоктовая кислота - 0,2100
Тимидин - 0,7300
Трансферрин (человека) - 10,0000
Экстракт бычьего гипофиза - 35,0000
Фунгизон - 0,2500
Пенициллин - 10000,0000 ед
Стрептомицин - 10,0000
Осмолярность - 280-285 мOсм/кг
причем один или более из указанных компонентов может быть исключен, и количество ингредиентов заместителей может меняться от указанных выше значений в интервале от ±50 до ±0,1, предпочтительно от ±10 до 0,1%; и эпинефрин в концентрации, достаточной для усиления роста кератиноцитов, предпочтительно, около, 250 мкг/л среды.
Аминокислоты
L-аланин - 9,0000
L-аргинин, НС1 - 316,0000
Аспарагин, Н2О - 15,0000
L-аспарагиновая кислота - 4,0000
L-цистеин, НСl, H2O - 42,0000
L-глутаминовая кислота - 14,8000
Глутамин - 877,0000
Глицин - 7,6000
L-гистидин, НС1, Н2О - 50,4000
L-изолейцин - 98,4000
L-лейцин - 131,2000
L-лизин, НС1 - 36,6000
L-метионин - 13,4000
L-фенилаланин - 14,9000
L-пролин - 34,6000
L-серин - 126,2000
L-треонин - 23,8000
L-триптофан - 9,2000
L-тирозин - 13,6000
L-валин - 70,2000
Неорганические соли
Метаванадат аммония (NH4VO3) - 0,0006
Молибдат аммония [(NH4)6Мо7O24•4Н2О] - 0,0010
Хлорид кальция [CaCl2•2H2О] - 16,2000
Сульфат меди (2) [CuSO4•5H2O] - 0,0025
Сульфат железа (2) [FeSO4•7H2O] - 1,4000
Хлорид марганца [МnСl2•4Н2О] - 0,0002
Хлорид магния [MgCl2 •6H2O] - 122,0000
Сульфат никеля [NiSO4•6H2O] - 0,0003
Хлорид калия [КС1] - 112,0000
Ацетат натрия - 301,5000
Бикарбонат натрия [NаНСО3] - 1088, 0000
Хлорид натрия [NaCl] - 5200, 0000
Двухосновный фосфат натрия [Nа2НРО4•7H2O] - 536,0000
Пируват натрия - 55,5000
Селенит натрия [NaSeO3] - 0,0050
Силикат натрия [NaSiO3•9H2O] - 0,1420
Хлорид олова [SnCl2•2H2O] - 0,0001
Сульфат цинка [ZnSO4•7H2O] - 0,5100
Витамины
d-биотин - 0,0200
d-кальцийпантотенат - 0,2600
Холинхлорид - 28,0000
Цианокобаламин (В12) - 0,4100
Фолиевая кислота - 0,7900
i-инозитол - 18,0000
Никотинамид (В3) - 0,0400
Пиридоксин (В6•H2O) - 0,0600
Рибофлавин (В2) - 0,0400
Остальное
Аденин - 27,3000
Эпидермальный фактор роста (EGF, человеческий, рекомб. ) - 0,0010
Этаноламин - 0,0310
Глюкоза - 1080, 0000
HEPES - 6000, 0000
Гидрокортизон - 0,5000
Инсулин (бычий) - 5,0000
Фенол красный - 1,2000
Фосфоэтаноламин - 0,0710
Путресцин 2НСl - 0,1600
Тиамин НСl - 0,3400
Тиоктовая кислота - 0,2100
Тимидин - 0,7300
Трансферрин (человека) - 10,0000
Экстракт бычьего гипофиза - 35,0000
Фунгизон - 0,2500
Пенициллин - 10000,0000 ед
Стрептомицин - 10,0000
Осмолярность - 280-285 мOсм/кг
причем один или более из указанных компонентов может быть исключен, и количество ингредиентов заместителей может меняться от указанных выше значений в интервале от ±50 до ±0,1, предпочтительно от ±10 до 0,1%; и эпинефрин в концентрации, достаточной для усиления роста кератиноцитов, предпочтительно, около, 250 мкг/л среды.
8. Бессывороточная среда NR-2, предназначенная для выделения, продуцирования и/или поддержания иммортализованных кератиноцитов и/или меланоцитов, содержащая, мг/л:
Аминокислоты
L-аланин - 9,0000
L-аргинин, НС1 - 316,0000
Аспарагин, H2O - 15,0000
L-аспарагиновая кислота - 4,0000
L-цистеин, НСl, Н2О - 42,0000
L-глутаминовая кислота - 14,8000
Глутамин - 877,0000
Глицин - 7,6000
L-гистидин, НСl, H2O - 50,4000
L-изолейцин - 98,4000
L-лейцин - 131,2000
L-лизин, НС1 - 36,6000
L-метионин - 13,4000
L-фенилаланин - 14,9000
L-пролин - 34,6000
L-серин - 126,2000
L-треонин - 23,8000
L-триптофан - 9,2000
L-тирозин - 13,6000
L-валин - 70,2000
Неорганические соли
Метаванадат аммония (NН4VО3) - 0,0006
Молибдат аммония [(NH4)6Мо7O24•4Н2О] - 0,0010
Хлорид кальция [СаСl2•2H2O] - 16,2000
Сульфат меди (2) [CuSO4•5H2O] - 0,0025
Сульфат железа (2) [FeSO4•7H2O] - 1,4000
Хлорид марганца [МnСl2•4H2O] - 0,0002
Хлорид магния [MgCl2•6H2O] - 122,0000
Сульфат никеля [NiSO4•6H2O] - 0,0003
Хлорид калия [КСl] - 112,0000
Ацетат натрия - 301,5000
Бикарбонат натрия [NаНСО3] - 1088,0000
Хлорид натрия [NaCl] - 5200,0000
Двухосновный фосфат натрия [Na2HPO4•7H2O] - 536,0000
Пируват натрия - 55,5000
Селенит натрия [NaSeO3] - 0,0050
Силикат натрия [NaSiO3•9H2O] - 0,1420
Хлорид олова [SnCl2•2H2O] - 0,0001
Сульфат цинка [ZnSO4•7H2O] - 0,5100
Витамины
d-биотин - 0,0200
d-кальцийпантотенат - 0,2600
Холинхлорид - 28,0000
Цианокобаламин (В12) - 0,4100
Фолиевая кислота - 0,7900
i-инозитол - 18,0000
Никотинамид (В3) - 0,0400
Пиридоксин (В6•H2O) - 0,0600
Рибофлавин (В2) - 0,0400
Остальное
Аденин - 27,3000
Эпидермальный фактор роста (EGF, человеческий, рекомб. ) - 0,0010
Этаноламин - 0,0310
Глюкоза - 1080,0000
HEPES - 6000,0000
Гидрокортизон - 0,5000
Инсулин (бычий) - 5,0000
Фенол красный - 1,2000
Фосфоэтаноламин - 0,0710
Путресцин 2НСl - 0,1600
Тиамин НСl - 0,3400
Тиоктовая кислота - 0,2100
Тимидин - 0,7300
Трансферрин (человека) - 10,0000
Экстракт бычьего гипофиза - 35,0000
Фунгизон - 0,2500
Пенициллин - 10000,0000 ед
Стрептомицин - 10,0000
Осмолярность - 280-285 мОсм/кг
9. Бессывороточная среда по п. 8, отличающаяся тем, что дополнительно содержит эпинефрин в концентрации 250 мкг/л среды (среда NR-3).
Аминокислоты
L-аланин - 9,0000
L-аргинин, НС1 - 316,0000
Аспарагин, H2O - 15,0000
L-аспарагиновая кислота - 4,0000
L-цистеин, НСl, Н2О - 42,0000
L-глутаминовая кислота - 14,8000
Глутамин - 877,0000
Глицин - 7,6000
L-гистидин, НСl, H2O - 50,4000
L-изолейцин - 98,4000
L-лейцин - 131,2000
L-лизин, НС1 - 36,6000
L-метионин - 13,4000
L-фенилаланин - 14,9000
L-пролин - 34,6000
L-серин - 126,2000
L-треонин - 23,8000
L-триптофан - 9,2000
L-тирозин - 13,6000
L-валин - 70,2000
Неорганические соли
Метаванадат аммония (NН4VО3) - 0,0006
Молибдат аммония [(NH4)6Мо7O24•4Н2О] - 0,0010
Хлорид кальция [СаСl2•2H2O] - 16,2000
Сульфат меди (2) [CuSO4•5H2O] - 0,0025
Сульфат железа (2) [FeSO4•7H2O] - 1,4000
Хлорид марганца [МnСl2•4H2O] - 0,0002
Хлорид магния [MgCl2•6H2O] - 122,0000
Сульфат никеля [NiSO4•6H2O] - 0,0003
Хлорид калия [КСl] - 112,0000
Ацетат натрия - 301,5000
Бикарбонат натрия [NаНСО3] - 1088,0000
Хлорид натрия [NaCl] - 5200,0000
Двухосновный фосфат натрия [Na2HPO4•7H2O] - 536,0000
Пируват натрия - 55,5000
Селенит натрия [NaSeO3] - 0,0050
Силикат натрия [NaSiO3•9H2O] - 0,1420
Хлорид олова [SnCl2•2H2O] - 0,0001
Сульфат цинка [ZnSO4•7H2O] - 0,5100
Витамины
d-биотин - 0,0200
d-кальцийпантотенат - 0,2600
Холинхлорид - 28,0000
Цианокобаламин (В12) - 0,4100
Фолиевая кислота - 0,7900
i-инозитол - 18,0000
Никотинамид (В3) - 0,0400
Пиридоксин (В6•H2O) - 0,0600
Рибофлавин (В2) - 0,0400
Остальное
Аденин - 27,3000
Эпидермальный фактор роста (EGF, человеческий, рекомб. ) - 0,0010
Этаноламин - 0,0310
Глюкоза - 1080,0000
HEPES - 6000,0000
Гидрокортизон - 0,5000
Инсулин (бычий) - 5,0000
Фенол красный - 1,2000
Фосфоэтаноламин - 0,0710
Путресцин 2НСl - 0,1600
Тиамин НСl - 0,3400
Тиоктовая кислота - 0,2100
Тимидин - 0,7300
Трансферрин (человека) - 10,0000
Экстракт бычьего гипофиза - 35,0000
Фунгизон - 0,2500
Пенициллин - 10000,0000 ед
Стрептомицин - 10,0000
Осмолярность - 280-285 мОсм/кг
9. Бессывороточная среда по п. 8, отличающаяся тем, что дополнительно содержит эпинефрин в концентрации 250 мкг/л среды (среда NR-3).
10. Бессывороточная среда по п. 8, отличающаяся тем, что дополнительно содержит βFGF в концентрации 3,0 мкг/л среды и форбитол-12-миристат-13 ацететат в концентрации 10,000 мкг/л среды (среда NR-4).
11. Анализ кожных реакций, включающий использование иммортализованных клеток кератинцитов и/или меланоцитов по пп. 1-4.
12. Анализ по п. 11, отличающийся тем, что указанный анализ является анализом воспалений.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US57648395A | 1995-12-21 | 1995-12-21 | |
US08/576,483 | 1995-12-21 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU98113400A RU98113400A (ru) | 2000-10-20 |
RU2215030C2 true RU2215030C2 (ru) | 2003-10-27 |
Family
ID=24304605
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU98113400/13A RU2215030C2 (ru) | 1995-12-21 | 1996-12-19 | Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов и меланоцитов (варианты), способ иммортализации клеток кожи человека для получения иммортализованных кератиноцитов, способ иммортализации клеток кожи человека для получения иммортализованных меланоцитов, бессывороточная среда (варианты), анализ кожных реакций |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6423540B2 (ru) |
EP (2) | EP0780469B1 (ru) |
JP (1) | JP4404965B2 (ru) |
KR (1) | KR100455006B1 (ru) |
CN (1) | CN1154717C (ru) |
AT (1) | ATE199390T1 (ru) |
AU (1) | AU730222B2 (ru) |
BR (1) | BR9612256B1 (ru) |
CA (1) | CA2234118C (ru) |
CZ (1) | CZ297289B6 (ru) |
DE (1) | DE69611894T2 (ru) |
DK (1) | DK0780469T3 (ru) |
ES (1) | ES2155166T3 (ru) |
GR (1) | GR3035719T3 (ru) |
HU (1) | HU226195B1 (ru) |
IL (1) | IL124191A (ru) |
NO (1) | NO326190B1 (ru) |
NZ (1) | NZ325814A (ru) |
PL (1) | PL195108B1 (ru) |
PT (1) | PT780469E (ru) |
RU (1) | RU2215030C2 (ru) |
SK (1) | SK283314B6 (ru) |
WO (1) | WO1997023602A1 (ru) |
Families Citing this family (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE199390T1 (de) * | 1995-12-21 | 2001-03-15 | Nestle Sa | Unsterbliche humane hautzell-linien und serumfreies medium für ihre herstellung |
SK286870B6 (sk) * | 1998-04-17 | 2009-06-05 | Soci�T� Des Produits Nestl� S.A. | Ľudská keratinocytová bunková línia, in vitro spôsob imortalizácie ľudských kožných buniek, použitie ľudskej bunkovej línie a umelá koža s jej obsahom |
US6964869B2 (en) | 1998-07-13 | 2005-11-15 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method and composition for skin grafts |
CN1087778C (zh) * | 1999-03-02 | 2002-07-17 | 华东理工大学 | 杂交瘤细胞无血清培养基 |
DE19912798C1 (de) * | 1999-03-10 | 2000-02-17 | Andreas Jordan | Verfahren zur Kultivierung von Krebszellen aus Humangewebe und Vorrichtung zur Aufbereitung von Gewebeproben |
AUPR298901A0 (en) | 2001-02-07 | 2001-03-08 | McComb Foundation, Inc., The | Cell suspension preparation technique and device |
ATE368856T1 (de) * | 2001-04-24 | 2007-08-15 | Wisconsin Alumni Res Found | Verfahren und zusammensetzung für hauttransplantate |
WO2002091999A2 (en) | 2001-05-09 | 2002-11-21 | Geron Corporation | Treatment for wounds |
US20030022369A1 (en) * | 2001-05-18 | 2003-01-30 | Helen Fillmore | Differentiation of specialized dermal and epidermal cells into neuronal cells |
CA2452660A1 (en) * | 2001-07-06 | 2003-01-16 | Lipomics Technologies, Inc. | Generating, viewing, interpreting, and utilizing a quantitative database of metabolites |
GB0208041D0 (en) | 2002-04-08 | 2002-05-22 | Lonza Biologics Plc | Method of culturing animal cells |
US20050025737A1 (en) * | 2003-07-30 | 2005-02-03 | Sebagh Jean Louis | Compositions containing melon extracts |
JP4532493B2 (ja) * | 2003-09-18 | 2010-08-25 | レイベン バイオテクノロジーズ,インコーポレイティド | 細胞培養培地 |
WO2005071065A1 (en) * | 2004-01-26 | 2005-08-04 | Cognis France S.A.S | Method for studying functional interactions between sensory neurons and keratinocytes or melanocytes |
ES2622508T3 (es) | 2005-03-17 | 2017-07-06 | Stratatech Corporation | Sustitutos de piel con pureza mejorada |
EP1818392B1 (en) * | 2006-02-14 | 2010-08-25 | Genetix Limited | Cell culture medium |
WO2010065907A2 (en) * | 2008-12-05 | 2010-06-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Use of a rock inhibitor to sustain primary human keratinocytes in a proliferative state |
WO2010134619A1 (ja) * | 2009-05-18 | 2010-11-25 | 国立大学法人東北大学 | 人工多能性幹細胞からの上皮系前駆細胞・幹細胞群及び角膜上皮細胞群の分化誘導方法 |
KR101768632B1 (ko) * | 2011-05-18 | 2017-08-17 | (주)아모레퍼시픽 | 칼슘 펄스를 통한 배양상피세포층의 분리방법 |
ES2627342T3 (es) | 2011-07-12 | 2017-07-27 | Foodchek Systems, Inc. | Medio de cultivo, método para cultivar Salmonella y E. coli y método para detectar Salmonella y E. coli |
WO2013129885A1 (ko) * | 2012-02-28 | 2013-09-06 | 건국대학교 산학협력단 | 세포 배양액 |
WO2014142038A1 (ja) | 2013-03-11 | 2014-09-18 | Jcrファーマ株式会社 | ヒト角膜上皮シートの製造法 |
AU2013205148B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-30 | AVITA Medical Americas, LLC | Systems and methods for tissue processing and preparation of cell suspension therefrom |
WO2016085304A1 (ko) * | 2014-11-28 | 2016-06-02 | (주)아모레퍼시픽 | 멜라닌 세포주 계대배양계 및 이를 이용한 노화 수준 판단, 미용 정보 제공, 또는 스크리닝 방법 |
WO2016122438A1 (en) * | 2015-01-26 | 2016-08-04 | Halliburton Energy Services, Inc. | Rotating superhard cutting element |
CN105238739A (zh) * | 2015-11-11 | 2016-01-13 | 朱宁文 | 临床治疗级细胞治疗用黑色素细胞(melanocytes)规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法 |
CN106520674A (zh) * | 2016-12-24 | 2017-03-22 | 严志海 | 一种用于表皮黑素细胞体外培养的无血清培养基 |
CN107115219A (zh) * | 2017-05-12 | 2017-09-01 | 青岛赛欧凯普图乐生物医药有限公司 | 一种纤维芽母细胞活化液面膜配方 |
CN114058565A (zh) * | 2020-07-31 | 2022-02-18 | 上海尚瑞生物医药科技有限公司 | 一种无血清的黑素母细胞培养液及其培养方法 |
KR102583179B1 (ko) * | 2020-11-27 | 2023-09-26 | (주)엑셀세라퓨틱스 | 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포 수립 또는 배양용 배지 조성물 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5292655A (en) * | 1990-01-29 | 1994-03-08 | Wille Jr John J | Method for the formation of a histologically-complete skin substitute |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4940666A (en) * | 1983-07-15 | 1990-07-10 | University Patents, Inc. | Process and defined medium for growth of human epidermal keratinocyte cells |
US4885238A (en) | 1987-10-30 | 1989-12-05 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Immortalized human bronchial epitherial mesothelial cell lines |
US5376542A (en) | 1992-04-27 | 1994-12-27 | Georgetown University | Method for producing immortalized cell lines using human papilluma virus genes |
EP0757558A4 (en) * | 1994-04-12 | 1999-06-16 | Alza Corp | METHOD FOR DETECTING AGENTS THAT MODULATE AN INFLAMMATORY SKIN REACTION |
DE19617261A1 (de) | 1995-04-21 | 1996-11-28 | Naeher Helmut Dr Med Priv Doz | Hautverträglichkeitstest |
ATE199390T1 (de) * | 1995-12-21 | 2001-03-15 | Nestle Sa | Unsterbliche humane hautzell-linien und serumfreies medium für ihre herstellung |
-
1996
- 1996-12-19 AT AT96203641T patent/ATE199390T1/de active
- 1996-12-19 PT PT96203641T patent/PT780469E/pt unknown
- 1996-12-19 CA CA002234118A patent/CA2234118C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-12-19 JP JP52332997A patent/JP4404965B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-12-19 SK SK835-98A patent/SK283314B6/sk unknown
- 1996-12-19 DK DK96203641T patent/DK0780469T3/da active
- 1996-12-19 KR KR10-1998-0704097A patent/KR100455006B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-12-19 DE DE69611894T patent/DE69611894T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-19 US US09/091,483 patent/US6423540B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-19 AU AU13054/97A patent/AU730222B2/en not_active Ceased
- 1996-12-19 BR BRPI9612256-0A patent/BR9612256B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-12-19 IL IL12419196A patent/IL124191A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-12-19 NZ NZ325814A patent/NZ325814A/xx unknown
- 1996-12-19 CZ CZ0194598A patent/CZ297289B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-12-19 PL PL96327320A patent/PL195108B1/pl unknown
- 1996-12-19 ES ES96203641T patent/ES2155166T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-19 HU HU9903742A patent/HU226195B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-12-19 EP EP96203641A patent/EP0780469B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-19 CN CNB961991755A patent/CN1154717C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-12-19 WO PCT/EP1996/005812 patent/WO1997023602A1/en active IP Right Grant
- 1996-12-19 RU RU98113400/13A patent/RU2215030C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-12-19 EP EP96944641A patent/EP0877797A1/en not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-06-18 NO NO19982810A patent/NO326190B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-04-06 GR GR20010400570T patent/GR3035719T3/el unknown
- 2001-10-18 US US09/982,649 patent/US6949381B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5292655A (en) * | 1990-01-29 | 1994-03-08 | Wille Jr John J | Method for the formation of a histologically-complete skin substitute |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
P.BOUKAMP et al., Normal keratinization in a Spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J. of Cell Biology, 1988, v.106, p.761-771. A.M.A. PFEIFER et al., Highly efficient establishment of immortalized cells from adult human line. Methods in cell science, 1995, v.17, 2, p.83-89. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2215030C2 (ru) | Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов и меланоцитов (варианты), способ иммортализации клеток кожи человека для получения иммортализованных кератиноцитов, способ иммортализации клеток кожи человека для получения иммортализованных меланоцитов, бессывороточная среда (варианты), анализ кожных реакций | |
JP2000506374A5 (ru) | ||
US5143842A (en) | Media for normal human muscle satellite cells | |
AU621972B2 (en) | Cell culture medium for human liver epithelial cell line | |
AU756151B2 (en) | Immortalised cell lines derived from normal human skin tissues | |
Ham | Dermal fibroblasts | |
MXPA00009558A (en) | Immortalised cell lines derived from normal human skin tissues |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20151220 |