JP4404965B2

JP4404965B2 - 改良した、不死化したヒト皮膚細胞系およびその生産に有用な新規無血清培地

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Publication number: JP4404965B2
Application number: JP52332997A
Authority: JP
Inventors: バウアー，マルクス; マース，キャスリーヌ; マルノー，アルマン; プフェイフェル，アンドレア，エム．，エイ．; レニエ，マルセル
Original assignee: ソシエテデプロデユイネツスルソシエテアノニム
Priority date: 1995-12-21
Filing date: 1996-12-19
Publication date: 2010-01-27
Anticipated expiration: 2016-12-19
Also published as: CA2234118A1; AU1305497A; CN1205737A; BR9612256B1; KR19990071817A; EP0877797A1; HUP9903742A2; US6949381B2; ATE199390T1; CZ194598A3; CA2234118C; PL195108B1; BR9612256A; GR3035719T3; CZ297289B6; AU730222B2; HU226195B1; SK83598A3; KR100455006B1; WO1997023602A1

Description

【０００１】
本発明は正常なヒト皮膚組織、特にケラチノサイトおよびメラノサイトから導かれる、高次の継代後においても、分化したメラノサイトもしくはケラチノサイトに特徴的な分化タンパク質を発現する能力を保持する、改良された、連続的（不死化した）細胞系に関する。本発明はまた支持細胞の使用を要しない新規な無血清培地に関する。
【０００２】
発明の背景
ヒト皮膚組織から導かれる不死化した細胞系の生産は以前に記述されている。一般にかかる方法は、インビトロで培養したヒト皮膚細胞、例えばケラチノサイトおよびメラノサイトを、不死化を提供する剤でトランスフェクトするか形質転換することを含む。
【０００３】
不死化はインビトロで長期間、一般的には無期限に、培養することができる細胞の生産を言う。これらの細胞はまた連続細胞系とも言う。対照的に、非不死化細胞はインビトロで有限数の細胞分裂の間増殖することができるのみである。不死化細胞は、明確な特性を有する細胞を安定に潜在的に無限に供給するので、非常に望ましい。不死化細胞系および不死化ヒト皮膚細胞系を生産するための常用剤は、特に、例えば、不死化を提供するＤＮＡ配列を含有するウイルス、組換えウイルス、およびプラスミドである。
【０００４】
不死化したヒト細胞系を生産するもっとも通常の方法は恐らく不死化剤としてＳＶ４０配列およびより具体的にはＳＶ４０ラージＴ抗原ＤＮＡの使用である。例えば、スタインバーグら，Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓ．，１２３：１１７−１２５（１９８５）；１９８９年１２月５日に発行されたレッデルらの米国特許第４，８８５，２３８号明細書；１９８７年１１月１７日に発行されたメイジャーの米国特許第４，７０７，４４８号明細書；ストウナーら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５１：３６５−３７１（１９９１）；チョプラら，ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌＤｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３０Ａ：５３９−５４６（１９９４）；チョプラら，ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌＤｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２７Ａ：７６３−７６５（１９９１）；クリスチャンら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４７：６０６６−６０７３（１９８７）；リムら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１２５０−１２５２（１９８５）；およびグラブマンら，Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．ＬｉｖｅｒＰｈｙｓｉｏｌ．，２９：Ｇ１０６０−Ｇ１０７０（１９９４）は不死化したヒト細胞系を生産するために、ＳＶ４０ベクターおよびＳＶ４０ラージＴ抗原配列含有ベクターの使用を教示している。かかる配列の導入は一般にＳＶ４０ウイルスを用いて感染させまたはハイブリッドアデノウイルス−１２ＳＶ４０ハイブリッドウイルスを用いて感染、またはリン酸ストロンチウム共沈を利用する、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列およびオリ−ＳＶ４０初期領域を含有する組換えプラスミドによる細胞のトランスフェクションによって行われる（ブラッシュら，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，７：２０３１−２０３４（１９８７））。
【０００５】
不死化した細胞系、および特に不死化したヒトケラチノサイトを生産する別の既知方法は、ヒト乳頭腫ウイルスＤＮＡ配列による細胞のトランスフェクションまたは感染を包含する。例えば、１９９４年１２月２７日に発行されたシュリーゲルの米国特許第５，３７６，５４２号明細書にはＨＰＶ−１６，１８，３１，３３または３５Ｅ６およびＥ７遺伝子によるまたはＥ７遺伝子単独によるヒト上皮細胞の不死化によって非腫瘍形成性の不死化細胞系を生産することが記載されている。また、バーボサら，Ｏｎｃｏｅｎｅ，４：１５２９−１５３２（１９８９）；およびマンガーら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３（１０）：４４１７−４４２１（１９８９）はＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８Ｅ６およびＥ７遺伝子を使用して不死化したヒトケラチノサイトを生産することを教示している。
【０００６】
しかしながら、多数のグループが不死化したケラチノサイト細胞系およびインビトロアッセイにおけるそれらの使用を報告してきたにもかかわらず、従来の不死化ケラチノサイト細胞系およびメラノサイト細胞系は概してそれらの使用を不利にする１以上の性質を示してきた。例えば、従来報告された不死化ケラチノサイトは以下の性質の１以上を示してきた：（ｉ）分化マーカー、例えば正常の分化したケラチノサイトによって発現されるタンパク質の発現の減少または喪失、および（ｉｉ）組織培養における変化した増殖特性。
【０００７】
例えば、ジェッテンら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９２：２０３−２０９（１９８９）は分化するのに用いることができるベクターＮＨＥＫ−ＳＶ４０−Ｔ８−１を用いて高継代数（＞１２継代）後に得られるＳＶ４０不死化ケラチノサイトを報告している。同様に、バーナードら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４５：１７０７−１７１６（１９８５）は分化することがほとんど完全にはできないと報告されているＳＶＫ１４と称される不死化ケラチノサイト細胞系の単離を報告している。また、この細胞系は、分化したケラチノサイトによって通常発現されるタンパク質であるケラチンＫ１／１０（＞５３ｋＤ）および５０ｋＤケラチン（ケラチン１４）を発現しない。
【０００８】
さらに、スタインバーグら，Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．，１２３：１１７−１２５（１９８５）は、正常なケラチン細胞骨格に特徴的なケラチンを発現する能力を徐々に失う、ＳＶ４０で形質転換したケラチノサイトを報告している。正常なケラチン発現の喪失は約１０−１５継代後に起こる。また、ロニスら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４４：５７９７−５８０４（１９８４）は正常な分化したケラチノサイトに特徴的なタンパク質であるＫ５、Ｋ６、Ｋ１４／１５、Ｋ１６およびＫ１７ケラチンおよびインボルクリンを生産する能力を失った、ＳＶ４０ＤＮＡで不死化したケラチノサイトを教示している。さらに、モリスら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：８４９８−８５０２（１９８５）はより高い継代（＞１４継代）でクラスＩＩおよびクラスＩケラチンの非常に減少した発現を示す、ＳＶ４０で不死化したケラチノサイトを教示している。例えば、これらのケラチノサイトはＫ１３の発現をほとんど示さない（同上書）。
【０００９】
また、ブランクス−シュリーゲルら，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，９６：３３０−３３７（１９８３）は組織培養において変化した増殖特性を示す、ＳＶ４０で不死化したケラチノサイトを開示している。例えば、正常なケラチノサイトと異なって、これらの不死化細胞は増殖するのに３Ｔ３支持層（ｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒ）を必要とする。
【００１０】
従来記述された、不死化ヒトケラチノサイトおよびメラノサイトを生産するための方法は、概して、支持細胞技術（そこにおいて、通常、繊維芽細胞が「支持」細胞として機能する）および一般に血清含有培地での培養細胞を使用してきた。例えば、セックストンら，“Ｓｔａｂｌｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ：ＨＰＶｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ”，ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＭｅｔｈｏｄｓ，アイ・エム・ライヒら編，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，１７９−１８０（１９９４）；およびガーリック“ＲｅｔｒｏｖｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ，ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＭｅｔｈｏｄｓ，（アイ・エム・ライヒら編，ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，１８１−１８３（１９９４））は不死化ケラチノサイトの単離および生産においてウシ胎仔血清含有培地および支持細胞の使用を教示している。
【００１１】
不死化した上皮細胞および特にヒトケラチノサイトの単離および生産における無血清培地の使用は従来記述されてきた。例えば、バーボサら，Ｏｎｃｏｅｎｅ，４：１５２９−１５３２（１９８９）は電気穿孔またはリポフェクションによってトランスフェクトしたヒトケラチノサイトを低カルシウム無血清培地で集密となるまで初期培養することを記載している。
【００１２】
しかしながら、従来報告されてきたことにもかかわらず、改良された性質を有し、特に正常なケラチノサイトおよびメラノサイトの分化潜在能力を維持し、および高次の継代後でも分化したメラノサイトおよびケラチノサイトに特徴的な分化タンパク質を発現する、不死化したヒトケラチノサイトおよびメラノサイトに対する当業界での著しいニーズが存在する。かかる細胞は多くの使用に、特に分化した皮膚細胞を必要とするアッセイにおいて非常に有益である。さらに、一次（ｐｒｉｍａｒｙ）および不死化ケラチノサイトおよびメラノサイトを維持することができる改良された培養培地、および支持細胞の使用を要しない改良された培養方法に対する当業界でのニーズが存在する。
【００１３】
発明の目的
かかる目的に向けて、正常なヒト皮膚組織から導かれた、改良された連続（不死化した）細胞系、特に正常なヒト皮膚組織から導かれた、分化し、高次の継代後でも分化タンパク質を発現する能力を維持している、不死化したケラチノサイトおよび／またはメラノサイト細胞系を生産することが本発明の１つの目的である。より詳しくは、従来の不死化ケラチノサイト細胞系によっては発現されないかわずかしか発現されない、ケラチン類、チトクローム類、および他の分化タンパク質、例えばインボルクリン、フィラグリンおよびロリクリンを発現する能力を維持している不死化ケラチノサイトを得ることが本発明の１つの目的である。本発明のさらに別の目的は、分化したケラチノサイトおよびメラノサイトによって通常発現される酵素、特にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等のフェーズＩＩ酵素、および細胞酸化および炎症応答に関与する酵素および／またはタンパク質を発現する、不死化したケラチノサイトおよびメラノサイトを得ることである。
【００１４】
本発明の別の目的は、正常なまたは連続ケラチノサイトおよび／またはメラノサイトを組織培養によって培養し、生産し、維持するための新規な無血清培地を提供することである。これらの新規な無血清培地はまた、本発明の連続メラノサイトおよびケラチノサイトを得るために、ヒト皮膚細胞を単離し、株化し（ｅｓｔａｂｌｉｓｈ）、不死化するのに有用である。したがって、ケラチノサイトを、支持細胞なしに、培養するための、無血清培地において正常なケラチノサイトの強力な増殖増進剤であることが、驚くべきことに、見出されたエピネフリンを含有する、十分に定義された（未知のまたは不明確な補給物のない）培養培地を提供することが本発明の１つの具体的目的である。
【００１５】
本発明の別の目的は、正常な皮膚組織から導かれる連続メラノサイトおよびケラチノサイト細胞系を得るために、ヒト皮膚細胞を単離し、株化し、不死化するための新規な方法を提供することである。該方法では、無血清培地、特に本発明の無血清培地、およびフィブロネクチン、ＢＳＡおよびタイプＩコラーゲンを含有する細胞付着カクテルを「支持細胞」（例えば、繊維芽細胞）なしに、用いる。
【００１６】
本発明の別の目的は、無血清条件下に、支持細胞の使用なしに生産される一次（ｐｒｉｍａｒｙ）ケラチノサイトまたはメラノサイトを提供することである。該ケラチノサイトおよびメラノサイトは皮膚移植のためにおよびエックスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）（生体外）遺伝子治療において用いられる。
【００１７】
本発明の別の目的は、かかる新規なおよび改良した連続ケラチノサイトおよびメラノサイト細胞系を、例えば免疫学的、薬学的、光毒性学的および化学毒性学的皮膚反応アッセイのためにおよび異種遺伝子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅｓ）の発現のために、用いる方法を提供することである。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、分化する能力を維持し、正常のケラチノサイトまたはメラノサイトによって発現される分化タンパク質を、高次の継代後でも、発現する能力を維持する、正常なヒト皮膚組織から導かれる連続（不死化）細胞系、すなわち不死化ケラチノサイトおよびメラノサイトを提供する。高次の継代によって、培養における少なくとも１０継代、好ましくは少なくとも２０−３０継代、より好ましくは少なくとも５０継代、および理想的には無限数の継代が意図される。例えば、本発明によって生産される不死化ケラチノサイトは、組織培養における高次継代後でも、分化タンパク質ケラチンＫ１／１０、ケラチンＫ１４、インボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）、フィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）およびロリクリン（ｌｏｒｉｃｒｉｎ）を発現する。このことは、これらの分化タンパク質を発現しないか、わずかにしか発現しない、以前に報告された不死化ケラチノサイトと対照的である。
【００１９】
また、本発明は無血清条件下におよび支持細胞なしに生産され、分化する能力、および分化したメラノサイトおよびケラチノサイトに特徴的なタンパク質を発現する能力を維持する一次ケラチノサイトおよびメラノサイトを提供する。
主題の不死化ケラチノサイトは、正常のケラチノサイトのそれと同じでないにしても同様なチトクロームｐ４５０プロフィール（ＣＹＰ４５０）を有する。例えば、主題細胞はＣＹＰ４５０３Ａ５を発現するが、ＣＹＰ４５０３Ａ４を発現しない。また、主題の不死化ケラチノサイトは、正常の不死化していないケラチノサイトと同等程度に、フェーズＩＩ酵素、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびより具体的にはＧＳＴα、ＧＳＴμおよびＧＳＴπを発現する。
【００２０】
さらに、主題の不死化ケラチノサイトは、正常の分化ケラチノサイトと同様にまたは等しく、細胞酸化および炎症応答に関与するタンパク質および酵素、例えばスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、およびホルボールエステルでの処理後にタイプＩコラゲナーゼおよび腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）を発現する。これらの特性を有するこれらの細胞系は、免疫学的、薬理学的、炎症性、光毒性学的および化学毒性学的皮膚反応の研究のために、高度に安定な、再生し得る細胞源を提供する。
【００２１】
さらに、主題の不死化メラノサイトは内因性にメラニンが結合したタンパク質を発現する。
【００２２】
また、主題の不死化ケラチノサイト細胞系およびメラノサイト細胞系は、臓器栄養培養（ｏｒｇａｎｏｔｒｏｐｈｉｃｃｕｌｔｕｒｅ）で培養すると、角化した浅層（角質層）を有する、高度に重層化し、分極した（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）上皮を形成する。これは、従来、常法的培養条件、すなわち、血清含有培地、支持細胞技術の下でのみ達せられていた（例えば、レフナーら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８５：５３６−５７１，１９９１）。
【００２３】
さらに、主題の不死化ケラチノサイトおよびメラノサイトは正常の皮膚から、無血清条件下におよび支持細胞の使用なしに、得られる。一般に、主題の不死化ケラチノサイトおよびメラノサイトは以下の工程によって得られる：
（ｉ）ヒト皮膚組織試料を得、
（ｉｉ）該皮膚試料をインビトロ培養用に調製し、
（ｉｉｉ）該調製した皮膚試料からケラチノサイトおよび／またはメラノサイトを得、該ケラチノサイトおよび／またはメラノサイトを、細胞の付着および増殖を容易にするフィブロネクチン、タイプ１コラーゲンおよびＢＳＡを含有する被膜を施した培養プレート上の、無血清増殖培地、好ましくはＮＲ−３培地またはＮＲ−４培地（メラノサイト用）（後述）に播種し、
（ｉｖ）培養プレート上の被膜を絶えず維持しながら、培養細胞の集密的な増殖を最適にするのに必要な程度に培地を交換し、
（ｖ）同様に予め被膜を施した培養プレート上の選択培地、好ましくは無血清培地に該ケラチノサイトまたはメラノサイトを移し、
（ｖｉ）該ケラチノサイトまたはメラノサイトにレトロウイルス構築物、好ましくはシミアン（Ｓｉｍｉａｎ）ウイルス４０のラージＴ抗原（ＴＡｇ）を含有するＳＶ４０プラスミドｐＬＸＳＨＤ＋ＳＶ４０（＃３２８）、乳頭腫ウイルス１６（ＨＰＶ１６）（後述）のＥ６／Ｅ７遺伝子を含有するプラスミドｐＬＸＳＨＤ＋Ｅ６／Ｅ７等のＳＶ４０または乳頭腫ウイルス１６をベースにした構築物を感染させ、
（ｖｉｉ）得られた不死化したケラチノサイトまたはメラノサイトを、同様に予め被膜を施した培養プレート上の、不死化したケラチノサイトまたはメラノサイトを増殖させるのに適した増殖培地、好ましくはＮＲ−２培地またはＮＲ−３培地（後述）およびメラノサイト培地Ｍ２（出所エム．オルソン，Ｉｎｓｔ．ｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）に移し、
（ｖｉｉｉ）得られる増殖したケラチノサイトを、同様に予め被膜を施した培養ディスク上の、カルシウムを高度に、好ましくは１．５ｍＭ含有する分化培地、好ましくはＮＲ−２培地（後述）または改変ＭＣＤＢ１５３培地（後述）に移す（ボイスら，Ｊ．ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．，９：８３−９３，１９８５；ピトルコウら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，８６：４１０−４１７，１９８６）。
【００２４】
より具体的には、工程（ｉ）は、一般に、ヒト提供者からヒト皮膚組織試料、例えば外科や小児科から得られる試料を得ることよりなる。単一の皮膚細胞試料、すなわち自系皮膚細胞試料の不死化は、明確な（ｄｅｆｉｎｅｄ）特性、例えば特定の提供者に特徴的な特定の受容体プロフィールを示す、不死化したケラチノサイトおよびメラノサイト細胞系の生産を可能にする。
【００２５】
該皮膚試料はついで工程（ｉｉ）でインビトロ培養に適するように調製される。これは好ましくはまず皮膚試料を、例えば培養に用いるのと同じ培地を用いて洗浄することによってなされる。好ましくはこれは無血清培地である（その正確な組成は後述する）ＮＲ−２培地を用いて行われる。ＮＲ−２培地は正常のケラチノサイトおよびメラノサイトの培養に有利であることが見出された。洗浄後、皮膚試料を、好ましくは、例えば採皮刀で剃り、ついで小片に切る。
【００２６】
得られる皮膚切片を好ましくは真皮（ｄｅｒｍｉｓ）と表皮に分ける。これは物理的および／または酵素的手段によって行うことができる。例えば、トリプシニゼーション（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）によって、例えばＥＤＴＡ（例えば約０．１％）含有トリプシン溶液（例えば約０．５％）に皮膚シートを３７℃で細胞分離を行うのに十分な時間、例えば３０−６０分または４℃で一夜浮べることによって行うことができる。
真皮は（繊維芽細胞を単離するために、実施例２参照）分離され、表皮は懸濁培地に入れる。好ましくは、懸濁培地は大豆トリプシン阻害剤溶液（ＳＢＴＩ）を含有し、この培地と細胞とを、トリプシンを失活させ細胞放出を行わせるために、十分な時間、一般的には約５分接触させる。ついで組織培養培地を好ましくは無血清ＮＲ−２培地（後述）に添加しそして混合物を濾過（例えば１００ｍｍフィルター）して、目的とする細胞、すなわちケラチノサイトおよび／またはメラノサイトを得る。
【００２７】
工程（ｉｉ）で得られる一次ケラチノサイトおよび／またはメラノサイトをついで、適当な細胞濃度、好ましくは約１．２×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²で、予め被膜を施した培養プレート上の無血清培地、好ましくはＮＲ−３培地（後で詳述）中に播種する。しかしながら、この細胞濃度は広い制限内で変えることができる。培養プレートは、好ましくは、ケラチノサイトおよびメラノサイトの付着および増殖を促進することが驚くべきことに見出された組成物、具体的にはフィブロネクチン、ＢＳＡおよびコラーゲンタイプＩの溶液で連続的に被覆する。この細胞被覆組成物は以前に気管支細胞に使用するものとして記述されており（レフナーら、Ｊ．ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．，９：４３−４８（１９８５））、この文献をここに参考に加入する。
【００２８】
工程（ｉｖ）においては、培養培地を細胞増殖を最適にするのに必要とされるほど多く交換する。好ましくは、培地は約２日に１回交換する。しかしながら、これは特定の皮膚試料によって変化する。一般的には約１０−１４日後に起こるほぼ全体的な集密、例えば約９０％の集密に達したら、ケラチノサイトおよびメラノサイトを分離する。これは、メラノサイトおよび／またはケラチノサイトに悪い影響を与えることなしに、十分な細胞分離を提供するいずれの手段によって行っても良い。例えば、これは識別トリプシニゼーション（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）によって行うことができる。好ましくは、メラノサイトまたはケラチノサイトをトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で処理し、ついで選択培地に移す。ケラチノサイトの場合には、好ましくは、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（０．０２５％／０．０１％）で約５−１０分処理し、ついで工程（ｖ）で予め皮膜を施したプレート上のＮＲ−３培地中に播種する。ＮＲ−３培地がメラノサイトに対するよりもケラチノサイトの増殖を促進することを認識しておくことは重要である。メラノサイトの場合には、好ましくは、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（０．０２５％／０．０１％）で約２−４分処理し、ついで工程（ｖ）で同様に予め皮膜を施した培養プレート上のＮＲ−４培地中に播種する。ＮＲ−４培地がケラチノサイトの増殖を特異的に阻害することを認識しておくことは重要である。
【００２９】
これらの細胞はついで不死化剤で処理する。または該細胞を不死化を行うまで、例えば、液体Ｎ₂中で冷凍しておくことも可能である。感染および不死化は、好ましくは、図２ａに示す、ｐＬＸＳＨＤ＋ＳＶ４０（＃３２８）と同定され、ストックシュレイダーら（ＧｅｎｅＢａｎｋ，アクセス番号Ｍ６４７５３；ストックシュレイダーら，ＨｕｍａｎＧｅｎ．Ｔｈｅｒａｐｙ，２，３３−３９，１９９１）によって記述されたＳＶ４０構築物、または図２ｂに示すｐＬＸＳＨＤ＋Ｅ６／Ｅ７と同定されるＨＰＶ１６構築物を用いて行う。ｐＬＸＳＨＤ＋ＳＶ４０（＃３２８）は、他の配列の中で、ＳＶ４０Ｔ−Ａｇ配列、ＳＶ４０の５′および３′ＬＴＲ配列、Ｅ．ｃｏｌｉ中での複製に備えるｐＢＲ３２２配列、多重クローニング部位、ＳＶ４０ポリアデニル化配列を含有する。ｐＬＸＳＨＤ＋Ｅ６／Ｅ７構築物は、Ｔ−Ａｇの代りに、ヒト乳頭腫ウイルス１６のＥ６／Ｅ７遺伝子のＮｃｏＩ／ＣｆｏＩ断片を含有する。Ｅ６／Ｅ７−プラスミドを構築する方法はＤｕｒｓｔら（ダーストら，１９８７，Ｏｎｃｏｅｎｅ１：２５１−２５６）に基づいている。不死化後、細胞を培養中必要な程度に継代し、得られる不死化細胞をついで工程（ｖｉｉ）における増殖培地に移す。ケラチノサイトの場合には、好ましくはこの移送は継代２で行う。
【００３０】
工程（ｖｉｉｉ）においては、不死化細胞を無血清培地よりなり、好ましくはＮＲ−２、ＮＲ−３およびメラノサイト用Ｍ２−培地（後述）よりなる、不死化ケラチノサイトまたはメラノサイト用の増殖培地で増殖する（ｅｘｐａｎｄｅｄ）。不死化細胞を、再度、連続的に予め被覆処理した、前記したごとくフィブロネクチン、ＢＳＡおよびタイプＩコラーゲンを含有する被膜を有する培養プレート上で培養する。
【００３１】
不死化細胞を増殖培地で増殖させた後、工程（ｖｉｉｉ）で正常のおよび不死化したケラチノサイトの分化に供される培地に移す。好ましくは、この培地は、高濃度に、好ましくは約１．５ｍＭのカルシウムを含有するＮＰ−２またはＭＣＤＢ１５３培地を包含し、培養は前記したごとくフィブロネクチン、ＢＳＡおよびタイプＩコラーゲンの溶液で連続的に被覆した培養プレート上で行われる。
【００３２】
上記したごとく、主題の方法によって生産される不死化ケラチノサイトおよびメラノサイト細胞系が分化し、正常の、分化したケラチノサイトおよびメラノサイトに特徴的な分化タンパク質を発現する能力を、組織培養における高次の継代後でも、すなわち少なくとも１０継代後でも、維持していることが驚くべことに発見された。例えば、主題の不死化ケラチノサイトは、、ケラチン類並びに他のタンパク質、例えば高次の継代後インボルクリン、フィラグリンおよびロリクリンを、発現し、その不死化細胞系はこれまでに報告されたＳＶ４０不死化ケラチノサイトによっては発現されないかわずかしか発現されない。
【００３３】
より具体的には、本発明によって生産されるいくつかの不死化ケラチノサイト細胞系、ＤＫ２−ＮＲ、ＤＫ３−ＮＲおよびＦＫ２−ＮＲ（後記表７および８参照）は分化タンパク質であるケラチンＫ１／１０、ケラチンＫ１４、インボルクリン、フィラグリンおよびロリクリンを高次継代（＞３０継代）後でも発現する。
【００３４】
また、本発明によって生産される不死化ケラチノサイトは正常のヒトケラチノサイトと同じでないにしても同様なＣＹＰ４５０プロフィールを有している。例えば、主題の不死化ケラチノサイトは、正常のケラチノサイトのチトクローム４５０プロフィールと同様に、ＣＹＰ４５０１Ａ１、２Ｃ、２Ｅ１および３Ａ５を発現するが、ＣＹＰ４５０１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６および２Ｄ６を発現しない。正常のおよび不死化したヒトケラチノサイトがＣＹＰ４５０３Ａ５を発現するが、ＣＹＰ４５０３Ａ４を発現しないことを実証したのはこれが初めてであった。
【００３５】
また、主題の不死化ケラチノサイト細胞系はフェーズＩＩ酵素、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を、正常の、分化したケラチノサイトに匹敵する程度に、発現する。さらに具体的には、主題の不死化ケラチノサイト細胞系は、正常のケラチノサイトに匹敵する程度に、ＧＳＴα、ＧＳＴμおよびＧＳＴπを発現する。
【００３６】
さらに、主題の不死化ケラチノサイトは細胞酸化および炎症応答に関与する酵素および他のタンパク質を、正常のケラチノサイトに匹敵する程度に、発現する。例えば、本発明によって生産される不死化ケラチノサイトはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を発現する。また、本発明によって生産される不死化ケラチノサイトは、ホルボールエステルに応答して、タイプＩコラゲナーゼ（炎症の伝達物質）およびＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）を発現する。
【００３７】
主題のメラノサイトはメラニン結合タンパク質およびビメンチンを発現する能力を有する。
【００３８】
さらに、主題の不死化細胞系は、臓器栄養培養で増殖させたときに、より高い継代（＞２０継代）でも、角化した浅層（角質層）を有する、高度に重層化し分極した上皮を形成する。これは、常法による培養条件下にすなわち血清含有培地および支持層を用いる条件下に株化させた、不死化ケラチノサイト細胞系について以前に報告されたのみである。
【００３９】
主題の不死化細胞系は、培養中全体的に無血清条件下におよび支持層の使用なしに得られる。
【００４０】
さらに、後でより詳細に述べるごとく、エピネフリンが、無血清培地で使用する場合に、正常なケラチノサイトの強力な増殖因子になることが驚くべきことに発見された。具体的には、後述するＮＲ−３培地が正常のケラチノサイトの増殖を促進することが見出されたエピネフリンを含有する（図１参照）。このことは、以前は、エピネフリンはケラチノサイトの増殖を阻害すると報告されていた事実（ハルプリン，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，８１：５５３−５５７（１９８３））またはケラチノサイトの細胞増殖にほどほどの効果を与えるのみであると報告されていた事実（コイズミら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９６：２３４−２３７（１９９１））を考慮すると、実に驚くべきことである。
【００４１】
また、一次および不死化ケラチノサイトおよび／またはメラノサイトを培養するのに用いられる培養皿または培養プレートの連続的な被覆、特にフィブロネクチン、ＢＳＡおよびタイプＩコラーゲンを含有する被膜または「カクテル」での被覆によって、ケラチノサイトおよびメラノサイトの培養プレートまたは培養皿への付着が改善され、さらに加えて、細胞増殖が促進されることが驚くべきことに発見された。かかる被膜材料は、不死化ケラチノサイトおよび／またはメラノサイトへの使用については、以前には記載されていない。
【００４２】
記述したごとく、本発明はさらに具体的にはＮＲ−３培地と称する新規な無血清培地を提供する。この培地によって、無血清条件下でのおよび支持層（ｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒ）の使用なしでの、ヒト皮膚からの正常なケラチノサイトおよび／またはメラノサイトの培養および単離が可能になる。この培地により、正常なケラチノサイトの増殖が改善され、血清や支持細胞への接触なしでの正常なケラチノサイトの培養細胞（ｃｕｌｔｕｒｅｓ）の株化（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ）が可能になることが見出された。
【００４３】
ＮＲ−３培地の正確な組成を表１に示す。この培地は種々のアミノ酸類、微量要素としての無機塩類、ビタミン類、増殖因子類および他の構成分を含有する。例えば、この培地は、増殖因子類として、表皮増殖因子（ＥＧＦ組換え体）、インスリン、ヒドロコルチゾン、（ヒト）トランスフェリン、ウシ下垂体エキスおよびエピネフリンを含有する。記述したごとく、エピネフリンは組織培養において一次ケラチノサイトの増殖を促進することが驚くべきことに発見された。
【００４４】
この培地は、アミノ酸類として、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ、Ｌ−アスパラギン−Ｈ₂ Ｏ、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン−ＨＣｌ−Ｈ₂ Ｏ、Ｌ−グルタミン酸、グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン−ＨＣｌ−Ｈ₂ Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン−ＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−バリンを含有する。
【００４５】
ここに含有される無機塩類はメタバナジン酸アンモニウム、モリブデン酸アンモニウム、塩化カルシウム、硫酸銅（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化マグネシウム、塩化マンガン、硫酸ニッケル、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、塩化スズおよび硫酸亜鉛である。
【００４６】
ＮＲ−３培地に含有されるビタミン類はｄ−ビオチン、ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、シアンコカルブミン（ｃｙａｎｃｏｃａｌｂｕｍｉｎ）、葉酸、ｉ−イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキシンおよびリボフラビンである。
【００４７】
該培地はさらにアデニン、エタノールアミン、ホスホエタノールアミン、フェノールレッドＮａ、プトレシン２ＨＣｌ、チアミンＨＣｌ、チオクト酸、チミジン、グルコース、ＨＥＰＥＳおよび抗生物質類（フンジゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含有する。
【００４８】
ＮＲ−３培地の好ましい組成を表１２に記載する。しかしながら、ＮＲ−３培地に含有される代替物類（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔｓ）の濃度は広い制限内で変り得ることが予想される。より特定的には、種々の代替物類の量が、表１２に開示した濃度から±５０％〜±０．１％、より好ましくは±１０％〜±０．１％の範囲で変化し得ると予想される。さらに、記述した代替物類の１以上を削除しても良く、また他の代替物類を、それらがケラチノサイトまたはメラノサイト一次細胞培養物（ｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）および不死化細胞系の単離および株化に実質上悪影響を及ぼさない限り、添加しても良いと予想される。これは当業者が試行錯誤分析によって決定し得ることである。
【００４９】
記述したごとく、主題のＮＲ−３無血清培地の重要な代替物はエピネフリンである。エピネフリンが一次ヒトケラチノサイトに対し非常に強い増殖促進活性を有することが発見された。
【００５０】
エピネフリンがケラチノサイトの増殖を促進する理由は明確ではない。ヒトケラチノサイトがエピネフリン合成の酵素を発現し、およびまた高密度でベータ２−アドレナリン作動性受容体を発現することが報告されている（シャルロイサーら，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍｉｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８９：７２−７８（１９９２））。これらの酵素、特にフェニルエタノールアミン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびビオプテリン依存性チロシンヒドロキシラーゼはカテコールアミン生合成経路に関与している。対照的に、かかる酵素活性はメラノサイトおよび繊維芽細胞では検出されない。したがって、この酵素活性および／または受容体発現はエピネフリンのケラチノサイトの増殖を調整する能力を説明するかもしれない。
【００５１】
本発明によって、ＮＲ−３培地は、それが細胞の分化を抑制し、それによって分化する能力、および正常の分化ケラチノサイトおよびメラノサイトによって発現されるタンパク質および酵素を発現する能力を維持している細胞を豊富にするので、一次細胞培養物および細胞系の単離および株化を促進するものと仮定される。
【００５２】
より具体的には、血清含有培地でのケラチノサイトまたはメラノサイトの増殖は第一継代における分化に有利であると思われる。しかしながら、このことは、分化した細胞は良好には増殖しないので、（初期培養期間を通しては）不利である。これは、今度は、弱い分化能力しか有さない増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）皮膚細胞の成長しすぎおよび選択に帰結する。したがって、高い分化能力を保持する細胞の数は、不死化前に培地に血清を添加すると、減少する。
【００５３】
対照的に、本発明では、ケラチノサイトおよびメラノサイトを無血清培地でおよびメラノサイトおよびケラチノサイトの分化を抑制する条件下に培養する。本発明では、不死化前および不死化中の全培養期間を通して、およびさらには増殖および分化を通して、無血清培地を用いるのが好ましい。
【００５４】
記述したごとく、主題のＮＲ−３無血清培養培地はケラチノサイトの分化を抑制し、もってケラチノサイト一次細胞培養物およびそれから誘導される不死化細胞系の改良された単離を可能にする。さらに、この無血清培地は一緒に単離される繊維芽細胞の増殖を抑制、選択的に抑制する低カルシウム濃度を含有する。これによって該培地は主としてメラノサイトおよびケラチノサイトを含有する培養細胞の生産に有利な、高度に選択的な増殖培地になる。したがって、主題の無血清ＮＲ−３培地は、それがケラチノサイトの分化を抑制すると共に繊維芽細胞の増殖をも抑制するので、有利である。
【００５５】
論じたように、分離したメラノサイト、ケラチノサイトおよび繊維芽細胞を含有する単一の皮膚試料から生産される、細胞懸濁液は、主題のＮＲ−３培地で培養するのが好ましい。これは、かかる細胞を、それらの付着を容易にする組成物で連続的に被覆した培養皿上に、播種することによって行われる。好ましくは、この被膜はフィブロネクチン、ウシ血清アルブミンおよびタイプＩコラーゲンの混合物を含有する。この被膜または「カクテル」被膜は気管支細胞について以前に記載されている（レフナーら，Ｊ．Ｔｉｓｓ．Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．，９：４３−４８（１９８５））。本発明者らはこのカクテルがケラチノサイトおよびメラノサイトのプラスチック培養皿への付着をも促進することを見出した。さらに、一次および不死化ケラチノサイトを培養するのに用いる培養プレートの該連続被膜がさらに細胞増殖を改善することが分った。培養プレートの連続被膜は不死化ケラチノサイトまたはメラノサイトについて以前に記載されていない。
【００５６】
一次細胞の培養中に、それらが集密に達したか実質上達した時点で培養物を分割し、他の被覆した培養皿上で増殖させるのが好ましい。一般的には、細胞培養物を約１０〜１４日ごとに分割する。
【００５７】
一次メラノサイトおよび／またはケラチノサイトを、ＮＲ−３無血清培地中で記述した被覆培養皿を用いて、培養して目的とする細胞数に増殖させた後、それらを不死化する。好ましくは、最も良い増殖を示すメラノサイトおよびケラチノサイトを不死化する。しかしながら、別法として、増殖させた一次メラノサイトまたはケラチノサイトを、不死化に先立って、例えばアッセイ、皮膚移植または遺伝子治療において用いることができる。
【００５８】
メラノサイトおよびケラチノサイトの不死化はＳＶ４０Ｔ−抗原の発現またはヒト乳頭腫ウイルス１６（ＨＰＶ１６）のＥ６／Ｅ７遺伝子の発現に供されるベクターを用いて行うことができる。好ましくは、不死化はメラノサイトまたはケラチノサイトにＳＶ４０Ｔ−抗原またはＨＰＶ１６のＥ６／Ｅ７遺伝子の発現に供されるレトロウイルス構築物を感染させることによって行われる。細胞へのＴ−Ａｇ感染は（ウイルスはＤＭＥＭ，１０％ウシ胎仔血清中で培養するか又は分化するパッケージング細胞系から回収したことを除いて）ファイファーら，Ｍｅｔｈ．ＣｅｌｌＳｃｉ．，１７：８３−８９，１９９５のプロトコルにしたがって行う。感染中、血清含有培地を使用しても良い。しかしながら、メラノサイトおよびケラチノサイトのための無血清培地、好ましくは、例えば、ファイファーら，Ｍｅｔｈ．ＣｅｌｌＳｃｉ．，１４，８３−８９（１９９５）に記載されたＰＣ−１培地が好ましい。この文献をここに参考に加入する。もっとも好ましくは、不死化は、図２ａに示され、ファイファーらおよびストックシュレイダーら（ＧｅｎｅＢａｎｋ，アクセス番号Ｍ６４７５３）に基づくｐＬＸＳＨＤ＋ＳＶ４０（＃３２８）と称せられるレトロウイルス構築物、または図２ｂに示され、ダーストら，１９８７，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１，２５１−２５６に基づくｐＬＸＳＨＤ＋Ｅ６／Ｅ７と称せられるレトロウイルス構築物を用いて行う。
【００５９】
不死化後、不死化細胞系を、予め被膜を施した培養皿を用いる増殖培地、好ましくはＮＲ−２またはＮＲ−３またはＭ２（メラノサイト用）に移す。細胞を目的とする細胞数に増殖させた後、正常のおよび不死化ケラチノサイトを培養するのに適した分化培地に移す。好ましくは、これは、予め被膜を施した培養プレート（同じＢＳＡ、タイプＩコラーゲン、フィブロネクチン被膜）を用いるＮＲ−２または高カルシウム（１．５ｍＭ）の改変ＭＣＤＢ１５３またはＭ２（メラノサイト用）よりなる。
【００６０】
すでに述べたごとく、本発明によって生産される分化した不死化ケラチノサイトおよびメラノサイト細胞系は、これらの細胞系を、分化したヒト皮膚細胞を必要とするアッセイに使用するのに良く適したものにするような、改良された性質を示す。特に、これらの細胞系は、高次の継代後でも、正常の分化したメラノサイトおよびケラチノサイトに特徴的なタンパク質を発現することが見出された。
【００６１】
例えば、本発明によって生産された不死化ケラチノサイトをウェスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲによって分析すると、それらは正常のケラチノサイトと同じではないとしても同様なチトクロームｐ４５０（ＣＹＰ４５０）プロフィールを有している。より具体的には、本発明によって生産される不死化ケラチノサイトはＣＹＰ４５０１Ａ１、２Ｃ、２Ｅ１、３Ａ５を発現するが、ＣＹＰ４５０１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６および２Ｄ６を発現しない。このＣＹＰ４５０プロフィールは正常のケラチノサイトと首尾一貫している。かかる代謝プロフィールは不死化ケラチノサイトについては以前に記載されたことはない。実際、正常のおよび不死化したケラチノサイトがＣＹＰ４５０３Ａ５を発現するがＣＹＰ４５０３Ａ４を発現しないことを実証できたのは今回が初めてである。また、本発明によって生産された不死化ケラチノサイトは、分化マーカーに特異的な抗体を用いて分析したときに、高次の継代後でも他の分化タンパク質を発現することが見出されている。より特定的には、主題の細胞系は、高次の継代でも、すなわち１０継代実際はそれ以上の後でも、分化タンパク質Ｋ１／１０、ケラチンＫ１４、インボルクリン、フィラグリンおよびロリクリンを発現する。
【００６２】
主題の、不死化したケラチノサイトおよびメラノサイトも外因性の必須脂肪酸類（ＥＦＡ）を取り込み、正常のメラノサイトおよびケラチノサイトに高度に一致したＥＦＡの脱飽和および鎖延長を示す。
【００６３】
さらに、より詳細に後述するように、主題の不死化ケラチノサイトは、ホルボールエステルで処理するときに、ＴＮＦαおよび炎症伝達物質コラゲナーゼタイプＩを、正常のケラチノサイトに匹敵する程度に、発現する。また、主題の不死化ケラチノサイトは、正常の、分化したケラチノサイトと同様に、細胞酸化に関与する酵素であるスーパーオキシドジスムターゼを発現する。
【００６４】
また、本発明によって生産される不死化メラノサイトは、メラニン産生誘導剤（例えばテオフィリンおよびチロシン）またはメラニン産生抑制剤（コウジ酸）で処理すると、正常のメラノサイトと同様に応答する。
【００６５】
これらの性質から、主題の不死化ケラチノサイトおよびメラノサイトは免疫学的、薬理学的、光毒性学的および化学毒性学的皮膚反応の研究に非常に適している。
【００６６】
例えば、主題の不死化ケラチノサイトおよびメラノサイト細胞系および一次メラノサイトおよびケラチノサイトは分化皮膚細胞を必要とするアッセイ、例えば、再構築した皮膚のバリアー機能（角化）の研究、分化ケラチノサイトの代謝（脂肪酸代謝、抗酸化代謝）の研究、皮膚細胞への紫外線照射の影響に関する研究、潜在的皮膚刺激剤および皮膚細胞への増感剤（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ）の効果に関する研究、メラニン生産に対する化合物の効果を測定するアッセイ、脂質代謝の研究、生体異物（例えば、化粧油、推定の保護化合物、例えば光保護剤のスクリーニング）による局所治療、皮膚の炎症および刺激の研究等に用いることができる。
【００６７】
また、本発明によって生産される不死化ケラチノサイトおよびメラノサイト細胞系および一次メラノサイトおよびケラチノサイトは潜在的抗ガン治療化合物および皮膚病治療化合物をスクリーニングするのに有用である。これは一般的には該細胞系または一次細胞をかかる化合物にある時間さらし、それらがなんらかの有害な作用、例えば遺伝子毒性、ＤＮＡ付加体形成、変異誘発性、細胞ガン化または細胞毒性を誘導するかどうかを確かめることを包含する。
【００６８】
また、主題のメラノサイトおよびケラチノサイト細胞系は組換えタンパク質、例えばヒトタンパク質およびポリペプチドの発現のために、並びにＲＮＡおよびＤＮＡの生産のために適している。
【００６９】
さらに、主題の不死化細胞系はエックスビボ遺伝子治療に潜在的用途を有している。主題の細胞系は、例えば治療への適用または細胞毒性／変異誘発性の研究を目的とする、遺伝子ターゲッティングのための、および目的とする遺伝子産物を発現する、遺伝子操作した細胞を開発するための、有用な手段を提供する。さらに、主題の細胞系が正常の細胞系に非常に似ているという事実から、それらは生体感受性（ｂｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）のアッセイに非常に適している。
【００７０】
加えて、本発明によって生産される一次ケラチノサイトおよびメラノサイトは、無血清条件下に生産されるので、遺伝子療法において有用である。本質的に、これらの細胞は（ウイルス感染中および液体窒素中での貯蔵中を除いて）血清、例えばウシや他の動物の血清にさらされていないので、それらはウイルスや他の病原性剤によって潜在的に汚染される可能性がより少ない。したがって、このことはこれらの細胞が遺伝子療法中に病原性または感染性因子を伝達する危険性を最小にする。かかるエックスビボ遺伝子療法は表皮水疱症（ケラチン変異障害）、白斑（メラニン合成遺伝子を含む障害）、ガンおよび黒色腫、アレルギー性障害および炎症関連障害等の障害の治療に可能性を有している。治療措置に関連して、汚染の唯一つの可能性ある供給源はウシ下垂体エキス、ウシインスリン、ウシコラーゲン、ウシ血清アルブミンまたはヒトフィブロネクチンおよびヒトトランスフェリンである。
【００７１】
また、主題の不死化メラノサイトおよびケラチノサイト細胞系および一次メラノサイトおよびケラチノサイトはＤＮＡ変異誘発アッセイ、皮膚変異誘発物質スクリーニングアッセイ、染色体損傷剤を同定するためのアッセイ、悪性ガン化の研究、細胞生化学の研究（例えば、ＣＹＰ４５０活性化アッセイ）、化合物や組成物、例えば炎症およびアレルギー反応に関与する必須脂肪酸カクテルのスクリーニング、コラゲナーゼ活性化アッセイ（炎症に関与する）に、ＴＮＦαやインターロイキンの検出も含め、用途を有する。
【００７２】
本発明によって生産される一次ケラチノサイトまたはメラノサイトの重要な可能性ある適用は、それらの入手性および生産方法を考慮して、皮膚移植である。これらの一次ケラチノサイトおよびメラノサイトは無血清条件下に生産されるので、それらは病原体（例えばウイルス）および感染性剤によって汚染される危険性が最小である。しかも、主題のメラノサイトおよびケラチノサイトは自系宿主、すなわち大きな傷を有する患者から得られるので、これは皮膚移植の拒絶または他の不利な免疫反応の危険性を最小にするかなくし、さらにまた感染の危険性を最小にする。
【００７３】
本発明によって生産される具体的な不死化ケラチノサイト細胞系の例は、その住所がＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ１ｂＤ−３８１２４ＢｒａｎｓｃｈｗｅｉｇＧｅｒｍａｎｙであるＤＳＭ−ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｒｇａｎｉｓｍｅｎＵｎｄＺｅｌｌＫｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨに１９９５年１０月５日に寄託され、アクセス番号ＤＳＭＡＣＣ２２４０、ＤＳＭＡＣＣ２２３８およびＤＳＭＡＣＣ２２３９をそれぞれ割り当てられたＦＫ２−ＮＲ、ＤＫ２−ＮＲおよびＤＫ３−ＮＲである。本発明によって生産される具体的な不死化ヒトメラノサイト系の例は、その住所が２５ｒｕｅｄｅＤｏｃｔｅｕｒＲｏｕｘ７５７２４ＰａｒｉｓＦｒａｎｃｅであるＰａｓｔｅｕｒＩｎｓｔｉｔｕｔに１９９６年１２月１１日に寄託され、寄託番号ＣＮＣＭＩ−１７９６を割り当てられたＤＭ２−ＮＲである。これらの寄託はブダペスト条約にしたがって行われた。これらの細胞系の入手可能性についてのすべての制限は、この出願またはこの出願の優先権の利益を要求する他の出願への特許の発行によって、取消し不可能に撤回される。
【００７４】
本発明の他の特徴は、本発明の例証のために与えられ限定的に解されるべきでない、以下の具体例態様の記載の間に明らかになるであろう。
【００７５】
実施例１：株化皮膚細胞の特性の記載
ウイルス感染のために処理したすべての皮膚試料を表１に掲げる。最良の細胞増殖を示す、単離したケラチノサイトを不死化に使用した。
【表１】

【００７６】
皮膚試料ＦＫ０−ＮＲ、ＧＫ０−ＮＲ、ＤＫ０−ＮＲからヒト繊維芽細胞を単離した。真皮および表皮画分の分離後、真皮を０．２×０．２ｍｍの小片に切断し、血清を用いて６ｃｍ培養プレート上に固定した。２−４時間後にＤｕｌｂｅｃｃｏ最少必須培地（ＤＭＥＭ，１０％ＦＣＳ）を加えた。この外植片培養物を繊維芽細胞の増殖（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）が明らかになるまで培養した。集密的な繊維芽細胞培養物を分割し（ｓｐｌｉｔ）、凍結貯蔵のために増殖させた（ｅｘｐａｎｄｅｄ）。
【００７７】
実施例２
１）無血清培地中でのケラチノサイトの増殖の特性の記載
一次細胞培養物を改変ＭＣＤＢ１５３［ボイスら，Ｊ．ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．，９：８３−９３（１９８５）；およびピトルコウら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，８６：４１０−４１７，１９８６］およびＮＲ−３培地で培養した。最良の細胞増殖はＮＲ−３培地で認められた（図１）。ウシ下垂体エキス（ＢＰＥ）なしの改変ＭＣＤＢ１５３と比較して改良された細胞増殖も十分に定義されたＮＲ−３培地（ＢＰＥなしのＮＲ−３）で認められた。
【００７８】
図１はＮＲ−３およびエピネフリン補給改変ＭＣＤＢ１５３（ケラチノサイト増殖培地）における６日後の細胞増殖を示す。該改変ＭＣＤＢ１５３培地は改変ＭＣＤＢ１５３を指す。ケラチノサイトはトリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％／０．０１％）で回収し、血球計で計数した。図１に示した結果は３回の平均である。
【００７９】
２）細胞付着および細胞増殖に対する被膜の効果
培養プレートの被膜は正常のケラチノサイトの細胞付着および細胞増殖を改善することが見出された。特に、表２に示した結果は被覆された培養プレートと被覆されていない培養プレートにおけるケラチノサイトの増殖を比較している。ＮＲ−３培地を含有する３．５ｃｍプレート上に１０００００のケラチノサイトを播種した。
【表２】

【００８０】
実施例３
１）ケラチノサイトの不死化
実施例１に記載した皮膚試料から生産した、分離したメラノサイト、ケラチノサイトおよび繊維芽細胞を含有する、細胞懸濁液を主題のＮＲ−３培地で培養した。これはかかる細胞を、気管支細胞について以前に記載された「カクテル」被膜（レフナーら，Ｊ．Ｔｉｓｓ．Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．，９：４３−４８（１９８５））で連続的に被覆した培養皿上に播種することによって行う。該一次細胞培養物の培養中、それらが集密に達するか実質上達したときに、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（０．０２５％／０．０１％）で４分間処理する。この処理中、メラノサイトはケラチノサイト培養物から剥れ、したがって分離して回収される。このようにして一次メラノサイトおよびケラチノサイトはこの段階で分離される。記述した被覆した培養皿を用いるＮＲ−３無血清培地（メラノサイトに比してケラチノサイトの増殖を促進する）（ｐｒｏｍｏｔｅｓｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓｖｅｒｓｕｓｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）中で一次ケラチノサイトを培養し、目的とする細胞数に増殖したら、それらをついで不死化する。ケラチノサイトの不死化はＳＶ−４０Ｔ抗原の発現を供給するレトロウイルス構築物ｐＬＸＳＨＤ＋ＳＶ４０（＃３２８）を用いて行う（ファイファーら，Ｍｅｔｈ．ＣｅｌｌＳｃｉ．１７：８３−８９，１９９５；ただし、ウイルスはＤＭＥＭ，１０％ウシ胎仔血清中にｆｏｒｗｉｎｇしているパッケージング細胞系から回収した）。感染中、ファイファーら，Ｍｅｔｈ．ＣｅｌｌＳｃｉ．１４：８３−８９，１９９５の論文に記載されたＰＣ−１無血清培地を用いる。不死化後、不死化した細胞系を、予め被膜を施した培養皿を用いるＮＲ−２またはＮＲ−３増殖培地に移す。該細胞を目的とする細胞数に増殖させた後、細胞を、正常のおよび不死化したケラチノサイトを培養するのに適した分化培地に移す。
【００８１】
２）不死化ケラチノサイトの高次継代での細胞増殖
該不死化ケラチノサイトは改良された、高次継代での細胞増殖を示すことが実証された。これは下記表３に示される。これは、集団倍増時間（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅ）（ＰＤＴ：対数増殖期に細胞集団の倍増する時間）の推定によって実証された。方法：ケラチノサイトをトリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％／０．０１％）で回収し、血球計を用いて計数した。結果は３回の平均である。
【表３】

【００８２】
３）不死化ヒトケラチノサイト系でのＣＹＰ４５０の発現
正常のおよび不死化したケラチノサイト皮膚細胞におけるＣＹＰ４５０１Ａ１、１Ａ２、３Ａ５、２Ｅ１、２Ｂ６、２Ａ６および２Ｄ６の発現をウェスタンブロット（タンパク質発現）およびＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡ発現、表４参照）によって分析した。不死化ケラチノサイトにおいて発現されたＣＹＰ４５０は正常のケラチノサイトにおけるものと同様である。発現の速度はわずかに減少している。しかしながら、ＤＫ２−ＮＲ系はほとんど正常なＣＹＰ４５０発現速度を示す。方法：ＣＹＰ４５０に特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応）（準備中のメースら）。
【表４】

【００８３】
４）ＣＹＰ４５０誘導剤への応答
該細胞系は高次の継代後でも、非不死化細胞と同様、ＣＹＰ４５０誘導剤であるベンツ（ａ）ピレンに応答する（表５参照）。この誘導はＴ−Ａｇ不死化ケラチノサイトについては記載していない。
【表５】

【００８４】
５）細胞の分化
分化マーカーを特異的抗体を用いて分析した。使用した特異的抗体を表６に示す。最高の分化容量はＤＫ２−ＮＲおよびＤＫ１−ＮＲクローンにおいて実証できた（表７、８）。
【表６】

【表７】

【表８】

【００８５】
６）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの発現
フェーズＩＩ酵素であるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をノーザンブロットおよびウェスタンブロット技術によって分析した。すべてのケラチノサイト系はＧＳＴπについてのｍＲＮＡを強く発現するが、ＧＳＴαおよびＧＳＴμについてのｍＲＮＡを発現しない（表９：方法：ノーザンブロット）。
該細胞系におけるＧＳＴα、ＧＳＴμおよびＧＳＴπのタンパク質発現プロフィールは正常のケラチノサイトと同様であった。
【表９】

【００８６】
７）必須脂肪酸（ＥＦＡ）代謝
添加ＥＦＡのケラチノサイト中での脱飽和および延長を分析および比較するために、不死化ケラチノサイト（ＤＫ１−ＮＲ、ＦＫ２−ＮＲ）および正常ケラチノサイトをリノール酸（ＬＡ，１５μＭ）およびα−リノレン酸（ＬＮ，１５μＭ）で処理した。これらの実験においては、ＥＦＡ欠損ＮＲ−２（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ社）を使用した。集密に達した後、細胞培養物をＮＲ−２高カルシウム（１．５ｍＭ）に取り替える（ｓｈｉｆｔ）ことにより、処理した。細胞を４日間ＥＦＡ（２日後に新たなものに替えた）で処理した。
【００８７】
ＥＦＡの分析はリン脂質の抽出およびＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）による分離およびＧＬＣ（ガス液体クロマトグラフィー）による脂肪酸メチルエステルの定量によって行った。ＬＡおよびＬＮの脱飽和の形成および延長生産物の生成（ＬＡについて２０：４ｎ−６および２２：４ｎ−６）および（ＬＮについて２０：５ｎ−３、２２：５ｎ−３および２２：６ｎ−３）が実証された。この代謝プロフィールは正常ケラチノサイトで観察されるものと矛盾しなかった。
【００８８】
８）核型
すべての細胞系は大部分の染色体総計（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｃｏｕｎｔｓ）が二倍体領域に入る低二倍体であった（ただしＤＫ２−ＮＲは低四倍体領域の染色体総計も有していた）。分析した細胞系の細胞以外の細胞は培養物において検出されなかった。この結果は細胞系の純粋さと他の供給源からの細胞汚染がないことを確認するものである。
【００８９】
９）インビボでの特性の記載
不死化ケラチノサイトの腫瘍形成性をヌードマウスへの皮下注射（１〜２より少ないケラチノサイト）によって決定した。試験したケラチノサイト系ＤＫ２−ＮＲ、ＤＫ３−ＮＲ、ＦＫ２−ＮＲはヌードマウスにおいて腫瘍形成性でない（４か月のインキュベーション）。しかしながら、ＤＫ３−ＮＲは５か月のインキュベーション後１０動物中６動物で弱く腫瘍形成性であった。
【００９０】
１０）皮膚刺激剤に対する応答
皮膚刺激剤ＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＩＬ−１β（インターロイキン１β）およびＵＶ−Ｂ（紫外線Ｂ）で処理後の「ストレス遺伝子」ＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）の誘導をノーザンブロットおよび生物学的アッセイによって分析した（表１０）。ケラチノサイト系はＰＭＡおよびＵＶ−Ｂに応答し、高次継代後でもタンパク質ＴＮＦαを発現する。
【００９１】
ホルボールエステル（ＰＭＡ）での不死化ケラチノサイトの処理後、コラゲナーゼ（タイプＩ）発現の増加が観察された。
【表１０】

【００９２】
１１）臓器栄養培養
臓器栄養条件下でのヒトケラチノサイトの培養（支持細胞と共に、コラーゲンゲル上で空気にさらして増殖させたケラチノサイト）も行った。すべてのケラチノサイト系は正常ケラチノサイトと比較して高増殖性形態（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を示した。これらの研究は血清含有培養培地で行った。高増殖性細胞増殖は無血清条件（プラスチック挿入培養皿（ｐｌａｓｔｉｃｉｎｓｅｒｔｃｌｕｔｕｒｅｄｉｓｈｅｓ）上のコラーゲンゲルなしのおよび支持細胞なしの高カルシウム（１．５ｍＭ）含有ＮＲ−２）下で減少した。
【００９３】
実施例４
１）メラノサイトの不死化
実施例１に記載した皮膚試料ＤＫＯ−ＮＲから生産した、分離したメラノサイト、ケラチノサイトおよび繊維芽細胞を含有している細胞懸濁液を主題のＮＲ−３培地で培養する。これは、かかる細胞を気管支細胞について以前に記述された「カクテル」被膜（レフナーら，Ｊ．Ｔｉｓｓ．Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．，９：４３−４８（１９８５））で連続的に被覆した培養皿上に播種することによって行う。一次細胞培養物を培養中、それらが集密に達するか実質上達したときに、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％／０．０１％）で４分間処理する。この処理中、メラノサイトがケラチノサイト培養物から剥れるので、それらを別々に回収する。一次メラノサイトと一次ケラチノサイトとはかくしてこの段階で分離される。回収した一次メラノサイトをついでケラチノサイトの増殖を特異的に抑制するＮＲ−４無血清培地に播種する。一次メラノサイトを、前述の被覆処理した培養を用いるＮＲ−４無血清培地中で培養し目的とする細胞数に増殖させ、ついで不死化する。ケラチノサイトの不死化はＳＶ４０Ｔ抗原の発現を供給するレトロウイルス構築物ｐＬＸＳＨＤ＋ＳＶ４０（＃３２８）で行う（ファイファーら，Ｍｅｔｈ．ＣｅｌｌＳｃｉ．，１７：８３−８９，１９９５；ただし、ウイルスはＤＭＥＭ，１０％ウシ胎仔血清中で培養するか又は分化しているパッケージング細胞系から回収した）。感染中、ファイファーら，Ｍｅｔｈ．ＣｅｌｌＳｃｉ．，１４：８３−８９，１９９５の論文に記載されたＰＣ−１無血清培地を使用する。不死化後、不死化した細胞系をＭ２増殖分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地，Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｎｏ１４８；エム．オルソン，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデンから購入することもできる）に移す。
【００９４】
２）Ｔ−Ａｇ発現ヒトメラノサイトの特性の記載
本発明によって生産される不死化メラノサイト（特にＤＭ２−ＮＲ）のメラニン結合タンパク質の発現を正常メラノサイトと比較した。不死化細胞が、発現のレベルはより少ないけれども正常細胞と同様に、メラニン結合タンパク質、メラノーマ結合抗原（ＭＡＡ）およびＨＭＢ４５を発現することが実証された。
【００９５】
３）メラニン合成の誘導
Ｔ−Ａｇ発現メラノサイト細胞系（特に系ＤＭ２−ＮＲ）のメラニン産生を正常メラノサイトと比較した。該メラノサイトをメラニン産生誘導剤であるチロシンおよびテオフィリンおよびメラニン産生抑制剤であるコウジ酸で処理した。該メラノサイト系（特に系ＤＭ２−ＮＲ）は正常細胞に匹敵する程度にメラニン産生調整剤に応答した。メラニン産生の誘導／抑制はまた用量依存的であることが実証された。
【００９６】
実施例５
実施例１に記載したＤＫＯ−ＮＲ株を、図２ｂに示したＨＰＶ１６ベースのレトロウイルス構築物ｐＬＸＳＨＤ＋Ｅ６／Ｅ７を用いて、上述のようにして不死化した。いくつかの連続ケラチノサイト系を選択した。これらの系の分化生産物（サイトケラチン類、ＧＳＴ、ＴＮＦα、インボルクリン、フィラグリン、ロリクリン、ビメンチン）についての分析結果はＤＫ２−ＮＲおよびＤＫ３−ＮＲ系について得られるそれらと同様である。
【００９７】
実施例６
本発明の新規ＮＲ−３培地および本発明の他のいくつかの無血清培地、すなわちＮＲ−１、ＮＲ−２およびＮＲ−４を下記に比較する。
【００９８】
１）ＮＲ−１培地の培地組成（下表参照）

【００９９】
２）ＮＲ−２培地の培地組成
ウシ下垂体エキス（バイオフルイド社）３５ｍｇ／Ｌが補給され、抗生物質（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ライフテクノロジィー社）フンジゾン（０．２５ｍｇ／Ｌ）、ペニシリン（１０．０００ｕｎｉｔｓ／Ｌ）およびストレプトマイシン（１０ｍｇ／Ｌ）を含有することを除いてＮＲ−１と同じ。
【０１００】
３）ＮＲ−３の培地組成
エピネフリン（バイオフルイド社）２５０μｇ／Ｌが補給されていることを除いてＮＲ−２と同じ代替物。
【０１０１】
４）ＮＲ−４の培地組成
βＦＧＦ（３μｇ／Ｌ）（シグマ社から得られる塩基性繊維芽細胞増殖因子）およびホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（１０μｇ／Ｌ）（ＰＭＡ）（Ｃ．Ｃ．Ｒ．社）が補給されていることを除いてＮＲ−２と同じ代替物。
【０１０２】
本発明を、そのある好ましい態様についてかなり詳細に記述したが、本発明の教示の範囲内で他の態様が可能である。したがって、詳細な説明も特許請求の範囲も、ここに含まれる好ましい態様の記載によって限定されることを意図するものではなく、限定されるものと解されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は不死化していないＤＫ０−ＮＲケラチノサイトの、３つの異なる培地、すなわちＮＲ−３、エピネフリン補給改変ＭＣＤＢ１５３およびＭＣＤＢ１５３中での６日後の、増殖（細胞数で表示）を比較する。
【図２ａ】図２ａは主題のメラノサイトおよび／またはケラチノサイトを不死化するのに好ましく用いられるＳＶ４０レトロウイルス構築物ｐＬＸＳＨＤ＋ＳＶ４０（＃３２８）を示す。
【図２ｂ】図２ｂはＨＰＶ１６レトロウイルス構築物ｐＬＸＳＨＤ＋Ｅ６／Ｅ７を示す。

Claims

ヒト皮膚細胞を不死化して不死化したケラチノサイトおよびメラノサイトを得る、改良された方法であって、以下の工程、すなわち
（ｉ）ヒト皮膚組織試料をインビトロ培養用に調製し、
（ｉｉ）該調製した皮膚試料からケラチノサイトおよび／またはメラノサイトを得、該ケラチノサイトおよび／またはメラノサイトを、細胞の付着および増殖を容易にするフィブロネクチン、タイプＩコラーゲンおよびＢＳＡを含有する被膜を施した培養プレート上の、無血清増殖培地に播種し、
（ｉｉｉ）培養プレート上の被膜を絶えず維持しながら、培養細胞の集密的な増殖を最適にするのに必要な程度に培地を交換し、
（ｉｖ）同様に予め被膜を施した培養プレート上の無血清選択培地に該ケラチノサイトまたはメラノサイトを移し、
（ｖ）該ケラチノサイトまたはメラノサイトに細胞を不死化させる遺伝子を含むレトロウイルス構築物を感染させ、
（ｖｉ）得られた不死化したケラチノサイトまたはメラノサイトを、同様に予め被膜を施した培養プレート上の、不死化したケラチノサイトまたはメラノサイトを増殖させるのに適した無血清増殖培地に移し、
（ｖｉｉ）得られる増殖したケラチノサイトを、同様に予め被膜を施した培養皿上の、カルシウムを高度に含有する無血清分化培地に移す
工程を含む方法。
工程（ｉｉ）における無血清培地が、以下の成分：
アミノ酸類：
Ｌ−アラニン９．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ３１６．００００ｍｇ／Ｌ
アスパラギン・Ｈ₂ Ｏ１５．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−アスパラギン酸４．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ₂ Ｏ４２．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−グルタミン酸１４．８０００ｍｇ／Ｌ
グルタミン８７７．００００ｍｇ／Ｌ
グリシン７．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ₂ Ｏ５０．４０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−イソロイシン９８．４０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−ロイシン１３１．２０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−リシン・ＨＣｌ３６．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−メチオニン１３．４０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−フェニルアラニン１４．９０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−プロリン３４．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−セリン１２６．２０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−トレオニン２３．８０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−トリプトファン９．２０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−チロシン１３．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−バリン７０．２０００ｍｇ／Ｌ
無機塩類：
メタバナジン酸アンモニウム[NH₄VO₃] ０．０００６ｍｇ／Ｌ
モリブデン酸アンモニウム[(NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O] ０．００１０ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム[CaCl₂・2H₂O] １６．２０００ｍｇ／Ｌ
硫酸銅（II）[CuSO₄・5H₂O] ０．００２５ｍｇ／Ｌ
硫酸鉄（III）[FeSO₄・7H₂O] １．４０００ｍｇ／Ｌ
塩化マグネシウム[MgCl₂・6H₂O] １２２．００００ｍｇ／Ｌ
塩化マンガン[MnCl₂・4H₂O] ０．０００２ｍｇ／Ｌ
硫酸ニッケル[NiSO₄・6H₂O] ０．０００３ｍｇ／Ｌ
塩化カリウム[KCl] １１２．００００ｍｇ／Ｌ
酢酸ナトリウム３０１．５０００ｍｇ／Ｌ
重炭酸ナトリウム[NaHCO₃] １０８８．００００ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム[NaCl] ５２００．００００ｍｇ／Ｌ
二塩基性リン酸ナトリウム[Na₂HPO₄・7H₂O] ５３６．００００ｍｇ／Ｌ
ピルビン酸ナトリウム５５．５０００ｍｇ／Ｌ
亜セレン酸ナトリウム[Na₂SeO₃] ０．００５０ｍｇ／Ｌ
ケイ酸ナトリウム[Na₂SiO₃・9H₂O] ０．１４２０ｍｇ／Ｌ
塩化スズ[SnCl₂・2H₂O] ０．０００１ｍｇ／Ｌ
硫酸亜鉛[ZnSO₄・7H₂O] ０．５１００ｍｇ／Ｌ
ビタミン類：
ｄ−ビオチン０．０２００ｍｇ／Ｌ
ｄ−パントテン酸カルシウム０．２６００ｍｇ／Ｌ
塩化コリン２８．００００ｍｇ／Ｌ
シアノコバラミン(B12) ０．４１００ｍｇ／Ｌ
葉酸０．７９００ｍｇ／Ｌ
ｉ−イノシトール１８．００００ｍｇ／Ｌ
ニコチンアミド(B3) ０．０４００ｍｇ／Ｌ
ピリドキシン(B6・H₂O) ０．０６００ｍｇ／Ｌ
リボフラビン(B2) ０．０４００ｍｇ／Ｌ
その他の成分：
アデニン２７．３０００ｍｇ／Ｌ
ヒト組換え体表皮増殖因子(EGF) ０．００１０ｍｇ／Ｌ
エタノールアミン０．０３１０ｍｇ／Ｌ
グルコース１０８０．００００ｍｇ／Ｌ
ヘペス（ＨＥＰＥＳ）６０００．００００ｍｇ／Ｌ
ヒドロコルチゾン０．５０００ｍｇ／Ｌ
ウシインスリン５．００００ｍｇ／Ｌ
フェノールレッド１．２０００ｍｇ／Ｌ
ホスホエタノールアミン０．０７１０ｍｇ／Ｌ
プトレシン・２ＨＣｌ０．１６００ｍｇ／Ｌ
チアミン・ＨＣｌ０．３４００ｍｇ／Ｌ
チオクト酸０．２１００ｍｇ／Ｌ
チミジン０．７３００ｍｇ／Ｌ
ヒトトランスフェリン１０．００００ｍｇ／Ｌ
オスモル濃度(osmolarity) ２８０−２８５mOsm／kg
を含み、さらに
エピネフリン２５０μｇ／Ｌ
を補給した培地である、請求項１に記載の方法。
工程（ｉｖ）における培地が、以下の成分：
アミノ酸類：
Ｌ−アラニン９．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ３１６．００００ｍｇ／Ｌ
アスパラギン・Ｈ₂ Ｏ１５．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−アスパラギン酸４．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ₂ Ｏ４２．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−グルタミン酸１４．８０００ｍｇ／Ｌ
グルタミン８７７．００００ｍｇ／Ｌ
グリシン７．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ₂ Ｏ５０．４０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−イソロイシン９８．４０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−ロイシン１３１．２０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−リシン・ＨＣｌ３６．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−メチオニン１３．４０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−フェニルアラニン１４．９０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−プロリン３４．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−セリン１２６．２０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−トレオニン２３．８０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−トリプトファン９．２０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−チロシン１３．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−バリン７０．２０００ｍｇ／Ｌ
無機塩類：
メタバナジン酸アンモニウム[NH₄VO₃] ０．０００６ｍｇ／Ｌ
モリブデン酸アンモニウム[(NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O] ０．００１０ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム[CaCl₂・2H₂O] １６．２０００ｍｇ／Ｌ
硫酸銅（II）[CuSO₄・5H₂O] ０．００２５ｍｇ／Ｌ
硫酸鉄（III）[FeSO₄・7H₂O] １．４０００ｍｇ／Ｌ
塩化マグネシウム[MgCl₂・6H₂O] １２２．００００ｍｇ／Ｌ
塩化マンガン[MnCl₂・4H₂O] ０．０００２ｍｇ／Ｌ
硫酸ニッケル[NiSO₄・6H₂O] ０．０００３ｍｇ／Ｌ
塩化カリウム[KCl] １１２．００００ｍｇ／Ｌ
酢酸ナトリウム３０１．５０００ｍｇ／Ｌ
重炭酸ナトリウム[NaHCO₃] １０８８．００００ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム[NaCl] ５２００．００００ｍｇ／Ｌ
二塩基性リン酸ナトリウム[Na₂HPO₄・7H₂O] ５３６．００００ｍｇ／Ｌ
ピルビン酸ナトリウム５５．５０００ｍｇ／Ｌ
亜セレン酸ナトリウム[Na₂SeO₃] ０．００５０ｍｇ／Ｌ
ケイ酸ナトリウム[Na₂SiO₃・9H₂O] ０．１４２０ｍｇ／Ｌ
塩化スズ[SnCl₂・2H₂O] ０．０００１ｍｇ／Ｌ
硫酸亜鉛[ZnSO₄・7H₂O] ０．５１００ｍｇ／Ｌ
ビタミン類：
ｄ−ビオチン０．０２００ｍｇ／Ｌ
ｄ−パントテン酸カルシウム０．２６００ｍｇ／Ｌ
塩化コリン２８．００００ｍｇ／Ｌ
シアノコバラミン(B12) ０．４１００ｍｇ／Ｌ
葉酸０．７９００ｍｇ／Ｌ
ｉ−イノシトール１８．００００ｍｇ／Ｌ
ニコチンアミド(B3) ０．０４００ｍｇ／Ｌ
ピリドキシン(B6・H₂O) ０．０６００ｍｇ／Ｌ
リボフラビン(B2) ０．０４００ｍｇ／Ｌ
その他の成分：
アデニン２７．３０００ｍｇ／Ｌ
ヒト組換え体表皮増殖因子(EGF) ０．００１０ｍｇ／Ｌ
エタノールアミン０．０３１０ｍｇ／Ｌ
グルコース１０８０．００００ｍｇ／Ｌ
ヘペス（ＨＥＰＥＳ）６０００．００００ｍｇ／Ｌ
ヒドロコルチゾン０．５０００ｍｇ／Ｌ
ウシインスリン５．００００ｍｇ／Ｌ
フェノールレッド１．２０００ｍｇ／Ｌ
ホスホエタノールアミン０．０７１０ｍｇ／Ｌ
プトレシン・２ＨＣｌ０．１６００ｍｇ／Ｌ
チアミン・ＨＣｌ０．３４００ｍｇ／Ｌ
チオクト酸０．２１００ｍｇ／Ｌ
チミジン０．７３００ｍｇ／Ｌ
ヒトトランスフェリン１０．００００ｍｇ／Ｌ
オスモル濃度(osmolarity) ２８０−２８５mOsm／kg
を含み、さらに以下の（Ｂ）又は（Ｃ）の補給物の組合せ：

を補給した培地である、請求項１に記載の方法。
工程（ｖｉ）における増殖培地が、以下の成分：
アミノ酸類：
Ｌ−アラニン９．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ３１６．００００ｍｇ／Ｌ
アスパラギン・Ｈ₂ Ｏ１５．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−アスパラギン酸４．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ₂ Ｏ４２．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−グルタミン酸１４．８０００ｍｇ／Ｌ
グルタミン８７７．００００ｍｇ／Ｌ
グリシン７．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ₂ Ｏ５０．４０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−イソロイシン９８．４０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−ロイシン１３１．２０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−リシン・ＨＣｌ３６．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−メチオニン１３．４０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−フェニルアラニン１４．９０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−プロリン３４．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−セリン１２６．２０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−トレオニン２３．８０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−トリプトファン９．２０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−チロシン１３．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−バリン７０．２０００ｍｇ／Ｌ
無機塩類：
メタバナジン酸アンモニウム[NH₄VO₃] ０．０００６ｍｇ／Ｌ
モリブデン酸アンモニウム[(NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O] ０．００１０ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム[CaCl₂・2H₂O] １６．２０００ｍｇ／Ｌ
硫酸銅（II）[CuSO₄・5H₂O] ０．００２５ｍｇ／Ｌ
硫酸鉄（III）[FeSO₄・7H₂O] １．４０００ｍｇ／Ｌ
塩化マグネシウム[MgCl₂・6H₂O] １２２．００００ｍｇ／Ｌ
塩化マンガン[MnCl₂・4H₂O] ０．０００２ｍｇ／Ｌ
硫酸ニッケル[NiSO₄・6H₂O] ０．０００３ｍｇ／Ｌ
塩化カリウム[KCl] １１２．００００ｍｇ／Ｌ
酢酸ナトリウム３０１．５０００ｍｇ／Ｌ
重炭酸ナトリウム[NaHCO₃] １０８８．００００ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム[NaCl] ５２００．００００ｍｇ／Ｌ
二塩基性リン酸ナトリウム[Na₂HPO₄・7H₂O] ５３６．００００ｍｇ／Ｌ
ピルビン酸ナトリウム５５．５０００ｍｇ／Ｌ
亜セレン酸ナトリウム[Na₂SeO₃] ０．００５０ｍｇ／Ｌ
ケイ酸ナトリウム[Na₂SiO₃・9H₂O] ０．１４２０ｍｇ／Ｌ
塩化スズ[SnCl₂・2H₂O] ０．０００１ｍｇ／Ｌ
硫酸亜鉛[ZnSO₄・7H₂O] ０．５１００ｍｇ／Ｌ
ビタミン類：
ｄ−ビオチン０．０２００ｍｇ／Ｌ
ｄ−パントテン酸カルシウム０．２６００ｍｇ／Ｌ
塩化コリン２８．００００ｍｇ／Ｌ
シアノコバラミン(B12) ０．４１００ｍｇ／Ｌ
葉酸０．７９００ｍｇ／Ｌ
ｉ−イノシトール１８．００００ｍｇ／Ｌ
ニコチンアミド(B3) ０．０４００ｍｇ／Ｌ
ピリドキシン(B6・H₂O) ０．０６００ｍｇ／Ｌ
リボフラビン(B2) ０．０４００ｍｇ／Ｌ
その他の成分：
アデニン２７．３０００ｍｇ／Ｌ
ヒト組換え体表皮増殖因子(EGF) ０．００１０ｍｇ／Ｌ
エタノールアミン０．０３１０ｍｇ／Ｌ
グルコース１０８０．００００ｍｇ／Ｌ
ヘペス（ＨＥＰＥＳ）６０００．００００ｍｇ／Ｌ
ヒドロコルチゾン０．５０００ｍｇ／Ｌ
ウシインスリン５．００００ｍｇ／Ｌ
フェノールレッド１．２０００ｍｇ／Ｌ
ホスホエタノールアミン０．０７１０ｍｇ／Ｌ
プトレシン・２ＨＣｌ０．１６００ｍｇ／Ｌ
チアミン・ＨＣｌ０．３４００ｍｇ／Ｌ
チオクト酸０．２１００ｍｇ／Ｌ
チミジン０．７３００ｍｇ／Ｌ
ヒトトランスフェリン１０．００００ｍｇ／Ｌ
オスモル濃度(osmolarity) ２８０−２８５mOsm／kg
を含み、さらに以下の（Ａ）又は（Ｂ）の補給物の組合せ：
（Ａ）ウシ下垂体エキス３５ｍｇ／Ｌ
抗生物質：
フンジゾン０．２５ｍｇ／Ｌ
ペニシリン１０．０００単位／Ｌ
ストレプトマイシン１０ｍｇ／Ｌ；
又は、
（Ｂ）エピネフリン２５０μｇ／Ｌ
を補給した培地、又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である、請求項１に記載の方法。
工程（ｖｉｉ）における無血清培地が、以下の成分：
アミノ酸類：
Ｌ−アラニン９．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ３１６．００００ｍｇ／Ｌ
アスパラギン・Ｈ₂ Ｏ１５．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−アスパラギン酸４．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ₂ Ｏ４２．００００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−グルタミン酸１４．８０００ｍｇ／Ｌ
グルタミン８７７．００００ｍｇ／Ｌ
グリシン７．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ₂ Ｏ５０．４０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−イソロイシン９８．４０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−ロイシン１３１．２０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−リシン・ＨＣｌ３６．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−メチオニン１３．４０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−フェニルアラニン１４．９０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−プロリン３４．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−セリン１２６．２０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−トレオニン２３．８０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−トリプトファン９．２０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−チロシン１３．６０００ｍｇ／Ｌ
Ｌ−バリン７０．２０００ｍｇ／Ｌ
無機塩類：
メタバナジン酸アンモニウム[NH₄VO₃] ０．０００６ｍｇ／Ｌ
モリブデン酸アンモニウム[(NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O] ０．００１０ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム[CaCl₂・2H₂O] １６．２０００ｍｇ／Ｌ
硫酸銅（II）[CuSO₄・5H₂O] ０．００２５ｍｇ／Ｌ
硫酸鉄（III）[FeSO₄・7H₂O] １．４０００ｍｇ／Ｌ
塩化マグネシウム[MgCl₂・6H₂O] １２２．００００ｍｇ／Ｌ
塩化マンガン[MnCl₂・4H₂O] ０．０００２ｍｇ／Ｌ
硫酸ニッケル[NiSO₄・6H₂O] ０．０００３ｍｇ／Ｌ
塩化カリウム[KCl] １１２．００００ｍｇ／Ｌ
酢酸ナトリウム３０１．５０００ｍｇ／Ｌ
重炭酸ナトリウム[NaHCO₃] １０８８．００００ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム[NaCl] ５２００．００００ｍｇ／Ｌ
二塩基性リン酸ナトリウム[Na₂HPO₄・7H₂O] ５３６．００００ｍｇ／Ｌ
ピルビン酸ナトリウム５５．５０００ｍｇ／Ｌ
亜セレン酸ナトリウム[Na₂SeO₃] ０．００５０ｍｇ／Ｌ
ケイ酸ナトリウム[Na₂SiO₃・9H₂O] ０．１４２０ｍｇ／Ｌ
塩化スズ[SnCl₂・2H₂O] ０．０００１ｍｇ／Ｌ
硫酸亜鉛[ZnSO₄・7H₂O] ０．５１００ｍｇ／Ｌ
ビタミン類：
ｄ−ビオチン０．０２００ｍｇ／Ｌ
ｄ−パントテン酸カルシウム０．２６００ｍｇ／Ｌ
塩化コリン２８．００００ｍｇ／Ｌ
シアノコバラミン(B12) ０．４１００ｍｇ／Ｌ
葉酸０．７９００ｍｇ／Ｌ
ｉ−イノシトール１８．００００ｍｇ／Ｌ
ニコチンアミド(B3) ０．０４００ｍｇ／Ｌ
ピリドキシン(B6・H₂O) ０．０６００ｍｇ／Ｌ
リボフラビン(B2) ０．０４００ｍｇ／Ｌ
その他の成分：
アデニン２７．３０００ｍｇ／Ｌ
ヒト組換え体表皮増殖因子(EGF) ０．００１０ｍｇ／Ｌ
エタノールアミン０．０３１０ｍｇ／Ｌ
グルコース１０８０．００００ｍｇ／Ｌ
ヘペス（ＨＥＰＥＳ）６０００．００００ｍｇ／Ｌ
ヒドロコルチゾン０．５０００ｍｇ／Ｌ
ウシインスリン５．００００ｍｇ／Ｌ
フェノールレッド１．２０００ｍｇ／Ｌ
ホスホエタノールアミン０．０７１０ｍｇ／Ｌ
プトレシン・２ＨＣｌ０．１６００ｍｇ／Ｌ
チアミン・ＨＣｌ０．３４００ｍｇ／Ｌ
チオクト酸０．２１００ｍｇ／Ｌ
チミジン０．７３００ｍｇ／Ｌ
ヒトトランスフェリン１０．００００ｍｇ／Ｌ
オスモル濃度(osmolarity) ２８０−２８５mOsm／kg
を含み、さらに
ウシ下垂体エキス３５ｍｇ／Ｌ
抗生物質：
フンジゾン０．２５ｍｇ／Ｌ
ペニシリン１０．０００単位／Ｌ
ストレプトマイシン１０ｍｇ／Ｌ
を補給した培地、又は１．５ｍＭ以上のカルシウム含量を有するＭＣＤＢ１５３培地である、請求項１に記載の方法。
前記無血清増殖培地、前記無血清選択培地又は前記無血清分化培地の少なくとも１つが、アミノ酸類若しくはアミノ酸塩類、無機塩類、ビタミン類、アデニン、エタノールアミン、グルコース、ＨＥＰＥＳ、フェノールレッド、プトレシン２ＨＣｌ、チオクト酸、チアミンＨＣｌ、チミジン、表皮増殖因子、インスリン、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、ホスホエタノールアミン及びウシ下垂体エキスを含有する、請求項１に記載の方法。
前記培地がさらにエピネフリンを含有する、請求項６に記載の方法。
一次メラノサイトまたはケラチノサイトを用いる改良されたアッセイであって、その改良が、分化する能力及び分化したヒトケラチノサイト若しくはメラノサイトの蛋白質及び酵素を発現する能力を、高次の継代後でも保持し、かつ請求項１の方法によって得られる一次メラノサイトまたはケラチノサイトを用いることである上記アッセイ。