PL195108B1 - Unieśmiertelnione linie komórkowe skóry ludzkiej,keratynocytów albo melanocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, nowe bezsurowicze pożywki, zastosowanie unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów oraz pierwotnych melanocytów albo keratynocytów oraz ulepszony sposób przeszczepiania skóry - Google Patents
Unieśmiertelnione linie komórkowe skóry ludzkiej,keratynocytów albo melanocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, nowe bezsurowicze pożywki, zastosowanie unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów oraz pierwotnych melanocytów albo keratynocytów oraz ulepszony sposób przeszczepiania skóryInfo
- Publication number
- PL195108B1 PL195108B1 PL96327320A PL32732096A PL195108B1 PL 195108 B1 PL195108 B1 PL 195108B1 PL 96327320 A PL96327320 A PL 96327320A PL 32732096 A PL32732096 A PL 32732096A PL 195108 B1 PL195108 B1 PL 195108B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- keratinocytes
- medium
- melanocytes
- immortalized
- serum
- Prior art date
Links
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 title claims description 13
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 268
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 143
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 claims abstract description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims abstract description 14
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 135
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 111
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 29
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 27
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 claims description 18
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 claims description 18
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 17
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 claims description 17
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 16
- 229930182837 (R)-adrenaline Natural products 0.000 claims description 16
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 16
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 claims description 16
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 16
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 14
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims description 13
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 13
- 101000693922 Bos taurus Albumin Proteins 0.000 claims description 12
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 12
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 12
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 12
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- -1 asparagineH 2 O Chemical compound 0.000 claims description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 11
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 11
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 11
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 10
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 9
- RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M cyanocobalamin Chemical compound N#C[Co+]N([C@]1([H])[C@H](CC(N)=O)[C@]\2(CCC(=O)NC[C@H](C)OP(O)(=O)OC3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)C)C/2=C(C)\C([C@H](C/2(C)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M 0.000 claims description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 8
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 8
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 8
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 7
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 7
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 7
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims description 7
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 7
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 7
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 7
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 102100028314 Filaggrin Human genes 0.000 claims description 6
- 101710088660 Filaggrin Proteins 0.000 claims description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000007236 involucrin Human genes 0.000 claims description 6
- 108010033564 involucrin Proteins 0.000 claims description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 150000004633 phorbol derivatives Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 claims description 6
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 5
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 claims description 5
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 claims description 4
- PMYDPQQPEAYXKD-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-n-naphthalen-2-ylnaphthalene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=CC2=CC(NC(=O)C3=CC4=CC=CC=C4C=C3O)=CC=C21 PMYDPQQPEAYXKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 claims description 4
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 4
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N O-phosphoethanolamine Chemical compound NCCOP(O)(O)=O SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004115 Sodium Silicate Substances 0.000 claims description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XXWCODXIQWIHQN-UHFFFAOYSA-N butane-1,4-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NCCCCN XXWCODXIQWIHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 claims description 4
- 229960002104 cyanocobalamin Drugs 0.000 claims description 4
- 235000000639 cyanocobalamin Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011666 cyanocobalamin Substances 0.000 claims description 4
- 229940068840 d-biotin Drugs 0.000 claims description 4
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 4
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims description 4
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims description 4
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims description 4
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 claims description 4
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 claims description 4
- LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L nickel sulfate Chemical compound [Ni+2].[O-]S([O-])(=O)=O LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229910000363 nickel(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 claims description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 claims description 4
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 claims description 4
- 239000011655 sodium selenate Substances 0.000 claims description 4
- 235000018716 sodium selenate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960001881 sodium selenate Drugs 0.000 claims description 4
- NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N sodium silicate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Si]([O-])=O NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052911 sodium silicate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 claims description 4
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 4
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 claims description 4
- HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J tin(iv) chloride Chemical compound Cl[Sn](Cl)(Cl)Cl HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 4
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 4
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 4
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 claims description 4
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 claims description 4
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 3
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 claims description 3
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 claims description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 claims description 3
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 claims description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 claims description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 3
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 claims description 3
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 3
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 claims description 3
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 claims description 3
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 claims description 3
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 3
- UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O azanium;oxido(dioxo)vanadium Chemical compound [NH4+].[O-][V](=O)=O UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 claims description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 3
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 3
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 claims description 3
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 3
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940032158 sodium silicate Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 3
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 3
- QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N 0.000 claims description 2
- KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N Arginine hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N 0.000 claims description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 2
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229940031098 ethanolamine Drugs 0.000 claims description 2
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 claims description 2
- 108010092206 glutathione S-transferase alpha Proteins 0.000 claims description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229940083542 sodium Drugs 0.000 claims description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims 1
- IFQSXNOEEPCSLW-DKWTVANSSA-N L-cysteine hydrochloride Chemical compound Cl.SC[C@H](N)C(O)=O IFQSXNOEEPCSLW-DKWTVANSSA-N 0.000 claims 1
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000006160 differential media Substances 0.000 claims 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 28
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 28
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 12
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 12
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 235000004626 essential fatty acids Nutrition 0.000 description 9
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 8
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 8
- 102100040445 Keratin, type I cytoskeletal 14 Human genes 0.000 description 8
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 101150013359 E7 gene Proteins 0.000 description 5
- 101100338009 Mus musculus Gsta1 gene Proteins 0.000 description 5
- 101100123101 Mus musculus Gsta4 gene Proteins 0.000 description 5
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 5
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N Benz[a]pyrene Chemical compound C1=C2C3=CC=CC=C3C=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000008142 Cytochrome P-450 CYP1A1 Human genes 0.000 description 4
- 108010074918 Cytochrome P-450 CYP1A1 Proteins 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 4
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 101150071673 E6 gene Proteins 0.000 description 3
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 3
- 101710183391 Keratin, type I cytoskeletal 14 Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 3
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 3
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 description 3
- 230000003061 melanogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- TXVHTIQJNYSSKO-UHFFFAOYSA-N BeP Natural products C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C3=CC=CC4=CC=C1C2=C34 TXVHTIQJNYSSKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 2
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- GEHJBWKLJVFKPS-UHFFFAOYSA-N bromochloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Br GEHJBWKLJVFKPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000001061 forehead Anatomy 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 229960004232 linoleic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 2
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- XYPANFGXFLOTDK-CJLNJPJHSA-N 1b-de-l-phenylalanine-insulin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 XYPANFGXFLOTDK-CJLNJPJHSA-N 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-MBNYWOFBSA-N 7,8-dimethyl-10-[(2R,3R,4S)-2,3,4,5-tetrahydroxypentyl]benzo[g]pteridine-2,4-dione Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000537222 Betabaculovirus Species 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100027992 Casein kinase II subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- LHQIJBMDNUYRAM-AWFVSMACSA-N D-erythro-biopterin Chemical compound N1=C(N)NC(=O)C2=NC([C@H](O)[C@H](O)C)=CN=C21 LHQIJBMDNUYRAM-AWFVSMACSA-N 0.000 description 1
- 206010014989 Epidermolysis bullosa Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 101000858625 Homo sapiens Casein kinase II subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 101000620359 Homo sapiens Melanocyte protein PMEL Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101000954519 Human papillomavirus type 18 Protein E6 Proteins 0.000 description 1
- 101000767629 Human papillomavirus type 18 Protein E7 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- LHQIJBMDNUYRAM-UHFFFAOYSA-N L-erythro-Biopterin Natural products N1=C(N)NC(=O)C2=NC(C(O)C(O)C)=CN=C21 LHQIJBMDNUYRAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 229910003206 NH4VO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910003424 Na2SeO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010002822 Phenylethanolamine N-Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100028917 Phenylethanolamine N-methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 206010058141 Skin graft rejection Diseases 0.000 description 1
- 206010040880 Skin irritation Diseases 0.000 description 1
- 101100289792 Squirrel monkey polyomavirus large T gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- 229910021626 Tin(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 1
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000016966 beta-2 Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010014499 beta-2 Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000008199 coating composition Substances 0.000 description 1
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 1
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000005550 inflammation mediator Substances 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- BEJNERDRQOWKJM-UHFFFAOYSA-N kojic acid Chemical compound OCC1=CC(=O)C(O)=CO1 BEJNERDRQOWKJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004705 kojic acid Drugs 0.000 description 1
- WZNJWVWKTVETCG-UHFFFAOYSA-N kojic acid Natural products OC(=O)C(N)CN1C=CC(=O)C(O)=C1 WZNJWVWKTVETCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000150 mutagenicity / genotoxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229940105132 myristate Drugs 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- XLCISDOVNFLSGO-VONOSFMSSA-N phorbol-12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(O)C1(C)C XLCISDOVNFLSGO-VONOSFMSSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003711 photoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036556 skin irritation Effects 0.000 description 1
- 231100000475 skin irritation Toxicity 0.000 description 1
- 230000036555 skin type Effects 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 235000011150 stannous chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- AXZWODMDQAVCJE-UHFFFAOYSA-L tin(II) chloride (anhydrous) Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Sn+2] AXZWODMDQAVCJE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- JOPDZQBPOWAEHC-UHFFFAOYSA-H tristrontium;diphosphate Chemical compound [Sr+2].[Sr+2].[Sr+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O JOPDZQBPOWAEHC-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/80—Neurotransmitters; Neurohormones
- C12N2501/81—Adrenaline
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Uniesmiertelniona linia komórkowa keratynocytów albo melanocytów, która zachowuje zdolnosc do róznicowania oraz ekspresji bialek i enzymów, które sa wyrazane przez normalnie zróznicowane keratynocyty albo melanocyty, nawet po wielu pasazach w hodowli tkankowej, przy czym srodkiem uniesmiertelniajacym jest konstrukt retrowirusowy SV40, pLXSHD+SV40(#328), albo konstrukt HPV16, pLXSHD+E6/E7. PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są unieśmiertelnione linie komórkowe skóry ludzkiej, keratynocytów albo melanocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, nowe bezsurowicze pożywki, zastosowanie unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów oraz pierwotnych melanocytów albo keratynocytów oraz ulepszony sposób przeszczepiania skóry.
W ogólności wynalazek dotyczy ulepszonych ciągłych (unieśmiertelnionych) linii komórkowych pochodzących z tkanek normalnej skóry ludzkiej, w szczególności keratynocytów i melanocytów, które zachowują zdolność do wyrażania białek różnicowania, charakterystycznych dla zróżnicowanych melanocytów albo keratynocytów, nawet po wielu pasażach. Niniejszym ujawniono również nowe bezsurowicze pożywki, które nie wymagają komórek żywicielskich.
Wytwarzanie unieśmiertelnionych linii komórkowych pochodzących z normalnych tkanek skóry ludzkiej opisano uprzednio. Sposoby takie obejmują zwykle transfekcję albo transformację komórek skóry ludzkiej np. keratynocytów i melanocytów, hodowanych in vitro z czynnikami zapewniającymi unieśmiertelnienie.
Unieśmiertelnienie dotyczy wytwarzania komórek, które są zdolne do wzrostu w hodowli in vitro przez czas dłuższy, idealnie w nieskończoność. Komórki te są również określane jako ciągłe linie komórkowe. W przeciwieństwie do komórek unieśmiertelnionych, komórki nieunieśmiertelnione są zdolne do wzrostu in vitro jedynie przez ograniczoną liczbę podziałów komórkowych. Komórki unieśmiertelnione są niezwykle pożądane, ponieważ zapewniają stabilne, potencjalnie nieskończone źródło komórek o określonej charakterystyce. Konwencjonalne środki do wytwarzania unieśmiertelnionych linii komórkowych i linii unieśmiertelnionych komórek skóry ludzkiej w szczególności obejmują, np. wirusy, rekombinowane wirusy i plazmidy zawierające sekwencje DNA zapewniające unieśmiertelnienie.
Prawdopodobnie najpowszechniejszy sposób wytwarzania unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych obejmuje zastosowanie sekwencji SV40, zaś w szczególności DNA wielkiego antygenu T SV40, jako środka unieśmiertelniającego. Przykładowo, Steinberg i in., J. Cell. Phys., 123:117-125 (1985); Reddel i in., patent USA nr 4,885,238 wydany 5 grudnia, 1989; Major, patent USA nr 4,707,448 wydany 17 listopada, 1987; Stoner i in., Cancer Res., 51:365-371 (1991); Chopra i in., In vitro Cell Dev. Biol., 30A:539-546 (1994); Chopra i in., In vitro Cell Dev. Biol., 27A:763-765 (1991); Christian i in., Cancer Res., 47:6066-6073 (1987); Rhim i in., Science, 227:1250-1252 (1985); i Grubman i in., Gastrointest. Liver Physiol., 29:G1060-G1070 (1994) opisują zastosowanie wektorów SV40 i wektorów zawierających sekwencje wielkiego antygenu T SV40 do wytwarzania unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych. Wprowadzanie takich sekwencji przeprowadza się zwykle przez zakażenie z użyciem wirusa SV40 albo hybrydy adenowirusa 12 i wirusa SV40 albo przez transfekowanie komórek metodą koprecypitacji fosforanem strontu rekombinowanym plazmidem zawierającym długie końcowe powtórzenia wirusa mięsaka Rousa i region wczesny Ori-SV 40 (patrz, Brash i in., Mol. Cell Biol., 7:2031-2034 (1987)).
Inna znana metoda otrzymywania unieśmiertelnionych linii komórkowych, zaś unieśmiertelnionych linii keratynocytów w szczególności, obejmuje transfekcję albo zakażenie komórek sekwencjami DNA wirusa brodawczaków. Przykładowo, patent USA nr 5,376,542 Schlegela, wydany 27 grudnia 1994, opisuje unieśmiertelnienie ludzkich komórek nabłonkowych wyizolowanymi genami E6 i E7 albo samym genem E7 HPV-16, 18, 31,33 albo 35, w celu wytworzenia unieśmiertelnionej linii komórkowej nietworzącej guzów. Również Barbosa i in., Oncogene, 4:1529-1532 (1989); i Muenger i in., J. Virol., 63(10): 4417-4421 (1989) opisują zastosowanie genów E6 i E7 HPV-16 i HPV-18 do wytwarzania unieśmiertelnionych keratynocytów ludzkich.
Jednakże, o ile liczne grupy donoszą o unieśmiertelnionych liniach komórkowych keratynocytów i ich zastosowaniu w testach in vitro, uprzednie unieśmiertelnione linie komórkowe keratynocytów i melanocytów wykazywały zwykle jedną albo wiele cech, z powodu których ich zastosowanie było niekorzystne. Przykładowo, uprzednio opisywane unieśmiertelnione keratynocyty wykazywały jedną albo wiele z poniższych cech: (i) zmniejszenie albo utrata ekspresji znaczników różnicowania, np. białek które są normalnie wytwarzane przez zróżnicowane keratynocyty, i (ii) zmieniona charakterystyka wzrostu w hodowli tkankowej.
Przykładowo, Jetten i in., J. Invest. Dermatol., 92:203-209 (1989) donoszą o keratynocytach unieśmiertelnionych SV40, uzyskanych po wielu pasażach (> 12 pasaży) przy użyciu wektora NHEKSV40-T8-1, które były niezdolne do różnicowania. Podobnie, Bernard i in., Cancer Res., 45:1707-1716 (1985) donoszą o wyizolowaniu unieśmiertelnionej linii komórkowej keratynocytów określanej jako
PL 195 108 B1
SVK14, która była niemal całkowicie niezdolna do różnicowania. Linia ta również nie wykazywała ekspresji keratyn K1/10 (>53 kDa) oraz keratyny 50 kDa (keratyny K14), które to białka są normalnie wyrażane przez zróżnicowane keratynocyty.
Ponadto, Steinberg i in., J. Cell. Physiol., 123:117-125 (1985) donoszą o keratynocytach transformowanych SV40, które stopniowo traciły zdolność do wyrażania keratyn, charakterystycznych dla normalnego keratynowego cytoszkieletu. Ta utrata normalnej ekspresji keratyn zachodziła po około 10-15 pasażach. Również, Hronis i in., Cancer Res., 44:5797-5804 (1984) opisują keratynocyty unieśmiertelnione DNA SV40, które utraciły zdolność do wytwarzania keratyn K5, K6, K14/15, K16 i K17 oraz inwolukryny, które to białka są charakterystyczne dla normalnie zróżnicowanych keratynocytów. Morris i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8498-8502 (1985) również opisują keratynocyty unieśmiertelnione SV40, które po licznych pasażach (> 14 pasaży) wykazywały znaczne zmniejszenie ekspresji keratyn klasy I i II. Przykładowo, keratynocyty te prawie nie wyrażały K13.
Również Banks-Schlegel i in., J. Cell. Biol., 96:330-337 (1983) ujawniają keratynocyty unieśmiertelnione SV40, które wykazują zmienioną charakterystykę wzrostu w hodowli. Przykładowo, w przeciwieństwie do normalnych keratynocytów, te unieśmiertelnione komórki wymagają do wzrostu warstwy komórek żywicielskich 3T3.
W uprzednio opisanych metodach wytwarzania unieśmiertelnionych keratynocytów i melanocytów ludzkich stosowano zwykle technikę komórek żywicielskich (w której jako komórki „żywicielskie” stosuje się fibroblasty) i zwykłą hodowlę w pożywce zawierającej surowicę. Przykładowo, Sextoni in., „Stable transfection of human keratinocytes: HPV immortalization”, Keratinocyte Methods, red. Leigh I.M. i in., University Press, 179-180 (1994); Garlick, „Retroviral Vectors”, Keratinocyte Methods, (red. Leigh I.M. i in., Cambridge University Press, 181-183 (1994)), opisują zastosowanie pożywki zawierającej cielęcą surowicę płodową i komórki żywicielskie do izolacji i wytwarzania unieśmiertelnionych keratynocytów.
Zastosowanie pożywek bezsurowiczych podczas izolacji i wytwarzania unieśmiertelnionych komórek nabłonkowych, a zwłaszcza keratynocytów ludzkich, opisano uprzednio. Przykładowo, Barbosa i in., Oncogene, 4:1529-1532 (1989), opisują wstępną hodowlę do zlewności przy niskim stężeniu wapnia i pożywce bezsurowiczej ludzkich keratynocytów transfekowanych przez elektroporację albo lipofekcję.
Jednakże, niezależnie od tego co do tej pory opisano, istnieje istotne zapotrzebowanie na unieśmiertelnione keratynocyty i melanocyty ludzkie, o ulepszonych właściwościach, w szczególności, które zachowują zdolność różnicowania normalnych keratynocytów i melanocytów, i które wyrażają białka różnicowania charakterystyczne dla zróżnicowanych melanocytów i keratynocytów, nawet po licznych pasażach. Takie komórki powinny być korzystne w wielu zastosowaniach, w szczególności w testach, które wymagają zróżnicowanych komórek skóry. Ponadto istnieje zapotrzebowanie w stanie techniki na ulepszone pożywki hodowlane zdolne do podtrzymywania pierwotnych i unieśmiertelnionych keratynocytów i melanocytów, jak również ulepszone metody hodowli, które nie wymagają zastosowania komórek żywicielskich.
Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów albo melanocytów według wynalazku zachowuje zdolność do różnicowania oraz ekspresji białek i enzymów, które są wyrażane przez normalnie zróżnicowane keratynocyty albo melanocyty, nawet po wielu pasażach w hodowli tkankowej, przy czym środkiem unieśmiertelniającym jest konstrukt retrowirusowy pLXSHD+SV40(#328) SV40 albo konstrukt pLXSHD+E6/E7 HPV16. Korzystnie unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według wynalazku wyraża białka keratyny i inne białka wyrażane przez normalne zróżnicowane keratynocyty, korzystniej białka keratyny obejmują keratynę K1/10, keratynę K14 i inne białka obejmujące inwolukrynę, filagrynę i lorykrynę.
Również korzystnie unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według wynalazku wykazuje profil CYP450 identyczny albo zasadniczo identyczny z profilem normalnych zróżnicowanych keratynocytów, a korzystniej wyraża CYP450 1A1, 2C, 2E1 i 3A5, ale nie wyraża CYP450 1A2, 2A6, 2B6 i 2D6.
Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów albo melanocytów według wynalazku jest korzystnie wytwarzana w warunkach bezsurowiczych, bez zastosowania komórek żywicielskich.
Korzystnie unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według wynalazku wyraża mRNA kodujący transferazę S-glutationu GST-π, GST-μ i GST-α. Również korzystnie, hodowana w warunkach organotypowych unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według wynalazku tworzy silnie uwarstwiony i spolaryzowany nabłonek posiadający zrogowaciałe warstwy powierzchniowe, pod
PL 195 108 B1 nieobecność surowicy albo komórek żywicielskich. Ponadto unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według wynalazku wyraża korzystnie kolagenazę typu I i TNF-α po traktowaniu jej estrami forbolu.
W zakres wynalazku wchodzi również linia komórek skóry ludzkiej unieśmiertelniona antygenem T SV40, wybrana z grupy obejmującej linie keratynocytów DK2-NR (DSM ACC2238), DK3-NR (DSM ACC2239) i FK2-NR (DSM ACC2240) oraz linię melanocytów DM2-NR (CNCM I-1796).
Wynalazek dotyczy też ulepszonego sposobu unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej w celu otrzymania unieśmiertelnionych keratynocytów i melanocytów, obejmującego etapy:
(i) pozyskania próbki normalnej skóry ludzkiej;
(ii) preparowania próbki skóry do hodowli in vitro;
(iii) uzyskiwania keratynocytów i/lub melanocytów z preparowanej próbki skóry i wysiewania keratynocytów i/lub melanocytów do bezsurowiczej pożywki hodowlanej na płytkach hodowlanych powleczonych warstwą ułatwiającą przyleganie i wzrost komórek zawierającą fibronektynę, kolagen typu I i BSA;
(iv) zmieniania pożywki jeżeli to konieczne, w celu optymalizacji wzrostu zlewnego hodowanych komórek, przy ciągłym zachowaniu powleczenia płytek hodowlanych;
(v) przeniesienia keratynocytów albo melanocytów do bezsurowiczej pożywki selekcyjnej na podobnie powleczone płytki hodowlane;
(vi) zakażenia keratynocytów albo melanocytów konstruktem retrowirusowym;
(vii) przeniesienia powstałych unieśmiertelnionych keratynocytów albo melanocytów do bezsurowiczej pożywki proliferacyjnej, odpowiedniej do proliferacji unieśmiertelnionych keratynocytów albo melanocytów na podobnie powleczonych płytkach hodowlanych; i (viii) przeniesienia powstałych proliferujących keratynocytów do bezsurowiczej pożywki różnicującej, która zawiera wysokie stężenie wapnia, na podobnie powleczonych płytkach hodowlanych.
Korzystnie konstruktem retrowirusowym stosowanym w sposobie według wynalazku jest konstrukt, pLXSHD+SV40(#328) SV40 albo konstrukt pLXSHD+E6/E7 HPV16.
Również korzystnie bezsurowiczą pożywką w etapie (iii) sposobu według wynalazku jest pożywka NR-3, a pożywką w etapie (v) jest pożywka NR-3 albo NR-4. Ponadto korzystnie proliferacyjną pożywką w etapie (vii) sposobu według wynalazku jest pożywka NR-2 albo NR-3 i pożywka M2 dla melanocytów, a różnicującą pożywką w etapie (viii) jest pożywka NR-2 albo zmodyfikowana pożywka MCDB 153, zawierająca wapń w ilości przynajmniej 1,5 mM.
Wynalazek obejmuje też nową bezsurowiczą pożywkę hodowlaną odpowiednią do izolowania i wytwarzania ludzkich keratynocytów i melanocytów, które zachowują zdolność do różnicowania oraz ekspresji białek i enzymów, które są wyrażane przez normalnie zróżnicowane keratynocyty albo melanocyty, nawet po wielu pasażach w hodowli tkankowej, która zawiera: aminokwasy albo ich sole, sole nieorganiczne, witaminy, adeninę, etanoloaminę, glukozę, HEPES, czerwień fenolową, dichlorowodorek putrescyny, kwas tioktowy, chlorowodorek tiaminy, tymidynę, naskórkowy czynnik wzrostowy, insulinę, hydrokortyzon, transferynę, fosfoetanoloaminę i ekstrakt przysadki bydlęcej. Korzystnie pożywka według wynalazku zawiera ponadto epinefrynę, a korzystniej stężenie epinefryny jest wystarczające do nasilenia wzrostu keratynocytów.
Korzystnie aminokwasy zawarte w pożywce według wynalazku wybrane są z grupy składającej się z L-alaniny, L-argininyHCl, asparaginyH2O, L-kwasu asparaginowego, L-cysteinyHCI-H-O, L-kwasu glutaminowego, glutaminy, glicyny, L-histydynyHCI«H2O, L-izoleucyny, L-leucyny, L-ilzyny-HCl, L-metioniny, L-fenyloalaniny, L-proliny, L-seryny, L-treoniny, L-tryptofanu, L-tyrozyny, L-waliny i ich soli. Również korzystnie sole nieorganiczne w pożywce według wynalazku wybrane są z grupy obejmującej metawanadan amonu, molibdenian amonu, chlorek wapnia, siarczan miedzi, siarczan żelaza, chlorek magnezu, chlorek manganu, siarczan niklu, chlorek potasu, octan sodu, wodorowęglan sodu, chlorek sodu, wodorofosforan sodu, pirogronian sodu, selenian sodu, krzemian sodu, chlorek cyny i siarczan cynku. Witaminy w pożywce według wynalazku wybrane są z grupy obejmującej d-biotynę, d-pantotenian wapnia, chlorek choliny, cyjanokobalaminę, kwas foliowy, i-inozytol, nikotynamid, pirydoksynę i ryboflawinę.
Wynalazek dotyczy również nowej bezsurowiczej pożywki do izolowania, tworzenia i/lub utrzymywania unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów, która jest wybrana z grupy obejmującej pożywkę NR-2, NR-3 i NR-4.
Wynalazek obejmuje ponadto zastosowanie unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów według wynalazku w testach wykorzystujących zróżnicowane keratynocyty i/lub melanocyty. Korzystnie, stosowanymi komórkami są komórki wybrane są grupy obejmującej DK2-NR (DSM ACC2238),
PL 195 108 B1
DK3-NR (DSM ACC2239), DM2-NR (CNCM 1-1796) i FK2-NR (DSM ACC2240), a testem jest test zapalny.
Ponadto w zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie pierwotnych melanocytów albo keratynocytów w testach wykorzystujących pierwotne melanocyty i/albo keratynocyty, przy czym melanocyty albo keratynocyty są otrzymane z próbki skóry po ich wysianiu do bezsurowiczej pożywki hodowlanej na płytkach hodowlanych powleczonych warstwą ułatwiającą przyleganie i wzrost komórek, zawierającą fibronektynę, kolagen typu I i BSA. Korzystnie testem jest test zapalny.
Przedmiotem wynalazku jest również ulepszony sposób przeszczepiania skóry, przy czym ulepszenie obejmuje zastosowanie jako przeszczepu skóry pierwotnych melanocytów albo keratynocytów, przy czym melanocyty albo keratynocyty są otrzymane z próbki skóry po ich wysianiu do bezsurowiczej pożywki hodowlanej na płytkach hodowlanych powleczonych warstwą ułatwiającą przyleganie i wzrost komórek, zawierającą fibronektynę, kolagen typu I i BSA.
Krótki opis figur
Na figurze 1 porównano wzrost (w sensie liczby komórek) nieunieśmiertelnionych keratynocytów DK0-NR w trzech różnych pożywkach, tj. NR-3, zmodyfikowanej MCDB 153 zawierającej epinefrynę i MCDB 153, po 6 dniach.
Figura 2a przedstawia konstrukt retrowirusowy SV40, pLXSHD+SV40(#328) korzystnie zastosowany do unieśmiertelnienia melanocytów i/lub keratynocytów osobnika.
Figura 2b przedstawia konstrukt retrowirusowy HPV16, pLXSHD+E6/E7.
Wynalazek dotyczy ciągłych (unieśmiertelnionych) linii komórkowych pochodzących z tkanek normalnej skóry ludzkiej, tj. unieśmiertelnionych keratynocytów i melanocytów, które zachowują zdolność do różnicowania, oraz które zachowują zdolność do wyrażania białek różnicowania, które wyrażają normalne keratynocyty albo melanocyty nawet po wielu pasażach. Przez wiele pasaży rozumie się przynajmniej 10 pasaży w hodowli, korzystnie przynajmniej 20-30 pasaży, jeszcze korzystniej przynajmniej 50 pasaży, zaś idealnie przez nieskończoną liczbę pasaży. Przykładowo, w przeciwieństwie do uprzednio opisanych unieśmiertelnionych keratynocytów, które nie wyrażają tych białek różnicowania albo wyrażają je bardzo słabo, unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku, wyrażają białka różnicowania, keratynę K1/10, keratynę K14, inwolukrynę, filagrynę i lorykrynę, nawet po wielu pasażach w hodowli tkankowej. Również, wynalazek dotyczy pierwotnych keratynocytów i melanocytów wytworzonych w warunkach bezsurowiczych i bez komórek żywicielskich, które utrzymują zdolność do różnicowania i wyrażają białka charakterystyczne dla zróżnicowanych melanocytów i keratynocytów.
Unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku wykazują profil cytochromu p450 (CYP450), który jest podobny, jeżeli nie identyczny, z normalnymi keratynocytami. Przykładowo, komórki te wyrażają CYP450 3A5, ale nie CYP450 3A4. Również, unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku wyrażają enzymy fazy II, np. transferazę S-glutationu (GST), zaś w szczególności GSTa, GSTp i GSTp, podobnie jak normalne nieunieśmiertelnione keratynocyty.
Ponadto, unieśmiertelnione keratynocyty wyrażają białka i enzymy związane z utlenianiem komórkowym i reakcjami zapalnymi, np. dysmutazę nadtlenkową (SOD) i kolagenazę typu I oraz czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α) po traktowaniu estrami forbolu, podobnie, albo identycznie jak normalne zróżnicowane keratynocyty. Z uwagi na tę charakterystykę, linie te dostarczają niezwykle stabilnego, powtarzalnego źródła komórek do badań reakcji skórnych immunologicznych, farmakologicznych, zapalnych, foto- i chemiotoksykologicznych.
Dalej, unieśmiertelnione keratynocyty wyrażają endogenne białka związane z melaniną (patrz, przykłady 14-15).
Również, linie komórkowe unieśmiertelnionych keratynocytów i melanocytów, w hodowli organotypowej tworzą silnie uwarstwiony i spolaryzowany nabłonek posiadający zrogowaciałe warstwy powierzchniowe (warstwa rogowa). Osiągnięto to uprzednio jedynie w konwencjonalnych warunkach hodowli, tj. w pożywce zawierającej surowicę, technika komórek żywicielskich (patrz, np. Lechner i in., Virology, 185:536-571, 1991).
Unieśmiertelnione keratynocyty i melanocyty otrzymuje się z normalnej skóry w warunkach bezsurowiczych i bez zastosowania jakichkolwiek komórek żywicielskich. Ogólnie, unieśmiertelnione keratynocyty i melanocyty według wynalazku otrzymuje się w następujących etapach:
(i) pozyskania próbki normalnej skóry ludzkiej;
(ii) preparowania próbki skóry do hodowli in vitro;
(iii) uzyskiwania keratynocytów i/lub melanocytów z preparowanej próbki skóry i wysianie keratynocytów i/lub melanocytów do bezsurowiczej pożywki hodowlanej, korzystnie pożywce NR-3 albo
PL 195 108 B1
NR-4 (dla melanocytów) (opisanej poniżej) na płytkach hodowlanych powleczonych warstwą ułatwiającą przyleganie i wzrost komórek zawierającą fibronektynę, kolagen typu I i BSA;
(iv) zmienianie pożywki j eżell to konieczne, w celu optymallzacji wzrostu zl^\^r^^c^o hodowanych komórek, przy ciągłym zachowaniu powlekania płytek hodowlanych;
(v) przeniesienia keratynocytów albo melanocytów w selekcyjnejj korzystnie p<^-^^^ie bezsurowiczej, na podobnie powleczone płytki hodowlane;
(vi) zakażenia keratynocytów albo melanocytów konstruktem retrowirusowym, korzystne konstruktem opartym na SV40 albo wirusie brodawczaków 16, takim jak plazmid pLXSHD+SV40(#328), który zawiera wielki antygen T (T Ag) małpiego wirusa 40, albo plazmidem pLXSHD+E6/E7, który zawiera gen E6/E7 wirusa brodawczaków 16 (HPV 16) (opisane poniżej);
(vii) prze niesienie ρο^^θΙυ^ unieśmiertelnionych keraty j^ocytów albo jmelanocytówdo pożywki proliferacyjnej, odpowiedniej do proliferacji unieśmiertelnionych keratynocytów albo melanocytów na podobnie powlekanych płytkach hodowlanych, korzystnie pożywce NR-2 albo NR-3 (opisanych poniżej) i pożywce dla melanocytów M2 (źródło, M. Olsson, Inst. of Dermatology, Uppsala, Szwecja); i (viii) przeniesienia powstałych proliferujących keratynocytów do pożywki różnicującej, korzystnie NR-2 (opisanej niżej) albo zmodyfikowanej pożywki MCDB 153 (opisanej niżej), która zawiera wysokie stężenie wapnia, na przykład 1,5 mM na podobnie powlekanych płytkach hodowlanych (Boyce i in., J. Tissue Cult. Meth., 9:83-93, 1983; Pittlekow i in., J. Invest. Dermatol., 86:410-417, 1986).
Konkretnie, etap (i) zwykle obejmuje uzyskanie próbki tkanki skóry ludzkiej od dawców ludzkich, np. otrzymanych podczas zabiegu chirurgicznego albo pediatrycznego. Unieśmiertelnianie pojedynczej próbki komórek skóry, tj. autologicznej próbki skóry umożliwia wytwarzanie unieśmiertelnionych linii komórkowych keratynocytów albo melanocytów, które wykazują określone cechy, np. konkretny profil receptorów, który jest charakterystyczny dla konkretnego dawcy.
Próbkę skóry preparuje się następnie w etapie (ii) w taki sposób, który jest odpowiedni do hodowli in vitro. Dokonuje się tego korzystnie przez wstępne płukanie próbki skóry, np. przy użyciu tej samej pożywki, którą stosuje się do hodowli. Korzystnie dokonuje się tego w pożywce NR-2, bezsurowiczej pożywce, której dokładny skład ujawniono poniżej, która, jak stwierdzono, jest korzystna do hodowania normalnych keratynocytów i melanocytów. Po płukaniu, próbkę skóry korzystnie goli się, np. dermatomem, a następnie dzieli na małe kawałki.
Powstałe skrawki skóry są korzystnie dzielone na skórę właściwą i naskórek. Można tego dokonać czynnikami fizycznymi i/lub enzymatycznymi. Przykładowo, można to osiągnąć przez trypsynizację, np. przez flotację płatów skóry w roztworze trypsyny (np. około 0,5%) zawierającym EDTA (np. około 0,1%) przez czas odpowiednio długi do rozdzielenia komórek, np. około 30-60 minut w 37°C albo przez noc w 4°C.
Skórę oddziela się (w celu wyizolowania fibroblastów, patrz przykład 2), zaś naskórek umieszcza się w pożywce do zawieszania. Korzystnie, pożywka do zawieszania zawiera roztwór inhibitora trypsyny z soi (SBTI) i kontaktuje się ją z komórkami na czas odpowiednio długi, zwykle około 5 minut, w celu inaktywacji trypsyny i zapewnienia uwalniania komórek. Następnie dodaje się pożywkę do hodowli komórkowej, korzystnie bezsurowiczą pożywkę NR-2 (opisaną poniżej) i filtruje (np. filtr 100 mm) w celu uzyskania pożądanych komórek, tj. keratynocytów i/lub melanocytów.
Powstała pierwotna hodowla keratynocytów/melanocytów uzyskana w etapie (ii) wysiewana jest na pożywkę bezsurowiczą, korzystnie pożywkę NR-3 (opisaną szczegółowo poniżej), w odpowiedniej gęstości komórek, korzystnie około 1,2x104 komórek/cm2, na uprzednio powleczone płytki hodowlane. Jednakże, gęstość komórek może być zmieniana w szerokim zakresie. Płytki hodowlane są korzystnie powlekanie kompozycją, która nieoczekiwanie okazała się zwiększać zarówno przyleganie, jak i wzrost keratynocytów i melanocytów, konkretnie roztworem fibronekty, BSA i kolagenu I. Tę kompozycję do powlekania opisano uprzednio w zastosowaniu do komórek oskrzeli (Lechner i in., J. Tissue Cult. Meth., 9:43-48 (1985)).
W etapie (iv) pożywkę hodowlaną zmienia się tak często, jak wymaga tego optymalizacja wzrostu komórek. Korzystnie, pożywkę zmienia się co drugi dzień. Jednakże, częstość zmiany pożywki może być różna w zależności od konkretnego rodzaju skóry. Po osiągnięciu niemal całkowitej zlewności, np. około 90% zlewności, co zwykle zachodzi po około 10-14 dniach, rozdziela się keratynocyty i melanocyty. Można to osiągnąć dowolnym sposobem zapewniającym odpowiednie oddzielenie komórek bez negatywnego wpływu na keratynocyty i/lub melanocyty. Przykładowo, można to osiągnąć przez różnicową trypsynizację. Korzystnie, melanocyty albo keratynocyty traktuje się roztworem trypsyna/EDTA, a następnie przenosi się do pożywki selekcjonującej. W przypadku keratynocytów,
PL 195 108 B1 komórki korzystnie traktuje się przez około 5-10 minut roztworem trypsyna/EDTA (0,025%/0,01%), a następnie w etapie (v) wysiewa się w pożywce NR-3 na powleczone płytki. Należy zaznaczyć, że pożywka NR-3 promuje wzrost keratynocytów w stosunku do melanocytów. W przypadku melanocytów, komórki traktuje się korzystnie przez 2-4 minuty trypsyną/EDTA (0,025%/0,01%), a następnie wysiewa w etapie (v) w pożywce NR-4 na podobnie powleczone płytki hodowlane. Należy zaznaczyć, że pożywka NR-4 swoiście hamuje wzrost keratynocytów.
Komórki te traktuje się czynnikiem unieśmiertelniającym. Alternatywnie, komórki można zamrozić dopóki się ich nieunieśmiertelni, np. w ciekłym azocie. Zakażenie i unieśmiertelnienie jest korzystnie osiągane przez zastosowanie konstruktu SV40 określonego jako pLXSHD+SV40(#328), który przedstawiono na figurze 2a, i który opisany został przez Stockshlaedera i in., (GeneBank, nr dostępu M64753; Stockshlaeder i in., Human Gene Therapy, 2:33-39 (1991)) albo konstruktu HPV16, określonego jako pLXSHD+E6/E7, który przedstawiono na figurze 2b. Konstrukt pLXSHD+SV40(#328) zawiera m.in. sekwencję T-Ag SV40, sekwencje LTR 5' i 3' SV40, sekwencję pBR322, zapewniające replikację w E. coli, miejsce klonowania, sekwencję poliadenylacji SV40. Konstrukt pLXSHD+E6/E7 zawiera zamiast T-Ag, fragment NcoI/CfoI genu E6/E7 ludzkiego wirusa brodawczaków 16. Sposób konstruowania plazmidu E6/E7 oparty jest na Durst i in., (Durst i in., 1987, Oncogene 1:251-256). Po unieśmiertelnieniu, komórki pasażuje się, jeżeli jest to konieczne, w trakcie hodowli, zaś powstałe unieśmiertelnione komórki przenosi się do pożywki proliferacyjnej w etapie (vii). W przypadku keratynocytów, przeniesienia tego dokonuje się korzystnie w trakcie 2 pasażu. W etapie (viii) unieśmiertelnione komórki namnaża się w pożywce proliferacyjnej dla unieśmiertelnionych keratynocytów albo melanocytów, która zawiera pożywkę bezsurowiczą i korzystnie obejmuje pożywkę NR-2 albo NR-3 i M2 dla melanocytów (opisaną poniżej). Unieśmiertelnione komórki hoduje się ponownie na powleczonych płytkach hodowlanych, przy czym powleczenie obejmuje roztwór fibronektyny, BSA i kolagenu typu I.
Po namnożeniu unieśmiertelnionych komórek w pożywce proliferacyjnej, przenosi się je w etapie (viii) do pożywki, która zapewnia różnicowanie normalnych i unieśmiertelnionych keratynocytów. Korzystnie, pożywka ta obejmuje pożywkę NR-2 albo zmodyfikowaną pożywkę MCDB 153, zawierające wysokie stężenie wapnia, korzystnie około 1,5 mM, przy czym komórki hoduje się ponownie na płytkach hodowlanych powleczonych roztworem fibronektyny, BSA i kolagenu typu I.
Jak zaznaczono powyżej, nieoczekiwanie stwierdzono, że unieśmiertelnione linie komórkowe keratynocytów i melanocytów według wynalazku zachowują zdolność do różnicowania i wyrażają białka różnicowania, które są charakterystyczne dla normalnie zróżnicowanych keratynocytów i melanocytów, nawet po licznych pasażach w hodowli, tj. po przynajmniej 10 pasażach. Przykładowo, unieśmiertelnione keratynocyty wyrażają keratyny, jak również inne białka np. inwolukrynę, filagrynę i lorykrynę po licznych pasażach, które to białka nie są wyrażane albo słabo wyrażane przez poprzednio opisane keratynocyty unieśmiertelnione SV40.
Konkretnie, kilka linii komórkowych unieśmiertelnionych keratynocytów według wynalazku, DK2-NR, DK3-NR i FK2-NR (patrz, tabela 7 i 8, poniżej) wyraża białka różnicowania, keratynę K1/10, keratynę K14, inwolukrynę, filagrynę i lorykrynę nawet po licznych pasażach (>30 pasaży).
Również, unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku mają profil CYP450 podobny, jeżeli nie identyczny jak normalne ludzkie keratynocyty. Przykładowo, unieśmiertelnione keratynocyty wyrażają CYP450 1A1, 2C, 2E1 i 3A5, ale nie CYP450 1A2, 2A6, 2B6 i 2D6, które są charakterystyczne dla profilu cytochromu 450 normalnych keratynocytów. Po raz pierwszy wykazano, że normalne i unieśmiertelnione keratynocyty ludzkie wyrażają CYP450 3A5, nie zaś CYP450 3A4.
Również, linie komórkowe unieśmiertelnionych keratynocytów wyrażają enzymy fazy II, np. transferazę S-glutationu (GST) podobnie do normalnie zróżnicowanych keratynocytów. Konkretnie, linie unieśmiertelnionych keratynocytów wyrażają GSTa, GSTp i GSTp podobnie do normalnych keratynocytów.
Dalej, unieśmiertelnione keratynocyty wyrażają enzymy i inne białka, które są związane z utlenianiem komórkowym i reakcjami zapalnymi w sposób porównywalny z normalnymi keratynocytami. Przykładowo, unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku wyrażają dysmutazę nadtlenkową (SOD). Również, w reakcji na estry forbolu unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku wyrażają kolagenazę typu l (mediator stanu zapalnego) i TNF-α (czynnik martwicy nowotworu alfa).
Melanocyty mają zdolność wyrażania białek związanych z melaniną i wimentyny.
Ponadto, linie unieśmiertelnionych komórek, hodowane w hodowli organotypowej tworzą silnie uwarstwiony i spolaryzowany nabłonek, posiadający zrogowaciałe warstwy powierzchniowe (warstwę rogową) nawet po wielu pasażach (>20 pasaży). Poprzednio opisano to tylko dla linii komórkowych
PL 195 108 B1 unieśmiertelnionych keratynocytów, hodowanych w konwencjonalnych warunkach hodowli, tj. pożywce zawierającej surowicę i z użyciem warstwy żywicielskiej.
Linie komórek unieśmiertelnionych uzyskuje się w całkowicie bezsurowiczych warunkach, bez zastosowania jakiejkolwiek warstwy żywicielskiej podczas hodowli.
Ponadto, jak to opisano szczegółowo poniżej, nieoczekiwanie stwierdzono, że epinefryna jest silnym czynnikiem wzrostowym dla normalnych keratynocytów, gdy stosuje się ją w pożywce bezsurowiczej. Konkretnie, opisana niżej pożywka NR-3, zawiera epinefrynę, która, jak stwierdzono, zwiększa wzrost normalnych keratynocytów (patrz, figura 1). Jest to nieco zaskakujące, zważywszy na fakt, że uprzednio opisano, że epinefryna hamuje wzrost keratynocytów (Halprin, J. Invest. Dermatol., 81:553-557 (1983)) albo wywiera umiarkowany wpływ na wzrost keratynocytów (Koizumi i in., J. Invest. Dermatol., 96:234-237, 1991).
Również, nieoczekiwanie stwierdzono, że ciągłe powlekanie szalek albo płytek hodowlanych zastosowanych do hodowli pierwotnych i unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów, w szczególności warstwą albo „koktajlem” zawierającym fibronektynę, BSA i kolagen typu I, poprawia zarówno przyleganie keratynocytów i melanocytów do płytek albo szalek hodowlanych, jak również zwiększa wzrost komórek. Zastosowania takich materiałów powlekających nie opisano do tej pory w zastosowaniu wobec unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów.
Jak to opisano, wynalazek dotyczy nowej pożywki bezsurowiczej określonej jako pożywka NR-3. Pożywka ta umożliwia hodowlę i izolowanie normalnych keratynocytów i/lub melanocytów ze skóry ludzkiej w warunkach bezsurowiczych, bez zastosowania warstwy żywicielskiej. Stwierdzono, że pożywka ta polepsza wzrost normalnych keratynocytów i umożliwia ustalenie hodowli normalnych keratynocytów bez jakiegokolwiek kontaktu z surowicą albo komórkami żywicielskimi.
Dokładny skład pożywki NR-3 opisano w tabeli 1. Pożywka ta zawiera różne aminokwasy, sole nieorganiczne jako pierwiastki śladowe, witaminy, czynniki wzrostowe i inne środki zastępcze. Przykładowo, pożywka ta zawiera jako czynniki wzrostowe naskórkowy czynnik wzrostowy (rekombinowany EGF), insulinę, hydrokortyzon, transferynę (ludzką), ekstrakt przysadki bydlęcej oraz epinefrynę. Jak zaznaczono, ujawniono nieoczekiwanie, że epinefryna zwiększa wzrost pierwotnych keratynocytów w hodowli tkankowej.
Jako aminokwasy pożywka zawiera L-alaninę, L-argininę«HCl, asparaginę«H2O, L-kwas asparaginowy, L-cysteinęHC«H2O, L-kwas glutaminowy, glutaminę, glicynę, L-histydynęHClH2O, L-izoleucynę, L-leucynę, L-lizynę«HCl, L-metioninę, L-fenyloalaninę, L-prolinę, L-serynę, L-treoninę, L-tryptofan, L-tyrozynę, L-walinę i ich sole.
Zawarte w niej sole nieorganiczne obejmują metawanadan amonu, molibdenian amonu, chlorek wapnia, siarczan miedzi, siarczan żelaza, chlorek magnezu, chlorek manganu, siarczan niklu, chlorek potasu, octan sodu, wodorowęglan sodu, chlorek sodu, wodorofosforan sodu, pirogronian sodu, selenian sodu, krzemian sodu, chlorek cyny i siarczan cynku.
Witaminy zawarte w pożywce NR-3 obejmują d-biotynę, d-pantotenian wapnia, chlorek choliny, cyjanokobalaminę, kwas foliowy, i-inozytol, nikotynamid, pirydoksynę i ryboflawinę.
Pożywka zawiera ponadto adeninę, etanoloaminę, fosfoetanoloaminę, czerwień fenolową, dichlorowodorek putrescyny, glukozę, kwas tioktowy, chlorowodorek tiaminy, tymidynę, HEPES i antybiotyki (fungizon, penicylinę i streptomycynę).
Korzystna kompozycja pożywki NR-3 przedstawiona została w tabeli 12. Jednakże, stężenia środków zastępczych zawartych w pożywce NR-3 można zmieniać w szerokim zakresie. Konkretnie, stężenie różnych środków zastępczych może różnić się od ±50% do ±0,1%, korzystnie od ±10% do ±0,1%, od wartości ujawnionych w tabeli 12. Ponadto, jeden albo wiele środków zastępczych można usunąć albo zastosować inny, zakładając, że nie wpłynie on istotnie ujemnie na izolowanie i ustalenie pierwotnych hodowli komórkowych keratynocytów albo melanocytów i linii unieśmiertelnionych komórek. Specjalista może to ustalić analizą prób i błędów.
Jak zaznaczono, istotnym składnikiem bezsurowiczej pożywki NR-3 jest epinefryna. Stwierdzono, że epinefryna wywiera bardzo silny wpływ promujący na pierwotne ludzkie keratynocyty.
Powód, dla którego epinefryna zwiększa proliferację keratynocytów, jest niejasny. Istnieją doniesienia, że ludzkie keratynocyty wyrażają enzymy do syntezy epinefryny, jak również wyrażają z dużą gęstością receptory beta 2-adrenergiczne (Schallreuther i in.,: „Production ofcatecholamines in the human epidermie”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 189:72-78 (1992)). Enzymy te związane są ze szlakiem biosyntezy katecholamin, w szczególności fenyloetanoloamino-N-metylotransferazy i zależnej od biopteryny hydroksylazy tyrozynowej. Takiej aktywności enzymatycznej nie można wykryć
PL 195 108 B1 w melanocytach i fibroblastach. Aktywność enzymatyczna i/lub ekspresja receptorów może wyjaśnić zdolność epinefryny do modulowania proliferacji keratynocytów.
Zakłada się, że pożywka NR-3 nasila izolowanie i ustalanie pierwotnych hodowli komórkowych i linii komórkowych, ponieważ hamuje różnicowanie komórek, co prowadzi do wzbogacenia w komórki, które zachowują swoją zdolność do różnicowania i wyrażania białek i enzymów wyrażanych przez normalne zróżnicowane keratynocyty i melanocyty.
Konkretniej, uważa się, że wzrost keratynocytów albo melanocytów w pożywce zawierającej surowicę preferuje różnicowanie w pierwszym pasażu. Jednakże, jest to niekorzystne (podczas początkowych etapów hodowli), ponieważ zróżnicowane komórki gorzej rosną. To z kolei powoduje przerastanie i selekcję proliferujących komórek skóry, które wykazują jedynie słabą zdolność do różnicowania. W następstwie, liczba komórek, które wykazują wysoką zdolność do różnicowania jest zmniejszona, gdy do pożywki dodana jest surowica przed unieśmiertelnieniem.
Natomiast, w rozwiązaniach według wynalazku keratynocyty i melanocyty są hodowane w pożywce bezsurowiczej, w warunkach które hamują różnicowanie melanocytów i keratynocytów. W niniejszym wynalazku pożywkę bezsurowiczą korzystnie stosuje się podczas całej hodowli, przed i po unieśmiertelnieniu, jak również podczas proliferacji i różnicowania.
Jak zaznaczono, hodowlana pożywka bezsurowicza NR-3 hamuje różnicowanie keratynocytów, umożliwiając w ten sposób ulepszoną izolację pierwotnych hodowli keratynocytów i unieśmiertelnionych linii komórkowych, które z nich pochodzą. Ponadto, pożywka ta zawiera niskie stężenia wapnia, które hamują wybiórczo wzrost równocześnie izolowanych fibroblastów. Daje to wysoce wybiórczą pożywkę hodowlaną, która faworyzuje tworzenie hodowli zawierających głównie melanocyty i keratynocyty. Tak więc bezsurowicza pożywka NR-3 jest korzystna, ponieważ hamuje różnicowanie keratynocytów, jak również hamuje wzrost fibroblastów.
Jak to zostało omówione, zawiesina komórek wytworzona z pojedynczej próbki skóry, która zawiera rozproszone melanocyty, keratynocyty i fibroblasty będzie hodowana korzystnie w pożywce NR-3. Dokonuje się tego przez wysianie tych komórek na płytki hodowlane, które są w sposób ciągły powleczone kompozycją wspomagającą przyleganie. Korzystnie, warstwa powlekająca zawiera mieszaninę fibronektyny, albuminy surowicy bydlęcej i kolagenu typu I. Warstwę tę albo „koktajl” opisano poprzednio dla komórek oskrzeli (Lechner i in., J. Tiss. Cult. Meth., 9:43-48 (1985)). Niniejsi twórcy stwierdzili, że koktajl ten wzmaga również przyleganie keratynocytów i melanocytów do płytek hodowlanych z tworzywa sztucznego. Ponadto, nieoczekiwanie stwierdzono, że to ciągłe opłaszczenie płytek hodowlanych, które są stosowane do hodowli pierwotnych i unieśmiertelnionych keratynocytów poprawia ponadto wzrost komórek. Ciągłe opłaszczenie płytek hodowlanych nie było opisywane uprzednio dla unieśmiertelnionych keratynocytów albo melanocytów.
Podczas hodowli pierwotne kultury komórkowe są dzielone, gdy osiągną zlewność albo zasadniczo osiągną zlewność, i są rozsiewane na inne powleczone płytki hodowlane. Zwykle, hodowle komórkowe dzielone będą co 10-14 dni.
Pierwotne melanocyty i/lub keratynocyty są hodowane i namnażane do odpowiedniej liczby komórek w bezsurowiczej pożywce NR-3, z zastosowaniem opisanych opłaszczonych płytek hodowlanych, a następnie są poddawane unieśmiertelnianiu. Korzystnie, unieśmiertelniane są melanocyty i keratynocyty, które wykazują najlepszy wzrost. Jednakże, alternatywnie pierwotne melanocyty albo keratynocyty można zastosować przed unieśmiertelnieniem, np. w testach, przeszczepianiu skóry albo w terapii genowej.
Zarówno unieśmiertelnianie melanocytów jak i keratynocytów można wykonać wektorem, który zapewnia ekspresję antygenu T SV40 albo ekspresję genu E6/E7 ludzkiego wirusa brodawczaków 16 (HPV16). Korzystnie, unieśmiertelnienie uzyskuje się przez zakażenie melanocytów albo keratynocytów konstruktem retrowirusowym, zapewniającym ekspresję antygenu T SV40 albo ekspresję genu E6/E7 ludzkiego wirusa brodawczaków 16 (HPV16). Komórkowe zakażenie T-Ag oparte jest na protokole Pfeifer i in., Meth. Cell Sci., 17:83-89, 1995 (z takim wyjątkiem, że wirus zebrano z linii upakowującej hodowanej w DMEM, 10% surowicy płodowej cielęcej). Podczas zakażania można zastosować pożywkę zawierającą surowicę. Jednakże, dla melanocytów i keratynocytów korzystna jest pożywka bezsurowicza, korzystnie np. pożywka PC-1 opisana w publikacji Pfeifer i in., Meth. Cell Sci., 17:83-89, 1995. Najkorzystniej, unieśmiertelniania dokonuje się przy użyciu konstruktu retrowirusowego określonego jako pLXSHD+SV40(#328), przedstawionego na figurze 2a, i opartego na Pfeifer i in., i Stockhlaeder i in., (GenBank, nr dostępu M64753) albo pLXSHD+E6/E7 przedstawionego na figurze 2b i opartego na Durst i in., 1987, Oncogene l, 251-256.
PL 195 108 B1
Po unieśmiertelnieniu, komórki unieśmiertelnione przenosi się do pożywki proliferacyjnej, korzystnie NR-2 albo NR-3, albo M2 (dla melanocytów) z zastosowaniem opłaszczonych płytek hodowlanych. Po proliferacji komórek do pożądanej liczby, komórki przenosi się do pożywki różnicującej odpowiedniej do hodowania normalnych i unieśmiertelnionych keratynocytów. Korzystnie, obejmuje ona NR-2 albo zmodyfikowaną MCDB 153 o wysokim stężeniu wapnia (1,5 mM) albo M2 (dla melanocytów), stosując uprzednio opłaszczone płytki hodowlane (to samo pokrycie BSA, kolagen typu I i fibronektyna).
Jak zaznaczono poprzednio, zróżnicowane unieśmiertelnione linie keratynocytów i melanocytów według wynalazku wykazują ulepszone właściwości, z powodu których linie te są przydatne w testach wymagających stosowania zróżnicowanych komórek skóry ludzkiej. W szczególności stwierdzono, że te linie komórkowe wyrażają białka charakterystyczne dla normalnych zróżnicowanych melanocytów i keratynocytów, nawet po licznych pasażach.
Przykładowo, gdy unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku bada się analizą Western blot albo RT-PCR, posiadają one profil cytochromu P450 (CYP450) podobny, jeżeli nie identyczny z normalnymi keratynocytami. Konkretnie, unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku wyrażają CYP450 1A1,2C, 2E1 i 3A5, ale nie CYP450 1A2, 2A6, 2B6 i 2D6. Profil CYP450 jest zgodny z normalnymi keratynocytami. Taki profil metaboliczny nie był uprzednio opisany dla unieśmiertelnionych keratynocytów. W rzeczywistości, po raz pierwszy wykazano, że normalne i unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku wyrażają CYP450 3A5, a nie CYP450 3A4. Również stwierdzono, że unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku, analizowane przy użyciu przeciwciał swoistych wobec znaczników różnicowania, wyrażają również inne białka różnicowania nawet po licznych pasażach. Konkretnie, linie komórkowe wyrażają białka różnicowania K1/10, keratynę K14, inwolukrynę, filagrynę i lorykrynę, nawet po wielu pasażach, tj. po 10 albo większej liczbie pasaży.
Unieśmiertelnione keratynocyty i melanocyty wychwytują również niezbędne egzogenne kwasy tłuszczowe (EFA) i wykazują desaturację i wydłużanie łańcucha EFA, jak ma to miejsce w przypadku normalnych melanocytów i keratynocytów.
Ponadto, jak opisano szczegółowo poniżej, unieśmiertelnione keratynocyty wyrażają TNFa i mediator stanu zapalnego, kolagenazę typu I, po traktowaniu estrami forbolu, w sposób podobny do normalnych keratynocytów. Również, unieśmiertelnione keratynocyty wyrażają dysmutazę nadtlenkową, enzym związany z utlenianiem komórkowym, podobnie jak prawidłowo zróżnicowane keratynocyty.
Również, unieśmiertelnione melanocyty według wynalazku, traktowane induktorami melanogenezy (np. teofiliną i tyrozyną) i inhibitorami melanogenezy (kwasem kojowym) reagują podobnie jak normalne melanocyty.
W oparciu o te właściwości, unieśmiertelnione keratynocyty i melanocyty dobrze nadają się do badań nad immunologicznymi, farmakologicznymi, foto- i chemiotoksykologicznymi reakcjami skórnymi.
Przykładowo, unieśmiertelnione linie komórkowe keratynocytów i melanocytów można zastosować w testach, które wymagają zróżnicowanych komórek skóry, np. badań nad funkcją barierową (kornifikacja) zrekonstruowanej skóry, badań metabolizmu zróżnicowanych keratynocytów (metabolizm kwasów tłuszczowych, metabolizm przeciwutleniaczy), badań dotyczących wpływu promieniowania ultrafioletowego na komórki skóry, badań dotyczących wpływu potencjalnie drażniących skórę substancji i substancji uczulających skórę, testów mierzących wpływ związków na wytwarzanie melaniny, badań metabolizmu lipidów, miejscowego zastosowania ksenobiotyków (np. olejów kosmetycznych, poszukiwań potencjalnych związków ochronnych, np. fotoochronnych), badań stanu zapalnego i podrażnienia skóry, itp.
Również, unieśmiertelnione linie komórkowe keratynocytów i melanocytów według wynalazku oraz pierwotne melanocyty i keratynocyty są przydatne do poszukiwania potencjalnych związków do leczenia raka i związków do leczenia chorób skóry. Obejmuje to zwykle eksponowanie linii komórkowej albo komórek pierwotnych na taki związek przez pewien okres czasu i ocenianie czy wywołuje on jakikolwiek niekorzystny efekt, np. genotoksyczność, mostkowanie DNA, mutagenność, transformacja komórek albo cytotoksyczność.
Również, linie komórkowe melanocytów i keratynocytów są przydatne do wyrażania białek rekombinowanych, np. ludzkich białek i polipeptydów, jak również do wytwarzania RNA i DNA.
Dalej, unieśmiertelnione linie komórkowe wykazują potencjalną przydatność w terapii genowej ex vivo. Linie komórkowe powinny dostarczać również przydatnego narzędzia do ukierunkowania genetycznego i opracowania komórek zmienionych genetycznie, które wyrażają pożądany produkt genowy, np. do zastosowań terapeutycznych albo do badań nad toksycznością/mutagennością komórkową.
PL 195 108 B1
Ponadto, zważywszy na fakt, że linie komórkowe według wynalazku naśladują wiernie normalne komórki skóry, powinny się nadawać do testów wrażliwości biologicznej.
Oprócz tego, pierwotne keratynocyty i melanocyty, wytwarzane w warunkach bezsurowiczych, mogą być przydatne w terapii genowej. Zasadniczo, ponieważ komórki te nie są eksponowane na surowicę, np. surowicę bydlęcą albo innego zwierzęcia (z wyjątkiem zakażania wirusem i przechowywania w ciekłym azocie), powinny być mniej podatne na ewentualne zanieczyszczenie wirusem albo innym czynnikiem patogennym. Stąd, powinno to zminimalizować ryzyko przeniesienia przez te komórki czynników patogennych albo zakaźnych podczas terapii genowej. Taka terapia genowa ex vivo znajduje zastosowanie w leczeniu zaburzeń takich, jak Epidermolysis bullosa (mutacja keratyny), bielactwo (zaburzenie obejmujące geny syntezy melaniny), raki i czerniaki, choroby alergiczne i zapalne. W odniesieniu do leczenia, jedynym potencjalnym źródłem zakażenia jest ekstrakt przysadki bydlęcej, insulina bydlęca, kolagen bydlęcy, albumina surowicy bydlęcej albo ludzka fibronektyna i transferyna.
Również, unieśmiertelnione linie komórkowe melanocytów i keratynocytów oraz pierwotne melanocyty i keratynocyty znajdują zastosowanie w testach mutagenezy DNA, testach przesiewowych na mutageny skórne, testach identyfikujących czynniki uszkadzające chromosomy, badaniach transformacji złośliwej, komórkowych badaniach biochemicznych (np. testach aktywacji CYP450), badaniach przesiewowych związków i kompozycji, np. koktajli niezbędnych kwasów tłuszczowych, związanych ze stanem zapalnym i reakcjami alergicznymi, testach aktywacji kolagenazy (związanych ze stanem zapalnym), obejmujących wykrywanie TNFa i interleukiny.
Istotnym potencjalnym zastosowaniem pierwotnych keratynocytów albo melanocytów według wynalazku, z uwagi na ich dostępność i sposoby wytwarzania, jest przeszczepianie skóry. Ponieważ te keratynocyty i melanocyty są wytwarzane w warunkach bezsurowiczych, powinny stanowić minimalne ryzyko zakażenia innymi patogenami (np. wirusami) i czynnikami zakaźnymi. Ponadto, ponieważ melanocyty i keratynocyty mogą pochodzić od autologicznego gospodarza, tj. pacjenta z rozległymi ranami, powinno to minimalizować albo eliminować potencjalne ryzyko odrzucenia przeszczepu skórnego albo innych niekorzystnych reakcji immunologicznych, jak również minimalizować ryzyko zakażenia.
Przykładami konkretnych unieśmiertelnionych linii komórkowych keratynocytów według wynalazku są FK2-NR, DK2-NR i DK3-NR, które zdeponowano 5 października, 1995 w DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschroeder Weg 1b, D-38124, Branschweig, Niemcy, pod numerami, odpowiednio, DSM ACC2240, DSM ACC2238 i DSM ACC2239. Ponadto, przykładem konkretnych unieśmiertelnionych linii melanocytów ludzkich według wynalazku jest DM2-NR, którą zdeponowano 11 grudnia, 1996 w Instytucie Pasteura, 25 rue de Docteur Roux 75724, Paryż, Francja, której nadano numer CNCM I-1796. Depozyty złożono zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim. Wszystkie ograniczenia co do dostępności tych linii komórkowych zostaną natychmiast zniesione po wydaniu patentu na niniejsze zgłoszenie albo inne zgłoszenie korzystające z pierwszeństwa tego zgłoszenia.
Inne cechy wynalazku staną się jasne na podstawie poniższego opisu przykładowych wykonań, które podano w celu zilustrowania wynalazku, nie zaś w celu jego ograniczenia.
P r z y k ł a d 1: Charakterystyka ustalonych komórek skóry
W tabeli 1 wymienione zostały wszystkie próbki skóry, które poddano zakażeniu wirusowemu. Izolowane keratynocyty, które wykazywały najlepszy wzrost komórek zastosowano do unieśmiertelnienia.
PL 195 108 B1
Tabel a 1
Próbki skóry zastosowane do izolacji komórek w pożywce NR-3
Pochodzenie tkanki | Nazwa linii komórkowej | Wiek | Płeć | Wzrost komórek1 |
udo | OS1 | 36 | k | ++ |
udo | OS2 | 68 | k | - |
udo | OS3 | 51 | k | + |
powieka | EL1 | 46 | k | + |
powieka | EL1 | 49 | k | + |
brzuch | Thor1 | 58 | k | - |
czoło | FK1-NR | 5 | m | +++ |
czoło | FK0-NR | 13 | m | ++++ |
brzuch | GK0-NR | 26 | k | +++ |
pierś | DK0-NR | 29 | k | +++ |
1 1 1 1 1
Sposób: komórki zebrano w trypsynie/EDTA (0,05%/0,01%) i zliczono przez zastosowanie hemocytometru, wynik jest średnią z trzykrotnego powtórzenia.
Ludzkie fibroblasty wyizolowano z próbek skóry FK0-NR, GK0-NR, DK0-NR. Po oddzieleniu warstwy skóry właściwej i naskórka, skórę cięto na małe kawałki 0,2 x 0,2 mm i przytwierdzano surowicą na 6 cm płytce hodowlanej. Po 2-4 godzinach dodawano minimalną niezbędną pożywkę Dulbecco (DMEM, 10% FCS). Hodowlę eksplantu inkubowano dopóki nie stało się widoczne wyrastanie fibroblastów. Zlewne hodowle fibroblastów rozdzielono i namnożono do zamrożonych banków.
P r zykła d 2
1) Charakterystyka wzrostu keratynocytów w pożywce bezsurowiczej: pierwotne hodowle komórkowe hodowano w MCDB 153 (Boyce i in., J. Tissue Cult. Meth., 9:83-93, 1985; Pittlekow i in., J. Invest. Dermatol., 86:410-417, 1986) i pożywce NR-3. Najlepszy wzrost komórek obserwowano w pożywce NR-3 (figura 1). Lepszy wzrost komórek obserwowano również we w pełni określonej pożywce NR-3 (NR-3 bez ekstraktu przysadki bydlęcej, BPE) w porównaniu ze zmodyfikowaną MCDB 153 bez BPE.
Wykres na figurze 1 odzwierciedla wzrost komórek w NR-3 i modyfikowanej MCDB 153 z dodatkiem epinefryny (pożywka wzrostowa dla keratynocytów) po 6 dniach. Zmodyfikowana pożywka MCDB 153 dotyczy zmodyfikowanej pożywki MCDB 153. Keratynocyty zebrano w trypsynie/EDTA (0,05%/0,01%) i policzono w hemocytometrze. Wyniki przedstawione na figurze 1 są średnimi z potrójnego powtórzenia.
2) Wpływ opłaszczania na przyleganie komórek i wzrost: stv^i^r^c^^c^m^, że powiekanie płytek hodowlanych poprawia przyleganie komórek i wzrost normalnych keratynocytów. W szczególności, wyniki przedstawione w tabeli 2 porównują wzrost keratynocytów na opłaszczonych i nieopłaszczonych płytkach hodowlanych. 100000 keratynocytów wysiano na 3,5 cm płytkę zawierającą pożywkę NR-3.
PL 195 108 B1
Tabel a 2
Wpływ powlekania powierzchni na przyleganie komórek
przylegające komórki 24 godziny po wysianiu1 | liczba komórek po 4 dniach^ | |||
niepowleczone % | powleczone % | niepowleczone | powleczone | |
DK0-NR po izolacji | 21,4 | 68,2 | 44600 | 143800 |
DK0-NR pasaż 2 | 73,8 | 86,8 | 175500 | 282300 |
*1 1 1 1 1 1
Liczba komórek przylegających podzielona przez liczbę komórek wysianych. Komórki przylegające zebrano w trypsynie/EDTA (0,005%/0,01%) i policzono stosując hemocytometr.
2Komórki zebrano w trypsynie/EDTA (0,005%/0,01%) i policzono stosując hemocytometr, wyniki stanowią średnie z potrójnego powtórzenia.
P r zykła d 3
1) Unieśmiertelnianie keratynocytów: zawiesinę komórek wytworzoną z próbek skóry opisanych w przykładzie 1, które zawierały rozproszone melanocyty, keratynocyty i fibroblasty, hodowano w pożywce NR-3. W tym celu wysiano komórki na płytkach hodowlanych, które opłaszczono w sposób ciągły „koktajlem” opisanym uprzednio dla komórek oskrzeli (Fechner i in., J. Tiss. Cult. Meth., 9:43-48 (1985)). Podczas hodowli pierwotnej, gdy komórki osiągnęły zlewność albo zasadniczą zlewność, traktowano je przez 4 minuty trypsyną/EDTA (0,005%/0,01%). Podczas tego traktowania, melanocyty odłączyły się od hodowli keratynocytów i zostały zebrane osobno. Tak więc, na tym etapie oddzielono pierwotne melanocyty i keratynocyty. Pierwotne keratynocyty hodowano i namnażano do pożądanej liczby w bezsurowiczej pożywce NR-3, stosując opisane opłaszczone płytki hodowlane (promujące wzrost keratynocytów względem melanocytów), a następnie unieśmiertelniano. Unieśmiertelnienie keratynocytów uzyskano przy użyciu konstruktu retrowirusowego pLXSHD+SV40(#328), który powodował ekspresję antygenu T SV40 (patrz, Pfeifer i in., Meth. Cell Sci. 17:83-89 (1995); z takim wyjątkiem, że wirus zebrano z linii upakowującej w DMEM, 10% FCS). Podczas zakażenia, zastosowano bezsurowiczą pożywkę PC-1 opisaną w artykule Pfeifer i in., Meth. Cell Sci. 14:83-89 (1995). Po unieśmiertelnieniu linie komórkowe przeniesiono do pożywki proliferacyjnej NR-2 albo NR-3, stosując opłaszczone płytki hodowlane. Po namnożeniu do pożądanej liczby, komórki przenoszono do pożywki różnicującej odpowiedniej do hodowania normalnych i unieśmiertelnionych keratynocytów.
2) Proliferacja unieśmiertelnionych keratynocytów w wielu pasażach: wykazano, że unieśmiertelnione keratynocyty wykazują lepszy wzrost komórek w wielu pasażach. Przedstawiono to w tabeli 3 poniżej. Wykazano to przez ocenę czasu podwojenia populacji (PDT: czas jednego podwojenia populacji komórek podczas logarytmicznej fazy wzrostu). Metoda: Keratynocyty zebrano w trypsynie/EDTA (0,05%/0,01%) i zliczono w hemocytometrze, wyniki są średnią z potrójnego powtórzenia.
Tabel a 3
Czas podwojenia populacji (PDT) linii keratynocytów hodowanych w NR-3
Keratynocyty | liczba pasaży | PDT (godz.) | kryzys* w pasażu |
FK2-NR | 15 | 48,00 | 16-18 |
FK2-NR | 39 | 21,16 | |
DK1-NR | 12 | 23,20 | 25-30 |
DK1-NR | 15 | 31,05 | |
DK1-NR | 31 | 32,99 | |
DK2-NR | 15 | 22,26 | 20-21 |
DK3-NR | 40 | 24,34 | - |
*Kryzys: wzrost komórek ze zmniejszonym tempem proliferacji
PL 195 108 B1
3) Ekspresja CYP450 w unieśmiertelnionych liniach keratynocytów I udzkich: ekspresję CYP450 1A1, 1A2, 3A5, 2E1, 2B6, 2A6 i 2D6 analizowano w liniach komórkowych normalnych i unieśmiertelnionych keratynocytów metodą Western błot (ekspresja białka) oraz RT-PCR (ekspresja mRNA, patrz tabela 4). Wyrażany CYP450 w unieśmiertelnionych keratynocytach był podobny do normalnych keratynocytów. Wielkość ekspresji CYP450 była nieco zmniejszona. Metoda: RT-PCR (odwrotna transkrypcja-reakcja łańcuchowa polimerazy) ze starterami swoistymi dla CYP450 (Mace i in., w przygotowaniu do druku).
T ab e la 4
Ekspresja mRNA CYP450 w keratynocytach ludzkich
Keratynocyty | Nr pasażu | 1A1* | 2C** | 2E1 | 3A5 | 1A2, 2A6, 2B6,2D6 |
FK0-NR | 4 | + | + | + | + | - |
FK2-NR | 36 | + | + | + | + | - |
DK0-NR | 3 | + | + | + | + | - |
DK1-NR | 31 | + | + | + | + | - |
DK2-NR | 13 | + | + | + | + | - |
*ekspresja mRNA 1A1 w liniach unieśmiertelnionych była zwiększona po indukcji bezo(a)pirenem (1,5 μΜ, Amersham Inc.). Wzrost był porównywalny z komórkami normalnymi.
**2C17/19 i 2C18
4) Reakcja na induktory CYP450: linie komórkowe reagowały na induktor CYP450, benzo(a)piren, jak komórki nieunieśmiertlenione, nawet po licznych pasażach (patrz, tabela 5). Indukcja ta nie była opisywana dla keratynocytów unieśmiertelnionych T-Ag.
T a b e l a 5
Aktywność O-deetylazy 7-etoksyresorufinowej (EROD, Sigma Inc.) w ludzkich keratynocytach po indukcji benzo(a)pirenem
Keratynocyty | Nr pasażu | EROD (pmol/mg białka) |
FK0-NR | 2 | niewykrywalny |
FK0-NR + B(a)P | 2 | 0,58 |
FK2-NR | 37 | 0,01 |
FK2-NR + B(a)P | 37 | 1,05 |
DK0-NR | 1 | 0,02 |
DK0-NR + B(a)P | 1 | 1,03 |
DK1-NR | 32 | 0,04 |
DK1-NR + B(a)P | 32 | 1,78 |
DK2-NR | 14 | 0,02 |
DK2-NR + B(a)P | 14 | 0,69 |
DK3-NR | 39 | 0,01 |
DK3-NR + B(a)P | 39 | 1,86 |
*Keratynocyty inkubowano 24 godzinyz B(a)P (1,5 μΜ).
Aktywność EROD mierzono po inkubacji w 37°C przez wykrywanie fluorescencji produktu resorufiny 9560 nm wzbudzanie, 586 nm wykrywanie.
PL 195 108 B1
5) Różnicowanie komórek: analizowano znaczniki różnicowania stosując swoiste przeciwciała. Swoiste przeciwciała zidentyfikowano w tabeli 6. Najwyższą zdoiność różnicowania mozia było wykazać w przypadku kioiów DK2-NR i DK1-NR (tabele 7, 8).
T a b e i a 6
Przeciwciała zastosowaie do wykrywaiia białek swoistych dia keratyiocytów
Swoistość | Nazwa przeciwciała | Firma /Odrośrik |
T-Ag | Ab-2 | Oicogeie, Maihassat, NY |
liwoiukryia | BTI BT-576 | bti, Stuoghtoi, MA |
Fiiagryia | Fiiagryia | Paesei+Lorei, Fraikfurt, Niemcy |
Lorykryia | aAg 73 | Magiaido i ii., 1992 |
Wimeityia | V9 | Dako, Giostrup, Dama |
Keratyia K4 | 6B10 | Sigma, St. Louis, USA |
Keratyia K7 | LDS-68 | Sigma, St. Louis, USA |
Keratyia K8 | M20 | Sigma, St. Louis, USA |
Keratyia K10/1 | K8.60 | Sigma, St. Louis, USA |
Keratyia K13 | KS-1A3 | Sigma, St. Louis, USA |
Keratyia K14 | CKB1 | Sigma, St. Louis, USA |
Keratyia K17 | CK-E3 | Sigma, St. Louis, USA |
Keratyia K18 | CY-90 | Sigma, St. Louis, USA |
Keratyia K19 | A53-B/A2 | Sigma, St. Louis, USA |
T a b e i a 7
Wykrywaiie T-Ag i produktów różnicowania keratyiocytów iaskórkowych
Keratyiocyt | Nr pasażu | T-Ag | liwoiukryia | Fiiagryia | Lorykryia | Wimeityia |
FK0-NR | 2 | - | +++ | ++ | + | ++ |
FK2-NR | 25 | +++ | ++ | ++ | + | ++ |
DK0-NR | 2 | - | +++ | +++ | ++ | +++ |
DK1-NR | 13 | +++ | +++ | ++ | ++ | ++ |
DK1-NR | 30 | +++ | ++ | ++ | + | ++ |
DK2-NR | 11 | +++ | +++ | +++ | ++ | +++ |
DK3-NR | 36 | +++ | ++ | ++ | + | ++ |
PL 195 108 B1
Tabel a 8
Wykrywanie keratyn (K) w keratynocytach
Keratynocyt | Nr pasażu | K4 | K7 | K8 | K10/1 | K13 | K14 | K17 | K18 | K19 |
FK0-NR | 2 | ++ | - | ++ | ++ | +++ | ++ | ++ | + | + |
FK2-NR | 25 | +++ | - | ++ | ++ | +++ | ++ | ++ | + | + |
DK0-NR | 2 | ++ | - | - | +++ | +++ | +++ | +++ | - | + |
DK1-NR | 13 | ++ | - | ++ | +++ | +++ | ++ | ++ | + | + |
DK1-NR | 30 | + | - | ++ | ++ | ++ | ++ | + | ++ | + |
DK2-NR | 11 | +++ | - | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | ++ |
DK3-NR | 36 | + | - | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | ++ |
Sposób (tabela 7 i 8): Kertynocyty hodowane na szkiełkach po utrwaleniu czystym metanolem zabarwiono przeciwciałami wymienionymi w tabeli 6.
+++: najwyższe stężenie białka, ocenione mikroskopią fluorescencyjną.
-: brak ekspresji białka.
6) Ekspresja transferazy S-glutationu: enzym II fazy, transferazę S-glutationu (Gis^T analizowano techniką Northern i Western blot. Wszystkie linie keratynocytów silnie wyrażały mRNA dla GSTp, ale nie GSTa i GSTp, (tabela 9: Metoda: Northern blot). Profil ekspresji białka GSTa, GSTp i GSTp w liniach komórkowych był podobny do normalnych keratynocytów.
Tabel a 9
Ekspresja białka enzymu GST
Keratynocyty | GSTa | GSTμ | GSTp |
FK2-NR | - | - | +++ |
DK0-NR | - | - | +++ |
DK1-NR | - | - | +++ |
DK2-NR | - | - | +++ |
DK3-NR | - | - | +++ |
7) Metabolizm niezbędnych kwasów tłuszczowych (EFA): w celu analizy i porównania desaturacji i wydłużania EFA dodanych do keratynocytów, unieśmiertelnione (DK1-NR, FK2-NR) i normalne keratynocyty traktowano kwasem linolowym (LA, 15 μΜ) i kwasem α-linolowym (LN, 15 μΜ). W badaniach tych zastosowano NR-2 pozbawioną EFA (Biofluids, Inc.). Hodowle komórkowe traktowano po osiągnięciu zlewności i zmianie pożywki na NR-2 o wysokim stężeniu wapnia (1,5 mM). Komórki traktowano EFA przez 4 dni (zmiana po 2 dniach).
Analizę EFA wykonano przez ekstrakcję i rozdział fosfolipidów w TLC (chromatografia cienkowarstwowa), a oznaczenie ilościowe estrów metylowych kwasów tłuszczowych w GLC (chromatografia ciekło-gazowa). Wykazano tworzenie produktów desaturacji i wydłużania LA (20:4n-6 i 22:4n-6) oraz LN (20:5n-3, 22:5n-3 i 22:6n-3). Ten profil metaboliczny był zgodny z obserwowanym w normalnych keratynocytach.
8) Kariotypowanie: wszystkie linie komórkowe były hipodiploidalne, z większością chromosomów w zakresie diploidalnym (z wyjątkiem DK2-NR z liczbą chromosomów zakresie tetraploidalnym). Nie wykrywano komórek innych niż analizowane linie komórkowe. Wyniki te potwierdzają czystość linii komórkowych i brak zanieczyszczeń komórkami z innych źródeł.
9) Charakterystyka in vivo\ tworzenie guzów przez unieśmiertelnione keratynocyty określano przez podanie podskórne (keratynocyty 1-2mio) myszom nagim. Badane linie keratynocytów DK2-NR, DK3-NR, FK2-NR nie tworzyły guzów u myszy nagich (4 miesiące inkubacji). Jednakże, DK3-NR była nieco guzotwórcza u 6 zwierząt z 10 po 5 miesiącach inkubacji.
10) Reakcja na środki drażniące skórę: indukcję „genu stresowego” TNFa (czynnik martwicy nowotworu alfa) po traktowaniu środkami drażniącymi skórę, PMA (octan forbolo-12-mirystynianu),
PL 195 108 B1
SDS (sól sodowa siarczanu dodecylu), DMSO (dimetylosulfotlenek), IL-Ιβ (interleukina 1β) i UV-B (ultrafiolet B), analizowano przez Northern blot i testy biologiczne (tabela 10). Linie keratynocytów reagują na PMA i UV-B, wyrażając TNFa nawet po wielu pasażach.
Po traktowaniu unieśmiertelnionych keratynocytów estrami forbolu (PMA) obserwowano wzrost ekspresji kolagenazy (typu I).
T ab e l a 10
Wydzielanie TNFa w keratynocytach po indukcji środkami drażniącymi skórę Test aktywności białka: włączanie 3H-tymidyny do komórek wrażliwych na TNFa
wydzielanie TNFa po indukcji | ||||||
Keratynocyty | Liczba | PMA | SDS | DMSO | IL-Ιβ | UV-B |
DK0-NR | 3 | + | - | - | nt | + |
DK1-NR | 20-22 | + | + | - | + | + |
DK1-NR | 32 | + | - | - | nt | + |
DK2-NR | 16 | + | - | - | - | + |
DK3-NR | 31 | + | - | - | nt | + |
nt: nie badano *:komórki wrażliwe: linia mysiego włókniako-mięsakaWEHI 164 klon 1.14 (ATCC).
11) Hodowle organotypowe: przeprowadzono również hodowlę ludzkich keratynocytów w warunkach organotypowych (keratynocyty hodowane w warunkach ekspozycji na powietrze na żelu kolagenowym z komórkami żywicielskimi). Wszystkie linie keratynocytów wykazywały morfologię hiperproliferacyjną w porównaniu z normalnymi keratynocytami. Badania te wykonano w pożywce hodowlanej z surowicą. Hiperproliferacyjny wzrost komórek był zmniejszony w warunkach bezsurowiczych (NR-2 z wysokim stężeniem wapnia (1,5 mM)) na wkładkach z tworzywa sztucznego do płytek hodowlanych bez żelu kolagenowego i bez komórek żywicielskich).
P r z y k ł a d 4
1) Unieśmiertelnienie melanocytów: zawiesinę komórek wytworzoną z próbki skóry DK0-NR opisanej w przykładzie 1, która zawierała rozproszone melanocyty, keratynocyty i fibroblasty, hodowano w pożywce NR-3. W tym celu wysiano komórki na płytkach hodowlanych, które opłaszczono w sposób ciągły „koktajlem” opisanym uprzednio dla komórek oskrzeli (Lechner i in., J. Tiss. Cult. Meth., 9:43-48 (1985)). Podczas hodowli pierwotnej, gdy komórki osiągnęły zlewność albo zasadniczą zlewność, traktowano je przez 4 minuty trypsyną/EDTA (0,005%/0,01%). Podczas tego traktowania, melanocyty odłączyły się od hodowli keratynocytów i zostały zebrane osobno. Tak więc, na tym etapie oddzielono pierwotne melanocyty i keratynocyty. Zebrane pierwotne melanocyty wysiano do bezsurowiczej pożywki NR-4, która swoiście hamowała wzrost keratynocytów. Pierwotne melanocyty hodowano i namnażano do pożądanej liczby w bezsurowiczej pożywce NR-4, stosując opisane opłaszczone płytki hodowlane, a następnie unieśmiertelniano. Unieśmiertelnienie melanocytów uzyskano przy użyciu konstruktu retrowirusowego pLXSHD+SV40(#328), który powodował ekspresję antygenu T SV40 (patrz, Pfeifer i in., Meth. Cell Sci. 17:83-89 (1995); z takim wyjątkiem, że wirus zebrano z linii upakowującej w DMEM, 10% FCS). Podczas zakażenia, zastosowano bezsurowiczą pożywkę PC-1 opisaną w artykule Pfeifer i in., Meth. Cell Sci. 17:83-89 (1995). Po unieśmiertelnieniu linie komórkowe przeniesiono do pożywki proliferacyjnej M2 i różnicującej (DMEM/F12, Biofluids, nr 148; można ją również nabyć od M. Olssena, Uppsala, Szwecja).
2) Charakterystyka ludzkich melanocytów wyrażających T-Ag: ekspresję białek związanych z melaniną w unieśmiertelnionych melanocytach według wynalazku (zwłaszcza DM2-NR) porównano z normalnymi melanocytami. Wykazano, że unieśmiertelnione komórki wyrażają białka związane z melaniną, antygen związany z czerniakiem (MAA) i HMB45, podobnie jak normalne komórki, jednak na niższym poziomie.
PL 195 108 B1
3) Indukcja syntezy melaniny: melanogenezę linii melanocytów wyrażających T-Ag Szwłanzcza linii DM2-NR) pcrówocwnoc y ocamniocmi mzinocycóżmi. Mzinochctc eanCecwnoc ioUkCócażmi mzindcezozyc, ócacycoc i ózcfiiioc cany iohibiócazm mzinocezozyc, Cwnszm Ccjcwcm. Lioiz mziżocycóów Zywłnyyyyn DM2-NR) aznecwnłc on mcUkinecac mzinocezozyc pcUcboiz jnC CcmóaCi ocamnioz. WcCnynoc aówoiza, az ioUkCyjn/ynhnmcwnoiz mzinocezozyc jzst ynizaoz cU UnwCi.
P a ycCłn U 5
Syyyzp DK0-NR cpisnoc w paycCłnUyiz 1 koizśmizatzioicoc, jnC óc cpisnoc wcżzj, CcoyeakCózm aztacwiakzcwcm cpnatcm on pLXSHD+E6/E7 HPV16, Ctóac payzytnwicoc on fiekayz 2b. WcszizCyjcocwnoc CiiCn yicetyyh iioii Czantyocyctów. goniiyn wcoiCów w cUoizyizoik Uc pacUkCtów aóaoiycwnoin ZyctcCzantcoc, GST, TNFo, iowcikCacoc, fiineacoc, icacCacoc, wimzotcoc) sc pcUcboz Uc kycyCnocyh Uin iioii DK2-NR i DK3-NR.
PaycCład 6
SCłnU ocwzj pcacwCi NR-3 wzUłke wconinyCk i CiiCk ioocyh pcacwzC bzyykacwiyycyh wzUłke wconinyCk, tj. NR-1, NR-2 i NR-4 pcaówonoc pcoiazj.
1) SCłnU pcacwCi NR-1 Zpntay tnbzin oiazj)
gmiocCwnsc | NR1 [miiieanmc/iita] |
1 | 2 |
L-ninoion | 9,0000 |
L-nagioion·HCl | 316,0000 |
nspnangioa·H2O | 15,0000 |
L-Cwżs nspnangiocwn | 4,0000 |
L-ynstzion·HCl·H2O | 42,0000 |
L-Cwns glktnmiocwn | 14,8000 |
glktnmion | 877,0000 |
gliynon | 7,6000 |
L-histcUcon’HCi’H2O | 50,4000 |
L-izcizkycon | 98,4000 |
L-izkycon | 131,2000 |
L-iizcon’HCi | 36,6000 |
L-mzticoion | 13,4000 |
L-fzocicninoion | 14,9000 |
L-paciion | 34,6000 |
L-szacon | 126,2000 |
L-tazcoion | 23,8000 |
L-tacptcfno | 9,2000 |
L-tcacycon | 13,6000 |
L-wniion | 70,2000 |
sciz oizcagnoiyyoz | |
mztnwnonUno nmcok [NH4VO3] | 0,0006 |
mciibUzoino nmcok [(NH4)6Mc7O24X4H2O] | 0,0010 |
yhicazC wnpoin [CnCi2x2H2O] | 16,2000 |
sinayyno mizUyi [CkSO4x5H2O] | 0,0025 |
PL 195 108 B1 ciąg dalszy tabeli
1 | 2 |
siarczan żelaza [FeSO4x7H2O] | 1,4000 |
chlorek magnezu [MgCl2x6H2O] | 122,0000 |
chlorek manganu [MnCl2x4H2O] | 0,0002 |
siarczan niklu [NiSO4x6H2O] | 0,0003 |
chlorek potasu [KCl] | 112,0000 |
octan sodu | 301,5000 |
wodorowęglan sodu [NaHCOa] | 1088,0000 |
chlorek sodu [NaCl] | 5200,0000 |
wodorofosforan sodu [Na2HPO4x7H2O] | 536,0000 |
pirogronian sodu | 55,5000 |
selenian sodu [Na2SeO3] | 0,0050 |
krzemian sodu [Na2SiO3x9H2O] | 0,1420 |
chlorek cyny [SnC^x2H2O] | 0,0001 |
siarczan cynku [ZnSO4x7H2O] | 0,5100 |
witaminy | |
d-biotyna | 0,0200 |
d-pantotenian wapnia | 0,2600 |
chlorek choliny | 28,0000 |
cyjanokobalamina (B12) | 0,4100 |
kwas foliowy | 0,7900 |
i-inozytol | 18,0000 |
nikotynamid (B3) | 0,0400 |
pirydoksyna (B6xH2O) | 0,0600 |
ryboflawina (B2) | 0,0400 |
inne | |
adenina | 27,3000 |
naskórkowy czynnik wzrostowy (EGF, ludzki rekombinowany) | 0,0010 |
etanoloamina | 0,0310 |
glukoza | 1080,0000 |
HEPES | 6000,0000 |
hydrokortyzon | 0,5000 |
insulina (bydlęca) | 5,0000 |
czerwień fenolowa | 1,2000 |
fosfoetanoloamina | 0,0710 |
dichlorowodorek putrescyny | 0,1600 |
chlorowodorek tiaminy | 0,3400 |
PL 195 108 B1 ciąg dalszy tabeli
1 | 2 |
kwas tioktowy | 0,2100 |
tymidyna | 0,7300 |
transferyna | 10,0000 |
osmolarność | 280-285 mOsm/kg |
2) Skład pożywki NR-2: taki sam jak NR-1, ale z dodatkiem ekstraktu przysadki bydlęcej (Biofluid, Inc.). w ilości 35 mg/l, ponadto zawiera antybiotyki (Gibco BRL, Life Technologies Inc.), fungizon (0,25 mg/ml), penicylinę (10000 jedn./ml) i streptomycynę (10 mg/l).
3) Skład pożywki NR-3: taki sam jak NR-2, ale z dodatkiem epinefryny (Biofluid, Inc.) 250 pg/l.
4) Skład pożywki NR-4: taki sam jak NR-2, ale z dodatkiem pFGF (3 pg/l) (zasadowy czynnik wzrostowy fibroblastów, Sigma, Inc.) oraz octanu forbolo-12-mirystynianu (10 pg/l, PMA, C.C.R., Inc.).
Mimo, że wynalazek opisano szczegółowo w odniesieniu do pewnych konkretnych wykonań, możliwe są inne wykonania mieszczące się w zakresie opisu niniejszego wynalazku. Zatem, ani ujawnienia, ani poniższe zastrzeżenia, nie są ograniczone przez zamieszczony tu opis najkorzystniejszych wykonań.
Claims (30)
- Zastrzeżenia patentowe1. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów albo melanocytów, która zachowuje zdolność do różnicowania oraz ekspresji białek i enzymów, które są wyrażane przez normalnie zróżnicowane keratynocyty albo melanocyty, nawet po wielu pasażach w hodowli tkankowej, przy czym środkiem unieśmiertelniającym jest konstrukt retrowirusowy SV40, pLXSHD+SV40(#328), albo konstrukt HPV16, pLXSHD+E6/E7.
- 2. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytówwedług zastrz. 1, znamienna tym, że wyraża białka keratyny i inne białka wyrażane przez normalne zróżnicowane keratynocyty.
- 3. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według zastrz. 2, znamienna tym, że białka keratyny obejmują keratynę K1/10, keratynę K14 i inne białka obejmujące inwolukrynę, filagrynę i lorykrynę.
- 4. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według zastrz. 1, znamienna tym, że wykazuje profil CYP450 identyczny albo zasadniczo identyczny z profilem normalnych zróżnicowanych keratynocytów.
- 5. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytówwedług zastrz. 4, znamienna tym, że wyraża CYP450 1A1,2C, 2E1 i 3A5, ale nie wyraża CYP450 1A2, 2A6, 2B6 i 2D6.
- 6. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytówwedług zastrz. 1, znamiennatym, że jest wytwarzana w warunkach bezsurowiczych, bez zastosowania komórek żywicielskich.
- 7. Unieśmiertelniona linia komórkowa melanocytów według zastrz. 1, znamienna tym, że jest wytwarzana w warunkach bezsurowiczych, bez zastosowania komórek żywicielskich.
- 8. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według zastrz. 1, znamienna tym, że wyraża mRNA kodujący transferazę S-glutationu GST-π, GST-μ i GST-α.
- 9. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według zastrz. 1, znamienna tym, że hodowana w warunkach organotypowych tworzy silnie uwarstwiony i spolaryzowany nabłonek posiadający zrogowaciałe warstwy powierzchniowe, pod nieobecność surowicy albo komórek żywicielskich.
- 10. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według zastrz. 1, znamienna tym, że po traktowaniu jej estrami forbolu wyraża kolagenazę typu I i TNF-α.
- 11. Linia komórek skóry ludzkiej unieśmiertelniona antygenem T SV40, wybrana z grupy obejmującej linie keratynocytów DK2-NR (DSM ACC2238), DK3-NR (DSM ACC2239) i FK2-NR (DSM ACC2240) oraz linię melanocytów DM2-NR (CNCM I-1796).
- 12. Ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej w celu otrzymania unieśmiertelnionych keratynocytówi melanocytów, znamienny tym, że obejmuje etapy:(i) pozyskania próbki normalnej skóry ludzkiej;(ii) preparowania próbki skóry do hodowli in vitro;PL 195 108 B1 (iii) uzyskiwaniakeratynocytów i/lubmelanocytówz preparowanej próbki skóry i wysiewania keratynocytów i/lub melanocytów do bezszrowiczej pożywki hodowlanej na płytkach hodowlanych powleczonych warstwą ułatwiającą przyleganie i wzrost komórek, zawierającą fibronektynę, kolagen typu I i BSA;(iv) zmieniania ροζγ\/νΚϊ]eżeH to konieccne, w ccIu optymallzacji wwrostuzlewnego hodowannch komórek, przy ciągłym zachowaniu powleczenia płytek hodowlanych;(v) przeniesienia keratynocytów albo melanocytów do bezsurowiczej pożywki selekcyśnej na podobnie powleczone płytki hodowlane;(vi) zakażenia keratynocytów albo melanocytów konstruktem retrowirusowym;(vii) prze niesie nia powssałych unieśmiertelnionych k^ι^^tt^ι^<sc^j^t¢^\y albo melanocytów do bezsurowiczej pożywki proliferacyjnej, odpowiedniej do proliferacji unieśmiertelnionych keratynocytów albo melanocytów na podobnie powleczonych płytkach hodowlanych; i (viii) przeniesienia powstałych proliferujących keratynocstów do bezsurowiczej pożywki różnicującej, która zawiera wysokie stężenie wapnia, na podobnie powleczonych płytkach hodowlanych.
- 13. Sposób według zasstz. 12, tym, że konsstuktem rerrowizusowym tess konsstukt pLXSHD+SV40(#328) SV40, albo konstrukt pLXSHD+E6/E7 HPV16.
- 14. Sposóbwedług zasstz. t2, znamiennytym, że bezsurowiczą pożywkąw β^ρΐβ tiii) j ees pożywka NR-3.
- 15. Spooch wedługzastyy. t2, znam ienny tym. że pożywkąw β^ρΐβ tv) j ees pozżywkaNFR-S al· bo NR-4.
- 16. Sposóbwedługzastyz. t2, znnmienny tym. że proll)erycjsną pożywką w β^ρΐθΟ^Ν) j ees pożywka NR-2 albo NR-3 i pożywka M2 dla melanocytów.
- 17. Sposób według z^^sr^^. 12, znamienny tym, że różnicużącą pożywką w eeapie (υϊη) j ess pożywka NR-2 albo zmodyfikowana pożywka MCDB 153, zawierająca wapń w ilości przynajmniej 1,5 mM.
- 18. Nowa bezsurOwicza pożżsykahodowlanaodpowiednia do żzolowania ί wytwarzaniaiudzieli keratynocytów i melanocytów, które zachowują zdolność do różnicowania oraz ekspresji białek i enzymów, które są wyrażane przez normalnie zróżnicowane keratynocyty albo melanocyty, nawet po wielu pasażach w hodowli tkankowej, znamienna tym, że zawiera: aminokwasy albo ich sole, sole nieorganiczne, witaminy, adeninę, etanoloaminę, glukozę, HEPES, czerwień fenolową, dichlorowodorek putrescyny, kwas tioktowy, chlorowodorek tiaminy, tymidynę, naskórkowy czynnik wzrostowy, insulinę, hydrokortyzon, transferynę, fosfoetanoloaminę i ekstrakt przysadki bydlęcej.
- 19. Pożywka według zastrz. 18, znamienna tym, że ponadto zawiera epinefrynę.
- 20. Rozrywka według zasstz. 19, znamienna tym, że ssężenie epineeryny t ess wyssarczaśące do nasilenia wzrostu keratynocytów.
- 21. Pożywka według zastrz. 18, znamienna tym, że aminokwasy zawarte w pożywce wybrane są z grupy składającej się z L-alaniny, L-argininyHCl, asparaginyH2O, L-kwasu asparaginowego, L-cysteinj^«HCl«H2O, L-kwasu glutaminowego, glutaminy, glicyny, L-histydyny·HCl·H2O, L-izoleucyny, L-leucyny, L-ii^^n^^H^^i, L-metioniny, L-fenyloalaniny, L-proliny, L-seryny, L-treoniny, L-tryptofanu, L-tyrozyny, L-waliny i ich soli.
- 22. Pożywka według zastrz. 18, znamienna tym, że sole nieorganiczne wybrane są z grupy obejmującej metawanadan amonu, molibdenian amonu, chlorek wapnia, siarczan miedzi, siarczan żelaza, chlorek magnezu, chlorek manganu, siarczan niklu, chlorek potasu, octan sodu, wodorowęglan sodu, chlorek sodu, wodorofosforan sodu, pirogronian sodu, selenian sodu, krzemian sodu, chlorek cyny i siarczan cynku.
- 23. Pożywka według zastrz. 18, znamienna tym, że witaminy wybrane są z grupy obejmującej d-biotynę, d-pantotenian wapnia, chlorek choliny, cyjanokobalaminę, kwas foliowy, i-inozytol, nikotynamid, pirydoksynę i ryboflawinę.
- 24. Nowa bezsurowicza pożywka do izolowania, tworzenia i/lub utrzymywania unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów, znamienna tym, że jest wybrana z grupy obejmującej pożywkę NR-2, NR-3 i NR-4.
- 25. Zastosowanie unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów określonych w zastrz. 1 w testach wykorzystujących zróżnicowane keratynocyty i/lub melanocyty.
- 26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że komórki wybrane są z grupy obejmującej DK2-NR (DSM ACC2238), DK3-NR (DSM ACC2239), DM2-NR (CNCM I-1796) i FK2-NR (DSM ACC2240).
- 27. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że testem jest test zapalny.PL195 108 B1
- 28. Zastosowanie pierwotnych melanocytów albo k(^i^^tt/nc^c^^/tc^\w w testach wykorzystujących pierwotne melanocyty i/albo keratynocyty, przy czym melanocyty albo keratynocyty są otrzymane z próbki skóry po ich wysianiu w bezsurowiczej pożywce hodowlanej do bezsurowiczej pożywki hodowlanej na płytkach hodowlanych powleczonych warstwą ułatwiającą przyleganie i wzrost komórek, zawierającą fibronektynę, kolagen typu I i BSA.
- 29. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że jest testem zapalnym.
- 30. Ulepszonn sposób przeszczepiania skóry, znamienny tym, że ulepszenie obejmie zastosowanie jako przeszczepu skóry pierwotnych melanocytów albo keratynocytów, przy czym melanocyty albo keratynocyty są otrzymane z próbki skóry po ich wysianiu do bezsurowiczej pożywki hodowlanej na płytkach hodowlanych powleczonych warstwą ułatwiającą przyleganie i wzrost komórek, zawierającą fibronektynę, kolagen typu I i BSA.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US57648395A | 1995-12-21 | 1995-12-21 | |
PCT/EP1996/005812 WO1997023602A1 (en) | 1995-12-21 | 1996-12-19 | Improved immortalized human skin cell lines and novel serum-free medium useful for the production thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL327320A1 PL327320A1 (en) | 1998-12-07 |
PL195108B1 true PL195108B1 (pl) | 2007-08-31 |
Family
ID=24304605
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL96327320A PL195108B1 (pl) | 1995-12-21 | 1996-12-19 | Unieśmiertelnione linie komórkowe skóry ludzkiej,keratynocytów albo melanocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, nowe bezsurowicze pożywki, zastosowanie unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów oraz pierwotnych melanocytów albo keratynocytów oraz ulepszony sposób przeszczepiania skóry |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6423540B2 (pl) |
EP (2) | EP0877797A1 (pl) |
JP (1) | JP4404965B2 (pl) |
KR (1) | KR100455006B1 (pl) |
CN (1) | CN1154717C (pl) |
AT (1) | ATE199390T1 (pl) |
AU (1) | AU730222B2 (pl) |
BR (1) | BR9612256B1 (pl) |
CA (1) | CA2234118C (pl) |
CZ (1) | CZ297289B6 (pl) |
DE (1) | DE69611894T2 (pl) |
DK (1) | DK0780469T3 (pl) |
ES (1) | ES2155166T3 (pl) |
GR (1) | GR3035719T3 (pl) |
HU (1) | HU226195B1 (pl) |
IL (1) | IL124191A (pl) |
NO (1) | NO326190B1 (pl) |
NZ (1) | NZ325814A (pl) |
PL (1) | PL195108B1 (pl) |
PT (1) | PT780469E (pl) |
RU (1) | RU2215030C2 (pl) |
SK (1) | SK283314B6 (pl) |
WO (1) | WO1997023602A1 (pl) |
Families Citing this family (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2234118C (en) * | 1995-12-21 | 2009-04-07 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Improved immortalized human skin cell lines and novel serum-free medium useful for the production thereof |
DE69919531T2 (de) * | 1998-04-17 | 2005-09-15 | Société des Produits Nestlé S.A. | Aus normalem menschlichem hautgewebe immortalizierte zellinien |
US6964869B2 (en) | 1998-07-13 | 2005-11-15 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method and composition for skin grafts |
CN1087778C (zh) * | 1999-03-02 | 2002-07-17 | 华东理工大学 | 杂交瘤细胞无血清培养基 |
DE19912798C1 (de) | 1999-03-10 | 2000-02-17 | Andreas Jordan | Verfahren zur Kultivierung von Krebszellen aus Humangewebe und Vorrichtung zur Aufbereitung von Gewebeproben |
AUPR298901A0 (en) * | 2001-02-07 | 2001-03-08 | McComb Foundation, Inc., The | Cell suspension preparation technique and device |
JP4669206B2 (ja) * | 2001-04-24 | 2011-04-13 | ウイスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーシヨン | 皮膚移植片のための方法および組成物 |
WO2002091999A2 (en) | 2001-05-09 | 2002-11-21 | Geron Corporation | Treatment for wounds |
US20030022369A1 (en) * | 2001-05-18 | 2003-01-30 | Helen Fillmore | Differentiation of specialized dermal and epidermal cells into neuronal cells |
ATE386986T1 (de) * | 2001-07-06 | 2008-03-15 | Lipomics Technologies Inc | Erzeugen, betrachten, interpretieren und verwenden einer quantitativen datenbank von metaboliten |
GB0208041D0 (en) | 2002-04-08 | 2002-05-22 | Lonza Biologics Plc | Method of culturing animal cells |
US20050025737A1 (en) * | 2003-07-30 | 2005-02-03 | Sebagh Jean Louis | Compositions containing melon extracts |
US7462487B2 (en) * | 2003-09-18 | 2008-12-09 | Raven Biotechnologies, Inc. | Cell culture media |
WO2005071065A1 (en) * | 2004-01-26 | 2005-08-04 | Cognis France S.A.S | Method for studying functional interactions between sensory neurons and keratinocytes or melanocytes |
EP1865884B1 (en) | 2005-03-17 | 2017-01-18 | Stratatech Corporation | Skin substitutes with improved purity |
DE602007008627D1 (de) * | 2006-02-14 | 2010-10-07 | Genetix Ltd | Zellkulturmedium |
US8637310B2 (en) | 2008-12-05 | 2014-01-28 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Use of a rock inhibitor to sustain primary human keratinocytes in a proliferative state |
WO2010134619A1 (ja) * | 2009-05-18 | 2010-11-25 | 国立大学法人東北大学 | 人工多能性幹細胞からの上皮系前駆細胞・幹細胞群及び角膜上皮細胞群の分化誘導方法 |
KR101768632B1 (ko) * | 2011-05-18 | 2017-08-17 | (주)아모레퍼시픽 | 칼슘 펄스를 통한 배양상피세포층의 분리방법 |
JP6104242B2 (ja) | 2011-07-12 | 2017-03-29 | フードチェク・システムズ・インコーポレイテッドFoodchek Systems, Inc. | サルモネラおよび大腸菌を培養するための培養培地、方法、ならびにサルモネラおよび大腸菌を検出するための方法 |
WO2013129885A1 (ko) * | 2012-02-28 | 2013-09-06 | 건국대학교 산학협력단 | 세포 배양액 |
EP2975117B1 (en) | 2013-03-11 | 2018-01-10 | JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for producing human corneal epithelium sheet |
AU2013205148B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-30 | AVITA Medical Americas, LLC | Systems and methods for tissue processing and preparation of cell suspension therefrom |
KR20160065038A (ko) | 2014-11-28 | 2016-06-08 | (주)아모레퍼시픽 | 멜라닌 세포주 계대배양계 및 이를 이용한 노화 수준 판단, 미용 정보 제공, 또는 스크리닝 방법 |
US10280688B2 (en) * | 2015-01-26 | 2019-05-07 | Halliburton Energy Services, Inc. | Rotating superhard cutting element |
CN105238739A (zh) * | 2015-11-11 | 2016-01-13 | 朱宁文 | 临床治疗级细胞治疗用黑色素细胞(melanocytes)规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法 |
CN106520674A (zh) * | 2016-12-24 | 2017-03-22 | 严志海 | 一种用于表皮黑素细胞体外培养的无血清培养基 |
CN107115219A (zh) * | 2017-05-12 | 2017-09-01 | 青岛赛欧凯普图乐生物医药有限公司 | 一种纤维芽母细胞活化液面膜配方 |
CN114058565A (zh) * | 2020-07-31 | 2022-02-18 | 上海尚瑞生物医药科技有限公司 | 一种无血清的黑素母细胞培养液及其培养方法 |
KR102583179B1 (ko) * | 2020-11-27 | 2023-09-26 | (주)엑셀세라퓨틱스 | 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포 수립 또는 배양용 배지 조성물 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4940666A (en) | 1983-07-15 | 1990-07-10 | University Patents, Inc. | Process and defined medium for growth of human epidermal keratinocyte cells |
US4885238A (en) | 1987-10-30 | 1989-12-05 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Immortalized human bronchial epitherial mesothelial cell lines |
US5292655A (en) | 1990-01-29 | 1994-03-08 | Wille Jr John J | Method for the formation of a histologically-complete skin substitute |
US5376542A (en) | 1992-04-27 | 1994-12-27 | Georgetown University | Method for producing immortalized cell lines using human papilluma virus genes |
EP0937460A3 (en) * | 1994-04-12 | 2000-04-05 | Adolor Corporation | Use of an antidiarrheal for the manufacture of a medicament for the treatment of inflammatory conditions |
DE19617261A1 (de) | 1995-04-21 | 1996-11-28 | Naeher Helmut Dr Med Priv Doz | Hautverträglichkeitstest |
CA2234118C (en) * | 1995-12-21 | 2009-04-07 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Improved immortalized human skin cell lines and novel serum-free medium useful for the production thereof |
-
1996
- 1996-12-19 CA CA002234118A patent/CA2234118C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-12-19 CN CNB961991755A patent/CN1154717C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-12-19 IL IL12419196A patent/IL124191A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-12-19 RU RU98113400/13A patent/RU2215030C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-12-19 PL PL96327320A patent/PL195108B1/pl unknown
- 1996-12-19 DE DE69611894T patent/DE69611894T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-19 ES ES96203641T patent/ES2155166T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-19 BR BRPI9612256-0A patent/BR9612256B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-12-19 SK SK835-98A patent/SK283314B6/sk unknown
- 1996-12-19 JP JP52332997A patent/JP4404965B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-12-19 KR KR10-1998-0704097A patent/KR100455006B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-12-19 DK DK96203641T patent/DK0780469T3/da active
- 1996-12-19 CZ CZ0194598A patent/CZ297289B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-12-19 EP EP96944641A patent/EP0877797A1/en not_active Withdrawn
- 1996-12-19 WO PCT/EP1996/005812 patent/WO1997023602A1/en active IP Right Grant
- 1996-12-19 AU AU13054/97A patent/AU730222B2/en not_active Ceased
- 1996-12-19 NZ NZ325814A patent/NZ325814A/xx unknown
- 1996-12-19 US US09/091,483 patent/US6423540B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-19 EP EP96203641A patent/EP0780469B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-19 PT PT96203641T patent/PT780469E/pt unknown
- 1996-12-19 HU HU9903742A patent/HU226195B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-12-19 AT AT96203641T patent/ATE199390T1/de active
-
1998
- 1998-06-18 NO NO19982810A patent/NO326190B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-04-06 GR GR20010400570T patent/GR3035719T3/el unknown
- 2001-10-18 US US09/982,649 patent/US6949381B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
PL195108B1 (pl) | Unieśmiertelnione linie komórkowe skóry ludzkiej,keratynocytów albo melanocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, nowe bezsurowicze pożywki, zastosowanie unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów oraz pierwotnych melanocytów albo keratynocytów oraz ulepszony sposób przeszczepiania skóry | |
JP2000506374A5 (pl) | ||
US5324656A (en) | Media for normal human muscle satellite cells | |
AU621972B2 (en) | Cell culture medium for human liver epithelial cell line | |
KR20060076781A (ko) | 세포 배양 배지 | |
AU756151B2 (en) | Immortalised cell lines derived from normal human skin tissues | |
US20050019310A1 (en) | Method for culturing and expansion of mammalian undifferentiated epidermal kerainocytes exhibiting stem cell characteristics | |
Agy et al. | Protein-free medium for C-1300 mouse neuroblastoma cells | |
MXPA00009558A (en) | Immortalised cell lines derived from normal human skin tissues |