CN114058565A - 一种无血清的黑素母细胞培养液及其培养方法 - Google Patents

一种无血清的黑素母细胞培养液及其培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种无血清的黑素母细胞培养液及其培养方法，培养液成分包括氨基酸、维生素、无机盐、添加剂和其他成分，所述培养液成分确切，可标准化配制，用于体外扩增高纯的人黑素母细胞，得到的黑素母细胞有正常细胞功能，能够继续分化成熟为黑素细胞，所述培养液仅适合黑素母细胞扩增，特异性扩增黑素母细胞，使得原代的黑素细胞占比减少，黑素母细胞占比增加。培养方法包括以下步骤：1裂解组织样本；2制备细胞悬液；3收集细胞悬液；4细胞传代。与现有技术相比，本发明的黑素母细胞培养液不使用胎牛血清，避免可能的病毒或支原体污染，同时避免不同批次血清造成的差异，提供一种简单、高效、经济的黑素母细胞培养方法。

Description

一种无血清的黑素母细胞培养液及其培养方法
技术领域
本发明涉及人原代细胞的体外培养领域，尤其是涉及一种无血清的黑素母细胞培养液及其培养方法。
背景技术
黑素母细胞(Melanoblast)是黑素细胞(Melanocyte)的前体细胞。黑素细胞是存在于人皮肤基底层、毛囊以及汗腺中的色素细胞，帮助产生黑色素，并将黑色素传递给周围的角质形成细胞，帮助抵御紫外线和各种光辐射对人皮肤的伤害。黑素母细胞具有继续增殖和分化为成熟黑素细胞的潜力。人表皮黑素功能的损害会导致白癜风等色素缺失性皮肤病；其功能的异常增强会导致黄褐斑等色素增加性皮肤病；其增殖的异常激活会导致恶性皮肤黑素瘤等疾病。黑素细胞异常导致的色素异常性皮肤病会严重影响患者的容貌，而恶性黑素瘤是高致死性的恶性肿瘤，会严重影响患者的生活质量。
近年来的研究发现，不论是白癜风等色素减少性皮肤病，或黄褐斑等色素增加性皮肤病，抑或是恶性黑素瘤等高致死性肿瘤，其发病机制都与黑素母细胞功能的异常有着密切的关系。黑素母细胞细胞性质和功能的变化可能是解决上述问题的关键。然而，现有的黑素细胞培养技术并不能保证黑素母细胞的高特异性增殖，在细胞培养的过程中黑素母细胞会不可避免的转化为成熟的黑素细胞。目前获得高纯度黑素母细胞的方法是通过复杂的细胞分化，并且纯化后的黑素母细胞在培养过程中也会逐渐转变为成熟黑素细胞而导致纯度降低。此外，常用的商品化培养液都不可避免的使用了胎牛血清或牛下丘脑提取物等难以进行质控的成分。
发明内容
本发明的目的就是为了克服现有技术中难以体外培养扩增高纯黑素母细胞，培养液成分质量不可控的问题，提供一种无血清的黑素母细胞培养液及其培养方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明首先提供一种无血清的黑素母细胞培养液，培养液成分包括20种氨基酸、11种维生素、12种无机盐和12种其他成分。
Figure BDA0002612782250000021
Figure BDA0002612782250000031
Figure BDA0002612782250000041
其中，无血清的黑素母细胞培养液中的其他成分中还可以添加0.1-0.5mg/L的酚红。
在本发明的一个实施方式中，氨基酸、维生素、无机盐、其他成分都需要在配制培养液的时候一起加入。
在本发明的一个实施方式中，无血清的黑素母细胞培养液在使用前还需要加入添加剂，所述添加剂的种类与添加浓度如下：
Figure BDA0002612782250000042
需要说明的是：添加剂是在培养液使用前加入，加入后2周内使用完毕。除添加剂以外，别的成分在配制培养液的时候一起加入。
本发明所述培养液能够体外特异性大量扩增原代或干细胞分化的人黑素母细胞，得到高纯的黑素母细胞。
本发明所述培养液成分确切，可标准化配制获得。
本发明所述培养液仅适合黑素母细胞扩增，可以筛选掉黑素细胞，将多次传代的原代黑素细胞培养液更换为本发明所述培养液，能够特异性扩增黑素母细胞，使得原代的黑素细胞占比减少，黑素母细胞占比增加。
利用本发明所述培养液扩增得到的黑素母细胞具有正常的细胞功能，在更换其他黑素细胞培养液后能够继续分化和成熟为黑素细胞。
本发明所述培养液中7种添加剂和其余成分分开配制，先配制好其余成分培养液后，放置于4℃保存，添加剂在使用前加入，添加剂添加前放置于-20℃保存。
添加剂加入后，即为无血清的黑素母细胞培养液配制完成，配制好的培养液放置于4℃保存，并在两周内使用。
本发明所述培养液成分使用双蒸水配制。
本发明还提供基于上述培养液用于培养黑素母细胞的方法，包括以下步骤：
1)裂解组织样本：将适量的当天新鲜获取的人全层组织样本或者包皮样本尽量修剪真皮层组织后放入1U/mL的Dispase II消化液中，放置在4℃的冰箱中过夜。
2)制备细胞悬液：第二天，将皮肤组织样本或包皮样本从Dispase II溶液中取出，放置到10cm的培养皿中。随后，用灭菌的眼科镊将上皮层组织轻松分离后，再用灭菌的眼科剪将上皮层组织剪碎。接着，将收集的上皮层组织聚集后加入适量的TrypLE溶液，并将培养皿盖好后放置到37℃中孵化15min。
3)收集细胞悬液：孵化结束后，使用注射器的末端配合70微米孔径的无菌滤网收集裂解后得到的细胞悬液，并使用无菌的DPBS缓冲液冲洗数次。
4)细胞传代：将收集到的细胞悬液转移到15ml或50mL的无菌离心管中，室温在250xg离心5min，离心结束后弃掉上清液，并加入5mL黑素母细胞培养液，用移液枪多次吹打以后将细胞悬液转移到培养皿中放入37℃5％CO2的培养箱中培养，隔天换液一次。
在本发明的一个实施例中，培养全过程的操作均在超净工作台中进行，所用试剂和工具均需灭菌处理。
本发明所述培养方法能够在体外从人皮肤组织样本中特异性扩增得到高纯的黑素母细胞，且黑素母细胞功能正常，能够分化成熟为黑素细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的黑素母细胞培养液能够特异性的扩增原代或由干细胞分化得到的人黑素母细胞，同时不会出现成熟的黑素细胞，有利于体外大量扩增黑素母细胞。
2、本发明的黑素母细胞培养液不需要使用胎牛血清，避免了血清可能存在的病毒或支原体污染，同时避免了不同批次血清造成的差异。
3、本发明的黑素母细胞培养液成分确切，黑素母细胞培养细胞状态良好，更换培养液后能够正常分化和成熟为黑素细胞，具有良好的应用前景。
4、本发明提供的黑素母细胞培养液仅适合黑素母细胞生存，通过使用本培养液能够简单筛选出黑素细胞中的黑素母细胞。
5、本发明提供了一种简单、高效、经济的黑素母细胞培养方法。
附图说明
图1：倒置显微镜40倍下原代黑素母细胞培养情况图。
图2：在本发明的培养液培养下黑素母细胞的细胞免疫荧光结果。其中MITF、DCT、CD117标记黑素母细胞，TYRP1、TYR标记成熟黑素细胞。Merge代表合并的细胞图，Hoest33342代表蓝色荧光染料染色后的细胞。
图3：在本发明的培养液培养下的黑素母细胞的细胞增值曲线对比在商业培养液培养下黑素细胞的增值曲线。其中Melnaocyte代表人原代黑素细胞；Melnaoblast代表黑素母细胞。
图4：在本发明的培养液培养下的黑素母细胞的黑素产量曲线对比在商业培养液培养下黑素细胞的黑素产量曲线。其中Melnaocyte代表人原代黑素细胞；Melnaoblast代表黑素母细胞。
图5：在本发明的培养液培养下扩增得到的黑素母细胞在更换其他黑素细胞培养液后的细胞形态图。
图6：原代黑素细胞通过本发明的培养液培养前后黑素母细胞和成熟黑素细胞的比例的细胞流式检测图。其中纵轴APC标记CD45，横轴PE标记CD117，Q3象限为黑素母细胞。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种黑素母细胞培养液的配制方法：
黑素母细胞培养液主要成分包括氨基酸、维生素、无机盐、细胞因子、牛血清蛋白等。具体成分如下表1所示，培养液使用双蒸水进行配制，其中添加剂成分在培养液使用前加入。配制好的培养液4℃保存，并建议在两周内使用。如果暂时不需要使用培养液，将添加剂放置于-20℃保存，其他组分放置于4℃保存。
表1黑素母细胞培养液成分
Figure BDA0002612782250000061
Figure BDA0002612782250000071
Figure BDA0002612782250000081
Figure BDA0002612782250000091
实施例2
提供基于实施例1所述培养液，培养黑素母细胞的方法，包括以下步骤：
1)组织裂解：将适量的当天新鲜获取的人全层组织样本或者包皮样本尽量修剪真皮层组织后放入1U/mL的分散酶(Dispase II)消化液中，放置于4℃的冰箱中过夜。
2)细胞悬液制备：转天，将皮肤组织样本或包皮样本从Dispase II溶液中取出，放置到10cm的培养皿中。随后，用灭菌的眼科镊将上皮层组织轻松分离后，再用灭菌的眼科剪将上皮层组织剪碎。接着，将收集的上皮层组织聚集后加入适量的胰蛋白酶(TrypLE)溶液，并将培养皿盖好后放置到37℃中孵化15min。
3)孵化结束后，使用注射器的末端配合70微米孔径的无菌滤网收集裂解后得到的细胞悬液，并使用无菌的DPBS缓冲液冲洗数次。
4)将收集到的细胞悬液转移到15ml或50mL的无菌离心管中，室温在250xg离心5min。
5)细胞传代：离心结束后弃掉上清液，并加入5mL黑素母细胞培养液，用移液枪多次吹打以后将细胞悬液转移到培养皿中放入37℃5％CO2的培养箱中培养，隔天换液一次。
本实施例全过程在超净工作台中完成。
按照上述细胞培养方法，配合实施例1所述的黑素母细胞培养液，从人皮肤组织样本中获取大量的黑素母细胞，细胞培养结果见图1所示，倒置显微镜40倍下下原代黑素母细胞的随培养时间推移，细胞数量明显增加。结果证实，该黑素母细胞培养液能够在体外细胞培养中保证黑素母细胞的高特异性增殖，尤其适用于人类黑素母细胞的原代培养。通过使用本培养液培养黑素细胞，可以简单快速的得到高纯度的黑素母细胞。
实施例3
本实施例考察黑素母细胞在实施例2的方法，结合实施例1培养液培养下细胞免疫荧光的结果。用MITF、DCT、CD117标记黑素母细胞，用TYRP1、TYR标记成熟黑素细胞，如图2所示，黑素母细胞在实施例1所述的黑素母细胞培养液培养下细胞免疫荧光的结果显示：本培养液培养出的黑素母细胞高表达DCT、CD117、MITF，而几乎不表达TYR、TYRP1。Merge是合并以后的细胞图，Hoest 33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对于细胞的毒性较小。
实施例4
本实施例通过细胞增殖曲线和黑素分泌曲线对比了在实施例1所述的黑素母细胞培养液培养的黑素母细胞和在商业化培养液中培养的黑素细胞的增殖情况和黑素生产情况。
如图3所示，Melnaocyte代表人原代黑素细胞；Melnaoblast代表黑素母细胞。
在实施例1所述的黑素母细胞培养液中培养的黑素母细胞的细胞增殖慢于在商业化培养液中培养的黑素细胞的细胞增殖。
如图4所示，Melnaocyte代表人原代黑素细胞；Melnaoblast代表黑素母细胞。
在实施例1所述的黑素母细胞培养液中培养的黑素母细胞的黑素产量低于在商业化培养液中培养的黑素细胞的黑素产量。
实施例5
利用实施例1所述的培养液培养的黑素母细胞具有正常的细胞功能，在更换其他黑素培养液后依然能够正常的分化成熟为黑素细胞。结果如图5所示。黑素母细胞在更换其他黑素细胞培养液后能够继续分化成熟。
从黑素细胞中纯化黑素母细胞：
通过将多次传代后的原代黑素细胞的培养液更换为实施例1所述的黑素母细胞培养液，能够特异性的扩增其中的黑素母细胞。如图6所示，细胞流式检测对比原代黑素细胞通过实施例1所述的黑素母细胞培养液培养前后黑素母细胞和成熟黑素细胞的比例，纵轴APC标记CD45，横轴PE标记CD117，Q3象限为黑素母细胞。原代的黑素细胞中黑素母细胞数量约占21.1％，更换为实施例1所述的黑素母细胞培养液培养1周后，黑素母细胞数量占比增加到68.8％。
实施例6
一种黑素母细胞培养液的配制方法：
黑素母细胞培养液主要成分包括氨基酸、维生素、无机盐、细胞因子、牛血清蛋白等。具体成分如下表2所示，培养液使用双蒸水进行配制，其中添加剂成分在培养液使用前加入。配制好的培养液4℃保存，并建议在两周内使用。如果暂时不需要使用培养液，将添加剂放置于-20℃保存，其他组分放置于4℃保存。
表2黑素母细胞培养液成分
Figure BDA0002612782250000111
Figure BDA0002612782250000121
Figure BDA0002612782250000131
基于所述培养液，培养黑素母细胞的方法，包括以下步骤：
1)组织裂解：将适量的当天新鲜获取的人全层组织样本或者包皮样本尽量修剪真皮层组织后放入1U/mL的分散酶(Dispase II)消化液中，放置于4℃的冰箱中过夜。
2)细胞悬液制备：转天，将皮肤组织样本或包皮样本从Dispase II溶液中取出，放置到10cm的培养皿中。随后，用灭菌的眼科镊将上皮层组织轻松分离后，再用灭菌的眼科剪将上皮层组织剪碎。接着，将收集的上皮层组织聚集后加入适量的胰蛋白酶(TrypLE)溶液，并将培养皿盖好后放置到37℃中孵化15min。
3)孵化结束后，使用注射器的末端配合70微米孔径的无菌滤网收集裂解后得到的细胞悬液，并使用无菌的DPBS缓冲液冲洗数次。
4)将收集到的细胞悬液转移到15ml或50mL的无菌离心管中，室温在250xg离心5min。
5)细胞传代：离心结束后弃掉上清液，并加入5mL黑素母细胞培养液，用移液枪多次吹打以后将细胞悬液转移到培养皿中放入37℃5％CO2的培养箱中培养，隔天换液一次。
本实施例全过程在超净工作台中完成。
按照上述细胞培养方法，可以确定，该黑素母细胞培养液能够在体外细胞培养中保证黑素母细胞的高特异性增殖，尤其适用于人类黑素母细胞的原代培养。通过使用本培养液培养黑素细胞，可以简单快速的得到高纯度的黑素母细胞。
实施例7
一种黑素母细胞培养液的配制方法：
黑素母细胞培养液主要成分包括氨基酸、维生素、无机盐、细胞因子、牛血清蛋白等。具体成分如下表3所示，培养液使用双蒸水进行配制，其中添加剂成分在培养液使用前加入。配制好的培养液4℃保存，并建议在两周内使用。如果暂时不需要使用培养液，将添加剂放置于-20℃保存，其他组分放置于4℃保存。
表3黑素母细胞培养液成分
Figure BDA0002612782250000141
Figure BDA0002612782250000151
Figure BDA0002612782250000161
基于所述培养液，培养黑素母细胞的方法，包括以下步骤：
1)组织裂解：将适量的当天新鲜获取的人全层组织样本或者包皮样本尽量修剪真皮层组织后放入1U/mL的分散酶(Dispase II)消化液中，放置于4℃的冰箱中过夜。
2)细胞悬液制备：转天，将皮肤组织样本或包皮样本从Dispase II溶液中取出，放置到10cm的培养皿中。随后，用灭菌的眼科镊将上皮层组织轻松分离后，再用灭菌的眼科剪将上皮层组织剪碎。接着，将收集的上皮层组织聚集后加入适量的胰蛋白酶(TrypLE)溶液，并将培养皿盖好后放置到37℃中孵化15min。
3)孵化结束后，使用注射器的末端配合70微米孔径的无菌滤网收集裂解后得到的细胞悬液，并使用无菌的DPBS缓冲液冲洗数次。
4)将收集到的细胞悬液转移到15ml或50mL的无菌离心管中，室温在250xg离心5min。
5)细胞传代：离心结束后弃掉上清液，并加入5mL黑素母细胞培养液，用移液枪多次吹打以后将细胞悬液转移到培养皿中放入37℃5％CO2的培养箱中培养，隔天换液一次。
本实施例全过程在超净工作台中完成。
按照上述细胞培养方法，可以确定，该黑素母细胞培养液能够在体外细胞培养中保证黑素母细胞的高特异性增殖，尤其适用于人类黑素母细胞的原代培养。通过使用本培养液培养黑素细胞，可以简单快速的得到高纯度的黑素母细胞。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种无血清的黑素母细胞培养液，其特征在于，培养液成分包括20种氨基酸、11种维生素、12种无机盐和12种其他成分，具体成分如下：
Figure FDA0002612782240000011
Figure FDA0002612782240000021
Figure FDA0002612782240000031
2.根据权利要求1所述的一种无血清的黑素母细胞培养液，其特征在于，无血清的黑素母细胞培养液中的其他成分中还添加0.1-0.5mg/L的酚红。
3.根据权利要求1所述的一种无血清的黑素母细胞培养液，其特征在于，无血清的黑素母细胞培养液还包括添加剂，所述添加剂的种类与添加浓度如下：
Figure FDA0002612782240000032
4.根据权利要求3所述的一种无血清的黑素母细胞培养液，其特征在于，所述添加剂是在培养液使用前加入，加入后2周内为使用有效期。
5.根据权利要求3所述的一种无血清的黑素母细胞培养液，其特征在于，添加剂在无血清的黑素母细胞培养液使用前加入，添加剂配制后放置于-20℃保存。
6.根据权利要求3所述的一种无血清的黑素母细胞培养液，其特征在于，无血清的黑素母细胞培养液的20种氨基酸、11种维生素、12种无机盐和12种其他成分混合配制后，放置于4保存；
所述添加剂加入无血清的黑素母细胞培养液后，放置于4保存，2周内为使用有效期。
7.根据权利要求1或2或3所述的一种无血清的黑素母细胞培养液，其特征在于，所述培养液成分使用双蒸水配制。
8.权利要求1-3中任一项所述培养液用于培养黑素母细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)裂解组织样本：将新鲜人全层组织样本或者包皮样本修剪真皮层组织后放入分解酶消化液中，放置于4℃过夜处理；
2)制备细胞悬液：第二天，将皮肤组织样本或包皮样本取出放置于培养皿，将上皮层组织分离剪碎后收集于胰蛋白酶溶液中，放置于37℃孵化；
3)收集细胞悬液：孵化结束后，用70微米孔径的无菌滤网收集细胞悬液，并使用无菌的DPBS缓冲液冲洗数次后转移到无菌离心管中；
4)细胞传代：将细胞悬液室温250xg离心5min，弃去上清液，加入权利要求1-3中任一项所述培养液，混匀后转移到培养皿中于37℃5％CO2培养箱中培养，隔天换液一次。
9.根据权利要求8所述的一种黑素母细胞的培养方法，其特征在于，培养全过程的操作均在超净工作台中进行，所用试剂和工具均灭菌处理。
10.根据权利要求8所述的一种黑素母细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法能够在体外从人皮肤组织样本中特异性扩增得到高纯的黑素母细胞，且黑素母细胞功能正常，能够分化成熟为黑素细胞。
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