RU98113400A

RU98113400A - Улучшенные иммортализованные клеточные линии кожи человека и не содержащая сыворотки среда для их получения

Info

Publication number: RU98113400A
Application number: RU98113400/13A
Authority: RU
Inventors: Баур Маркус; Мас Катрин; Малне Арман; М.А.Пфайфер Андреа; Ренье Марсель
Original assignee: Сосьете Де Продюи Нестле С.А.
Priority date: 1995-12-21
Filing date: 1996-12-19
Publication date: 2000-10-20

Claims

1. Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов или меланоцитов человека, которая сохраняет способность дифференцировать и экспрессировать протеины и ферменты, которые экспрессируются нормальными дифференцированными кератиноцитами или меланоцитами даже после большого числа пассажей в культуре тканей.

2. Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов по п.1, отличающаяся тем, что указанная клеточная линия экспрессирует протеины кератина и другие протеины, которые экспрессируются нормальными дифференцированными кератиноцитами.

3. Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов по п.2, отличающаяся тем, что указанные протеины кератина включают кератин К1/10, кератин К14, а указанные другие протеины включают инволюкрин, филаггрин и лорикрин.

4. Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов по п.1, отличающаяся тем, что указанная клеточная линия иммортализованных кератиноцитов демонстрирует CYP450 профиль, который идентичен, или практически идентичен, профилю, характерному для нормальных дифференцированных кератиноцитов.

5. Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов по п. 4, отличающаяся тем, что указанная клеточная линия экспрессирует CYP450 1А1, 2С, 2Е1 и 3А5, но не экспрессирует CYP450 1А2, 2А6, 2В6 и 2D6.

6. Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов человека по п. 1, отличающаяся тем, что получена в условиях без сыворотки и без использования фидерных клеток.

7. Клеточная линия иммортализованных меланоцитов человека по п. 1, отличающаяся тем, что получена в условиях без сыворотки и без использования фидерных клеток.

8. SV40 Т-антиген иммортализованная клеточная линия кожи человека, выбранная из группы, состоящей из линий кератиноцитов DK2-NR (DSM АСС2238), DK3-NR (DSM АСС2239) и FK2-NR (DSM АСС2240) и линии меланоцитов DM2-NR, (CNCM I-1796).

9. Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов по п.1, отличающаяся тем, что экспрессирует мРНК, кодирующую глутатион-S-трансферазы GSTπ, GSTμ и GSTα.

10. Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов по п.1, отличающаяся тем, что при культивировании в органотипической культуре образует сильно расслоенный и поляризованный эпителий, содержащий ороговевшие поверхностные слои в отсутствии сыворотки или фидерных клеток.

11. Клеточная линия иммортализованных кератиноцитов по п.1, отличающаяся тем, что экспрессирует коллагеназу типа 1 и TNFα при обработке сложными эфирами форбола.

12. Способ иммортализации клеток кожи человека для получения иммортализованных кератиноцитов и меланоцитов, отличающийся тем, что включает следующие стадии: (i) получения образца ткани кожи человека; (ii) подготовки указанного образца кожи для культивирования in vitro; (iii) получения кератиноцитов и/или меланоцитов из указанного подготовленного образца кожи и посева указанных кератиноцитов и/или меланоцитов на не содержащую сыворотки среду для выращивания, на культуральные пластины, снабженные покрытием, включающим фибронектин, коллаген типа 1 и BSA, которые облегчают прикрепление клеток и их рост; (iv) замену среды при необходимости для оптимизации конфлюэнтного роста культивируемых клеток при постоянном сохранении покрытия на пластинах с культурами; (v) переноса кератиноцитов или меланоцитов в не содержащую сыворотки селекционную среду на аналогичным образом предварительно покрытые культуральные пластины; (vi) инфицирования кератиноцитов или меланоцитов ретровирусной конструкцией; (vii) переноса полученных иммортализованных кератиноцитов или меланоцитов на не содержащую сыворотки пролиферационную среду, подходящую для пролиферации иммортализованных кератиноцитов или меланоцитов на аналогичным образом предварительно покрытых культуральных пластинах; и (viii) переноса полученных пролиферированных кератиноцитов на не содержащую сыворотки дифференцирующую среду с высоким содержанием кальция на аналогичным образом предварительно покрытые культуральные пластины.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что ретровирусной конструкцией является SV40 конструкция pLXSHD+SV40( 328) или HPV16 конструкция pLXSHD+E6/E7.

14. Способ по п.12, отличающийся тем, что не содержащей сыворотки средой на стадии (iii) является NR-3 среда.

15. Способ по п.12, отличающийся тем, что средой на стадии (v) является NR-3 среда или NR-4 среда.

16. Способ по п. 12, отличающийся тем, что пролиферационной средой на стадии (vii) является NR-2 среда или NR-3 среда и М2 среда для меланоцитов.

17. Способ по п. 12, отличающийся тем, что дифференцирующей средой на стадии (viii) является NR-2 среда или модифицированная MCDB 153 среда, которая содержит кальций в количестве, по крайней мере, 1,5 мМ.

18. Новая, не содержащая сыворотки, среда, пригодная для выделения и продуцирования кератиноцитов и меланоцитов человека, которые сохраняют способность дифференцировать и экспрессировать протеины и ферменты дифференцированных кератиноцитов и меланоцитов человека даже после большого числа пассажей, которая включает: аминокислоты или соли аминокислот; неорганические соли; витамины; аденин, этаноламин, глюкозу, HEPES, фенол красный, путресцин 2НС1, тиоктовую кислоту, тиамин НСl, тимидин, эпидермальный фактор роста; инсулин; гидрокортизон; трансферрин; фосфоэтаноламин; и экстракт бычьего гипофиза.

19. Среда по п.18, отличающаяся тем, что содержит эпинефрин.

20. Среда по п.19, отличающаяся тем, что концентрация эпинефрина достаточна для усиления роста кератиноцитов.

21. Среда по п.18, отличающаяся тем, что аминокислоты, содержащиеся в среде, выбирают из группы, состоящей из L-аланина, L-аргинина-НСl, аспарагина-Н₂О, L-аспарагиновой кислоты, L-цистеин-НСl-Н₂O, L-глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, L-гистидин-НСl-Н₂O, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизин-HCl, L-метионина, L-фенилаланина, L-пролина, L-серина, L-треонина, L-триптофана, L-тирозина, L-валина и их солей.

22. Среда по п.18, отличающаяся тем, что неорганические соли выбирают из группы, состоящей из метаванадата аммония, молибдата аммония, хлорида кальция, сульфата меди(2), сульфата железа (3), хлорида магния, хлорида марганца, сульфата никеля, хлорида калия, ацетата натрия, бикарбоната натрия, хлорида натрия, двухосновного фосфата натрия, пирувата натрия, селенита натрия, силиката натрия, хлорида олова и сульфата цинка.

23. Способ по п.18, отличающийся тем, что витамины выбирают из группы, состоящей из d-биотина, d-кальцийпантотената, холинхлорида, цианокобаламина, фолиевой кислоты, i-инозитола, никотинамида, пиридоксина и рибофлавина.

24. Новая, не содержащая сыворотки среда, отличающаяся тем, что предназначена для выделения, продуцирования и/или поддержания иммортализованных кератиноцитов и/или меланоцитов, которую выбирают из группы, состоящей из NR-2 среды, NR-3 среды и NR-4 среды.

25. Анализ, который использует дифференцированные кератиноциты и/или меланоциты, в котором усовершенствование включает использование иммортализованных кератиноцитов и/или меланоцитов по п.1.

26. Анализ по п.25, отличающийся тем, что клетки выбирают из группы, состоящей из DK2-NR (DSM АСС2238), DK3-NR (DSM АСС2239), DM2-NR (CNCM 1-1796) и FK2-NR (DSM АСС 2240).

27. Способ по п.24, отличающийся тем, что указанный анализ представляет анализ воспалений.

28. Анализ, в котором используют первичные меланоциты или кератиноциты, отличающийся тем, что усовершенствование включает использование первичных меланоцитов или кератиноцитов, полученных по п.12 (iii).

29. Анализ по п.28, отличающийся тем, что указанный анализ является анализом воспалений.

30. Способ трансплантации кожи, отличающийся тем, что усовершенствование включает использование в качестве трансплантируемой кожной ткани первичных кератиноцитов или меланоцитов, полученных по п.12 (iii).