KR101768632B1 - 칼슘 펄스를 통한 배양상피세포층의 분리방법 - Google Patents

칼슘 펄스를 통한 배양상피세포층의 분리방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배양상피세포층의 분리방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 효소를 사용하지 않고 칼슘 펄스(pulse)법에 의해 칼슘농도를 조절하여 배양상피세포층이 자발적으로 분리되도록 유도하여 피부이식효과와 피부이식 후 생착력을 증가시켜 피부 재생효과를 극대화 시킬 수 있는 배양상피세포층의 분리방법에 관한 것이다.

Description

칼슘 펄스를 통한 배양상피세포층의 분리방법{Method of separating cultured epithelial sheet by calcium pulse}
본 발명은 배양상피세포층의 분리방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 효소를 사용하지 않고 칼슘 펄스(pulse)법에 의해 칼슘농도를 조절하여 배양상피세포층이 자발적으로 분리되도록 유도하여 피부이식 후 생착력을 증가시켜 피부 이식효과와 피부 재생효과를 극대화 시킬 수 있는 배양상피세포층의 분리방법에 관한 것이다.
피부는 신체 조직 중에서 가장 무거운 기관으로, 체중의 약 16~20%를 차지하고, 가장 밖에 존재하면서 체내를 보호하고 자외선으로부터 신체를 보호하며, 수분의 분비와 배출 및 체온을 조절하는 기능을 한다. 이러한 보호막을 상실한 화상, 외상 또는 피부질환 환자들의 2차 세균감염과 수분 손실을 막고 더 나아가 손상된 피부를 재생시키기 위해 인공피부가 꾸준히 개발되어 왔다.
인공피부는 크게 생체 혹은 합성재료를 이용한 일시피복형과 세포배양을 통한 영구생착형으로 분류된다. 세포배양을 통한 인공피부의 개발은 1975 H. Green이 각질형성세포를 영양공급세포인 NIH 3T3와의 공동배양을 통해 배양상피세포(cultured epithelial sheets)을 분리해 냄으로써 가능하게 되었고, 이를 이용한 화상 혹은 궤양 치료가 시작되었다. 배양상피세포층에는 면역반응을 일으키는 T 세포가 증식되지 않아서 자가이식은 물론 동종간 이식도 가능하며 자가 상피세포층 이식만큼의 효과가 있었음이 일부 보고 되었다. 배양상피세포층을 얻기 위해서는 이 세포층을 영양공급세포, 진피(dermis) 또는 실험용 접시로부터 분리해 내어야 하는 데, 이를 위해서 많은 경우 디스파아제(dispase)라는 효소를 사용해 왔다.
디스파아제는 세포외 기질(extracelluar matrix)인 파이브로넥틴(fibronectin), 콜라겐 IV, 그리고 콜라겐 I을 자름으로써 표피를 분리해 내게 된다. 세포외 기질은 세포들을 서로에게 혹은 세포외 구조에 고정시키는 점착제(glue)역할을 할 뿐 아니라, 중요한 생장요소들을 보유하고 있다가 방출하는 기능을 가지고 있다. 따라서 디스파아제로 이러한 세포외 기질을 분해함으로써 배양상피세포층을 강제적으로 분리하는 방법은 피부이식 후 생착력을 감소시킴과 동시에 이식 효과를 저해하는 요인으로 작용할 수 있는 문제점을 가지고 있었으며, 이러한 배양상피세포층을 동종간 이식시 생착이 되지 않고 박리되었다는 보고가 있었다.
이에 본 발명자들은 세포외 기질을 분해하지 않으며 간이하고 자발적인 방법으로 배양상피세포층의 분리를 유도할 수 있는 방법을 찾기 위해 연구를 거듭한 결과, 일시적으로 칼슘을 처리함으로써(칼슘 pulse) 세포외 기질을 분해시키지 않으면서 배양상피세포층이 자발적으로 분리될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 효소를 사용하지 않고 칼슘 펄스(pulse)법에 의해 칼슘농도를 조절하여 배양상피세포층이 자발적으로 분리되도록 유도하여 기존 분리법의 단점을 극복하고, 피부 재생효과를 극대화 시킬 수 있는 배양상피세포층의 분리방법을 제공한다.
또한 본 발명은 칼슘 펄스법에 의해 배양상피세포층이 자발적으로 분리되는 배양상피세포층 분리용 키트를 제공한다.
본 발명의 칼슘 펄스(pulse)를 통한 배양상피세포층의 분리방법은 (a) 각질형성세포를 기본배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 각질형성세포가 배양디쉬의 바닥이 보이지 않도록 배양된 시점에 상기 배양된 각질형성세포의 배지를 고농도 칼슘배지로 갈아 주어 배양하는 단계; (c) 상기 고농도 칼슘배지에서 배양된 각질형성세포의 배지를 다시 기본배지로 갈아주어 배양하는 단계; (d) 상기 배양된 각질형성세포에서 기본배지를 제거하고 완충액으로 씻어내는 단계; (e) 상기 세척된 각질형성세포를 공기 중에 노출 시키는 단계; 및 (f) 상기 각질형성세포에 다시 완충액을 넣어 주는 단계; 를 포함하여 자발적으로 배양상피세포층을 분리하는 방법을 제공한다.
상기 인간각질형성세포(Normal Human Epidermal Keratinocyte)는 Lonza 에서 제공하는 NHEK-Neo, Pooled(Neonatal Normal Human Epidermal Keratinocytes, Pooled; 제품번호 00192906), NHEK-Neo(제품번호 00192907), NHEK-Adult(제품번호 00192627)를 사용할 수 있다.
상기 기본배지는 KGM-2 BulletKit(제품번호 CC-3107; Lonza) 혹은 KGM-Gold BulletKit(제품번호 192060; Lonza)를 사용할 수 있으며, 각질형성세포가 기저막(base membrane)에 붙어서 증식하는 성질을 유지하기 위해서 디쉬는 0.1~0.2% gelatin 혹은 5~10 g/ml collagen type I으로 코팅해서 사용하는 것이 적당하다.
상기 고농도 칼슘배지는 상기 기본배지에 최종적으로 1.2 mM CaCl2를 첨가해서 사용한다. 배양상피층의 분리를 위해서는 상기 고농도의 칼슘배지가 필요하며 1.2~1.4 mM 농도가 바람직하다.
상기 각질형성세포는 기본배지로 35~37 ℃, 5~10% CO2 인큐베이터에서 배양되며, 고농도 칼슘배지에서의 배양 또한 같은 35~37 ℃, 5~10% CO2 인큐베이터에서 하는 것이 바람직하다.
상기 (b) 단계에 있어서 각질형성세포가 배양디쉬의 바닥이 보이지 않도록 배양된 시점(90~100% confluent)에 기본배지를 고농도 칼슘배지로 갈아 주어 배양한다. 본 발명에서 상기와 같이 배양된 시점에 고농도 칼슘배지로 갈아주는 것은 layer 형성 등 최적의 분화 조건을 갖추기 위해서이며, 배양디쉬의 바닥이 보이지 않은 시점에서 계속해서 더 배양하거나, 그 시점 이전에 고농도의 칼슘배지로 갈아줄 수 있다.
상기 (b)단계의 칼슘 펄스로써 고농도 칼슘배지에서의 배양은 2~6일이 바람직하다. 2일 미만으로 배양할 경우 각질형성세포의 분화가 충분히 일어나지 않으며, 배양이 6일을 초과하는 경우에는 오히려 분화를 억제하기 때문이다. 고농도 칼슘을 7일간 지속적으로 처리 후 마커들의 발현양상을 조사해 봤을 때, 미분화 마커인 p63이 급격히 증가 되어 있음을 알 수 있다(도 2). 따라서 각질형성세포의 분화를 위해서 고농도 칼슘을 계속적으로 배지에 공급하는 것은 오히려 분화를 억제하므로 바람직하지 않다.
상기 (c) 상기 고농도 칼슘배지에서 배양된 각질형성세포의 배지를 다시 기본배지로 갈아주어 배양하는 단계; 는 완충액으로 상기 배양된 각질형성세포를 씻어내어 고농도 칼슘을 제거하고 기본배지로 갈아주어 배양할 수 있으며, 완충액으로는 PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7.4; 12-well plate 기준 well 당 2 ml, 2회)를 사용할 수 있다. 또한, 상기 완충액으로 씻어내는 것 외에 일반배지로 여러 번 갈아주는 등 칼슘농도를 낮추어 다시 배양할 수 있도록 하는 공지된 다른 방법을 사용할 수도 있다.
상기 (d) 상기 배양된 각질형성세포에서 최종적으로 기본배지를 제거하고 완충액으로 씻어내는 단계; 및 (f) 상기 각질형성세포에 다시 완충액을 넣어 주는 단계; 에서의 완충액은 PBS 혹은 HBSS(Hank's Buffered Salt Solution, pH 7.4)을 사용할 수 있다.
상기 (c)단계에서 고농도 칼슘배지에서 자라던 각질형성세포를 PBS로 두 번 씻어 내고, 기본 배지로 갈아 준 후 최소 3일간 추가 배양한다. 3일간 배양 후, 새롭게 넣어 준 배지의 색깔이 세포들의 왕성한 대사결과로 인해 도 4의 비교예 3에서 보여지는 것처럼 변하면 상기 (c)단계에 3일 간격으로 최대 7일 동안 배지를 갈아주는 단계를 더 포함 시킬 수 있다. 이 기간 내 새롭게 갈아 준 배지의 색상이 도 4의 실시예 1에서 보여지는 것처럼 더 이상 변하지 않을 때가 배양상피세포층이 자발적으로 분리될 수 있는 시점이다.
상기 (d)단계에서 각질형성세포를 PBS 또는 HBSS로 두 번 씻어 낸 후, 잔여물을 없애고 뚜껑을 덮고 인큐베이터에 5~10분간 넣어둔다. 상기 세척은 배지 없이 세포층을 공기 중에 노출시키기 위함이다.
상기 (e)단계에서 5~10분간 공기중에 노출된 세포층에 (f)단계에서 다시 PBS 또는 HBSS를 넣어주면서 자발적으로 분리되는 배양상피세포층을 수득한다.
본 발명에서 분리된 배양상피세포층을 자가이식 또는 동종이식했을 때 배양상피세포층은 IL-1, IL-6와 같은 특정 cytokines을 분비하고 및 TGF-alpha, KGF와 같은 세포성장요소들의 분비를 촉진할 수 있다. 이들은 진피와 표피의 상호작용으로 피부재생을 극대화할 중요한 매개체로 작용하며, 배양상피세포층 분리 시 효소를 사용하지 않았으므로 세포외 기질이 보전되어 있으며, 이것이 이식 대상이 되는 피부에 존재하는 세포외 기질의 수용체들과 결합함으로써 이식력을 증대시킬 수 있다.
본 발명의 칼슘 펄스(Calcium pulse)법에 의하면, 배양상피세포층이 빠르게 분화될 수 있고, 인위적인 효소처리 없이 자발적으로 분리되는 효과를 나타내며, 본 발명에 의해 분리된 배양상피세포층은 화상 혹은 외상 등으로 인해 필요한 피부에 이식되었을 때 IL-1, IL-6와 같은 특정 cytokines 및 TGF-alpha, KGF와 같은 세포성장요소들을 분비할 수 있으며, 세포외 기질이 보전되어 있으며, 이것이 이식 대상이 되는 피부에 존재하는 세포외 기질의 수용체들과 결합함으로써 높은 생착력으로 피부의 이식효과 및 피부재생효과를 극대화 시킬 수 있다.
도 1은 밀도에 의한 각질형성세포의 미분화(p63) 혹은 분화(krt1, cytokeratin 1 및 loricrin) 마커들의 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 2는 기본배지에서 10일간 밀도처리한 각질형성세포(비교예 2)와 고농도 칼슘을 7일간 처리한 각질형성세포(비교예 3)에서 미분화(p63) 혹은 분화(krt1, cytokeratin 1 및 loricrin) 마커들의 발현을 나타낸 것이다.
도 3은 100% confluent 상태에서 고농도 칼슘배지로 갈아 주었을 때 4시간 후의 세포모양을 나타낸 것이다.
도 4는 고농도 칼슘을 일시적(Ca pulse, 3일) 혹은 지속적(Ca, 7일)으로 주었을 때 배지 색상을 나타낸 것이다.
도 5는 고농도 칼슘을 일시적(Ca pulse, 3일) 혹은 지속적(Ca, 7일)으로 주었을 때 세포 모양을 나타낸 것이다.
도 6은 고농도 칼슘배지에서 3일, 기본배지에서 4일(Ca pulse)을 배양 한 후 PBS 상에서 자발적으로 분리가 일어나고 있는 배양상피세포층을 나타낸 것이다.
도 7은 분리된 배양상피세포층 및 디쉬에 남아있는 세포층에서 cytokeratin 8(krt8), integrin alpha 6, p63, cytokeratin 1(krt1) 및 loricrin의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 8은 진피조직 및 진피조직에 배양상피세포층을 이식한 것을 7일간 배양한 것으로부터 얻은 배지(1차실험) 와 3일간 배양한 것으로부터 얻어진 배지(2차실험)에서 분비된 IL-6의 양을 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 하기 시험예 및 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 시험예 및 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 예로 한정되는 것은 아니다.
< 시험예 1> 각질형성세포의 준비
Lonza에서 구입한 인간각질형성세포(Neonatal Normal Human Epidermal Keratinocytes, Pooled; NHEK-Neo; 제품번호 00192906)를 0.1% gelatin으로 코팅된 12-well plate에 well 당 2 x 105 cells/ml 농도로 심고 기본배지(KGM-2 BulletKit; 제품번호 CC-3107; Lonza)에서37℃, 5% CO2 인큐베이터로 배양하였다. 약 70~80% 의 밀도가 되었을 때 계대 배양을 하였고, 이 후 진행되는 실험들에 각질형성세포들을 제공하였다.
< 시험예 2> 밀도 와 칼슘에 의한 각질형성세포의 분화비교
각질형성세포의 분화에 있어서 대표적인 두 가지 방법인 밀도처리와 고농도 칼슘처리를 이용, 각각의 효과를 자세히 비교해 보았다. 밀도만으로 분화를 유도한 것(도 1)과 고농도 칼슘을 지속적으로 넣어줌으로써 분화를 유도한 것(도 2)의 분화양상을 비교하기 위해서 각질분화 단계 중 유극층(spinous layer) 마커인 cytokeratin 1(krt1), 각질층(cornified layer) 마커인 loricrin, 및 각질간세포(keratinocyte progenitor cell) 마커인 p63의 mRNA변화를 qPCR(quantitative PCR)을 통해 조사하였다.
먼저 밀도에 의한 분화 효과를 조사하기 위해, 상기 시험예 1에서 배양된 각질형성세포를 기본 배지(KGM-2 BulletKit; 제품번호 CC-3107; Lonza) 에서 각각 6일 및 10일간 배양하였다. 각질형성세포의 특성상 고밀도에 의해서 분화가 유도되면서 시간이 흐름(6일-> 10일)에 따라 단일 층이 아닌 여러 층(layer)을 이루게 된다. 기본배지에서 6일간 배양된 각질형성세포(비교예 1) 및 10일간 배양된 각질형성세포(비교예 2)를 수득하였다.
분화에 대한 고농도 칼슘의 영향을 조사하기 위해서(도 2), 시험예 1에서 배양된 각질형성세포를 기본배지에서 3일간 배양한 후 그리고 고농도 칼슘배지(기본배지에 1.2 mM CaCl2 를 첨가한 것)로 옮겨 7일간 배양하여 각질형성세포를 수득하였다(비교예 3).
상기 비교예 1~3의 각질형성세포를 PBS로 씻어 내고 키트(miRNeasy mini kit, Qiagen, 제품번호 217004)를 이용하여 total RNA를 분리해 낸 후, RT-PCR kit(SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR, Invitrogen, 제품번호 18080-051)를 통해 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(TaqMan® Gene Expression Assays, Applied Biosystems)와 SYBR(TaqMan Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems; 제품번호, 4304437)를 이용하여 p63, cytokeratin 1(krt1) 그리고 loricrin의 mRNA 발현 변화를 측정하였다.
상기 실험결과 밀도가 증가함에 따라 각질분화 단계 중 유극층의 마커인 cytokeratin 1(krt 1)과 각질층의 마커인 loricrin이 현저히 증가되어 있음을 알 수 있다(도 1). 이에 비해, 밀도 100%에 이른 후 고농도 칼슘배지로 7일간 분화를 유도한 경우(비교예 3)는 기본배지에서 10일 키운 것(비교예 2)에 비해 각질 분화 마커 중 loricrin은 크게 차이가 없으나 cytokeratin 1 은 오히려 감소하였고, 더불어서 각질간세포(keratinocyte progenitor cell) 마커이자 미분화 마커인 p63이 급격히 증가되어 있음을 알 수 있다(도 2). 이로부터, 고농도 칼슘의 장기간, 지속적인 처리는 밀도에 의한 방법보다 오히려 분화를 억제함을 알 수 있었다.
< 실시예 1> 칼슘 펄스에 의한 배양상피세포의 분화
고농도 칼슘을 장기간 처리 시 오히려 분화를 억제함을 알 수 있었지만, 표피에서 칼슘은 각질형성세포의 증식과 분화에 중요한 역할을 함이 잘 알려져 있다. 따라서 고농도 칼슘의 처리 시간에 따른 효과의 차이를 알아보기 위해, 각질형성세포에 칼슘을 펄스(3일간)로 처리하였을 때 세포의 변화를 관찰했다.
상기 시험예 1에서 배양된 각질형성세포의 confluency가 100%에 이른 시점에, 고농도 칼슘배지 [기본배지(KGM-2 BulletKit; 제품번호 CC-3107; Lonza)에 1.2 mM CaCl2를 첨가한 것]로 갈아주고 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 3일간 배양 한 후, 다시 기본배지(KGM-2 BulletKit; 제품번호 CC-3107; Lonza)로 옮겨 4일 동안 배양하였다.
고농도의 칼슘배지로 옮긴 후, 4시간 후에 세포들은 단일 층으로 세포간 경계가 뚜렷한 모양을 보였다(도3). 이 칼슘배지에서 3일간 배양한 것을 다시 기본 배지로 갈아 준 후 4일이 지났을 때(도 4, 실시예 1) 배지의 색상은 고농도 칼슘을 7일간 지속적으로 처리해 준 디쉬(비교예 3)에 비해 덜 변했음을 알 수 있었다(도4). 또한 실시예 1은 여러 층으로 겹겹이 쌓여 있는 모습(각질화의 특성)을 보임에 비해, 비교예 3은 여전히 단일 층으로 배열이 되어있음을 알 수 있었다(도 5). 이는 동일한 기간 내, 칼슘 펄스법이 지속적인 칼슘처리 방법에 비해 각질분화를 효과적으로 혹은 빠르게 진행시켰음을 의미한다.
< 실시예 2> 칼슘 펄스를 통한 배양상피세포층의 박리
시험예 1에서 배양된 각질형성세포의 confluency가 100%에 이른 시점에, 고농도 칼슘배지[기본배지(KGM-2 BulletKit; 제품번호 CC-3107; Lonza)에 1.2 mM CaCl2를 첨가한 것]로 갈아주고, 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 3일간 배양 한 후, 고농도 칼슘을 제거하기 위해서 2 ml PBS(12-well 기준, well 당 2ml)로 두 번 씻어 냈다. 세척된 배양세포에 다시 기본배지(KGM-2 BulletKit; 제품번호 CC-3107; Lonza)를 넣고 37 ℃, 5% CO2인큐베이터에서 배양하면서 3일 간격으로 배지를 갈아주었다. 고농도 칼슘배지에서 기본배지로 옮긴 후 4일이 지났을 때 더 이상 배지의 색이 변하지 않았으므로(도4, 실시예 1), 이 때 배지를 제거하고 PBS로 두 번 세척하였다. 잔여물을 완전히 제거하고 디쉬의 뚜껑을 덮어 5-10분간 인큐베이터에 넣어 둔 후, 다시 PBS를 넣어 주었다. 이 시점에서 배양상피세포층이 시트(sheet)로서 디쉬로부터 분리되었다(도 6, 실시예 2). 그러나 고농도 칼슘배지에서 7일간 지속적으로 키운 각질형성세포는 시트(sheet)로서 전혀 분리 되지 않았다(도 6, 비교예 3).
< 시험예 3> 칼슘 펄스에 의해 분리된 배양상피세포층의 분화양상
상기 실시예 2에서 분리된 배양상피세포층(실시예 3) 및 동일 디쉬 내에 배양상피세포층이 분리되고 바닥에 남아 있는 세포들(비교예 4)로부터 키트(miRNeasy mini kit, Qiagen, 제품번호 217004)를 통해 total RNA를 분리해 낸 후, RT-PCR kit(SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR, Invitrogen, 제품번호 18080-051)를 통해 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(qMan® Gene Expression Assays, Applied Biosystems)와 SYBR(TaqMan Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems; 제품번호 4304437)를 이용하여 외배엽 마커인 cytokeratin 8(krt 8), 기저막에 존재하는 각질간세포(keratinocyte progenitor cells)가 발현하는 integrin alpha 6와 p63, 유극층(spinous layer)의 마커인 cytokeratin 1(krt 1)과 각질층(cornified layer)의 마커인 loricrin의 mRNA 발현 변화를 측정하였다.
상기 결과 실시예 3 은 비교예 4 에 비해서 미분화 마커들(krt8, alph6, p63)은 거의 발현하지 않는 반면 각질 분화 마커인 cytokeratin 1(유극층 마커, krt1)과 loricrin(각질층 마커)을 잘 발현하고 있음을 알 수 있었다 (도 7). 이를 통해서 분리된 배양상피세포층에는 표피의 상층부위를 구성하는 유극층, 과립층, 그리고 각질층이 포함되어 있음을 알 수 있었다.
< 시험예 4> 칼슘 펄스에 의해 분리된 배양상피세포층의 물질분비효과
또한 분리된 상피세포층이 생리적인 기능을 할 수 있는지 알아보기 위해 진피구조체(2 mg/ml collagen I 과 1 x 105 primary fibroblast를 섞어서 굳힌 것) 를 만들고 이에 주사 바늘로 중앙선을 그리면서 상처(scratch)를 유도했다. 상기의 진피구조체에 실시예 2에서 얻은 배양상피세포층을 덮은 것(실시예 4)과 진피조직만 있는 것(비교예 5)의 배지로부터 cytokine의 분비량을 ELISA로 확인해 보았다. 배양상피세포층으로 진피구조체를 덮고 DMEM/10% FBS 와 KGM-2 BulletKit 의 1:1 혼합배지에서 7일간 배양한 후 배지를 수득하고(1차실험), 다시 새로운 배지를 넣어주고 3일간 배양한 후 두 번째 배지를 수득하여(2차실험) 비교예 5와 비교한 결과 배양상피세포층으로 덮어 준 실시예 4에서 IL-6가 많이 분비되었음을 알 수 있었다(도 8).
IL-6는 손상된 조직 복구를 위한 acute phase response 등에 가장 중요한 물질로서, 실시예 4에서 IL-6의 분비가 정상적으로 일어나는 것을 통해 배양상피세포층의 피부재생과 관련하여 물질분비가 정상적으로 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (11)

  1. (a) 각질형성세포를 기본배지에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 각질형성세포가 배양디쉬의 바닥이 보이지 않도록 배양된 시점에 상기 배양된 각질형성세포의 배지를 고농도 칼슘배지로 갈아 주어 배양하는 단계;
    (c) 상기 고농도 칼슘배지에서 배양된 각질형성세포의 배지를 다시 기본배지로 3일 간격으로 갈아주어 배양하는 단계;
    (d) 상기 배양된 각질형성세포에서 기본배지를 제거하고 완충액으로 세척하는 단계;
    (e) 완충액을 제거한 후 상기 세척된 각질형성세포를 5~10분간 공기 중에 노출시키는 단계; 및
    (f) 상기 각질형성세포에 다시 완충액을 넣어 주는 단계;
    를 포함하며,
    상기 기본배지는 칼슘농도가 0.1~0.15 mM이고,
    상기 고농도 칼슘배지는 1.2~1.4 mM의 CaCl2를 함유하며,
    상기 (b)단계의 배양기간은 2~6일인,
    각질형성세포로 이루어진 배양상피세포층의 자발적인 분리방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 (c)단계는 상기 배양된 각질형성세포를 완충액으로 세척하여 기본배지로 갈아주는 것을 특징으로 하는 배양상피세포층의 자발적인 분리방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 완충액은 PBS(Phosphate Buffered Saline)인 것을 특징으로 하는 배양상피세포층의 자발적인 분리방법.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서, 상기 (d)단계 및 (f)단계의 완충액은 PBS(Phosphate Buffered Saline) 또는 HBSS(Hank's Buffered Salt Solution)인 것을 특징으로 하는 배양상피세포층의 자발적인 분리방법.
  8. 삭제
  9. 제 1항에 있어서, 상기 배양상피세포층은 자가이식용인 것을 특징으로 하는 배양상피세포층의 자발적인 분리방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 배양상피세포층은 동종이식용인 것을 특징으로 하는 배양상피세포층의 자발적인 분리방법.
  11. 삭제
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Scand. J. Plast. Reconstr.Surg. Hand. Surg. 2005, 39, 138-146
THe Journal of Dermatology. 1992, 19, 325-334

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