CN106282105A - 一种间充质干细胞培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞培养基，包含无血清的基础培养基及添加在基础培养基中的添加剂，所述添加剂包括纳他霉素和杀菌剂，所述杀菌剂选用氟喹诺酮和甲基红霉素；且所述间充质干细胞培养基中，所述纳他霉素、氟喹诺酮和甲基红霉素的浓度分别为40‑50mg/ml、0‑60mg/ml和0‑45mg/ml，同时所述基础培养基中添加有Hedgehog通路激动剂Purmorphamine 7μmol/L，叶酸5.5mg/L。该间充质干细胞培养基能有效杀灭进入培养基中的支原体，从而防止间充质干细胞培养过程中支原体的污染；同时可以有效改善间充质干细胞生长速度，间充质干细胞生长增殖速度显著提高。

Description

一种间充质干细胞培养基

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，具体涉及一种间充质干细胞培养基。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。随着国内外学者对间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，目前已经可以从多种组织中分离出间充质干细胞。间充质干细胞具有支持造血和调节免疫等作用，在造血重建、组织修复、免疫治疗等方面具有广阔的临床应用前景。

间充质干细胞采用含动物血清的间充质干细胞培养基作为常见的培养基质，血清能为干细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，但其存在诸多缺点：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，成分不明确，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被细菌和支原体感染等。针对现有的含有血清的培养基质存在的上述问题，寻找到一种替代的培养基质已成为行业内研发重点之一。如公告号为CN102433302A的中国专利提供了一种间充质干细胞无血清培养基，其包括25μg/ml纤连蛋白、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、15ng/ml人表皮细胞生长因子、1mg/ml重组人胰岛素、0.55mg/ml人转铁蛋白、体积比为5％的人血白蛋白、0.67μg/ml的亚硒酸钠、5mM左旋卡尼丁和30μM白藜芦醇。

该间充质干细胞无血清培养基，由于不含有动物来源的血清，因此可以控制培养基自身对培养细胞感染的风险；但在使用该无血清培养基对间充质干细胞培养的过程中，仍然存在被操作环境中的支原体对间充质干细胞造成污染的风险，如果培养的干细胞被支原体污染，会造成培养的干细胞生长率明显下降，生长缓慢，破碎细胞多，需要将培养基中的干细胞全部舍弃，对操作环境严格灭菌后重新获取干细胞后再对其进行培养，造成大量成本的浪费。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种间充质干细胞培养基，减少间充质干细胞培养过程中支原体的污染。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种间充质干细胞培养基，包含无血清的基础培养基及添加在基础培养基中的添加剂，所述添加剂包括纳他霉素和杀菌剂，所述杀菌剂选用氟喹诺酮和甲基红霉素；且所述间充质干细胞培养基中，所述纳他霉素、氟喹诺酮和甲基红霉素的浓度分别为40-50mg/ml、0-60mg/ml和0-45mg/ml。

采用上述方案，纳他霉素的内酯环上含有氨基二脱氧甘露糖基团，该基团能与甾醇化合物作用从而使形成纳他霉素分子-甾醇化合物；而常见的细菌，特别是在干细胞培养中常对细胞培养造成污染的支原体，其细胞膜上含有较多的甾醇化合物；当培养基感染支原体等细菌后，纳他霉素能与支原体细胞膜表面的甾醇化合物结合，纳他霉素上的多醇部分在细胞膜上形成通孔，增大细胞膜的通透性；

氟喹诺酮又称吡啶酮酸类，属化学合成抗菌药，其杀菌机理作用主要是通过细菌或真菌的细胞膜后作用于细胞内的DNA旋转酶，阻碍细胞膜DNA的正常复制、转录、转运与重组，从而造成支原体死亡；

甲基红霉素属于大环内酯类抗菌素，其可透过支原体的细胞膜，在支原体细胞内与接近供位(“P”位)与核糖体成可逆性结合，阻断了转移核糖核酸(t-RNA)结合至“P”位上，同时也阻断了多肽链自受位(“A”位)“P”位的位移，因而细胞内蛋白质合成受到抑制，从而阻止支原体的快速分裂，从而起到对支原体的杀灭作用；

纳他霉素与氟喹诺酮联合作用，当培养基中混入细菌如支原体时，纳他霉素可作用于细菌细胞膜使细胞膜表面形成“通道”，氟喹诺酮直接通过该“通道”快速进入到支原体细胞中，并与细胞内的DNA旋转酶作用，遏制DNA旋转酶的形成，从而阻碍细胞膜DNA的正常工作，使支原体快速“凋亡”，大大提高了对支原体的杀灭能力，在对间充质干细胞支原体感染实验研究中发现，采用本申请的一种间充质干细胞培养基培养间充质干细胞的过程中，纳他霉素与氟喹诺酮联合杀菌效果可在5天内将接种至培养基中的支原体全部杀灭；

纳他霉素与甲基红霉素联合作用，当培养基中混入细菌如支原体时，纳他霉素可作用于细菌细胞膜使细胞膜表面形成“通道”，甲基红霉素直接通过该“通道”快速进入到支原体细胞中，作用于支原体细胞内的蛋白质系统，扰乱蛋白质的正常合成，使支原体快速死亡，在对间充质干细胞支原体感染实验研究中发现，采用本申请的一种间充质干细胞培养基培养间充质干细胞的过程中，纳他霉素与甲基红霉素联合杀菌效果可在6天内将接种至培养基中的支原体全部杀灭；

纳他霉素、氟喹诺酮与甲基红霉素联合作用，当培养基中混入细菌如支原体时，纳他霉素可作用于细菌细胞膜使细胞膜表面形成“通道”，氟喹诺酮与甲基红霉素直接通过该“通道”快速进入到支原体细胞中，分别抑制支原体细胞内DNA的正常合成及蛋白质的正常合成，从而杀灭支原体，在对间充质干细胞支原体感染实验研究中发现，采用本申请的一种间充质干细胞培养基培养间充质干细胞的过程中，纳他霉素、氟喹诺酮与甲基红霉素联合杀菌效果可在3天内将接种至培养基中的支原体全部杀灭。

作为优选，所述间充质干细胞培养基中纳他霉素、氟喹诺酮和甲基红霉素的浓度分别为40-50mg/ml、60mg/ml和45mg/ml。

采用上述方案，经多次试验证明，采用上述浓度可达到对支原体最佳的杀灭效果。

作为优选，所述基础培养基包括有Hedgehog通路激动剂Purmorphamine和叶酸；且所述间充质干细胞培养基中，Hedgehog通路激动剂Purmorphamine和叶酸的浓度分别为7μmol/L和5.5mg/L。

采用上述方案，Hedgehog信号通路控制着细胞的生长与增殖，经反复试验在培养基中添加7μmol/L的Purmorphamine能有效加快培养基中培养的干细胞增殖能力，同时添加5.5mg/L叶酸可减少培养过程中干细胞的畸变与凋亡；在对间充质干细胞支原体感染实验研究中发现，当培养基体系中同时含有Purmorphamine和叶酸时，在一周内该培养基体系中间充质干细胞的生长速度明显优于只含有Purmorphamine或叶酸或不含有Purmorphamine和叶酸的培养基，且最后的细胞活率在90％以上。

作为优选，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

采用上述方案，DMEM/F12培养基是将DMEM培养基与F12培养基1：1结合组成的培养基，其结合了DMEM培养基具有较高浓度的营养成分及F12含有多种细胞生长所需微量元素的特点，故其能保证培养基中干细胞的快速生长过程中的物质所需。

本发明的另一个目的在于提供一种上述间充质干细胞培养基的制备方法：一种间充质干细胞培养基的制备方法，包含以下步骤：

向DMEM/F12培养基中，按所述浓度加入甲基红霉素、氟喹诺酮、纳他霉素、Purmorphamine及叶酸，混匀，过膜除菌即得。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1.具有较强的杀菌能力，特别是对培养基中间充质干细胞内外的支原体具有较强的杀灭清除能力，经过反复试验证明，该培养基能在一周内将培养基中感染的支原体全部杀灭，当培养基中同时含有纳他霉素、氟喹诺酮和甲基红霉素时，培养基中支原体全部被杀灭的时间可缩短至3天；

2.Purmorphamine与叶酸结合能有效提高该培养基体系中间充质干细胞的增殖速度及细胞活性，经过反复试验证明，该培养基中同时含有这两种物质时可保证间充质干细胞数量在一周内迅速增长，且最后的细胞活率维持在90％以上，且其对间充质干细胞增值的影响优于单独只含有Purmorphamine与叶酸中的一种或不含Purmorphamine与叶酸的培养基。

综上，该间充质干细胞培养基能保证在其中培养的间充质干细胞免受环境中支原体的污染，防止支原体对干细胞的正常生长造成影响，确保间充质干细胞的快速生长及保持良好的细胞活性。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1-8：一种间充质干细胞培养基，其由如下方法制备得到：

向基础培养基中，加入甲基红霉素、氟喹诺酮、纳他霉素、Purmorphamine及叶酸，混匀，用millipore 0.22um孔径滤器过膜除菌即得，实施例1-8的一种间充质干细胞培养基中各组分如表1所示；

将牙髓间充质干细胞按照1000细胞/cm²的密度种植到盛有上述培养基的T75细胞培养瓶中进行培养。

表1实施例1-8的成分及其含量

实施例9：

实验步骤：

1.取实施例1-8中的细胞培养瓶各7瓶，分成7组，每组含实施例1-8中的细胞培养瓶各1瓶，并作上标记；

2.分别向培养瓶中添加EP(欧洲药典)生产的口腔支原体标准品5μl；

3.将所有细胞培养瓶放入到37℃、CO₂浓度为5％的细胞培养箱中进行细胞培养；

4.在细胞培养24小时后将第1组细胞培养瓶中的细胞收获，48小时后将第2组细胞培养瓶中的细胞收获，72小时后将第3组细胞培养瓶中的细胞收获，96小时后将第4组细胞培养瓶中的细胞收获，120小时后将第5组细胞培养瓶中的细胞收获,144小时后将第6组细胞培养瓶中的细胞收获，168小时后将第7组细胞培养瓶中的细胞收获；

5.使用Lonza MycoAlert支原体检测试剂盒，对每瓶细胞培养瓶中细胞培养后的培养液上清液进行检测，检测结果如表2所示；

6.同时将步骤4得到的细胞用Invitrogen公司全自动细胞计数仪Countess进行细胞计数和存活率计数。每组测3次，结果取平均值如表3所述。

表2支原体检测结果

由表2可知，实施例1、2、5、6和7中细胞培养基在第3天检测时，支原体检测结果由阳性转为阴性，说明在72小时(3天)这些实施例中培养基内里面含有的支原体全部死亡；实施例3在第5天检测时，支原体检测结果由阳性转为阴性，说明在120小时(5天)实施例3中培养基内里面含有的支原体全部死亡；实施例4中细胞培养基在第6天检测时，支原体检测结果由阳性转为阴性，说明在144小时(6天)实施例4中培养基内里面含有的支原体全部死亡；实施例8的检测一直为阳性，说明实施例8中培养基一直存在存活的支原体。

实验分析：通过对比支原体检测结果可知，当培养基中同时含有纳他霉素、氟喹诺酮和甲基红霉素这三种成分时，其杀灭支原体的效果最强，并且其杀菌效果优于纳他霉素与氟喹诺酮或者纳他霉素与甲基红霉素的组合，能至少提前48小时将培养基中支原体全部杀灭，说明这三种成分的结合在清除支原体上起到了协同作用，其清除支原体的效果远远优于两种药物的组合。

表3细胞数及细胞活率检测结果

由表3可知，实施例1、5、6和7中的细胞数一致处于增加状态，说明细胞一直在增殖，实施例2.、3和4中细胞培养6天后即停止增殖，实施例8中细胞培养5天后即停止增殖。

实验分析：通过对比以上实施例可知，当培养基中存在Purmorphamine或者叶酸中的一种物质时，干细胞在培养的一周内都是在一直在增殖；同时对比实施例1和实施例5和实施例1与实施例6可知当培养基中同时含Purmorphamine和叶酸两种物质时，其对干细胞增殖的作用远远大于培养基中只含有Purmorphamine或者叶酸的情况；此外对比实施例5和实施例6的数据可知Purmorphamine对干细胞增殖的影响远远大于叶酸；说明了Purmorphamine和叶酸对于培养基中干细胞的增殖起到了协同作用，其结合对干细胞增殖起到的效果远远优于单独使用Purmorphamine或单独使用叶酸；

同时对比实施例1和实施例7可知当基础培养基为DMEM/F12时，培养的间充质干细胞具有更快的增值速度和更好的细胞活性。

此外结合对表2的分析可知，当培养基中同时存在纳他霉素、氟喹诺酮、甲基红霉素、Purmorphamine和叶酸时可在防止培养基中的间充质干细胞被支原体感染的情况下，维持培养体系中间充质干细胞的活性，使间充质干细胞保持更快的增殖速度。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (5)

1.一种间充质干细胞培养基，包含无血清的基础培养基及添加在基础培养基中的添加剂，其特征是：所述添加剂包括纳他霉素和杀菌剂，所述杀菌剂选用氟喹诺酮和甲基红霉素；且所述间充质干细胞培养基中，所述纳他霉素、氟喹诺酮和甲基红霉素的浓度分别为40-50mg/ml、0-60mg/ml和0-45mg/ml。

2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞培养基，其特征是：所述间充质干细胞培养基中纳他霉素、氟喹诺酮和甲基红霉素的浓度分别为40-50mg/ml、60mg/ml和45mg/ml。

3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞培养基，其特征是：所述基础培养基包括有Hedgehog通路激动剂Purmorphamine和叶酸；且所述间充质干细胞培养基中，Hedgehog通路激动剂Purmorphamine和叶酸的浓度分别为7μmol/L和5.5mg/L。

4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞培养基，其特征是：所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

5.一种间充质干细胞培养基的制备方法，其特征是：包括如下步骤：向DMEM/F12培养基中，加入甲基红霉素、氟喹诺酮、纳他霉素、Purmorphamine、叶酸混匀，过膜除菌即得。