PL195108B1 - Unieśmiertelnione linie komórkowe skóry ludzkiej,keratynocytów albo melanocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, nowe bezsurowicze pożywki, zastosowanie unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów oraz pierwotnych melanocytów albo keratynocytów oraz ulepszony sposób przeszczepiania skóry - Google Patents

Unieśmiertelnione linie komórkowe skóry ludzkiej,keratynocytów albo melanocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, nowe bezsurowicze pożywki, zastosowanie unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów oraz pierwotnych melanocytów albo keratynocytów oraz ulepszony sposób przeszczepiania skóry

Info

Publication number
PL195108B1
PL195108B1 PL96327320A PL32732096A PL195108B1 PL 195108 B1 PL195108 B1 PL 195108B1 PL 96327320 A PL96327320 A PL 96327320A PL 32732096 A PL32732096 A PL 32732096A PL 195108 B1 PL195108 B1 PL 195108B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
keratinocytes
medium
melanocytes
immortalized
serum
Prior art date
Application number
PL96327320A
Other languages
English (en)
Other versions
PL327320A1 (en
Inventor
Markus Baur
Catherine Mace
Armand Malnoe
Andrea M.A. Pfeifer
Marcelle Regnier
Original Assignee
Nestle Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nestle Sa filed Critical Nestle Sa
Publication of PL327320A1 publication Critical patent/PL327320A1/xx
Publication of PL195108B1 publication Critical patent/PL195108B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/80—Neurotransmitters; Neurohormones
    • C12N2501/81—Adrenaline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1. Uniesmiertelniona linia komórkowa keratynocytów albo melanocytów, która zachowuje zdolnosc do róznicowania oraz ekspresji bialek i enzymów, które sa wyrazane przez normalnie zróznicowane keratynocyty albo melanocyty, nawet po wielu pasazach w hodowli tkankowej, przy czym srodkiem uniesmiertelniajacym jest konstrukt retrowirusowy SV40, pLXSHD+SV40(#328), albo konstrukt HPV16, pLXSHD+E6/E7. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są unieśmiertelnione linie komórkowe skóry ludzkiej, keratynocytów albo melanocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, nowe bezsurowicze pożywki, zastosowanie unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów oraz pierwotnych melanocytów albo keratynocytów oraz ulepszony sposób przeszczepiania skóry.
W ogólności wynalazek dotyczy ulepszonych ciągłych (unieśmiertelnionych) linii komórkowych pochodzących z tkanek normalnej skóry ludzkiej, w szczególności keratynocytów i melanocytów, które zachowują zdolność do wyrażania białek różnicowania, charakterystycznych dla zróżnicowanych melanocytów albo keratynocytów, nawet po wielu pasażach. Niniejszym ujawniono również nowe bezsurowicze pożywki, które nie wymagają komórek żywicielskich.
Wytwarzanie unieśmiertelnionych linii komórkowych pochodzących z normalnych tkanek skóry ludzkiej opisano uprzednio. Sposoby takie obejmują zwykle transfekcję albo transformację komórek skóry ludzkiej np. keratynocytów i melanocytów, hodowanych in vitro z czynnikami zapewniającymi unieśmiertelnienie.
Unieśmiertelnienie dotyczy wytwarzania komórek, które są zdolne do wzrostu w hodowli in vitro przez czas dłuższy, idealnie w nieskończoność. Komórki te są również określane jako ciągłe linie komórkowe. W przeciwieństwie do komórek unieśmiertelnionych, komórki nieunieśmiertelnione są zdolne do wzrostu in vitro jedynie przez ograniczoną liczbę podziałów komórkowych. Komórki unieśmiertelnione są niezwykle pożądane, ponieważ zapewniają stabilne, potencjalnie nieskończone źródło komórek o określonej charakterystyce. Konwencjonalne środki do wytwarzania unieśmiertelnionych linii komórkowych i linii unieśmiertelnionych komórek skóry ludzkiej w szczególności obejmują, np. wirusy, rekombinowane wirusy i plazmidy zawierające sekwencje DNA zapewniające unieśmiertelnienie.
Prawdopodobnie najpowszechniejszy sposób wytwarzania unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych obejmuje zastosowanie sekwencji SV40, zaś w szczególności DNA wielkiego antygenu T SV40, jako środka unieśmiertelniającego. Przykładowo, Steinberg i in., J. Cell. Phys., 123:117-125 (1985); Reddel i in., patent USA nr 4,885,238 wydany 5 grudnia, 1989; Major, patent USA nr 4,707,448 wydany 17 listopada, 1987; Stoner i in., Cancer Res., 51:365-371 (1991); Chopra i in., In vitro Cell Dev. Biol., 30A:539-546 (1994); Chopra i in., In vitro Cell Dev. Biol., 27A:763-765 (1991); Christian i in., Cancer Res., 47:6066-6073 (1987); Rhim i in., Science, 227:1250-1252 (1985); i Grubman i in., Gastrointest. Liver Physiol., 29:G1060-G1070 (1994) opisują zastosowanie wektorów SV40 i wektorów zawierających sekwencje wielkiego antygenu T SV40 do wytwarzania unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych. Wprowadzanie takich sekwencji przeprowadza się zwykle przez zakażenie z użyciem wirusa SV40 albo hybrydy adenowirusa 12 i wirusa SV40 albo przez transfekowanie komórek metodą koprecypitacji fosforanem strontu rekombinowanym plazmidem zawierającym długie końcowe powtórzenia wirusa mięsaka Rousa i region wczesny Ori-SV 40 (patrz, Brash i in., Mol. Cell Biol., 7:2031-2034 (1987)).
Inna znana metoda otrzymywania unieśmiertelnionych linii komórkowych, zaś unieśmiertelnionych linii keratynocytów w szczególności, obejmuje transfekcję albo zakażenie komórek sekwencjami DNA wirusa brodawczaków. Przykładowo, patent USA nr 5,376,542 Schlegela, wydany 27 grudnia 1994, opisuje unieśmiertelnienie ludzkich komórek nabłonkowych wyizolowanymi genami E6 i E7 albo samym genem E7 HPV-16, 18, 31,33 albo 35, w celu wytworzenia unieśmiertelnionej linii komórkowej nietworzącej guzów. Również Barbosa i in., Oncogene, 4:1529-1532 (1989); i Muenger i in., J. Virol., 63(10): 4417-4421 (1989) opisują zastosowanie genów E6 i E7 HPV-16 i HPV-18 do wytwarzania unieśmiertelnionych keratynocytów ludzkich.
Jednakże, o ile liczne grupy donoszą o unieśmiertelnionych liniach komórkowych keratynocytów i ich zastosowaniu w testach in vitro, uprzednie unieśmiertelnione linie komórkowe keratynocytów i melanocytów wykazywały zwykle jedną albo wiele cech, z powodu których ich zastosowanie było niekorzystne. Przykładowo, uprzednio opisywane unieśmiertelnione keratynocyty wykazywały jedną albo wiele z poniższych cech: (i) zmniejszenie albo utrata ekspresji znaczników różnicowania, np. białek które są normalnie wytwarzane przez zróżnicowane keratynocyty, i (ii) zmieniona charakterystyka wzrostu w hodowli tkankowej.
Przykładowo, Jetten i in., J. Invest. Dermatol., 92:203-209 (1989) donoszą o keratynocytach unieśmiertelnionych SV40, uzyskanych po wielu pasażach (> 12 pasaży) przy użyciu wektora NHEKSV40-T8-1, które były niezdolne do różnicowania. Podobnie, Bernard i in., Cancer Res., 45:1707-1716 (1985) donoszą o wyizolowaniu unieśmiertelnionej linii komórkowej keratynocytów określanej jako
PL 195 108 B1
SVK14, która była niemal całkowicie niezdolna do różnicowania. Linia ta również nie wykazywała ekspresji keratyn K1/10 (>53 kDa) oraz keratyny 50 kDa (keratyny K14), które to białka są normalnie wyrażane przez zróżnicowane keratynocyty.
Ponadto, Steinberg i in., J. Cell. Physiol., 123:117-125 (1985) donoszą o keratynocytach transformowanych SV40, które stopniowo traciły zdolność do wyrażania keratyn, charakterystycznych dla normalnego keratynowego cytoszkieletu. Ta utrata normalnej ekspresji keratyn zachodziła po około 10-15 pasażach. Również, Hronis i in., Cancer Res., 44:5797-5804 (1984) opisują keratynocyty unieśmiertelnione DNA SV40, które utraciły zdolność do wytwarzania keratyn K5, K6, K14/15, K16 i K17 oraz inwolukryny, które to białka są charakterystyczne dla normalnie zróżnicowanych keratynocytów. Morris i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8498-8502 (1985) również opisują keratynocyty unieśmiertelnione SV40, które po licznych pasażach (> 14 pasaży) wykazywały znaczne zmniejszenie ekspresji keratyn klasy I i II. Przykładowo, keratynocyty te prawie nie wyrażały K13.
Również Banks-Schlegel i in., J. Cell. Biol., 96:330-337 (1983) ujawniają keratynocyty unieśmiertelnione SV40, które wykazują zmienioną charakterystykę wzrostu w hodowli. Przykładowo, w przeciwieństwie do normalnych keratynocytów, te unieśmiertelnione komórki wymagają do wzrostu warstwy komórek żywicielskich 3T3.
W uprzednio opisanych metodach wytwarzania unieśmiertelnionych keratynocytów i melanocytów ludzkich stosowano zwykle technikę komórek żywicielskich (w której jako komórki „żywicielskie” stosuje się fibroblasty) i zwykłą hodowlę w pożywce zawierającej surowicę. Przykładowo, Sextoni in., „Stable transfection of human keratinocytes: HPV immortalization”, Keratinocyte Methods, red. Leigh I.M. i in., University Press, 179-180 (1994); Garlick, „Retroviral Vectors”, Keratinocyte Methods, (red. Leigh I.M. i in., Cambridge University Press, 181-183 (1994)), opisują zastosowanie pożywki zawierającej cielęcą surowicę płodową i komórki żywicielskie do izolacji i wytwarzania unieśmiertelnionych keratynocytów.
Zastosowanie pożywek bezsurowiczych podczas izolacji i wytwarzania unieśmiertelnionych komórek nabłonkowych, a zwłaszcza keratynocytów ludzkich, opisano uprzednio. Przykładowo, Barbosa i in., Oncogene, 4:1529-1532 (1989), opisują wstępną hodowlę do zlewności przy niskim stężeniu wapnia i pożywce bezsurowiczej ludzkich keratynocytów transfekowanych przez elektroporację albo lipofekcję.
Jednakże, niezależnie od tego co do tej pory opisano, istnieje istotne zapotrzebowanie na unieśmiertelnione keratynocyty i melanocyty ludzkie, o ulepszonych właściwościach, w szczególności, które zachowują zdolność różnicowania normalnych keratynocytów i melanocytów, i które wyrażają białka różnicowania charakterystyczne dla zróżnicowanych melanocytów i keratynocytów, nawet po licznych pasażach. Takie komórki powinny być korzystne w wielu zastosowaniach, w szczególności w testach, które wymagają zróżnicowanych komórek skóry. Ponadto istnieje zapotrzebowanie w stanie techniki na ulepszone pożywki hodowlane zdolne do podtrzymywania pierwotnych i unieśmiertelnionych keratynocytów i melanocytów, jak również ulepszone metody hodowli, które nie wymagają zastosowania komórek żywicielskich.
Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów albo melanocytów według wynalazku zachowuje zdolność do różnicowania oraz ekspresji białek i enzymów, które są wyrażane przez normalnie zróżnicowane keratynocyty albo melanocyty, nawet po wielu pasażach w hodowli tkankowej, przy czym środkiem unieśmiertelniającym jest konstrukt retrowirusowy pLXSHD+SV40(#328) SV40 albo konstrukt pLXSHD+E6/E7 HPV16. Korzystnie unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według wynalazku wyraża białka keratyny i inne białka wyrażane przez normalne zróżnicowane keratynocyty, korzystniej białka keratyny obejmują keratynę K1/10, keratynę K14 i inne białka obejmujące inwolukrynę, filagrynę i lorykrynę.
Również korzystnie unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według wynalazku wykazuje profil CYP450 identyczny albo zasadniczo identyczny z profilem normalnych zróżnicowanych keratynocytów, a korzystniej wyraża CYP450 1A1, 2C, 2E1 i 3A5, ale nie wyraża CYP450 1A2, 2A6, 2B6 i 2D6.
Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów albo melanocytów według wynalazku jest korzystnie wytwarzana w warunkach bezsurowiczych, bez zastosowania komórek żywicielskich.
Korzystnie unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według wynalazku wyraża mRNA kodujący transferazę S-glutationu GST-π, GST-μ i GST-α. Również korzystnie, hodowana w warunkach organotypowych unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według wynalazku tworzy silnie uwarstwiony i spolaryzowany nabłonek posiadający zrogowaciałe warstwy powierzchniowe, pod
PL 195 108 B1 nieobecność surowicy albo komórek żywicielskich. Ponadto unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według wynalazku wyraża korzystnie kolagenazę typu I i TNF-α po traktowaniu jej estrami forbolu.
W zakres wynalazku wchodzi również linia komórek skóry ludzkiej unieśmiertelniona antygenem T SV40, wybrana z grupy obejmującej linie keratynocytów DK2-NR (DSM ACC2238), DK3-NR (DSM ACC2239) i FK2-NR (DSM ACC2240) oraz linię melanocytów DM2-NR (CNCM I-1796).
Wynalazek dotyczy też ulepszonego sposobu unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej w celu otrzymania unieśmiertelnionych keratynocytów i melanocytów, obejmującego etapy:
(i) pozyskania próbki normalnej skóry ludzkiej;
(ii) preparowania próbki skóry do hodowli in vitro;
(iii) uzyskiwania keratynocytów i/lub melanocytów z preparowanej próbki skóry i wysiewania keratynocytów i/lub melanocytów do bezsurowiczej pożywki hodowlanej na płytkach hodowlanych powleczonych warstwą ułatwiającą przyleganie i wzrost komórek zawierającą fibronektynę, kolagen typu I i BSA;
(iv) zmieniania pożywki jeżeli to konieczne, w celu optymalizacji wzrostu zlewnego hodowanych komórek, przy ciągłym zachowaniu powleczenia płytek hodowlanych;
(v) przeniesienia keratynocytów albo melanocytów do bezsurowiczej pożywki selekcyjnej na podobnie powleczone płytki hodowlane;
(vi) zakażenia keratynocytów albo melanocytów konstruktem retrowirusowym;
(vii) przeniesienia powstałych unieśmiertelnionych keratynocytów albo melanocytów do bezsurowiczej pożywki proliferacyjnej, odpowiedniej do proliferacji unieśmiertelnionych keratynocytów albo melanocytów na podobnie powleczonych płytkach hodowlanych; i (viii) przeniesienia powstałych proliferujących keratynocytów do bezsurowiczej pożywki różnicującej, która zawiera wysokie stężenie wapnia, na podobnie powleczonych płytkach hodowlanych.
Korzystnie konstruktem retrowirusowym stosowanym w sposobie według wynalazku jest konstrukt, pLXSHD+SV40(#328) SV40 albo konstrukt pLXSHD+E6/E7 HPV16.
Również korzystnie bezsurowiczą pożywką w etapie (iii) sposobu według wynalazku jest pożywka NR-3, a pożywką w etapie (v) jest pożywka NR-3 albo NR-4. Ponadto korzystnie proliferacyjną pożywką w etapie (vii) sposobu według wynalazku jest pożywka NR-2 albo NR-3 i pożywka M2 dla melanocytów, a różnicującą pożywką w etapie (viii) jest pożywka NR-2 albo zmodyfikowana pożywka MCDB 153, zawierająca wapń w ilości przynajmniej 1,5 mM.
Wynalazek obejmuje też nową bezsurowiczą pożywkę hodowlaną odpowiednią do izolowania i wytwarzania ludzkich keratynocytów i melanocytów, które zachowują zdolność do różnicowania oraz ekspresji białek i enzymów, które są wyrażane przez normalnie zróżnicowane keratynocyty albo melanocyty, nawet po wielu pasażach w hodowli tkankowej, która zawiera: aminokwasy albo ich sole, sole nieorganiczne, witaminy, adeninę, etanoloaminę, glukozę, HEPES, czerwień fenolową, dichlorowodorek putrescyny, kwas tioktowy, chlorowodorek tiaminy, tymidynę, naskórkowy czynnik wzrostowy, insulinę, hydrokortyzon, transferynę, fosfoetanoloaminę i ekstrakt przysadki bydlęcej. Korzystnie pożywka według wynalazku zawiera ponadto epinefrynę, a korzystniej stężenie epinefryny jest wystarczające do nasilenia wzrostu keratynocytów.
Korzystnie aminokwasy zawarte w pożywce według wynalazku wybrane są z grupy składającej się z L-alaniny, L-argininyHCl, asparaginyH2O, L-kwasu asparaginowego, L-cysteinyHCI-H-O, L-kwasu glutaminowego, glutaminy, glicyny, L-histydynyHCI«H2O, L-izoleucyny, L-leucyny, L-ilzyny-HCl, L-metioniny, L-fenyloalaniny, L-proliny, L-seryny, L-treoniny, L-tryptofanu, L-tyrozyny, L-waliny i ich soli. Również korzystnie sole nieorganiczne w pożywce według wynalazku wybrane są z grupy obejmującej metawanadan amonu, molibdenian amonu, chlorek wapnia, siarczan miedzi, siarczan żelaza, chlorek magnezu, chlorek manganu, siarczan niklu, chlorek potasu, octan sodu, wodorowęglan sodu, chlorek sodu, wodorofosforan sodu, pirogronian sodu, selenian sodu, krzemian sodu, chlorek cyny i siarczan cynku. Witaminy w pożywce według wynalazku wybrane są z grupy obejmującej d-biotynę, d-pantotenian wapnia, chlorek choliny, cyjanokobalaminę, kwas foliowy, i-inozytol, nikotynamid, pirydoksynę i ryboflawinę.
Wynalazek dotyczy również nowej bezsurowiczej pożywki do izolowania, tworzenia i/lub utrzymywania unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów, która jest wybrana z grupy obejmującej pożywkę NR-2, NR-3 i NR-4.
Wynalazek obejmuje ponadto zastosowanie unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów według wynalazku w testach wykorzystujących zróżnicowane keratynocyty i/lub melanocyty. Korzystnie, stosowanymi komórkami są komórki wybrane są grupy obejmującej DK2-NR (DSM ACC2238),
PL 195 108 B1
DK3-NR (DSM ACC2239), DM2-NR (CNCM 1-1796) i FK2-NR (DSM ACC2240), a testem jest test zapalny.
Ponadto w zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie pierwotnych melanocytów albo keratynocytów w testach wykorzystujących pierwotne melanocyty i/albo keratynocyty, przy czym melanocyty albo keratynocyty są otrzymane z próbki skóry po ich wysianiu do bezsurowiczej pożywki hodowlanej na płytkach hodowlanych powleczonych warstwą ułatwiającą przyleganie i wzrost komórek, zawierającą fibronektynę, kolagen typu I i BSA. Korzystnie testem jest test zapalny.
Przedmiotem wynalazku jest również ulepszony sposób przeszczepiania skóry, przy czym ulepszenie obejmuje zastosowanie jako przeszczepu skóry pierwotnych melanocytów albo keratynocytów, przy czym melanocyty albo keratynocyty są otrzymane z próbki skóry po ich wysianiu do bezsurowiczej pożywki hodowlanej na płytkach hodowlanych powleczonych warstwą ułatwiającą przyleganie i wzrost komórek, zawierającą fibronektynę, kolagen typu I i BSA.
Krótki opis figur
Na figurze 1 porównano wzrost (w sensie liczby komórek) nieunieśmiertelnionych keratynocytów DK0-NR w trzech różnych pożywkach, tj. NR-3, zmodyfikowanej MCDB 153 zawierającej epinefrynę i MCDB 153, po 6 dniach.
Figura 2a przedstawia konstrukt retrowirusowy SV40, pLXSHD+SV40(#328) korzystnie zastosowany do unieśmiertelnienia melanocytów i/lub keratynocytów osobnika.
Figura 2b przedstawia konstrukt retrowirusowy HPV16, pLXSHD+E6/E7.
Wynalazek dotyczy ciągłych (unieśmiertelnionych) linii komórkowych pochodzących z tkanek normalnej skóry ludzkiej, tj. unieśmiertelnionych keratynocytów i melanocytów, które zachowują zdolność do różnicowania, oraz które zachowują zdolność do wyrażania białek różnicowania, które wyrażają normalne keratynocyty albo melanocyty nawet po wielu pasażach. Przez wiele pasaży rozumie się przynajmniej 10 pasaży w hodowli, korzystnie przynajmniej 20-30 pasaży, jeszcze korzystniej przynajmniej 50 pasaży, zaś idealnie przez nieskończoną liczbę pasaży. Przykładowo, w przeciwieństwie do uprzednio opisanych unieśmiertelnionych keratynocytów, które nie wyrażają tych białek różnicowania albo wyrażają je bardzo słabo, unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku, wyrażają białka różnicowania, keratynę K1/10, keratynę K14, inwolukrynę, filagrynę i lorykrynę, nawet po wielu pasażach w hodowli tkankowej. Również, wynalazek dotyczy pierwotnych keratynocytów i melanocytów wytworzonych w warunkach bezsurowiczych i bez komórek żywicielskich, które utrzymują zdolność do różnicowania i wyrażają białka charakterystyczne dla zróżnicowanych melanocytów i keratynocytów.
Unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku wykazują profil cytochromu p450 (CYP450), który jest podobny, jeżeli nie identyczny, z normalnymi keratynocytami. Przykładowo, komórki te wyrażają CYP450 3A5, ale nie CYP450 3A4. Również, unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku wyrażają enzymy fazy II, np. transferazę S-glutationu (GST), zaś w szczególności GSTa, GSTp i GSTp, podobnie jak normalne nieunieśmiertelnione keratynocyty.
Ponadto, unieśmiertelnione keratynocyty wyrażają białka i enzymy związane z utlenianiem komórkowym i reakcjami zapalnymi, np. dysmutazę nadtlenkową (SOD) i kolagenazę typu I oraz czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α) po traktowaniu estrami forbolu, podobnie, albo identycznie jak normalne zróżnicowane keratynocyty. Z uwagi na tę charakterystykę, linie te dostarczają niezwykle stabilnego, powtarzalnego źródła komórek do badań reakcji skórnych immunologicznych, farmakologicznych, zapalnych, foto- i chemiotoksykologicznych.
Dalej, unieśmiertelnione keratynocyty wyrażają endogenne białka związane z melaniną (patrz, przykłady 14-15).
Również, linie komórkowe unieśmiertelnionych keratynocytów i melanocytów, w hodowli organotypowej tworzą silnie uwarstwiony i spolaryzowany nabłonek posiadający zrogowaciałe warstwy powierzchniowe (warstwa rogowa). Osiągnięto to uprzednio jedynie w konwencjonalnych warunkach hodowli, tj. w pożywce zawierającej surowicę, technika komórek żywicielskich (patrz, np. Lechner i in., Virology, 185:536-571, 1991).
Unieśmiertelnione keratynocyty i melanocyty otrzymuje się z normalnej skóry w warunkach bezsurowiczych i bez zastosowania jakichkolwiek komórek żywicielskich. Ogólnie, unieśmiertelnione keratynocyty i melanocyty według wynalazku otrzymuje się w następujących etapach:
(i) pozyskania próbki normalnej skóry ludzkiej;
(ii) preparowania próbki skóry do hodowli in vitro;
(iii) uzyskiwania keratynocytów i/lub melanocytów z preparowanej próbki skóry i wysianie keratynocytów i/lub melanocytów do bezsurowiczej pożywki hodowlanej, korzystnie pożywce NR-3 albo
PL 195 108 B1
NR-4 (dla melanocytów) (opisanej poniżej) na płytkach hodowlanych powleczonych warstwą ułatwiającą przyleganie i wzrost komórek zawierającą fibronektynę, kolagen typu I i BSA;
(iv) zmienianie pożywki j eżell to konieczne, w celu optymallzacji wzrostu zl^\^r^^c^o hodowanych komórek, przy ciągłym zachowaniu powlekania płytek hodowlanych;
(v) przeniesienia keratynocytów albo melanocytów w selekcyjnejj korzystnie p<^-^^^ie bezsurowiczej, na podobnie powleczone płytki hodowlane;
(vi) zakażenia keratynocytów albo melanocytów konstruktem retrowirusowym, korzystne konstruktem opartym na SV40 albo wirusie brodawczaków 16, takim jak plazmid pLXSHD+SV40(#328), który zawiera wielki antygen T (T Ag) małpiego wirusa 40, albo plazmidem pLXSHD+E6/E7, który zawiera gen E6/E7 wirusa brodawczaków 16 (HPV 16) (opisane poniżej);
(vii) prze niesienie ρο^^θΙυ^ unieśmiertelnionych keraty j^ocytów albo jmelanocytówdo pożywki proliferacyjnej, odpowiedniej do proliferacji unieśmiertelnionych keratynocytów albo melanocytów na podobnie powlekanych płytkach hodowlanych, korzystnie pożywce NR-2 albo NR-3 (opisanych poniżej) i pożywce dla melanocytów M2 (źródło, M. Olsson, Inst. of Dermatology, Uppsala, Szwecja); i (viii) przeniesienia powstałych proliferujących keratynocytów do pożywki różnicującej, korzystnie NR-2 (opisanej niżej) albo zmodyfikowanej pożywki MCDB 153 (opisanej niżej), która zawiera wysokie stężenie wapnia, na przykład 1,5 mM na podobnie powlekanych płytkach hodowlanych (Boyce i in., J. Tissue Cult. Meth., 9:83-93, 1983; Pittlekow i in., J. Invest. Dermatol., 86:410-417, 1986).
Konkretnie, etap (i) zwykle obejmuje uzyskanie próbki tkanki skóry ludzkiej od dawców ludzkich, np. otrzymanych podczas zabiegu chirurgicznego albo pediatrycznego. Unieśmiertelnianie pojedynczej próbki komórek skóry, tj. autologicznej próbki skóry umożliwia wytwarzanie unieśmiertelnionych linii komórkowych keratynocytów albo melanocytów, które wykazują określone cechy, np. konkretny profil receptorów, który jest charakterystyczny dla konkretnego dawcy.
Próbkę skóry preparuje się następnie w etapie (ii) w taki sposób, który jest odpowiedni do hodowli in vitro. Dokonuje się tego korzystnie przez wstępne płukanie próbki skóry, np. przy użyciu tej samej pożywki, którą stosuje się do hodowli. Korzystnie dokonuje się tego w pożywce NR-2, bezsurowiczej pożywce, której dokładny skład ujawniono poniżej, która, jak stwierdzono, jest korzystna do hodowania normalnych keratynocytów i melanocytów. Po płukaniu, próbkę skóry korzystnie goli się, np. dermatomem, a następnie dzieli na małe kawałki.
Powstałe skrawki skóry są korzystnie dzielone na skórę właściwą i naskórek. Można tego dokonać czynnikami fizycznymi i/lub enzymatycznymi. Przykładowo, można to osiągnąć przez trypsynizację, np. przez flotację płatów skóry w roztworze trypsyny (np. około 0,5%) zawierającym EDTA (np. około 0,1%) przez czas odpowiednio długi do rozdzielenia komórek, np. około 30-60 minut w 37°C albo przez noc w 4°C.
Skórę oddziela się (w celu wyizolowania fibroblastów, patrz przykład 2), zaś naskórek umieszcza się w pożywce do zawieszania. Korzystnie, pożywka do zawieszania zawiera roztwór inhibitora trypsyny z soi (SBTI) i kontaktuje się ją z komórkami na czas odpowiednio długi, zwykle około 5 minut, w celu inaktywacji trypsyny i zapewnienia uwalniania komórek. Następnie dodaje się pożywkę do hodowli komórkowej, korzystnie bezsurowiczą pożywkę NR-2 (opisaną poniżej) i filtruje (np. filtr 100 mm) w celu uzyskania pożądanych komórek, tj. keratynocytów i/lub melanocytów.
Powstała pierwotna hodowla keratynocytów/melanocytów uzyskana w etapie (ii) wysiewana jest na pożywkę bezsurowiczą, korzystnie pożywkę NR-3 (opisaną szczegółowo poniżej), w odpowiedniej gęstości komórek, korzystnie około 1,2x104 komórek/cm2, na uprzednio powleczone płytki hodowlane. Jednakże, gęstość komórek może być zmieniana w szerokim zakresie. Płytki hodowlane są korzystnie powlekanie kompozycją, która nieoczekiwanie okazała się zwiększać zarówno przyleganie, jak i wzrost keratynocytów i melanocytów, konkretnie roztworem fibronekty, BSA i kolagenu I. Tę kompozycję do powlekania opisano uprzednio w zastosowaniu do komórek oskrzeli (Lechner i in., J. Tissue Cult. Meth., 9:43-48 (1985)).
W etapie (iv) pożywkę hodowlaną zmienia się tak często, jak wymaga tego optymalizacja wzrostu komórek. Korzystnie, pożywkę zmienia się co drugi dzień. Jednakże, częstość zmiany pożywki może być różna w zależności od konkretnego rodzaju skóry. Po osiągnięciu niemal całkowitej zlewności, np. około 90% zlewności, co zwykle zachodzi po około 10-14 dniach, rozdziela się keratynocyty i melanocyty. Można to osiągnąć dowolnym sposobem zapewniającym odpowiednie oddzielenie komórek bez negatywnego wpływu na keratynocyty i/lub melanocyty. Przykładowo, można to osiągnąć przez różnicową trypsynizację. Korzystnie, melanocyty albo keratynocyty traktuje się roztworem trypsyna/EDTA, a następnie przenosi się do pożywki selekcjonującej. W przypadku keratynocytów,
PL 195 108 B1 komórki korzystnie traktuje się przez około 5-10 minut roztworem trypsyna/EDTA (0,025%/0,01%), a następnie w etapie (v) wysiewa się w pożywce NR-3 na powleczone płytki. Należy zaznaczyć, że pożywka NR-3 promuje wzrost keratynocytów w stosunku do melanocytów. W przypadku melanocytów, komórki traktuje się korzystnie przez 2-4 minuty trypsyną/EDTA (0,025%/0,01%), a następnie wysiewa w etapie (v) w pożywce NR-4 na podobnie powleczone płytki hodowlane. Należy zaznaczyć, że pożywka NR-4 swoiście hamuje wzrost keratynocytów.
Komórki te traktuje się czynnikiem unieśmiertelniającym. Alternatywnie, komórki można zamrozić dopóki się ich nieunieśmiertelni, np. w ciekłym azocie. Zakażenie i unieśmiertelnienie jest korzystnie osiągane przez zastosowanie konstruktu SV40 określonego jako pLXSHD+SV40(#328), który przedstawiono na figurze 2a, i który opisany został przez Stockshlaedera i in., (GeneBank, nr dostępu M64753; Stockshlaeder i in., Human Gene Therapy, 2:33-39 (1991)) albo konstruktu HPV16, określonego jako pLXSHD+E6/E7, który przedstawiono na figurze 2b. Konstrukt pLXSHD+SV40(#328) zawiera m.in. sekwencję T-Ag SV40, sekwencje LTR 5' i 3' SV40, sekwencję pBR322, zapewniające replikację w E. coli, miejsce klonowania, sekwencję poliadenylacji SV40. Konstrukt pLXSHD+E6/E7 zawiera zamiast T-Ag, fragment NcoI/CfoI genu E6/E7 ludzkiego wirusa brodawczaków 16. Sposób konstruowania plazmidu E6/E7 oparty jest na Durst i in., (Durst i in., 1987, Oncogene 1:251-256). Po unieśmiertelnieniu, komórki pasażuje się, jeżeli jest to konieczne, w trakcie hodowli, zaś powstałe unieśmiertelnione komórki przenosi się do pożywki proliferacyjnej w etapie (vii). W przypadku keratynocytów, przeniesienia tego dokonuje się korzystnie w trakcie 2 pasażu. W etapie (viii) unieśmiertelnione komórki namnaża się w pożywce proliferacyjnej dla unieśmiertelnionych keratynocytów albo melanocytów, która zawiera pożywkę bezsurowiczą i korzystnie obejmuje pożywkę NR-2 albo NR-3 i M2 dla melanocytów (opisaną poniżej). Unieśmiertelnione komórki hoduje się ponownie na powleczonych płytkach hodowlanych, przy czym powleczenie obejmuje roztwór fibronektyny, BSA i kolagenu typu I.
Po namnożeniu unieśmiertelnionych komórek w pożywce proliferacyjnej, przenosi się je w etapie (viii) do pożywki, która zapewnia różnicowanie normalnych i unieśmiertelnionych keratynocytów. Korzystnie, pożywka ta obejmuje pożywkę NR-2 albo zmodyfikowaną pożywkę MCDB 153, zawierające wysokie stężenie wapnia, korzystnie około 1,5 mM, przy czym komórki hoduje się ponownie na płytkach hodowlanych powleczonych roztworem fibronektyny, BSA i kolagenu typu I.
Jak zaznaczono powyżej, nieoczekiwanie stwierdzono, że unieśmiertelnione linie komórkowe keratynocytów i melanocytów według wynalazku zachowują zdolność do różnicowania i wyrażają białka różnicowania, które są charakterystyczne dla normalnie zróżnicowanych keratynocytów i melanocytów, nawet po licznych pasażach w hodowli, tj. po przynajmniej 10 pasażach. Przykładowo, unieśmiertelnione keratynocyty wyrażają keratyny, jak również inne białka np. inwolukrynę, filagrynę i lorykrynę po licznych pasażach, które to białka nie są wyrażane albo słabo wyrażane przez poprzednio opisane keratynocyty unieśmiertelnione SV40.
Konkretnie, kilka linii komórkowych unieśmiertelnionych keratynocytów według wynalazku, DK2-NR, DK3-NR i FK2-NR (patrz, tabela 7 i 8, poniżej) wyraża białka różnicowania, keratynę K1/10, keratynę K14, inwolukrynę, filagrynę i lorykrynę nawet po licznych pasażach (>30 pasaży).
Również, unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku mają profil CYP450 podobny, jeżeli nie identyczny jak normalne ludzkie keratynocyty. Przykładowo, unieśmiertelnione keratynocyty wyrażają CYP450 1A1, 2C, 2E1 i 3A5, ale nie CYP450 1A2, 2A6, 2B6 i 2D6, które są charakterystyczne dla profilu cytochromu 450 normalnych keratynocytów. Po raz pierwszy wykazano, że normalne i unieśmiertelnione keratynocyty ludzkie wyrażają CYP450 3A5, nie zaś CYP450 3A4.
Również, linie komórkowe unieśmiertelnionych keratynocytów wyrażają enzymy fazy II, np. transferazę S-glutationu (GST) podobnie do normalnie zróżnicowanych keratynocytów. Konkretnie, linie unieśmiertelnionych keratynocytów wyrażają GSTa, GSTp i GSTp podobnie do normalnych keratynocytów.
Dalej, unieśmiertelnione keratynocyty wyrażają enzymy i inne białka, które są związane z utlenianiem komórkowym i reakcjami zapalnymi w sposób porównywalny z normalnymi keratynocytami. Przykładowo, unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku wyrażają dysmutazę nadtlenkową (SOD). Również, w reakcji na estry forbolu unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku wyrażają kolagenazę typu l (mediator stanu zapalnego) i TNF-α (czynnik martwicy nowotworu alfa).
Melanocyty mają zdolność wyrażania białek związanych z melaniną i wimentyny.
Ponadto, linie unieśmiertelnionych komórek, hodowane w hodowli organotypowej tworzą silnie uwarstwiony i spolaryzowany nabłonek, posiadający zrogowaciałe warstwy powierzchniowe (warstwę rogową) nawet po wielu pasażach (>20 pasaży). Poprzednio opisano to tylko dla linii komórkowych
PL 195 108 B1 unieśmiertelnionych keratynocytów, hodowanych w konwencjonalnych warunkach hodowli, tj. pożywce zawierającej surowicę i z użyciem warstwy żywicielskiej.
Linie komórek unieśmiertelnionych uzyskuje się w całkowicie bezsurowiczych warunkach, bez zastosowania jakiejkolwiek warstwy żywicielskiej podczas hodowli.
Ponadto, jak to opisano szczegółowo poniżej, nieoczekiwanie stwierdzono, że epinefryna jest silnym czynnikiem wzrostowym dla normalnych keratynocytów, gdy stosuje się ją w pożywce bezsurowiczej. Konkretnie, opisana niżej pożywka NR-3, zawiera epinefrynę, która, jak stwierdzono, zwiększa wzrost normalnych keratynocytów (patrz, figura 1). Jest to nieco zaskakujące, zważywszy na fakt, że uprzednio opisano, że epinefryna hamuje wzrost keratynocytów (Halprin, J. Invest. Dermatol., 81:553-557 (1983)) albo wywiera umiarkowany wpływ na wzrost keratynocytów (Koizumi i in., J. Invest. Dermatol., 96:234-237, 1991).
Również, nieoczekiwanie stwierdzono, że ciągłe powlekanie szalek albo płytek hodowlanych zastosowanych do hodowli pierwotnych i unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów, w szczególności warstwą albo „koktajlem” zawierającym fibronektynę, BSA i kolagen typu I, poprawia zarówno przyleganie keratynocytów i melanocytów do płytek albo szalek hodowlanych, jak również zwiększa wzrost komórek. Zastosowania takich materiałów powlekających nie opisano do tej pory w zastosowaniu wobec unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów.
Jak to opisano, wynalazek dotyczy nowej pożywki bezsurowiczej określonej jako pożywka NR-3. Pożywka ta umożliwia hodowlę i izolowanie normalnych keratynocytów i/lub melanocytów ze skóry ludzkiej w warunkach bezsurowiczych, bez zastosowania warstwy żywicielskiej. Stwierdzono, że pożywka ta polepsza wzrost normalnych keratynocytów i umożliwia ustalenie hodowli normalnych keratynocytów bez jakiegokolwiek kontaktu z surowicą albo komórkami żywicielskimi.
Dokładny skład pożywki NR-3 opisano w tabeli 1. Pożywka ta zawiera różne aminokwasy, sole nieorganiczne jako pierwiastki śladowe, witaminy, czynniki wzrostowe i inne środki zastępcze. Przykładowo, pożywka ta zawiera jako czynniki wzrostowe naskórkowy czynnik wzrostowy (rekombinowany EGF), insulinę, hydrokortyzon, transferynę (ludzką), ekstrakt przysadki bydlęcej oraz epinefrynę. Jak zaznaczono, ujawniono nieoczekiwanie, że epinefryna zwiększa wzrost pierwotnych keratynocytów w hodowli tkankowej.
Jako aminokwasy pożywka zawiera L-alaninę, L-argininę«HCl, asparaginę«H2O, L-kwas asparaginowy, L-cysteinęHC«H2O, L-kwas glutaminowy, glutaminę, glicynę, L-histydynęHClH2O, L-izoleucynę, L-leucynę, L-lizynę«HCl, L-metioninę, L-fenyloalaninę, L-prolinę, L-serynę, L-treoninę, L-tryptofan, L-tyrozynę, L-walinę i ich sole.
Zawarte w niej sole nieorganiczne obejmują metawanadan amonu, molibdenian amonu, chlorek wapnia, siarczan miedzi, siarczan żelaza, chlorek magnezu, chlorek manganu, siarczan niklu, chlorek potasu, octan sodu, wodorowęglan sodu, chlorek sodu, wodorofosforan sodu, pirogronian sodu, selenian sodu, krzemian sodu, chlorek cyny i siarczan cynku.
Witaminy zawarte w pożywce NR-3 obejmują d-biotynę, d-pantotenian wapnia, chlorek choliny, cyjanokobalaminę, kwas foliowy, i-inozytol, nikotynamid, pirydoksynę i ryboflawinę.
Pożywka zawiera ponadto adeninę, etanoloaminę, fosfoetanoloaminę, czerwień fenolową, dichlorowodorek putrescyny, glukozę, kwas tioktowy, chlorowodorek tiaminy, tymidynę, HEPES i antybiotyki (fungizon, penicylinę i streptomycynę).
Korzystna kompozycja pożywki NR-3 przedstawiona została w tabeli 12. Jednakże, stężenia środków zastępczych zawartych w pożywce NR-3 można zmieniać w szerokim zakresie. Konkretnie, stężenie różnych środków zastępczych może różnić się od ±50% do ±0,1%, korzystnie od ±10% do ±0,1%, od wartości ujawnionych w tabeli 12. Ponadto, jeden albo wiele środków zastępczych można usunąć albo zastosować inny, zakładając, że nie wpłynie on istotnie ujemnie na izolowanie i ustalenie pierwotnych hodowli komórkowych keratynocytów albo melanocytów i linii unieśmiertelnionych komórek. Specjalista może to ustalić analizą prób i błędów.
Jak zaznaczono, istotnym składnikiem bezsurowiczej pożywki NR-3 jest epinefryna. Stwierdzono, że epinefryna wywiera bardzo silny wpływ promujący na pierwotne ludzkie keratynocyty.
Powód, dla którego epinefryna zwiększa proliferację keratynocytów, jest niejasny. Istnieją doniesienia, że ludzkie keratynocyty wyrażają enzymy do syntezy epinefryny, jak również wyrażają z dużą gęstością receptory beta 2-adrenergiczne (Schallreuther i in.,: „Production ofcatecholamines in the human epidermie”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 189:72-78 (1992)). Enzymy te związane są ze szlakiem biosyntezy katecholamin, w szczególności fenyloetanoloamino-N-metylotransferazy i zależnej od biopteryny hydroksylazy tyrozynowej. Takiej aktywności enzymatycznej nie można wykryć
PL 195 108 B1 w melanocytach i fibroblastach. Aktywność enzymatyczna i/lub ekspresja receptorów może wyjaśnić zdolność epinefryny do modulowania proliferacji keratynocytów.
Zakłada się, że pożywka NR-3 nasila izolowanie i ustalanie pierwotnych hodowli komórkowych i linii komórkowych, ponieważ hamuje różnicowanie komórek, co prowadzi do wzbogacenia w komórki, które zachowują swoją zdolność do różnicowania i wyrażania białek i enzymów wyrażanych przez normalne zróżnicowane keratynocyty i melanocyty.
Konkretniej, uważa się, że wzrost keratynocytów albo melanocytów w pożywce zawierającej surowicę preferuje różnicowanie w pierwszym pasażu. Jednakże, jest to niekorzystne (podczas początkowych etapów hodowli), ponieważ zróżnicowane komórki gorzej rosną. To z kolei powoduje przerastanie i selekcję proliferujących komórek skóry, które wykazują jedynie słabą zdolność do różnicowania. W następstwie, liczba komórek, które wykazują wysoką zdolność do różnicowania jest zmniejszona, gdy do pożywki dodana jest surowica przed unieśmiertelnieniem.
Natomiast, w rozwiązaniach według wynalazku keratynocyty i melanocyty są hodowane w pożywce bezsurowiczej, w warunkach które hamują różnicowanie melanocytów i keratynocytów. W niniejszym wynalazku pożywkę bezsurowiczą korzystnie stosuje się podczas całej hodowli, przed i po unieśmiertelnieniu, jak również podczas proliferacji i różnicowania.
Jak zaznaczono, hodowlana pożywka bezsurowicza NR-3 hamuje różnicowanie keratynocytów, umożliwiając w ten sposób ulepszoną izolację pierwotnych hodowli keratynocytów i unieśmiertelnionych linii komórkowych, które z nich pochodzą. Ponadto, pożywka ta zawiera niskie stężenia wapnia, które hamują wybiórczo wzrost równocześnie izolowanych fibroblastów. Daje to wysoce wybiórczą pożywkę hodowlaną, która faworyzuje tworzenie hodowli zawierających głównie melanocyty i keratynocyty. Tak więc bezsurowicza pożywka NR-3 jest korzystna, ponieważ hamuje różnicowanie keratynocytów, jak również hamuje wzrost fibroblastów.
Jak to zostało omówione, zawiesina komórek wytworzona z pojedynczej próbki skóry, która zawiera rozproszone melanocyty, keratynocyty i fibroblasty będzie hodowana korzystnie w pożywce NR-3. Dokonuje się tego przez wysianie tych komórek na płytki hodowlane, które są w sposób ciągły powleczone kompozycją wspomagającą przyleganie. Korzystnie, warstwa powlekająca zawiera mieszaninę fibronektyny, albuminy surowicy bydlęcej i kolagenu typu I. Warstwę tę albo „koktajl” opisano poprzednio dla komórek oskrzeli (Lechner i in., J. Tiss. Cult. Meth., 9:43-48 (1985)). Niniejsi twórcy stwierdzili, że koktajl ten wzmaga również przyleganie keratynocytów i melanocytów do płytek hodowlanych z tworzywa sztucznego. Ponadto, nieoczekiwanie stwierdzono, że to ciągłe opłaszczenie płytek hodowlanych, które są stosowane do hodowli pierwotnych i unieśmiertelnionych keratynocytów poprawia ponadto wzrost komórek. Ciągłe opłaszczenie płytek hodowlanych nie było opisywane uprzednio dla unieśmiertelnionych keratynocytów albo melanocytów.
Podczas hodowli pierwotne kultury komórkowe są dzielone, gdy osiągną zlewność albo zasadniczo osiągną zlewność, i są rozsiewane na inne powleczone płytki hodowlane. Zwykle, hodowle komórkowe dzielone będą co 10-14 dni.
Pierwotne melanocyty i/lub keratynocyty są hodowane i namnażane do odpowiedniej liczby komórek w bezsurowiczej pożywce NR-3, z zastosowaniem opisanych opłaszczonych płytek hodowlanych, a następnie są poddawane unieśmiertelnianiu. Korzystnie, unieśmiertelniane są melanocyty i keratynocyty, które wykazują najlepszy wzrost. Jednakże, alternatywnie pierwotne melanocyty albo keratynocyty można zastosować przed unieśmiertelnieniem, np. w testach, przeszczepianiu skóry albo w terapii genowej.
Zarówno unieśmiertelnianie melanocytów jak i keratynocytów można wykonać wektorem, który zapewnia ekspresję antygenu T SV40 albo ekspresję genu E6/E7 ludzkiego wirusa brodawczaków 16 (HPV16). Korzystnie, unieśmiertelnienie uzyskuje się przez zakażenie melanocytów albo keratynocytów konstruktem retrowirusowym, zapewniającym ekspresję antygenu T SV40 albo ekspresję genu E6/E7 ludzkiego wirusa brodawczaków 16 (HPV16). Komórkowe zakażenie T-Ag oparte jest na protokole Pfeifer i in., Meth. Cell Sci., 17:83-89, 1995 (z takim wyjątkiem, że wirus zebrano z linii upakowującej hodowanej w DMEM, 10% surowicy płodowej cielęcej). Podczas zakażania można zastosować pożywkę zawierającą surowicę. Jednakże, dla melanocytów i keratynocytów korzystna jest pożywka bezsurowicza, korzystnie np. pożywka PC-1 opisana w publikacji Pfeifer i in., Meth. Cell Sci., 17:83-89, 1995. Najkorzystniej, unieśmiertelniania dokonuje się przy użyciu konstruktu retrowirusowego określonego jako pLXSHD+SV40(#328), przedstawionego na figurze 2a, i opartego na Pfeifer i in., i Stockhlaeder i in., (GenBank, nr dostępu M64753) albo pLXSHD+E6/E7 przedstawionego na figurze 2b i opartego na Durst i in., 1987, Oncogene l, 251-256.
PL 195 108 B1
Po unieśmiertelnieniu, komórki unieśmiertelnione przenosi się do pożywki proliferacyjnej, korzystnie NR-2 albo NR-3, albo M2 (dla melanocytów) z zastosowaniem opłaszczonych płytek hodowlanych. Po proliferacji komórek do pożądanej liczby, komórki przenosi się do pożywki różnicującej odpowiedniej do hodowania normalnych i unieśmiertelnionych keratynocytów. Korzystnie, obejmuje ona NR-2 albo zmodyfikowaną MCDB 153 o wysokim stężeniu wapnia (1,5 mM) albo M2 (dla melanocytów), stosując uprzednio opłaszczone płytki hodowlane (to samo pokrycie BSA, kolagen typu I i fibronektyna).
Jak zaznaczono poprzednio, zróżnicowane unieśmiertelnione linie keratynocytów i melanocytów według wynalazku wykazują ulepszone właściwości, z powodu których linie te są przydatne w testach wymagających stosowania zróżnicowanych komórek skóry ludzkiej. W szczególności stwierdzono, że te linie komórkowe wyrażają białka charakterystyczne dla normalnych zróżnicowanych melanocytów i keratynocytów, nawet po licznych pasażach.
Przykładowo, gdy unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku bada się analizą Western blot albo RT-PCR, posiadają one profil cytochromu P450 (CYP450) podobny, jeżeli nie identyczny z normalnymi keratynocytami. Konkretnie, unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku wyrażają CYP450 1A1,2C, 2E1 i 3A5, ale nie CYP450 1A2, 2A6, 2B6 i 2D6. Profil CYP450 jest zgodny z normalnymi keratynocytami. Taki profil metaboliczny nie był uprzednio opisany dla unieśmiertelnionych keratynocytów. W rzeczywistości, po raz pierwszy wykazano, że normalne i unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku wyrażają CYP450 3A5, a nie CYP450 3A4. Również stwierdzono, że unieśmiertelnione keratynocyty według wynalazku, analizowane przy użyciu przeciwciał swoistych wobec znaczników różnicowania, wyrażają również inne białka różnicowania nawet po licznych pasażach. Konkretnie, linie komórkowe wyrażają białka różnicowania K1/10, keratynę K14, inwolukrynę, filagrynę i lorykrynę, nawet po wielu pasażach, tj. po 10 albo większej liczbie pasaży.
Unieśmiertelnione keratynocyty i melanocyty wychwytują również niezbędne egzogenne kwasy tłuszczowe (EFA) i wykazują desaturację i wydłużanie łańcucha EFA, jak ma to miejsce w przypadku normalnych melanocytów i keratynocytów.
Ponadto, jak opisano szczegółowo poniżej, unieśmiertelnione keratynocyty wyrażają TNFa i mediator stanu zapalnego, kolagenazę typu I, po traktowaniu estrami forbolu, w sposób podobny do normalnych keratynocytów. Również, unieśmiertelnione keratynocyty wyrażają dysmutazę nadtlenkową, enzym związany z utlenianiem komórkowym, podobnie jak prawidłowo zróżnicowane keratynocyty.
Również, unieśmiertelnione melanocyty według wynalazku, traktowane induktorami melanogenezy (np. teofiliną i tyrozyną) i inhibitorami melanogenezy (kwasem kojowym) reagują podobnie jak normalne melanocyty.
W oparciu o te właściwości, unieśmiertelnione keratynocyty i melanocyty dobrze nadają się do badań nad immunologicznymi, farmakologicznymi, foto- i chemiotoksykologicznymi reakcjami skórnymi.
Przykładowo, unieśmiertelnione linie komórkowe keratynocytów i melanocytów można zastosować w testach, które wymagają zróżnicowanych komórek skóry, np. badań nad funkcją barierową (kornifikacja) zrekonstruowanej skóry, badań metabolizmu zróżnicowanych keratynocytów (metabolizm kwasów tłuszczowych, metabolizm przeciwutleniaczy), badań dotyczących wpływu promieniowania ultrafioletowego na komórki skóry, badań dotyczących wpływu potencjalnie drażniących skórę substancji i substancji uczulających skórę, testów mierzących wpływ związków na wytwarzanie melaniny, badań metabolizmu lipidów, miejscowego zastosowania ksenobiotyków (np. olejów kosmetycznych, poszukiwań potencjalnych związków ochronnych, np. fotoochronnych), badań stanu zapalnego i podrażnienia skóry, itp.
Również, unieśmiertelnione linie komórkowe keratynocytów i melanocytów według wynalazku oraz pierwotne melanocyty i keratynocyty są przydatne do poszukiwania potencjalnych związków do leczenia raka i związków do leczenia chorób skóry. Obejmuje to zwykle eksponowanie linii komórkowej albo komórek pierwotnych na taki związek przez pewien okres czasu i ocenianie czy wywołuje on jakikolwiek niekorzystny efekt, np. genotoksyczność, mostkowanie DNA, mutagenność, transformacja komórek albo cytotoksyczność.
Również, linie komórkowe melanocytów i keratynocytów są przydatne do wyrażania białek rekombinowanych, np. ludzkich białek i polipeptydów, jak również do wytwarzania RNA i DNA.
Dalej, unieśmiertelnione linie komórkowe wykazują potencjalną przydatność w terapii genowej ex vivo. Linie komórkowe powinny dostarczać również przydatnego narzędzia do ukierunkowania genetycznego i opracowania komórek zmienionych genetycznie, które wyrażają pożądany produkt genowy, np. do zastosowań terapeutycznych albo do badań nad toksycznością/mutagennością komórkową.
PL 195 108 B1
Ponadto, zważywszy na fakt, że linie komórkowe według wynalazku naśladują wiernie normalne komórki skóry, powinny się nadawać do testów wrażliwości biologicznej.
Oprócz tego, pierwotne keratynocyty i melanocyty, wytwarzane w warunkach bezsurowiczych, mogą być przydatne w terapii genowej. Zasadniczo, ponieważ komórki te nie są eksponowane na surowicę, np. surowicę bydlęcą albo innego zwierzęcia (z wyjątkiem zakażania wirusem i przechowywania w ciekłym azocie), powinny być mniej podatne na ewentualne zanieczyszczenie wirusem albo innym czynnikiem patogennym. Stąd, powinno to zminimalizować ryzyko przeniesienia przez te komórki czynników patogennych albo zakaźnych podczas terapii genowej. Taka terapia genowa ex vivo znajduje zastosowanie w leczeniu zaburzeń takich, jak Epidermolysis bullosa (mutacja keratyny), bielactwo (zaburzenie obejmujące geny syntezy melaniny), raki i czerniaki, choroby alergiczne i zapalne. W odniesieniu do leczenia, jedynym potencjalnym źródłem zakażenia jest ekstrakt przysadki bydlęcej, insulina bydlęca, kolagen bydlęcy, albumina surowicy bydlęcej albo ludzka fibronektyna i transferyna.
Również, unieśmiertelnione linie komórkowe melanocytów i keratynocytów oraz pierwotne melanocyty i keratynocyty znajdują zastosowanie w testach mutagenezy DNA, testach przesiewowych na mutageny skórne, testach identyfikujących czynniki uszkadzające chromosomy, badaniach transformacji złośliwej, komórkowych badaniach biochemicznych (np. testach aktywacji CYP450), badaniach przesiewowych związków i kompozycji, np. koktajli niezbędnych kwasów tłuszczowych, związanych ze stanem zapalnym i reakcjami alergicznymi, testach aktywacji kolagenazy (związanych ze stanem zapalnym), obejmujących wykrywanie TNFa i interleukiny.
Istotnym potencjalnym zastosowaniem pierwotnych keratynocytów albo melanocytów według wynalazku, z uwagi na ich dostępność i sposoby wytwarzania, jest przeszczepianie skóry. Ponieważ te keratynocyty i melanocyty są wytwarzane w warunkach bezsurowiczych, powinny stanowić minimalne ryzyko zakażenia innymi patogenami (np. wirusami) i czynnikami zakaźnymi. Ponadto, ponieważ melanocyty i keratynocyty mogą pochodzić od autologicznego gospodarza, tj. pacjenta z rozległymi ranami, powinno to minimalizować albo eliminować potencjalne ryzyko odrzucenia przeszczepu skórnego albo innych niekorzystnych reakcji immunologicznych, jak również minimalizować ryzyko zakażenia.
Przykładami konkretnych unieśmiertelnionych linii komórkowych keratynocytów według wynalazku są FK2-NR, DK2-NR i DK3-NR, które zdeponowano 5 października, 1995 w DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschroeder Weg 1b, D-38124, Branschweig, Niemcy, pod numerami, odpowiednio, DSM ACC2240, DSM ACC2238 i DSM ACC2239. Ponadto, przykładem konkretnych unieśmiertelnionych linii melanocytów ludzkich według wynalazku jest DM2-NR, którą zdeponowano 11 grudnia, 1996 w Instytucie Pasteura, 25 rue de Docteur Roux 75724, Paryż, Francja, której nadano numer CNCM I-1796. Depozyty złożono zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim. Wszystkie ograniczenia co do dostępności tych linii komórkowych zostaną natychmiast zniesione po wydaniu patentu na niniejsze zgłoszenie albo inne zgłoszenie korzystające z pierwszeństwa tego zgłoszenia.
Inne cechy wynalazku staną się jasne na podstawie poniższego opisu przykładowych wykonań, które podano w celu zilustrowania wynalazku, nie zaś w celu jego ograniczenia.
P r z y k ł a d 1: Charakterystyka ustalonych komórek skóry
W tabeli 1 wymienione zostały wszystkie próbki skóry, które poddano zakażeniu wirusowemu. Izolowane keratynocyty, które wykazywały najlepszy wzrost komórek zastosowano do unieśmiertelnienia.
PL 195 108 B1
Tabel a 1
Próbki skóry zastosowane do izolacji komórek w pożywce NR-3
Pochodzenie tkanki Nazwa linii komórkowej Wiek Płeć Wzrost komórek1
udo OS1 36 k ++
udo OS2 68 k -
udo OS3 51 k +
powieka EL1 46 k +
powieka EL1 49 k +
brzuch Thor1 58 k -
czoło FK1-NR 5 m +++
czoło FK0-NR 13 m ++++
brzuch GK0-NR 26 k +++
pierś DK0-NR 29 k +++
1 1 1 1 1
Sposób: komórki zebrano w trypsynie/EDTA (0,05%/0,01%) i zliczono przez zastosowanie hemocytometru, wynik jest średnią z trzykrotnego powtórzenia.
Ludzkie fibroblasty wyizolowano z próbek skóry FK0-NR, GK0-NR, DK0-NR. Po oddzieleniu warstwy skóry właściwej i naskórka, skórę cięto na małe kawałki 0,2 x 0,2 mm i przytwierdzano surowicą na 6 cm płytce hodowlanej. Po 2-4 godzinach dodawano minimalną niezbędną pożywkę Dulbecco (DMEM, 10% FCS). Hodowlę eksplantu inkubowano dopóki nie stało się widoczne wyrastanie fibroblastów. Zlewne hodowle fibroblastów rozdzielono i namnożono do zamrożonych banków.
P r zykła d 2
1) Charakterystyka wzrostu keratynocytów w pożywce bezsurowiczej: pierwotne hodowle komórkowe hodowano w MCDB 153 (Boyce i in., J. Tissue Cult. Meth., 9:83-93, 1985; Pittlekow i in., J. Invest. Dermatol., 86:410-417, 1986) i pożywce NR-3. Najlepszy wzrost komórek obserwowano w pożywce NR-3 (figura 1). Lepszy wzrost komórek obserwowano również we w pełni określonej pożywce NR-3 (NR-3 bez ekstraktu przysadki bydlęcej, BPE) w porównaniu ze zmodyfikowaną MCDB 153 bez BPE.
Wykres na figurze 1 odzwierciedla wzrost komórek w NR-3 i modyfikowanej MCDB 153 z dodatkiem epinefryny (pożywka wzrostowa dla keratynocytów) po 6 dniach. Zmodyfikowana pożywka MCDB 153 dotyczy zmodyfikowanej pożywki MCDB 153. Keratynocyty zebrano w trypsynie/EDTA (0,05%/0,01%) i policzono w hemocytometrze. Wyniki przedstawione na figurze 1 są średnimi z potrójnego powtórzenia.
2) Wpływ opłaszczania na przyleganie komórek i wzrost: stv^i^r^c^^c^m^, że powiekanie płytek hodowlanych poprawia przyleganie komórek i wzrost normalnych keratynocytów. W szczególności, wyniki przedstawione w tabeli 2 porównują wzrost keratynocytów na opłaszczonych i nieopłaszczonych płytkach hodowlanych. 100000 keratynocytów wysiano na 3,5 cm płytkę zawierającą pożywkę NR-3.
PL 195 108 B1
Tabel a 2
Wpływ powlekania powierzchni na przyleganie komórek
przylegające komórki 24 godziny po wysianiu1 liczba komórek po 4 dniach^
niepowleczone % powleczone % niepowleczone powleczone
DK0-NR po izolacji 21,4 68,2 44600 143800
DK0-NR pasaż 2 73,8 86,8 175500 282300
*1 1 1 1 1 1
Liczba komórek przylegających podzielona przez liczbę komórek wysianych. Komórki przylegające zebrano w trypsynie/EDTA (0,005%/0,01%) i policzono stosując hemocytometr.
2Komórki zebrano w trypsynie/EDTA (0,005%/0,01%) i policzono stosując hemocytometr, wyniki stanowią średnie z potrójnego powtórzenia.
P r zykła d 3
1) Unieśmiertelnianie keratynocytów: zawiesinę komórek wytworzoną z próbek skóry opisanych w przykładzie 1, które zawierały rozproszone melanocyty, keratynocyty i fibroblasty, hodowano w pożywce NR-3. W tym celu wysiano komórki na płytkach hodowlanych, które opłaszczono w sposób ciągły „koktajlem” opisanym uprzednio dla komórek oskrzeli (Fechner i in., J. Tiss. Cult. Meth., 9:43-48 (1985)). Podczas hodowli pierwotnej, gdy komórki osiągnęły zlewność albo zasadniczą zlewność, traktowano je przez 4 minuty trypsyną/EDTA (0,005%/0,01%). Podczas tego traktowania, melanocyty odłączyły się od hodowli keratynocytów i zostały zebrane osobno. Tak więc, na tym etapie oddzielono pierwotne melanocyty i keratynocyty. Pierwotne keratynocyty hodowano i namnażano do pożądanej liczby w bezsurowiczej pożywce NR-3, stosując opisane opłaszczone płytki hodowlane (promujące wzrost keratynocytów względem melanocytów), a następnie unieśmiertelniano. Unieśmiertelnienie keratynocytów uzyskano przy użyciu konstruktu retrowirusowego pLXSHD+SV40(#328), który powodował ekspresję antygenu T SV40 (patrz, Pfeifer i in., Meth. Cell Sci. 17:83-89 (1995); z takim wyjątkiem, że wirus zebrano z linii upakowującej w DMEM, 10% FCS). Podczas zakażenia, zastosowano bezsurowiczą pożywkę PC-1 opisaną w artykule Pfeifer i in., Meth. Cell Sci. 14:83-89 (1995). Po unieśmiertelnieniu linie komórkowe przeniesiono do pożywki proliferacyjnej NR-2 albo NR-3, stosując opłaszczone płytki hodowlane. Po namnożeniu do pożądanej liczby, komórki przenoszono do pożywki różnicującej odpowiedniej do hodowania normalnych i unieśmiertelnionych keratynocytów.
2) Proliferacja unieśmiertelnionych keratynocytów w wielu pasażach: wykazano, że unieśmiertelnione keratynocyty wykazują lepszy wzrost komórek w wielu pasażach. Przedstawiono to w tabeli 3 poniżej. Wykazano to przez ocenę czasu podwojenia populacji (PDT: czas jednego podwojenia populacji komórek podczas logarytmicznej fazy wzrostu). Metoda: Keratynocyty zebrano w trypsynie/EDTA (0,05%/0,01%) i zliczono w hemocytometrze, wyniki są średnią z potrójnego powtórzenia.
Tabel a 3
Czas podwojenia populacji (PDT) linii keratynocytów hodowanych w NR-3
Keratynocyty liczba pasaży PDT (godz.) kryzys* w pasażu
FK2-NR 15 48,00 16-18
FK2-NR 39 21,16
DK1-NR 12 23,20 25-30
DK1-NR 15 31,05
DK1-NR 31 32,99
DK2-NR 15 22,26 20-21
DK3-NR 40 24,34 -
*Kryzys: wzrost komórek ze zmniejszonym tempem proliferacji
PL 195 108 B1
3) Ekspresja CYP450 w unieśmiertelnionych liniach keratynocytów I udzkich: ekspresję CYP450 1A1, 1A2, 3A5, 2E1, 2B6, 2A6 i 2D6 analizowano w liniach komórkowych normalnych i unieśmiertelnionych keratynocytów metodą Western błot (ekspresja białka) oraz RT-PCR (ekspresja mRNA, patrz tabela 4). Wyrażany CYP450 w unieśmiertelnionych keratynocytach był podobny do normalnych keratynocytów. Wielkość ekspresji CYP450 była nieco zmniejszona. Metoda: RT-PCR (odwrotna transkrypcja-reakcja łańcuchowa polimerazy) ze starterami swoistymi dla CYP450 (Mace i in., w przygotowaniu do druku).
T ab e la 4
Ekspresja mRNA CYP450 w keratynocytach ludzkich
Keratynocyty Nr pasażu 1A1* 2C** 2E1 3A5 1A2, 2A6, 2B6,2D6
FK0-NR 4 + + + + -
FK2-NR 36 + + + + -
DK0-NR 3 + + + + -
DK1-NR 31 + + + + -
DK2-NR 13 + + + + -
*ekspresja mRNA 1A1 w liniach unieśmiertelnionych była zwiększona po indukcji bezo(a)pirenem (1,5 μΜ, Amersham Inc.). Wzrost był porównywalny z komórkami normalnymi.
**2C17/19 i 2C18
4) Reakcja na induktory CYP450: linie komórkowe reagowały na induktor CYP450, benzo(a)piren, jak komórki nieunieśmiertlenione, nawet po licznych pasażach (patrz, tabela 5). Indukcja ta nie była opisywana dla keratynocytów unieśmiertelnionych T-Ag.
T a b e l a 5
Aktywność O-deetylazy 7-etoksyresorufinowej (EROD, Sigma Inc.) w ludzkich keratynocytach po indukcji benzo(a)pirenem
Keratynocyty Nr pasażu EROD (pmol/mg białka)
FK0-NR 2 niewykrywalny
FK0-NR + B(a)P 2 0,58
FK2-NR 37 0,01
FK2-NR + B(a)P 37 1,05
DK0-NR 1 0,02
DK0-NR + B(a)P 1 1,03
DK1-NR 32 0,04
DK1-NR + B(a)P 32 1,78
DK2-NR 14 0,02
DK2-NR + B(a)P 14 0,69
DK3-NR 39 0,01
DK3-NR + B(a)P 39 1,86
*Keratynocyty inkubowano 24 godzinyz B(a)P (1,5 μΜ).
Aktywność EROD mierzono po inkubacji w 37°C przez wykrywanie fluorescencji produktu resorufiny 9560 nm wzbudzanie, 586 nm wykrywanie.
PL 195 108 B1
5) Różnicowanie komórek: analizowano znaczniki różnicowania stosując swoiste przeciwciała. Swoiste przeciwciała zidentyfikowano w tabeli 6. Najwyższą zdoiność różnicowania mozia było wykazać w przypadku kioiów DK2-NR i DK1-NR (tabele 7, 8).
T a b e i a 6
Przeciwciała zastosowaie do wykrywaiia białek swoistych dia keratyiocytów
Swoistość Nazwa przeciwciała Firma /Odrośrik
T-Ag Ab-2 Oicogeie, Maihassat, NY
liwoiukryia BTI BT-576 bti, Stuoghtoi, MA
Fiiagryia Fiiagryia Paesei+Lorei, Fraikfurt, Niemcy
Lorykryia aAg 73 Magiaido i ii., 1992
Wimeityia V9 Dako, Giostrup, Dama
Keratyia K4 6B10 Sigma, St. Louis, USA
Keratyia K7 LDS-68 Sigma, St. Louis, USA
Keratyia K8 M20 Sigma, St. Louis, USA
Keratyia K10/1 K8.60 Sigma, St. Louis, USA
Keratyia K13 KS-1A3 Sigma, St. Louis, USA
Keratyia K14 CKB1 Sigma, St. Louis, USA
Keratyia K17 CK-E3 Sigma, St. Louis, USA
Keratyia K18 CY-90 Sigma, St. Louis, USA
Keratyia K19 A53-B/A2 Sigma, St. Louis, USA
T a b e i a 7
Wykrywaiie T-Ag i produktów różnicowania keratyiocytów iaskórkowych
Keratyiocyt Nr pasażu T-Ag liwoiukryia Fiiagryia Lorykryia Wimeityia
FK0-NR 2 - +++ ++ + ++
FK2-NR 25 +++ ++ ++ + ++
DK0-NR 2 - +++ +++ ++ +++
DK1-NR 13 +++ +++ ++ ++ ++
DK1-NR 30 +++ ++ ++ + ++
DK2-NR 11 +++ +++ +++ ++ +++
DK3-NR 36 +++ ++ ++ + ++
PL 195 108 B1
Tabel a 8
Wykrywanie keratyn (K) w keratynocytach
Keratynocyt Nr pasażu K4 K7 K8 K10/1 K13 K14 K17 K18 K19
FK0-NR 2 ++ - ++ ++ +++ ++ ++ + +
FK2-NR 25 +++ - ++ ++ +++ ++ ++ + +
DK0-NR 2 ++ - - +++ +++ +++ +++ - +
DK1-NR 13 ++ - ++ +++ +++ ++ ++ + +
DK1-NR 30 + - ++ ++ ++ ++ + ++ +
DK2-NR 11 +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++
DK3-NR 36 + - +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++
Sposób (tabela 7 i 8): Kertynocyty hodowane na szkiełkach po utrwaleniu czystym metanolem zabarwiono przeciwciałami wymienionymi w tabeli 6.
+++: najwyższe stężenie białka, ocenione mikroskopią fluorescencyjną.
-: brak ekspresji białka.
6) Ekspresja transferazy S-glutationu: enzym II fazy, transferazę S-glutationu (Gis^T analizowano techniką Northern i Western blot. Wszystkie linie keratynocytów silnie wyrażały mRNA dla GSTp, ale nie GSTa i GSTp, (tabela 9: Metoda: Northern blot). Profil ekspresji białka GSTa, GSTp i GSTp w liniach komórkowych był podobny do normalnych keratynocytów.
Tabel a 9
Ekspresja białka enzymu GST
Keratynocyty GSTa GSTμ GSTp
FK2-NR - - +++
DK0-NR - - +++
DK1-NR - - +++
DK2-NR - - +++
DK3-NR - - +++
7) Metabolizm niezbędnych kwasów tłuszczowych (EFA): w celu analizy i porównania desaturacji i wydłużania EFA dodanych do keratynocytów, unieśmiertelnione (DK1-NR, FK2-NR) i normalne keratynocyty traktowano kwasem linolowym (LA, 15 μΜ) i kwasem α-linolowym (LN, 15 μΜ). W badaniach tych zastosowano NR-2 pozbawioną EFA (Biofluids, Inc.). Hodowle komórkowe traktowano po osiągnięciu zlewności i zmianie pożywki na NR-2 o wysokim stężeniu wapnia (1,5 mM). Komórki traktowano EFA przez 4 dni (zmiana po 2 dniach).
Analizę EFA wykonano przez ekstrakcję i rozdział fosfolipidów w TLC (chromatografia cienkowarstwowa), a oznaczenie ilościowe estrów metylowych kwasów tłuszczowych w GLC (chromatografia ciekło-gazowa). Wykazano tworzenie produktów desaturacji i wydłużania LA (20:4n-6 i 22:4n-6) oraz LN (20:5n-3, 22:5n-3 i 22:6n-3). Ten profil metaboliczny był zgodny z obserwowanym w normalnych keratynocytach.
8) Kariotypowanie: wszystkie linie komórkowe były hipodiploidalne, z większością chromosomów w zakresie diploidalnym (z wyjątkiem DK2-NR z liczbą chromosomów zakresie tetraploidalnym). Nie wykrywano komórek innych niż analizowane linie komórkowe. Wyniki te potwierdzają czystość linii komórkowych i brak zanieczyszczeń komórkami z innych źródeł.
9) Charakterystyka in vivo\ tworzenie guzów przez unieśmiertelnione keratynocyty określano przez podanie podskórne (keratynocyty 1-2mio) myszom nagim. Badane linie keratynocytów DK2-NR, DK3-NR, FK2-NR nie tworzyły guzów u myszy nagich (4 miesiące inkubacji). Jednakże, DK3-NR była nieco guzotwórcza u 6 zwierząt z 10 po 5 miesiącach inkubacji.
10) Reakcja na środki drażniące skórę: indukcję „genu stresowego” TNFa (czynnik martwicy nowotworu alfa) po traktowaniu środkami drażniącymi skórę, PMA (octan forbolo-12-mirystynianu),
PL 195 108 B1
SDS (sól sodowa siarczanu dodecylu), DMSO (dimetylosulfotlenek), IL-Ιβ (interleukina 1β) i UV-B (ultrafiolet B), analizowano przez Northern blot i testy biologiczne (tabela 10). Linie keratynocytów reagują na PMA i UV-B, wyrażając TNFa nawet po wielu pasażach.
Po traktowaniu unieśmiertelnionych keratynocytów estrami forbolu (PMA) obserwowano wzrost ekspresji kolagenazy (typu I).
T ab e l a 10
Wydzielanie TNFa w keratynocytach po indukcji środkami drażniącymi skórę Test aktywności białka: włączanie 3H-tymidyny do komórek wrażliwych na TNFa
wydzielanie TNFa po indukcji
Keratynocyty Liczba PMA SDS DMSO IL-Ιβ UV-B
DK0-NR 3 + - - nt +
DK1-NR 20-22 + + - + +
DK1-NR 32 + - - nt +
DK2-NR 16 + - - - +
DK3-NR 31 + - - nt +
nt: nie badano *:komórki wrażliwe: linia mysiego włókniako-mięsakaWEHI 164 klon 1.14 (ATCC).
11) Hodowle organotypowe: przeprowadzono również hodowlę ludzkich keratynocytów w warunkach organotypowych (keratynocyty hodowane w warunkach ekspozycji na powietrze na żelu kolagenowym z komórkami żywicielskimi). Wszystkie linie keratynocytów wykazywały morfologię hiperproliferacyjną w porównaniu z normalnymi keratynocytami. Badania te wykonano w pożywce hodowlanej z surowicą. Hiperproliferacyjny wzrost komórek był zmniejszony w warunkach bezsurowiczych (NR-2 z wysokim stężeniem wapnia (1,5 mM)) na wkładkach z tworzywa sztucznego do płytek hodowlanych bez żelu kolagenowego i bez komórek żywicielskich).
P r z y k ł a d 4
1) Unieśmiertelnienie melanocytów: zawiesinę komórek wytworzoną z próbki skóry DK0-NR opisanej w przykładzie 1, która zawierała rozproszone melanocyty, keratynocyty i fibroblasty, hodowano w pożywce NR-3. W tym celu wysiano komórki na płytkach hodowlanych, które opłaszczono w sposób ciągły „koktajlem” opisanym uprzednio dla komórek oskrzeli (Lechner i in., J. Tiss. Cult. Meth., 9:43-48 (1985)). Podczas hodowli pierwotnej, gdy komórki osiągnęły zlewność albo zasadniczą zlewność, traktowano je przez 4 minuty trypsyną/EDTA (0,005%/0,01%). Podczas tego traktowania, melanocyty odłączyły się od hodowli keratynocytów i zostały zebrane osobno. Tak więc, na tym etapie oddzielono pierwotne melanocyty i keratynocyty. Zebrane pierwotne melanocyty wysiano do bezsurowiczej pożywki NR-4, która swoiście hamowała wzrost keratynocytów. Pierwotne melanocyty hodowano i namnażano do pożądanej liczby w bezsurowiczej pożywce NR-4, stosując opisane opłaszczone płytki hodowlane, a następnie unieśmiertelniano. Unieśmiertelnienie melanocytów uzyskano przy użyciu konstruktu retrowirusowego pLXSHD+SV40(#328), który powodował ekspresję antygenu T SV40 (patrz, Pfeifer i in., Meth. Cell Sci. 17:83-89 (1995); z takim wyjątkiem, że wirus zebrano z linii upakowującej w DMEM, 10% FCS). Podczas zakażenia, zastosowano bezsurowiczą pożywkę PC-1 opisaną w artykule Pfeifer i in., Meth. Cell Sci. 17:83-89 (1995). Po unieśmiertelnieniu linie komórkowe przeniesiono do pożywki proliferacyjnej M2 i różnicującej (DMEM/F12, Biofluids, nr 148; można ją również nabyć od M. Olssena, Uppsala, Szwecja).
2) Charakterystyka ludzkich melanocytów wyrażających T-Ag: ekspresję białek związanych z melaniną w unieśmiertelnionych melanocytach według wynalazku (zwłaszcza DM2-NR) porównano z normalnymi melanocytami. Wykazano, że unieśmiertelnione komórki wyrażają białka związane z melaniną, antygen związany z czerniakiem (MAA) i HMB45, podobnie jak normalne komórki, jednak na niższym poziomie.
PL 195 108 B1
3) Indukcja syntezy melaniny: melanogenezę linii melanocytów wyrażających T-Ag Szwłanzcza linii DM2-NR) pcrówocwnoc y ocamniocmi mzinocycóżmi. Mzinochctc eanCecwnoc ioUkCócażmi mzindcezozyc, ócacycoc i ózcfiiioc cany iohibiócazm mzinocezozyc, Cwnszm Ccjcwcm. Lioiz mziżocycóów Zywłnyyyyn DM2-NR) aznecwnłc on mcUkinecac mzinocezozyc pcUcboiz jnC CcmóaCi ocamnioz. WcCnynoc aówoiza, az ioUkCyjn/ynhnmcwnoiz mzinocezozyc jzst ynizaoz cU UnwCi.
P a ycCłn U 5
Syyyzp DK0-NR cpisnoc w paycCłnUyiz 1 koizśmizatzioicoc, jnC óc cpisnoc wcżzj, CcoyeakCózm aztacwiakzcwcm cpnatcm on pLXSHD+E6/E7 HPV16, Ctóac payzytnwicoc on fiekayz 2b. WcszizCyjcocwnoc CiiCn yicetyyh iioii Czantyocyctów. goniiyn wcoiCów w cUoizyizoik Uc pacUkCtów aóaoiycwnoin ZyctcCzantcoc, GST, TNFo, iowcikCacoc, fiineacoc, icacCacoc, wimzotcoc) sc pcUcboz Uc kycyCnocyh Uin iioii DK2-NR i DK3-NR.
PaycCład 6
SCłnU ocwzj pcacwCi NR-3 wzUłke wconinyCk i CiiCk ioocyh pcacwzC bzyykacwiyycyh wzUłke wconinyCk, tj. NR-1, NR-2 i NR-4 pcaówonoc pcoiazj.
1) SCłnU pcacwCi NR-1 Zpntay tnbzin oiazj)
gmiocCwnsc NR1 [miiieanmc/iita]
1 2
L-ninoion 9,0000
L-nagioion·HCl 316,0000
nspnangioa·H2O 15,0000
L-Cwżs nspnangiocwn 4,0000
L-ynstzion·HCl·H2O 42,0000
L-Cwns glktnmiocwn 14,8000
glktnmion 877,0000
gliynon 7,6000
L-histcUcon’HCi’H2O 50,4000
L-izcizkycon 98,4000
L-izkycon 131,2000
L-iizcon’HCi 36,6000
L-mzticoion 13,4000
L-fzocicninoion 14,9000
L-paciion 34,6000
L-szacon 126,2000
L-tazcoion 23,8000
L-tacptcfno 9,2000
L-tcacycon 13,6000
L-wniion 70,2000
sciz oizcagnoiyyoz
mztnwnonUno nmcok [NH4VO3] 0,0006
mciibUzoino nmcok [(NH4)6Mc7O24X4H2O] 0,0010
yhicazC wnpoin [CnCi2x2H2O] 16,2000
sinayyno mizUyi [CkSO4x5H2O] 0,0025
PL 195 108 B1 ciąg dalszy tabeli
1 2
siarczan żelaza [FeSO4x7H2O] 1,4000
chlorek magnezu [MgCl2x6H2O] 122,0000
chlorek manganu [MnCl2x4H2O] 0,0002
siarczan niklu [NiSO4x6H2O] 0,0003
chlorek potasu [KCl] 112,0000
octan sodu 301,5000
wodorowęglan sodu [NaHCOa] 1088,0000
chlorek sodu [NaCl] 5200,0000
wodorofosforan sodu [Na2HPO4x7H2O] 536,0000
pirogronian sodu 55,5000
selenian sodu [Na2SeO3] 0,0050
krzemian sodu [Na2SiO3x9H2O] 0,1420
chlorek cyny [SnC^x2H2O] 0,0001
siarczan cynku [ZnSO4x7H2O] 0,5100
witaminy
d-biotyna 0,0200
d-pantotenian wapnia 0,2600
chlorek choliny 28,0000
cyjanokobalamina (B12) 0,4100
kwas foliowy 0,7900
i-inozytol 18,0000
nikotynamid (B3) 0,0400
pirydoksyna (B6xH2O) 0,0600
ryboflawina (B2) 0,0400
inne
adenina 27,3000
naskórkowy czynnik wzrostowy (EGF, ludzki rekombinowany) 0,0010
etanoloamina 0,0310
glukoza 1080,0000
HEPES 6000,0000
hydrokortyzon 0,5000
insulina (bydlęca) 5,0000
czerwień fenolowa 1,2000
fosfoetanoloamina 0,0710
dichlorowodorek putrescyny 0,1600
chlorowodorek tiaminy 0,3400
PL 195 108 B1 ciąg dalszy tabeli
1 2
kwas tioktowy 0,2100
tymidyna 0,7300
transferyna 10,0000
osmolarność 280-285 mOsm/kg
2) Skład pożywki NR-2: taki sam jak NR-1, ale z dodatkiem ekstraktu przysadki bydlęcej (Biofluid, Inc.). w ilości 35 mg/l, ponadto zawiera antybiotyki (Gibco BRL, Life Technologies Inc.), fungizon (0,25 mg/ml), penicylinę (10000 jedn./ml) i streptomycynę (10 mg/l).
3) Skład pożywki NR-3: taki sam jak NR-2, ale z dodatkiem epinefryny (Biofluid, Inc.) 250 pg/l.
4) Skład pożywki NR-4: taki sam jak NR-2, ale z dodatkiem pFGF (3 pg/l) (zasadowy czynnik wzrostowy fibroblastów, Sigma, Inc.) oraz octanu forbolo-12-mirystynianu (10 pg/l, PMA, C.C.R., Inc.).
Mimo, że wynalazek opisano szczegółowo w odniesieniu do pewnych konkretnych wykonań, możliwe są inne wykonania mieszczące się w zakresie opisu niniejszego wynalazku. Zatem, ani ujawnienia, ani poniższe zastrzeżenia, nie są ograniczone przez zamieszczony tu opis najkorzystniejszych wykonań.

Claims (30)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów albo melanocytów, która zachowuje zdolność do różnicowania oraz ekspresji białek i enzymów, które są wyrażane przez normalnie zróżnicowane keratynocyty albo melanocyty, nawet po wielu pasażach w hodowli tkankowej, przy czym środkiem unieśmiertelniającym jest konstrukt retrowirusowy SV40, pLXSHD+SV40(#328), albo konstrukt HPV16, pLXSHD+E6/E7.
  2. 2. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytówwedług zastrz. 1, znamienna tym, że wyraża białka keratyny i inne białka wyrażane przez normalne zróżnicowane keratynocyty.
  3. 3. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według zastrz. 2, znamienna tym, że białka keratyny obejmują keratynę K1/10, keratynę K14 i inne białka obejmujące inwolukrynę, filagrynę i lorykrynę.
  4. 4. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według zastrz. 1, znamienna tym, że wykazuje profil CYP450 identyczny albo zasadniczo identyczny z profilem normalnych zróżnicowanych keratynocytów.
  5. 5. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytówwedług zastrz. 4, znamienna tym, że wyraża CYP450 1A1,2C, 2E1 i 3A5, ale nie wyraża CYP450 1A2, 2A6, 2B6 i 2D6.
  6. 6. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytówwedług zastrz. 1, znamiennatym, że jest wytwarzana w warunkach bezsurowiczych, bez zastosowania komórek żywicielskich.
  7. 7. Unieśmiertelniona linia komórkowa melanocytów według zastrz. 1, znamienna tym, że jest wytwarzana w warunkach bezsurowiczych, bez zastosowania komórek żywicielskich.
  8. 8. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według zastrz. 1, znamienna tym, że wyraża mRNA kodujący transferazę S-glutationu GST-π, GST-μ i GST-α.
  9. 9. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według zastrz. 1, znamienna tym, że hodowana w warunkach organotypowych tworzy silnie uwarstwiony i spolaryzowany nabłonek posiadający zrogowaciałe warstwy powierzchniowe, pod nieobecność surowicy albo komórek żywicielskich.
  10. 10. Unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów według zastrz. 1, znamienna tym, że po traktowaniu jej estrami forbolu wyraża kolagenazę typu I i TNF-α.
  11. 11. Linia komórek skóry ludzkiej unieśmiertelniona antygenem T SV40, wybrana z grupy obejmującej linie keratynocytów DK2-NR (DSM ACC2238), DK3-NR (DSM ACC2239) i FK2-NR (DSM ACC2240) oraz linię melanocytów DM2-NR (CNCM I-1796).
  12. 12. Ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej w celu otrzymania unieśmiertelnionych keratynocytówi melanocytów, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    (i) pozyskania próbki normalnej skóry ludzkiej;
    (ii) preparowania próbki skóry do hodowli in vitro;
    PL 195 108 B1 (iii) uzyskiwaniakeratynocytów i/lubmelanocytówz preparowanej próbki skóry i wysiewania keratynocytów i/lub melanocytów do bezszrowiczej pożywki hodowlanej na płytkach hodowlanych powleczonych warstwą ułatwiającą przyleganie i wzrost komórek, zawierającą fibronektynę, kolagen typu I i BSA;
    (iv) zmieniania ροζγ\/νΚϊ]eżeH to konieccne, w ccIu optymallzacji wwrostuzlewnego hodowannch komórek, przy ciągłym zachowaniu powleczenia płytek hodowlanych;
    (v) przeniesienia keratynocytów albo melanocytów do bezsurowiczej pożywki selekcyśnej na podobnie powleczone płytki hodowlane;
    (vi) zakażenia keratynocytów albo melanocytów konstruktem retrowirusowym;
    (vii) prze niesie nia powssałych unieśmiertelnionych k^ι^^tt^ι^<sc^j^t¢^\y albo melanocytów do bezsurowiczej pożywki proliferacyjnej, odpowiedniej do proliferacji unieśmiertelnionych keratynocytów albo melanocytów na podobnie powleczonych płytkach hodowlanych; i (viii) przeniesienia powstałych proliferujących keratynocstów do bezsurowiczej pożywki różnicującej, która zawiera wysokie stężenie wapnia, na podobnie powleczonych płytkach hodowlanych.
  13. 13. Sposób według zasstz. 12, tym, że konsstuktem rerrowizusowym tess konsstukt pLXSHD+SV40(#328) SV40, albo konstrukt pLXSHD+E6/E7 HPV16.
  14. 14. Sposóbwedług zasstz. t2, znamiennytym, że bezsurowiczą pożywkąw β^ρΐβ tiii) j ees pożywka NR-3.
  15. 15. Spooch wedługzastyy. t2, znam ienny tym. że pożywkąw β^ρΐβ tv) j ees pozżywkaNFR-S al· bo NR-4.
  16. 16. Sposóbwedługzastyz. t2, znnmienny tym. że proll)erycjsną pożywką w β^ρΐθΟ^Ν) j ees pożywka NR-2 albo NR-3 i pożywka M2 dla melanocytów.
  17. 17. Sposób według z^^sr^^. 12, znamienny tym, że różnicużącą pożywką w eeapie (υϊη) j ess pożywka NR-2 albo zmodyfikowana pożywka MCDB 153, zawierająca wapń w ilości przynajmniej 1,5 mM.
  18. 18. Nowa bezsurOwicza pożżsykahodowlanaodpowiednia do żzolowania ί wytwarzaniaiudzieli keratynocytów i melanocytów, które zachowują zdolność do różnicowania oraz ekspresji białek i enzymów, które są wyrażane przez normalnie zróżnicowane keratynocyty albo melanocyty, nawet po wielu pasażach w hodowli tkankowej, znamienna tym, że zawiera: aminokwasy albo ich sole, sole nieorganiczne, witaminy, adeninę, etanoloaminę, glukozę, HEPES, czerwień fenolową, dichlorowodorek putrescyny, kwas tioktowy, chlorowodorek tiaminy, tymidynę, naskórkowy czynnik wzrostowy, insulinę, hydrokortyzon, transferynę, fosfoetanoloaminę i ekstrakt przysadki bydlęcej.
  19. 19. Pożywka według zastrz. 18, znamienna tym, że ponadto zawiera epinefrynę.
  20. 20. Rozrywka według zasstz. 19, znamienna tym, że ssężenie epineeryny t ess wyssarczaśące do nasilenia wzrostu keratynocytów.
  21. 21. Pożywka według zastrz. 18, znamienna tym, że aminokwasy zawarte w pożywce wybrane są z grupy składającej się z L-alaniny, L-argininyHCl, asparaginyH2O, L-kwasu asparaginowego, L-cysteinj^«HCl«H2O, L-kwasu glutaminowego, glutaminy, glicyny, L-histydyny·HCl·H2O, L-izoleucyny, L-leucyny, L-ii^^n^^H^^i, L-metioniny, L-fenyloalaniny, L-proliny, L-seryny, L-treoniny, L-tryptofanu, L-tyrozyny, L-waliny i ich soli.
  22. 22. Pożywka według zastrz. 18, znamienna tym, że sole nieorganiczne wybrane są z grupy obejmującej metawanadan amonu, molibdenian amonu, chlorek wapnia, siarczan miedzi, siarczan żelaza, chlorek magnezu, chlorek manganu, siarczan niklu, chlorek potasu, octan sodu, wodorowęglan sodu, chlorek sodu, wodorofosforan sodu, pirogronian sodu, selenian sodu, krzemian sodu, chlorek cyny i siarczan cynku.
  23. 23. Pożywka według zastrz. 18, znamienna tym, że witaminy wybrane są z grupy obejmującej d-biotynę, d-pantotenian wapnia, chlorek choliny, cyjanokobalaminę, kwas foliowy, i-inozytol, nikotynamid, pirydoksynę i ryboflawinę.
  24. 24. Nowa bezsurowicza pożywka do izolowania, tworzenia i/lub utrzymywania unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów, znamienna tym, że jest wybrana z grupy obejmującej pożywkę NR-2, NR-3 i NR-4.
  25. 25. Zastosowanie unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów określonych w zastrz. 1 w testach wykorzystujących zróżnicowane keratynocyty i/lub melanocyty.
  26. 26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że komórki wybrane są z grupy obejmującej DK2-NR (DSM ACC2238), DK3-NR (DSM ACC2239), DM2-NR (CNCM I-1796) i FK2-NR (DSM ACC2240).
  27. 27. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że testem jest test zapalny.
    PL195 108 B1
  28. 28. Zastosowanie pierwotnych melanocytów albo k(^i^^tt/nc^c^^/tc^\w w testach wykorzystujących pierwotne melanocyty i/albo keratynocyty, przy czym melanocyty albo keratynocyty są otrzymane z próbki skóry po ich wysianiu w bezsurowiczej pożywce hodowlanej do bezsurowiczej pożywki hodowlanej na płytkach hodowlanych powleczonych warstwą ułatwiającą przyleganie i wzrost komórek, zawierającą fibronektynę, kolagen typu I i BSA.
  29. 29. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że jest testem zapalnym.
  30. 30. Ulepszonn sposób przeszczepiania skóry, znamienny tym, że ulepszenie obejmie zastosowanie jako przeszczepu skóry pierwotnych melanocytów albo keratynocytów, przy czym melanocyty albo keratynocyty są otrzymane z próbki skóry po ich wysianiu do bezsurowiczej pożywki hodowlanej na płytkach hodowlanych powleczonych warstwą ułatwiającą przyleganie i wzrost komórek, zawierającą fibronektynę, kolagen typu I i BSA.
PL96327320A 1995-12-21 1996-12-19 Unieśmiertelnione linie komórkowe skóry ludzkiej,keratynocytów albo melanocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, nowe bezsurowicze pożywki, zastosowanie unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów oraz pierwotnych melanocytów albo keratynocytów oraz ulepszony sposób przeszczepiania skóry PL195108B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US57648395A 1995-12-21 1995-12-21
PCT/EP1996/005812 WO1997023602A1 (en) 1995-12-21 1996-12-19 Improved immortalized human skin cell lines and novel serum-free medium useful for the production thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL327320A1 PL327320A1 (en) 1998-12-07
PL195108B1 true PL195108B1 (pl) 2007-08-31

Family

ID=24304605

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96327320A PL195108B1 (pl) 1995-12-21 1996-12-19 Unieśmiertelnione linie komórkowe skóry ludzkiej,keratynocytów albo melanocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, nowe bezsurowicze pożywki, zastosowanie unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów oraz pierwotnych melanocytów albo keratynocytów oraz ulepszony sposób przeszczepiania skóry

Country Status (23)

Country Link
US (2) US6423540B2 (pl)
EP (2) EP0780469B1 (pl)
JP (1) JP4404965B2 (pl)
KR (1) KR100455006B1 (pl)
CN (1) CN1154717C (pl)
AT (1) ATE199390T1 (pl)
AU (1) AU730222B2 (pl)
BR (1) BR9612256B1 (pl)
CA (1) CA2234118C (pl)
CZ (1) CZ297289B6 (pl)
DE (1) DE69611894T2 (pl)
DK (1) DK0780469T3 (pl)
ES (1) ES2155166T3 (pl)
GR (1) GR3035719T3 (pl)
HU (1) HU226195B1 (pl)
IL (1) IL124191A (pl)
NO (1) NO326190B1 (pl)
NZ (1) NZ325814A (pl)
PL (1) PL195108B1 (pl)
PT (1) PT780469E (pl)
RU (1) RU2215030C2 (pl)
SK (1) SK283314B6 (pl)
WO (1) WO1997023602A1 (pl)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT780469E (pt) * 1995-12-21 2001-06-29 Nestle Sa Linhas imortalizadas de celulas derivadas de tecidos cutaneos humanos normais e meios de cultura sem soro adaptados a sua cultura
ES2226383T3 (es) * 1998-04-17 2005-03-16 Societe Des Produits Nestle S.A. Linea de celulas inmortalizadas derivadas de tejidos cutaneos humanos normales.
US6964869B2 (en) 1998-07-13 2005-11-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Method and composition for skin grafts
CN1087778C (zh) * 1999-03-02 2002-07-17 华东理工大学 杂交瘤细胞无血清培养基
DE19912798C1 (de) * 1999-03-10 2000-02-17 Andreas Jordan Verfahren zur Kultivierung von Krebszellen aus Humangewebe und Vorrichtung zur Aufbereitung von Gewebeproben
AUPR298901A0 (en) 2001-02-07 2001-03-08 McComb Foundation, Inc., The Cell suspension preparation technique and device
JP4669206B2 (ja) * 2001-04-24 2011-04-13 ウイスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーシヨン 皮膚移植片のための方法および組成物
AU2002342613A1 (en) 2001-05-09 2002-11-25 Geron Corporation Treatment for wounds
US20030022369A1 (en) * 2001-05-18 2003-01-30 Helen Fillmore Differentiation of specialized dermal and epidermal cells into neuronal cells
ATE386986T1 (de) * 2001-07-06 2008-03-15 Lipomics Technologies Inc Erzeugen, betrachten, interpretieren und verwenden einer quantitativen datenbank von metaboliten
GB0208041D0 (en) 2002-04-08 2002-05-22 Lonza Biologics Plc Method of culturing animal cells
US20050025737A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Sebagh Jean Louis Compositions containing melon extracts
US7462487B2 (en) * 2003-09-18 2008-12-09 Raven Biotechnologies, Inc. Cell culture media
WO2005071065A1 (en) * 2004-01-26 2005-08-04 Cognis France S.A.S Method for studying functional interactions between sensory neurons and keratinocytes or melanocytes
WO2006101834A1 (en) 2005-03-17 2006-09-28 Stratatech Corporation Skin substitutes with improved purity
DE602007008627D1 (de) * 2006-02-14 2010-10-07 Genetix Ltd Zellkulturmedium
US8637310B2 (en) 2008-12-05 2014-01-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Use of a rock inhibitor to sustain primary human keratinocytes in a proliferative state
WO2010134619A1 (ja) * 2009-05-18 2010-11-25 国立大学法人東北大学 人工多能性幹細胞からの上皮系前駆細胞・幹細胞群及び角膜上皮細胞群の分化誘導方法
KR101768632B1 (ko) * 2011-05-18 2017-08-17 (주)아모레퍼시픽 칼슘 펄스를 통한 배양상피세포층의 분리방법
HUE034396T2 (en) * 2011-07-12 2018-02-28 Foodchek Systems Inc Culture media, Method for Salmonella and E. coli cultivation and Method for Detection of Salmonella and E. coli
WO2013129885A1 (ko) * 2012-02-28 2013-09-06 건국대학교 산학협력단 세포 배양액
EP2975117B1 (en) 2013-03-11 2018-01-10 JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for producing human corneal epithelium sheet
AU2013205148B2 (en) 2013-03-14 2014-10-30 AVITA Medical Americas, LLC Systems and methods for tissue processing and preparation of cell suspension therefrom
WO2016085304A1 (ko) * 2014-11-28 2016-06-02 (주)아모레퍼시픽 멜라닌 세포주 계대배양계 및 이를 이용한 노화 수준 판단, 미용 정보 제공, 또는 스크리닝 방법
GB2547605A (en) * 2015-01-26 2017-08-23 Halliburton Energy Services Inc Rotating superhard cutting element
CN105238739A (zh) * 2015-11-11 2016-01-13 朱宁文 临床治疗级细胞治疗用黑色素细胞(melanocytes)规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法
CN106520674A (zh) * 2016-12-24 2017-03-22 严志海 一种用于表皮黑素细胞体外培养的无血清培养基
CN107115219A (zh) * 2017-05-12 2017-09-01 青岛赛欧凯普图乐生物医药有限公司 一种纤维芽母细胞活化液面膜配方
CN114058565A (zh) * 2020-07-31 2022-02-18 上海尚瑞生物医药科技有限公司 一种无血清的黑素母细胞培养液及其培养方法
KR102583179B1 (ko) * 2020-11-27 2023-09-26 (주)엑셀세라퓨틱스 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포 수립 또는 배양용 배지 조성물

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4940666A (en) * 1983-07-15 1990-07-10 University Patents, Inc. Process and defined medium for growth of human epidermal keratinocyte cells
US4885238A (en) 1987-10-30 1989-12-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Immortalized human bronchial epitherial mesothelial cell lines
US5292655A (en) * 1990-01-29 1994-03-08 Wille Jr John J Method for the formation of a histologically-complete skin substitute
US5376542A (en) 1992-04-27 1994-12-27 Georgetown University Method for producing immortalized cell lines using human papilluma virus genes
AU2385795A (en) * 1994-04-12 1995-10-30 Alza Corporation Screening methods for integumental inflammation modulating agents
DE19617261A1 (de) * 1995-04-21 1996-11-28 Naeher Helmut Dr Med Priv Doz Hautverträglichkeitstest
PT780469E (pt) * 1995-12-21 2001-06-29 Nestle Sa Linhas imortalizadas de celulas derivadas de tecidos cutaneos humanos normais e meios de cultura sem soro adaptados a sua cultura

Also Published As

Publication number Publication date
NZ325814A (en) 2000-10-27
AU730222B2 (en) 2001-03-01
EP0780469A1 (fr) 1997-06-25
US6949381B2 (en) 2005-09-27
CZ297289B6 (cs) 2006-10-11
ES2155166T3 (es) 2001-05-01
HUP9903742A2 (hu) 2000-03-28
DK0780469T3 (da) 2001-03-26
US20020042129A1 (en) 2002-04-11
DE69611894T2 (de) 2001-09-13
KR100455006B1 (ko) 2005-01-13
NO326190B1 (no) 2008-10-13
SK83598A3 (en) 1999-01-11
SK283314B6 (sk) 2003-05-02
EP0877797A1 (en) 1998-11-18
WO1997023602A1 (en) 1997-07-03
US6423540B2 (en) 2002-07-23
CA2234118C (en) 2009-04-07
GR3035719T3 (en) 2001-07-31
JP2000506374A (ja) 2000-05-30
BR9612256B1 (pt) 2010-08-10
CN1154717C (zh) 2004-06-23
HUP9903742A3 (en) 2000-10-30
BR9612256A (pt) 1999-07-13
DE69611894D1 (de) 2001-04-05
CN1205737A (zh) 1999-01-20
HU226195B1 (hu) 2008-06-30
PL327320A1 (en) 1998-12-07
RU2215030C2 (ru) 2003-10-27
CZ194598A3 (cs) 1998-11-11
JP4404965B2 (ja) 2010-01-27
NO982810L (no) 1998-08-21
US20020012993A1 (en) 2002-01-31
CA2234118A1 (en) 1997-07-03
EP0780469B1 (fr) 2001-02-28
AU1305497A (en) 1997-07-17
IL124191A (en) 2004-06-01
PT780469E (pt) 2001-06-29
KR19990071817A (ko) 1999-09-27
ATE199390T1 (de) 2001-03-15
NO982810D0 (no) 1998-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL195108B1 (pl) Unieśmiertelnione linie komórkowe skóry ludzkiej,keratynocytów albo melanocytów, ulepszony sposób unieśmiertelniania komórek skóry ludzkiej, nowe bezsurowicze pożywki, zastosowanie unieśmiertelnionych keratynocytów i/lub melanocytów oraz pierwotnych melanocytów albo keratynocytów oraz ulepszony sposób przeszczepiania skóry
JP2000506374A5 (pl)
US5324656A (en) Media for normal human muscle satellite cells
AU621972B2 (en) Cell culture medium for human liver epithelial cell line
Darmon et al. Neural differentiation following culture of embryonal carcinoma cells in a serum-free defined medium
KR20060076781A (ko) 세포 배양 배지
AU756151B2 (en) Immortalised cell lines derived from normal human skin tissues
US20050019310A1 (en) Method for culturing and expansion of mammalian undifferentiated epidermal kerainocytes exhibiting stem cell characteristics
Agy et al. Protein-free medium for C-1300 mouse neuroblastoma cells
MXPA00009558A (en) Immortalised cell lines derived from normal human skin tissues