CN104304237B - 一种安全高效的动物精液消毒剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明为了填补市面上动物精液消毒剂的空白，提供了一种安全高效的动物精液消毒剂及其制备方法。按重量计，包括以下组分：聚维酮碘4.0％-6.0％、抗菌肽0.5％-1.0％、维生素0.2％-0.3％、乙二胺四乙酸0.1％－0.2％和蒸馏水余量。采用聚维酮碘与抗菌肽的混合物作为精液消毒剂用于经济动物的精液净化消毒杀菌。经试验证明它能够完全杀灭公猪精液中最常见的五种危害最大的病毒：猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒（PCV-2）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV），以及其他大多数病原微生物，同时对精子活力及保存时间有一定延长效果，对受精卵、胚胎无毒无害。

Description

一种安全高效的动物精液消毒剂及其制备方法

技术领域

本发明属于动物防疫技术领域，具体涉及一种安全高效的动物精液消毒剂及其制备方法。

背景技术

现代畜牧业的大力发展得益于人工授精技术的快速发展。人工授精技术的优势是能够通过人工采集优质精液，通过一定的技术手段使它能够长时间保存运输，为畜牧业品种改良和提高生产绩效带来巨大经济效益。但是人工授精技术也有它的天然缺陷，那就是将供体精液里面可能带有的病原微生物都传染给它的受体。以猪为例，公猪精液中通常含有10⁴~10⁵CFU/ml细菌以及可能污染的未知病毒及其他病原微生物，这些细菌和病毒会影响公猪精液的保存时间及精子的活率，并且能够通过人工授精技术将公猪所可能携带病原微生物传染给母猪和小猪，导致母猪繁殖障碍、小猪疾病的流行和生产绩效的大幅度下降，造成严重的经济损失。

一些学者的研究表明公猪精液中能检出的危害养猪生产的主要病毒有：口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒（PCV-2）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）。其中已证实CSFV、PRRSV、PPV、PRV能通过人工受精感染母猪引起死胎、流产等繁殖障碍。种公猪精液带毒是猪群病毒病垂直传播的一个重要途径，也是制约人工受精技术发展和推广的一大难题。

针对公猪精液污染，精液消毒剂开发的难度很大，原因在于：一方面是安全性的考虑，首先要不损伤精子活率，不对受精卵、胚胎以及母猪的繁殖造成影响，对精子的遗传性能无影响；另一方面是有效性的考虑，对精子里面的有害病原，特别是病毒有效，是这项技术的关键。而安全性和有效性是一对矛盾，很难对立统一。因此，目前市而上还没有商品化的精液消毒剂。全世界的从业者都只有通过在精液稀释液中加入抗生素（如青霉素、链霉素、庆大霉素、林可霉素等）来抑菌，但是抗生素仅能抑杀精液中的部份细菌繁殖，而对病毒无效，滥用抗生素带来的是大量耐药菌株的产生。

201210055618.9，名称为“一种动物精液消毒液及其制备方法”的发明专利，公开了一种动物精液的消毒液，是由聚乙烯吡咯烷酮、精碘、甘油、维生素C、乙二胺四乙酸二钠、蒸馏水组成，按照配制聚乙烯吡咯烷酮-精碘混合物、配制维生素C-甘油混合液、混料、检验等步骤制备得到。该消毒液单独采用碘制剂作为精液消毒剂，很难完全杀灭精液里面污染的病原微生物，特别是精液常见病毒，缺乏这方面必要的数据来证明其对精液消毒的有效性，也缺乏必要的数据证明其对精子的安全性。

201410342549.9，名称为“一种复方活力碘消毒剂及其制备方法”的发明专利申请，公开了一种复方活力碘消毒剂，该消毒剂包括下列各组分(wt%)：聚维酮碘PVP-I，2.0-10.0%；维生素A，0.05-0.5%；碘酸钾KIO₃，0.5-1.0%；碘化钾KI，0.5-1.0%；螯合剂，0.2-2.0%；有机溶剂，1.0-10.0%；pH调节剂，适量；水，余量。该消毒液只能作为体表消毒剂，不能用于动物精液消毒。

发明内容

本发明为了填补市面上动物精液消毒剂的空白，提供了一种安全高效的动物精液消毒剂及其制备方法。采用聚维酮碘与抗菌肽的混合物作为精液消毒剂用于经济动物（主要是猪、牛、羊）的精液净化消毒杀菌。经试验证明它能够完全杀灭公猪精液中最常见的五种危害最大的病毒：猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒（PCV-2）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV），以及其他大多数病原微生物，同时对精子活力及保存时间有一定延长效果，对受精卵、胚胎无毒无害。

为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：

一种安全高效的动物精液消毒剂，其特征在于：按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘4.0％－6.0％

抗菌肽0.5％－1.0％

维生素0.2％-0.3％

乙二胺四乙酸0.1％－0.2％

蒸馏水余量。

聚维酮碘是目前畜禽养殖场常用的碘制剂之一，是将碘载于强碱性阴离子树脂上形成的一种接触型消毒剂，可杀死大部分细菌、真菌和病毒。但是，在对精子安全的浓度范围内，聚维酮碘对部份细菌和病毒有很好的效果，但不能完全杀灭精液里面常见五种病毒，特别是猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒效果不佳。

抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成，对细菌和病毒都有广谱杀灭效果，且对精子安全性非常好，特别是对精液常见病毒特别是猪瘟病毒、伪狂犬病毒、蓝耳病病毒有很好的杀灭作用，和聚维酮碘配合使用有强烈互补性。

本发明的精液消毒剂对动物精子、受精卵、胚胎无毒，能有效杀灭动物精液中的病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体等致病微生物，且不污染环境。

优选地，本发明的动物精液消毒剂按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘4.0％－6.0％

抗菌肽0.5％－1.0％

蜂胶2％－4％

维生素0.2％-0.3％

乙二胺四乙酸0.1％－0.2％

蒸馏水余量。

蜂胶的抗菌范围十分广泛，具有抗细菌、抗真菌、抗霉菌、抗寄生虫和抗病毒等作用，是不可多得的天然广谱抗菌和抗病毒物质。在本发明的配方含量下，蜂胶对精子安全，而且对精子的活率和保存时间有促进作用，特别是对精液的低温保存有保护作用，对聚维酮碘和抗菌肽的杀灭病毒组合配方有协同作用。

进一步优选地，所述的蜂胶为天然蜂胶，黄酮含量不低于8mg／ml，不含任何有机溶剂，增强抗菌效果的同时，不会影响精子活力。

进一步优选地，本发明的动物精液消毒剂按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘4.0％－6.0％

抗菌肽0.5％－1.0％

蜂胶2％－4％

维生素0.2％-0.3％

乙二胺四乙酸0.1％－0.2％

甘油2％－3％

蒸馏水余量。

加入甘油的目的是：对公猪精子活率和保存时间有明显的促进作用。

优选地，所述的抗菌肽为蟑螂内源性抗菌肽。

本发明选用蟑螂内源性抗菌肽，其氨基酸序列为SEQIDNO:1。这种抗菌肽具有良好稳定性以及广谱高效抗菌、抗病毒等特点，且生产工艺成熟和完善，其生产工艺是以蟑螂内源性抗菌肽的氨基酸序列为模版，以固相多肽合成方法将氨基酸序列重组后用工程菌表达发酵，得到重组广谱抗菌肽纯品。

本发明所述的维生素是指水溶性维生素C、维生素A和维生素E中的一种或者两种以上的组合。能有效保护精子的功能，配合使用能更好促进精子活力，提高精子保存时间，有利于精子的保存运输。

本发明的动物精液消毒剂配制方法如下：

第一步、配制9.5％－10.0％聚维酮碘水溶液A；

第二步、配制抗菌肽与蜂胶混合物B：将蜂胶溶液加入适量蒸馏水，搅拌混合配成蜂胶溶液，冷却至常温后，加入抗菌肽低速搅拌待完全溶解后待用。

优选地，32-37℃下搅拌15-20分钟配成蜂胶溶液，促进充分融合，保证生物活性。

第三步、配制维生素混合液C：采用水溶性维生素加入蒸馏水中低速搅拌，待完全溶解后待用。

第四步：将乙二胺四乙酸加入蒸馏水搅拌，待完全溶解后依次加入C液、B液，低速搅拌10-20分钟，混合均匀后加入A液，低速搅拌20-40分钟，得到红棕色混悬液，将混悬液过滤、灌装得成品。

所述的第三步，水溶性维生素完全溶解后，加入甘油搅拌均匀待用。

优选地，所述的低速搅拌是指15-20转/分，完全混合不起泡，混悬液稳定。

常规的消毒剂对公猪精子毒性很强，因此不能直接添加到公猪精液中。而广泛应用于皮肤和粘膜消毒的高分子有机碘，具有较高的安全性，对细菌和病毒都有较强的杀灭作用，但高分子有机碘由于组份复杂也对公猪精子有较强杀灭作用。本研究的精液消毒剂在小于或等于1%的低浓度下对公猪精子是安全无害的，不但不会影响精子活率和保存时间，还可适当提高活率和延长保存时间。因此，可应用于猪人工受精技术精液净化消毒，同时也可以运用于的精液采集和输精过程皮肤、生殖器等消毒。具体的有益效果体现在于：

1、本发明的精液消毒剂中，含聚维酮碘按有效碘计算，为标示量的8.5%～12.0%；采用聚维酮碘与抗菌肽配合使用，用于经济动物的精液净化消毒杀菌，具有强烈的互补性。能够完全杀灭公猪精液中最常见的五种危害最大的病毒：猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒（PCV-2）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV），以及其他大多数病原微生物；同时本发明的精液消毒剂对精子活力及保存时间有一定延长效果，对受精卵、胚胎无毒无害。

2、本发明的配方中添加蜂胶，特别是不含任何有机溶剂的天然蜂胶，且对精子安全，而且对精子的活率和保存时间有促进作用，特别是对精液的低温保存有保护作用；对聚维酮碘和抗菌肽的杀灭病毒组合配方有协同作用，不会影响精子活力，同时具有增强配方抗菌效果的作用。

3、本发明选用蟑螂内源性抗菌肽，这种抗菌肽具有良好稳定性以及广谱高效抗菌、抗病毒等特点，且生产工艺成熟和完善，易于产业化生产。

4、本发明对精液消毒剂的制备方法严格控制，按制备方法中的顺序添加配方中各组分，不会产生沉淀，得到产品的稳定性好，37℃恒温箱放置三个月后碘含量下降率低于4％，六个月碘含量下降率低于8％。

5、由于安全性和有效性的考虑，精液消毒剂开发的难度很大，目前精液消毒剂还没有市售同类产品，只有普通用于动物体表、圈舍、环境等消毒剂，本发明的精液消毒剂已经得到全国超过100家大中型养猪企业的生产验证，在使用本发明产品后生产成绩大幅改善的有超过50％，普遍反映母猪繁殖障碍疾病大幅降低，疾病发生率显著下降，小猪好养，生产绩效普遍提高，具有显著经济效益和社会效益。

附图说明

图1为本发明的不同浓度精液消毒剂对精子活率的影响示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。

实施例1

一种安全高效的动物精液消毒剂，按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘4.0％

抗菌肽0.5％

维生素C0.2％

乙二胺四乙酸0.1％

蒸馏水余量。

实施例2

一种安全高效的动物精液消毒剂，按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘6.0％

抗菌肽1.0％

维生素A0.3％

乙二胺四乙酸0.2％

蒸馏水余量。

实施例3

一种安全高效的动物精液消毒剂，按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘5.0％

抗菌肽0.6％

维生素C和A0.22％

乙二胺四乙酸0.12％

蒸馏水余量。

所述的蜂胶为天然蜂胶，黄酮含量不低于8mg／ml，不含任何有机溶剂。

所述的抗菌肽为蟑螂内源性抗菌肽。

实施例4

一种安全高效的动物精液消毒剂，按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘4.0％

抗菌肽0.5％

蜂胶2％

维生素C和E0.2％

乙二胺四乙酸0.1％

蒸馏水余量。

实施例5

一种安全高效的动物精液消毒剂，按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘6.0％

抗菌肽1.0％

蜂胶4％

维生素C、A、E0.3％

乙二胺四乙酸0.2％

蒸馏水余量。

所述的抗菌肽为蟑螂内源性抗菌肽。

实施例6

一种安全高效的动物精液消毒剂，按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘5.5％

抗菌肽0.8％

蜂胶3％

维生素C、A、E0.25％

乙二胺四乙酸0.15％

蒸馏水余量。

所述的蜂胶为天然蜂胶，黄酮含量不低于8mg／ml，不含任何有机溶剂。

实施例7

一种安全高效的动物精液消毒剂，按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘4.0％

抗菌肽0.5％

蜂胶2％％

维生素C、A、E0.2％

乙二胺四乙酸0.1％

甘油2％

蒸馏水余量。

所述的蜂胶为天然蜂胶，黄酮含量不低于8mg／ml，不含任何有机溶剂。

实施例8

一种安全高效的动物精液消毒剂，按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘6.0％

抗菌肽1.0％

蜂胶4％

维生素E0.3％

乙二胺四乙酸0.2％

甘油3％

蒸馏水余量。

实施例9

一种安全高效的动物精液消毒剂，按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘5.2％

抗菌肽0.7％

蜂胶3.2％

维生素C、A、E0.26％

乙二胺四乙酸0.16％

甘油2.5％

蒸馏水余量。

实施例10

一种安全高效的动物精液消毒剂，按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘4.5％

抗菌肽0.9％

蜂胶2.5％

维生素C、A、E0.28％

乙二胺四乙酸0.18％

甘油2.2％

蒸馏水余量。

所述的蜂胶为天然蜂胶，黄酮含量不低于8mg／ml，不含任何有机溶剂。

所述的抗菌肽为蟑螂内源性抗菌肽。

实施例11

本发明动物精液消毒剂的配制方法如下：

第一步、配制9.5％聚维酮碘水溶液A待用；

第二步、配制抗菌肽与蜂胶混合物B：将蜂胶溶液加入适量蒸馏水，搅拌混合配成蜂胶溶液，冷却至常温后，加入抗菌肽低速搅拌待完全溶解后待用；

第三步、配制维生素混合液C：采用水溶性维生素加入蒸馏水中低速搅拌，待完全溶解后待用；

第四步：将乙二胺四乙酸加入蒸馏水搅拌，待完全溶解后依次加入C液、B液，低速搅拌10分钟，混合均匀后加入A液，低速搅拌20分钟，得到红棕色混悬液，将混悬液过滤、灌装得成品。

实施例12

本发明动物精液消毒剂的配制方法如下：

第一步、配制10.0％聚维酮碘水溶液A待用；

第二步、配制抗菌肽与蜂胶混合物B：将蜂胶溶液加入适量蒸馏水，37℃下搅拌15分钟配成蜂胶溶液，冷却至常温后，加入抗菌肽低速搅拌待完全溶解后待用；

第三步、配制维生素混合液C：采用水溶性维生素加入蒸馏水中低速搅拌，待完全溶解后待用；

第四步：将乙二胺四乙酸加入蒸馏水搅拌，待完全溶解后依次加入C液、B液，低速搅拌20分钟，混合均匀后加入A液，低速搅拌40分钟，得到红棕色混悬液，将混悬液过滤、灌装得成品。

实施例13

本发明动物精液消毒剂的配制方法如下：

第一步、配制9.6％聚维酮碘水溶液A待用；

第二步、配制抗菌肽与蜂胶混合物B：将蜂胶溶液加入适量蒸馏水，32℃下搅拌20分钟配成蜂胶溶液，冷却至常温后，加入抗菌肽低速搅拌待完全溶解后待用；

第三步、配制维生素混合液C：采用水溶性维生素加入蒸馏水中低速搅拌，待完全溶解后加入甘油搅拌均匀待用；

第四步：将乙二胺四乙酸加入蒸馏水搅拌，待完全溶解后依次加入C液、B液，低速搅拌15分钟，混合均匀后加入A液，低速搅拌30分钟，得到红棕色混悬液，将混悬液过滤、灌装得成品。

所述的低速搅拌是指15转/分。

实施例14

本发明动物精液消毒剂的配制方法如下：

第一步、配制9.7％聚维酮碘水溶液A待用；

第二步、配制抗菌肽与蜂胶混合物B：将蜂胶溶液加入适量蒸馏水，35℃下搅拌16分钟配成蜂胶溶液，冷却至常温后，加入抗菌肽低速搅拌待完全溶解后待用；

第三步、配制维生素混合液C：采用水溶性维生素加入蒸馏水中低速搅拌，待完全溶解后加入甘油搅拌均匀待用；

第四步：将乙二胺四乙酸加入蒸馏水搅拌，待完全溶解后依次加入C液、B液，低速搅拌16分钟，混合均匀后加入A液，低速搅拌25分钟，得到红棕色混悬液，将混悬液过滤、灌装得成品。

所述的低速搅拌是指20转/分。

实施例15

本发明动物精液消毒剂的配制方法如下：

第一步、配制9.8％聚维酮碘水溶液A待用；

第二步、配制抗菌肽与蜂胶混合物B：将蜂胶溶液加入适量蒸馏水，36℃下搅拌18分钟配成蜂胶溶液，冷却至常温后，加入抗菌肽低速搅拌待完全溶解后待用；

第三步、配制维生素混合液C：采用水溶性维生素加入蒸馏水中低速搅拌，待完全溶解后加入甘油搅拌均匀待用；

第四步：将乙二胺四乙酸加入蒸馏水搅拌，待完全溶解后依次加入C液、B液，低速搅拌14分钟，混合均匀后加入A液，低速搅拌28分钟，得到红棕色混悬液，将混悬液过滤、灌装得成品。

所述的低速搅拌是指16转/分。

实施例16

本发明涉及的蟑螂内源性抗菌肽生产工艺，采用蟑螂内源性抗菌肽基因转化酵母发酵生产方法：

（1）摇瓶培养：将含蟑螂内源性抗菌肽基因质粒转化的酵母作为菌种接入三角瓶中，在28-32℃，摇床转速150-300转/分的条件下，培养24-72小时；

（2）发酵罐培养：将（1）中已培养好的种子接入发酵罐，接种量为2-20％，在28-322，搅拌速度180-400转/分，罐压0.04-0.12兆帕，风量1∶0.5-1∶1.8体积/体积/分，pH6.5-7.5的条件下，培养24-96小时。

培养过程中加入1％甲醇诱导，将发酵所得抗菌肽在90-110℃下加热8-20分钟；其中所用的培养基组分及重量百分含量为：酵母粉0.1-3％、蛋白胨0.5-4％、糖0.1-3％，pH6.5-7.5。

实施例17

毒理学试验

采用动物试验观察其急性毒性、亚急性毒性及刺激性毒性结果。

结果：本发明精液消毒剂（1％稀释）对大鼠和小鼠急性经口LD50均大于5000mg/kg·BW，其原液对兔眼、完整皮肤及破损皮肤无刺激性；给药剂量在1000mg/kg·BW以下，与阴性对照组比较，对大鼠的体重、血常规及血液生物化学指标无显著影响，试验动物各脏器均未见明显病理改变。

仔猪口服精液净化保护剂原液，每天两次，每次1ml，连续两天给药，用药前后试验仔猪可食用组织中碘浓度均低于最高残留限量，精液消毒剂在猪使用时无休药期。精液净化保护剂在使用浓度下毒理学是安全的。

实施例18

本发明的成品检验项目与操作方法：

1．有效碘含量检测

按照《中华人民共和国兽药典》（2005版）有效碘检测方法，本品含聚维酮碘按有效碘(I)计算，应为标示量的8.5%～12.0%。

【性状】本品为红棕色液体。

【鉴别】

(1)取本品1～5漓，加水10ml与淀粉指示液1滴，即显蓝紫色。

(2)取本品10ml，置50ml锥形瓶中(瓶内颈切勿沾污)，瓶口覆盖一张用淀粉指示液湿润的滤纸，放置80秒钟，不显蓝色。

【检查】pH值应为3.O～6.0。

2．公猪精子安全性检测

采集公猪精液，用精液稀释液分别配制浓度为2%、1.5%、1%的精液净化保护剂，将所有稀释液置于37℃水浴锅中温浴备用。

采集好精液后，迅速用精子自动形态分析仪检测原精液精子的活率。将原精液平均分成4份，分别与不同浓度的精液净化保护剂等体积混合，以不含精液消毒剂的精液稀释液所稀释的精液为对照组。混合后精液消毒剂的终浓度分别为1%、7.5%、0.5%。

将各组稀释好的精液分装，置于17℃恒温冰箱，每隔24小时检测一次各组的精子活率并记录，直至精子活率低50%则停止检测。精子活率指呈直线运动的精子占总精子数的比率，用百分率表示。精子有效存活时间定义为精子活率在50%以上的保存时间。

成品检验结果如图1所示，检验标准为1%、0.75%、0.5%三组精子活率及保存时间均应高于对照组。

3、常见五种猪精液污染病毒杀灭效果检验方法

3.1必备材料和方法

3.1.1药物本明的精液消毒剂

3.1.2细胞和毒株：ST细胞、Marc-145细胞、PK15-ZJU细胞；猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）JXA1-R株、伪狂犬病毒(PRV)SE株、猪瘟病毒(CFSV)Thiveral株、细小病毒(PPV)SC1株，和圆环病毒2型(PCV-2)ZJ/C株。

3.1.3细胞培养相关试剂和仪器设备：

3.2检验方法及操作步骤：

3.2.1、检测ST、Marc-145、PK15-ZJU细胞对不同稀释度精液消毒剂溶液（PBS稀释）的耐受性，得出对应于每种细胞的精液消毒剂的安全浓度。

3.2.2、精液消毒剂对PBS稀释的病毒杀灭实验方法（体外实验）：在精液消毒剂安全浓度范围内，将不同浓度精液消毒剂溶液分别与一定浓度的五种病毒溶液等体积混合置37℃作用1h，然后接种于对应细胞中，通过观察细胞病变程度判定精液消毒剂对病毒的体外杀灭作用。

判定标准：若病毒接种于相应细胞能引起典型病变，且除开病毒的其他试剂不引起细胞病变，实验成立，此时，精液消毒剂与病毒混合作用后接种细胞，精液消毒剂的杀灭作用与细胞病变程度成反比，即：无细胞病变，表明精液消毒剂对病毒有完全杀灭作用。见表1。

表196孔板中各病毒检测加入试剂说明

注：各病毒均稀释至相同病毒含量。

3.2.3、精液消毒剂对精液稀释的病毒杀灭实验方法（体内实验）：按照上一条的原理和方法，用公猪精液稀释病毒液至所需浓度，然后与不同浓度的精液消毒剂溶液混合置37℃作用1h，再接种于对应的细胞中，通过观察细胞病变程度判定精液消毒剂对病毒的体内杀灭作用。

3．3检验结果

3.3.1、精液消毒剂对PBS中的PPV、PCV2、PRRSV、PRV、CSFV的杀灭作用

A．精液消毒剂对PBS中PPV的杀灭试验结果

表2精液消毒剂对PBS中的PPV杀灭效果

从表2可以看出，当浓度为0.078%时，PPV8孔中有2孔无细胞病变（CPE），当浓度≥0.156%时，所有孔都无细胞病变。因此，精液消毒剂能完全杀灭PPV的最低浓度为0.156%。

B．精液消毒剂对PBS中PCV2的杀灭试验结果

从表3可以看出，当浓度为0.078%时，PCV-28孔中有1孔无细胞病变（CPE），当浓度≥0.156%时，所有孔都无细胞病变。因此，精液消毒剂能完全杀灭PCV-2的最低浓度为0.156%。

表3精液消毒剂对PBS中的PCV-2杀灭效果

C．精液消毒剂对PBS中的PRV的杀灭试验结果

表4精液消毒剂对PBS中的PRV的杀灭效果

从表4中可以看出，当精液消毒剂浓度≥0.125%时，各组8孔都无细胞病变（CPE）。因此，精液消毒剂能完全杀灭PRV的最低浓度为0.125%。

．精液消毒剂对PBS中的PRRSV的杀灭试验结果

表5精液消毒剂对PBS中的PRRSV杀灭效果

从表5中可以看出，当精液消毒剂浓度≥0.125%时，各组8孔中都无细胞病变（CPE），因此，精液消毒剂能完全杀灭PRRS的最低浓度为0.125%。

E、精液消毒剂对PBS中的CSFV的杀灭试验结果

表6精液消毒剂对PBS中的CSFV杀灭效果

从表6可以看出，当精液消毒剂浓度为0.078%时，CSFV8孔中有3孔无细胞病变（CPE），当精液消毒剂浓度≥0.156%，所有孔都无细胞病变。因此，精液消毒剂能完全杀灭CSFV的最低浓度为0.078%。

3.3.2、精液消毒剂对精液中PPV、PCV2、PRRSV、PRV、CSFV的杀灭作用

由于精液对细胞有细胞毒性，因此要先细胞对精液的耐受性，得到精液稀释的安全浓度（稀释倍数为X）。把精液用PBS稀释到40亿精子／头份，然后接种X倍病毒，用不同稀释倍数的精液消毒剂作用1h后统一稀释X倍后接种适宜细胞观察结果。

A．精液消毒剂对精液中PCV-2的杀灭作用

表7精液消毒剂对精液中PCV-2的杀灭浓度

从表7可以看出，当精液消毒剂浓度≥0.125%时，各组细胞都无细胞病变（CPE）。因此，精液消毒剂能完全杀灭精液中PCV-2的最低浓度为0.125%。

B．精液消毒剂对精液中PPV的杀灭作用

表8精液消毒剂对精液中PPV的杀灭浓度

从表8可以看出，当精液消毒剂浓度≥0.125%时，各组细胞都无细胞病变（CPE）。因此，精液消毒剂能完全杀灭精液中PPV的最低浓度为0.125%。

C．精液消毒剂对精液中PRV的杀灭作用

表9精液消毒剂对精液中PRV的杀灭浓度

从表9可以看出，当精液消毒剂浓度≥0.098%时，各组细胞都无细胞病变（CPE）。因此，精液消毒剂能完全杀灭精液中PRV的最低浓度为0.098%。

．精液消毒剂对精液中PRRSV的杀灭作用

表10精液消毒剂对精液中PRRSV的杀灭浓度

从表10可以看出，当精液消毒剂浓度≥0.098%时，各组细胞都无细胞病变（CPE）。因此，精液消毒剂能完全杀灭精液中PRRSV的最低浓度为0.098%。

．精液消毒剂对精液中CSFV的杀灭作用

表11精液消毒剂对精液中CSFV的杀灭浓度

从表11可以看出，当精液消毒剂浓度≥1.195%时，各组细胞都无细胞病变（CPE）。因此，精液消毒剂能完全杀灭精液中CSFV的最低浓度为1.195%。

检验结果说明：在PBS试验中，本发明精液消毒剂完全杀灭PBS中的PCV-2、PPV、PRV、PRRSV、CSFV五种病毒的最低浓度依次为0.156%、0.156%、0.125%、0.125%、0.156%；在精液试验中，本发明精液消毒剂完全杀灭这五种病毒的最低浓度依次为0.125%、0.125%、0.098%、0.098%、0.195%。对同一种病毒，精液内试验和PBS内试验的浓度差异不大，处于相近的数量级。这也说明精液的存在对本发明精液消毒剂杀灭病毒效果的影响较小。

试验中采用将精液稀释4倍后用于病毒稀释，主要是结合临床中用于输精的精液一般作3~5倍稀释。试验中向稀释4倍的精液中人工接种大量病毒，低浓度的精液消毒剂仍然能完全杀灭病毒，这充分保证了精液消毒剂在临床上杀灭病毒的效果。同时，杀灭病毒试验数据显示，本发明精液消毒剂的最低杀病毒浓度均远低于1%精液消毒剂的安全浓度，这也保证了精液消毒剂临床上使用的安全性和有效性。精液消毒剂高效的杀病毒作用表明其完全可应用于公猪精液的病原净化，切断病原通过精液的垂直传播途径，具有很强的可行性。

序列表

<110>成都美强兽医技术服务有限公司

<120>一种安全高效的动物精液消毒剂及其制备方法

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>37

<212>PRT

<213>蟑螂内源性抗菌肽

<400>1

LysTrpLysValPheLysLysIleGluLysMetGlyArgAsnIleArg

151015

AsnGlyIleValLysAlaGlyProAlaIleAlaValLeuGlyGluAla

202530

LysAlaLysAlaLeu

35

Claims (8)

1.一种安全高效的动物精液消毒剂，其特征在于：按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘4.0％－6.0％

蟑螂内源性抗菌肽0.5％－1.0％

维生素0.2％-0.3％

乙二胺四乙酸0.1％－0.2％

蒸馏水余量。

2.一种安全高效的动物精液消毒剂，其特征在于：按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘4.0％－6.0％

蟑螂内源性抗菌肽0.5％－1.0％

蜂胶2％－4％

维生素0.2％-0.3％

乙二胺四乙酸0.1％－0.2％

蒸馏水余量。

3.根据权利要求2所述的一种安全高效的动物精液消毒剂，其特征在于：所述的蜂胶为天然蜂胶，黄酮含量不低于8mg／ml，不含任何有机溶剂。

4.一种安全高效的动物精液消毒剂，其特征在于：按重量计，包括以下组分：

聚维酮碘4.0％－6.0％

蟑螂内源性抗菌肽0.5％－1.0％

蜂胶2％－4％

维生素0.2％-0.3％

乙二胺四乙酸0.1％－0.2％

甘油2％－3％

蒸馏水余量。

5.根据权利要求1所述的一种安全高效的动物精液消毒剂，其特征在于：所述的维生素是指水溶性维生素C、维生素A和维生素E中的一种或者两种以上的组合。

6.根据权利要求2所述的一种安全高效的动物精液消毒剂的制备方法，其特征在于：所述动物精液消毒剂的配制方法如下：

第一步、配制9.5％－10.0％聚维酮碘水溶液A待用；

第二步、配制蟑螂内源性抗菌肽与蜂胶混合物B：将蜂胶溶液加入适量蒸馏水，搅拌混合配成蜂胶溶液，冷却至常温后，加入抗菌肽低速搅拌待完全溶解后待用；

第三步、配制维生素混合液C：采用水溶性维生素加入蒸馏水中低速搅拌，待完全溶解后待用；

第四步：将乙二胺四乙酸加入蒸馏水搅拌，待完全溶解后依次加入C液、B液，低速搅拌10-20分钟，混合均匀后加入A液，低速搅拌20-40分钟，得到红棕色混悬液，将混悬液过滤、灌装得成品。

7.根据权利要求6所述的一种安全高效的动物精液消毒剂的制备方法，其特征在于：所述的第二步，32-37℃下搅拌15-20分钟配成蜂胶溶液。

8.根据权利要求6所述的一种安全高效的动物精液消毒剂的制备方法，其特征在于：所述的低速搅拌是指15-20转/分。