CN101310009B - 细胞保存用水溶液 - Google Patents

细胞保存用水溶液 Download PDF

Info

Publication number
CN101310009B
CN101310009B CN200680042980.5A CN200680042980A CN101310009B CN 101310009 B CN101310009 B CN 101310009B CN 200680042980 A CN200680042980 A CN 200680042980A CN 101310009 B CN101310009 B CN 101310009B
Authority
CN
China
Prior art keywords
aqueous solution
cell
preservation
zooblast
solution according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200680042980.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101310009A (zh
Inventor
山城尚登
佐濑孝一
大根田修
长野真澄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nippon Zenyaku Kogyo Co Ltd
Original Assignee
Nippon Zenyaku Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nippon Zenyaku Kogyo Co Ltd filed Critical Nippon Zenyaku Kogyo Co Ltd
Publication of CN101310009A publication Critical patent/CN101310009A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101310009B publication Critical patent/CN101310009B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

提供一种细胞保存用水溶液，其不合天然动物源组分例如基础培养基或血清。通过除去天然动物源组分例如基础培养基或血清和控制其他组分和其浓度得到显示高细胞存活率的保存用水溶液。

Description

细胞保存用水溶液
技术领域
本发明涉及能通过简单操作长期保存细胞的细胞保存用水溶液，和更具体地，涉及无天然动物源组分例如基础培养基或血清的细胞保存用水溶液。
背景技术
通常，为防止培养的细胞因连续传代而劣化和被细菌污染进行深低温保藏以便能长期使用该细胞。已知用于细胞保存的通常方法是在液氮(-196℃)中通过以下保存细胞的方法：在含有二甲亚砜(下文中，称为DMSO)和血清的培养基中悬浮该细胞；在冷冻管或安瓿中分配该悬浮液；并用程序冷冻机冷却该悬浮液。
依赖于要保存的细胞的类型已经制备了深低温保藏用保存溶液的各种组合物。例如，已经发展了深低温保藏用无血清培养基用于在无血清的培养基中培养的培养细胞(例如见专利文件1)。此外，深低温保藏用溶液的质量因不同的血清种类而改变。此外，本质上不需要的细胞保存用组分，例如包含在血清中的各种细胞因子、生长因子和荷尔蒙可改变保存细胞的性质，因而已经发展了不使用血清的深低温保藏用溶液(例如见专利文件2)。
然而，在专利文件1中公开的无血清深低温保藏溶液包括包含多种组分的基础培养基。例如，RPMI1640培养基包含很多来源不明确的氨基酸。也还不知道这些培养基组分对保存细胞的影响。此外，在专利文件2中使用纯化过的白蛋白。然而，依赖于白蛋白提纯的程度其还可能被各种组分污染，因而仍然存在关于对细胞的影响的问题。
考虑到对保存在含有血清或基础培养基的溶液中的细胞潜在的影响，特别是用于医学使用，期望发展无天然动物源组分的化学上定义明确的细胞保存溶液。这种细胞保存溶液包括来源明确的组分，因而，期待其具有使该溶液的质量保持不变的优点。
不幸地，传统的细胞保存溶液需要基础培养基、血清或血清替代品，例如血清白蛋白，纯化过的白蛋白和类似物以进行长期和稳定的细胞保存。因此，至今还没有得到完全无天然动物源组分的细胞保存溶液。
专利文件1：JP63-216476A
专利文件2：JP2002-233356A
发明内容
本发明所要解决的问题
本发明的目的是提供一种无天然动物源组分例如基础培养基或血清的细胞保存用水溶液。本发明的另一目的是提供使所述水性保存溶液的细胞保存方法。
解决问题的手段
作为为解决以上问题的深入研究的结果，通过发现通过调节其他组分和其浓度排除任何天然动物源组分例如基础培养基或血清允许细胞保存后显示高存活率的一种水性保存溶液本发明的发明人最后完成了本发明。此外，通过用本发明的水性保存溶液制备细胞，发明人还完成了细胞保存方法。
本发明涉及使用根据以下项(1)至(17)中任一项所述的细胞保存用水溶液的细胞保存方法：
(1)细胞保存用水溶液，包含：增稠剂、防冷冻剂和糖，和无天然动物源组分；
(2)根据以上项(1)所述的细胞保存用水溶液，进一步包含：pH调节剂；
(3)根据以上项(1)或(2)所述的细胞保存用水溶液，其中该天然动物源组分是血清和源自基础培养基的组分；
(4)一种细胞保存用水溶液，包括以下组成(a)至(e)并具有pH6.5至9.0：
(a)1.0至20.0w/v％的防冷冻剂；
(b)1.0至10.0w/v％的糖；
(c)0.1至1.0w/v％的增稠剂；
(d)0.01至1.0w/v％的pH调节剂；和
(e)适量水；
(5)根据以上项(1)至(4)中任一项所述的细胞保存用水溶液，其中渗透压为1,000mOsm以上；
(6)根据以上项(5)所述的细胞保存用水溶液，其中该渗透压为1,000至2,700mOsm；
(7)根据以上项(1)至(6)中任一项所述的细胞保存用水溶液，其中该增稠剂包括羧甲基纤维素(CMC)，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，或有机酸聚合物；
(8)根据以上项(7)所述的细胞保存用水溶液，其中该有机酸聚合物为聚丙烯酸钠；
(9)根据以上项(1)至(8)中任一项所述的细胞保存用水溶液，其中该防冷冻剂为二甲亚砜(DMSO)或丙二醇；
(10)根据以上项(1)至(9)中任一项所述的细胞保存用水溶液，其中该糖为葡萄糖；
(11)根据以上项(1)至(10)中任一项所述的细胞保存用水溶液，其中该pH调节剂为磷酸盐缓冲液；
(12)一种细胞保存用水溶液，包括以下组成(a)至(e)并具有pH6.5至9.0：
(a)5.0至12.0w/v％的DMSO；
(b)3.0至5.0w/v％的葡萄糖；
(c)0.2至0.7w/v％的增稠剂；
(d)0.01至1.0w/v％的磷酸盐缓冲液；和
(e)适量水；
(13)根据以上项(1)至(12)中任一项所述的细胞保存用水溶液，其中要保存的细胞为以下任何细胞：淋巴细胞、脾细胞、胸腺细胞、动物细胞、体干细胞、间充质干细胞和胚胎干细胞；
(14)根据以上项(1)至(13)中任一项所述的细胞保存用水溶液，将该水溶液用于医学应用；
(15)根据以上项(1)至(14)中任一项所述的细胞保存用水溶液，其中该细胞保存方法为深低温保藏；
(16)根据以上项(1)至(15)中任一项所述的细胞保存用水溶液，其中保存后的细胞存活率为至少80％；
(17)根据以上项(1)至(15)中任一项所述的细胞保存用水溶液，其中在-80℃保存4天后和进一步在-196℃保存72天后保持了细胞的增殖能力；
(18)根据以上项(1)至(15)中任一项所述的细胞保存用水溶液，其中保存后保持了细胞的分化能力；
(19)一种细胞保存方法，包括：在根据以上项(1)至(15)中任一项所述的细胞保存用水溶液中分散细胞；分配该细胞进入容器中；和使该细胞进行深低温保藏；或
(20)根据以上项(19)所述的细胞保存方法，其中该分配细胞的数量为1×105至1×107个细胞/毫升。
本发明的效果
通过本发明建立的细胞保存用水溶液无天然动物源组分例如基础培养基或血清，由于保存细胞被杂质例如牛白血病毒、朊病毒等污染的可能性低，以致能够将其安全地用于医学应用。此外，使用本发明的细胞保存用水溶液的保存方法能够提供高存活率和/或保持细胞的增殖潜能和分化能力。此外，因为该溶液无来源不明确的组分，例如基础培养基、血清等，所以细胞能够在低成本下保存。
附图说明
图1a是说明保存在细胞保存用水溶液M、I和K中的每一种(实施例6)中的存活细胞数量的图。
图1b是说明保存在细胞保存用水溶液M、I和K中的每一种(实施例6)中的增殖细胞数量的图。
图2a是说明保存在细胞保存用水溶液M、I和K中的每一种(实施例6)中的细胞分化为成骨细胞的图。
图2b是说明保存在细胞保存用水溶液M、I和K(实施例6)中的每一种中的细胞分化为脂肪细胞的图。
具体实施方式
本发明的细胞保存用水溶液涉及包含增稠剂、防冷冻剂和糖同时无任何天然动物源组分的水溶液来保存细胞。进一步地，该溶液涉及包含pH调节剂但无任何天然动物源组分的水溶液。这是因为不知道天然动物源组分对要保存的细胞的影响。本发明的细胞保存用水溶液的特点是该溶液的组成只包括不影响要保存的细胞的来源明确的组分。因而，期望在该溶液中不包括天然动物源的组分，不论天然动物源组分的组合如何。
不期望包括在本发明的细胞保存用水溶液中的天然动物源组分包括常规用于细胞保存和培养的天然动物源组分和其他天然动物源组分。例如，包括能够用于细胞培养的血清、来源不明确的基础培养基等。此外，还包括纯化过的白蛋白、纯化过的蛋白质、蛋黄、脂肪乳剂、乳酸盐(例如乳酸盐和母乳)等。该血清的实例包括成牛血清、小牛血清、新生小牛血清和胎牛血清等。该基础培养基的实例包括RPMI培养基、MEM培养基、HamF-12培养基、DM-160培养基等。换言之，本发明的细胞保存用水溶液涉及无如以上示例的任何天然动物源组分但只包含合成的化学制品或既包含化学制品又包含源自植物的组分的水溶液。
本发明的细胞保存用水溶液涉及增稠剂、防冷冻剂和糖的组合。此外，该溶液可进一步地与pH调节剂组合。这些组分以水溶液状态使用。然而，任何类型的此种用法都符合本发明的使用：将进行冷冻干燥或类似操作的粉末溶解在水中或类似物中，然后将其用作水溶液；和直接使用以前以水溶液状态所制备的。
本发明的增稠剂可为任何增稠剂，只要该增稠剂能够组成即使在完全无天然动物源组分的水溶液中也能充分保存细胞的细胞保存用水溶液即可。该增稠剂的实例包括羧甲基纤维素(下文中，称为CMC)、羧甲基纤维素钠(下文中，称为CMC-Na)，有机酸聚合物、丙二醇藻酸酯，和藻酸钠等。这些中，优选使用CMC或CMC-Na。特别地，优选使用CMC-Na。进一步地，在有机酸聚合物中，优选使用聚丙稀酸钠。在该细胞保存用水溶液中该增稠剂的含量优选0.1至1.0w/v％，更优选0.1至0.5w/v％，特别优选0.25w/v％。
本发明的防冷冻剂可为任何防冷冻剂，只要该冷冻剂能够组成即使在完全无任何天然动物源组分的水溶液中也能充分保存细胞的细胞保存用水溶液即可。该防冷冻剂的实例包括DMSO、丙三醇、丙二醇，和1-甲基-2吡咯烷酮等。这些中，优选使用DMSO和丙二醇。特别地，优选使用DMSO。在该细胞保存用水溶液中该防冷冻剂的含量优选5w/v％以上但低于15w/v％，最优选5至12w/v％。在此范围中，特别优选10w/v％的含量。
本发明的糖可为任何糖，只要该糖能够组成即使在完全无任何天然动物源组分的水溶液中也能充分保存细胞的细胞保存用水溶液即可。该糖的实例包括葡萄糖、海藻糖、蔗糖、和乳糖等。这些中，特别优选使用葡萄糖。在该细胞保存用水溶液中该糖的含量优选1.0至10.0w/v％，更优选3至5w/v％，在此范围中，特别优选3w/v％的含量。
本发明的pH调节剂可为任何pH调节剂，只要该pH调节剂能够组成即使在完全无天然动物源组分的水溶液中也能充分保存细胞的细胞保存用水溶液即可。该pH调节剂的实例包括碳酸氢钠、HEPES、和磷酸盐缓冲液等。此外，当碱性备用溶液(BSS)不包含磷酸盐缓冲液时，也可以使用加入在适合细胞的pH值周围具有给予缓冲容量功能的氯化钠的碱性备用溶液。这些中，特别优选使用磷酸盐缓冲液。优选以合适的量使用pH调节剂用于将细胞保存用水溶液的pH调节至约6.5至9.0，更优选7.0至8.5。顺便地，本发明的磷酸盐缓冲液涉及，例如，氯化钠、磷酸二氢钠(无水)、磷酸二氢钾(无水)、磷酸氢二钠(无水)、磷酸三钠(无水)、氯化钾或磷酸二氢钾(无水)等。特别地，优选使用氯化钠、磷酸二氢钠(无水)、氯化钾或磷酸二氢钾(无水)。
在该细胞保存用水溶液中该pH调节剂的含量优选0.01至1.0w/v％，更优选0.05至0.5w/v％。
本发明的细胞保存用水溶液的渗透压优选1,000mOsm以上，更优选1,000至2,700mOsm以保持该溶液作为保存溶液的性能。
本发明的细胞保存用水溶液的组合物可为以上列出的具体示例性组分的任何组合，只要能够充分地保存细胞即可。该组合物的实例包括：通过混合适量的CMC作为增稠剂、DMSO作为防冷冻剂、葡萄糖作为糖、碳酸氢钠和HEPES作为pH调节剂制备的细胞保存用水溶液，和通过进一步向上述溶液中加入磷酸盐缓冲液得到的细胞保存用水溶液。此外，该组合物可包括CMC-Na或有机酸聚合物而不是CMC作为增稠剂。可选择地，该组合物可包括丙二醇等而不是DMSO作为防冷冻剂。
期望本发明的细胞保存用水溶液为具有保存至少一周后存活率80％以上，优选90％以上，更优选100％的那种，虽然该存活率可能依赖于保存的细胞而改变。
本发明的细胞保存方法可为任何用其能够充分保存细胞的方法。例如，该方法可包括：在本发明的细胞保存用水溶液中分散要保存的细胞；分配该悬浮液进入容器中例如安瓿或冷冻管；初步冷冻该悬浮液20至30分钟；然后使该悬浮液在-80℃或-196℃深低温保藏。根据本发明的保存方法，能够不用程序冷冻机进行深低温保藏。
将在该细胞保存用水溶液中保存细胞的数量调节为，但不具体限定于，优选1×105至1×107个细胞/毫升，更优选5×105至5×106个细胞/毫升。
要保存的细胞可为任何细胞，只要该细胞能够用本发明的细胞保存用水溶液保存即可。这种细胞的实例包括各种动物的已建立细胞系、淋巴细胞、脾细胞、胸腺细胞、受精卵、骨髓瘤细胞、体干细胞、间充质干细胞和胚胎干细胞(ES细胞)等。特别地，所述动物可为小鼠(例如BALB/C、ICR和C3H)、大鼠、兔子、豚鼠、猫、母牛、山羊、狗、猪或人类等。此外，本发明的细胞保存用水溶液不仅可用于细胞的保存而且可以用于组织和器官的保存。
下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不限于这些实施例。
实施例1
<制备细胞保存用水溶液>
1.制备各个组分
如下描述制备细胞保存用水溶液的各个组分：
(1)增稠剂
a.CMC
通过在高温或常温下在蒸馏水中溶解5g羧甲基纤维素(由WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)制备CMC，总体积为750ml。
b.CMC-Na
通过在高温或常温下在蒸馏水中溶解5g羧甲基纤维素钠(由WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)制备CMC-Na，总体积为750ml。
c.聚丙烯酸钠
通过在蒸馏水中溶解5g聚丙烯酸钠(由WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)制备聚丙烯酸钠，总体积为750ml。
(2)防冷冻剂
d.二甲亚砜(DMSO)
使用100毫升二甲亚砜(由WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)。
e.丙二醇
使用100毫升丙二醇(由WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)。
(3)糖，pH调节剂等
f.磷酸盐缓冲液
使用磷酸盐缓冲液(由NissuiPharmaceuticalCO.，Ltd.制造)。
g.碱性贮备溶液(下文中BSS)
通过向双蒸馏水中添加30.0g葡萄糖、0.8g碳酸氢钠、0.36gHEPES(由WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)和1.576gPBS(由NissuiPharmaceuticalCo.，Ltd.制造)制备BSS，总体积为150ml。
(4)基础培养基(用于比较)
h.RPMI1640
以1.576g的量使用RPMI1640(由DainipponPharmaceuticalCo.，Ltd.制造)。
2.制备
在搅拌的同时混合以上项1中制备的各个组分来制备如表1所述的各个组合物。由通过一系列渐减孔径的1.0μm、0.5μm和0.22μm过滤器过滤来消毒该各个组合物。
[表1]
<细胞保存用水溶液的性能测试和规格测试>
1.性能测试
通过测量保存中细胞的存活率检测细胞保存用水溶液的性能。
通过离心收集在加入10-v/v％FBS的RPMI1640培养基中预培养的X63Ag8-6.5.3(小鼠骨髓瘤)细胞，然后加入1ml细胞保存用水溶液C、I和M中的每一种以使在该溶液中以5×105至5×106个细胞/毫升悬浮该细胞，接着分配该悬浮液进入2-毫升-容积的冷冻管中(由NuncCo.，Ltd.制造)。之后立即将该冷冻管在-80℃迅速冷冻，然后保存7天(n＝3)。
2.规格测试
检测如上述制备的每种细胞保存用水溶液的pH和渗透压。
此外，在表2中示出该各个细胞保存用水溶液的性能测试和规格测试的结果(n＝3)。如表2所示，保存用水溶液C和I都显示存活率80％以上。
从而，该结果确定表1所示的保存用水溶液C和I具有与包含基础培养基组分的保存用水溶液M的保存性能同等的保存性能，尽管溶液C和I都不包含血清和该基础培养的组分。
[表2]
实施例2
<不同类型细胞的存活率>
通过离心收集从加入10-v/v％FBS的RPMI1640培养基预先收获和分馏的表3中所述的细胞，加入1ml细胞保存用水溶液J或对比细胞保存用水溶液M，以使在该溶液中以5×105至5×106个细胞/毫升悬浮该细胞，接着分配该悬浮液进入2-毫升-容积的冷冻管中(由NuncCo.，Ltd.制造)。之后立即将该冷冻管在-80℃迅速冷冻，然后保存一定时间。表3示出了在淋巴细胞的情况下各个保存期后的细胞存活率，表4示出了在脾细胞的情况下各个保存期后的细胞存活率，和表5示出了在胸腺细胞的情况下各个保存期后的细胞存活率。
[表3]
[表4]
[表5]
如表3至5所示，在用本发明的细胞保存用水溶液保存的各种动物种类的淋巴细胞、脾细胞和胸腺细胞中的每一种中显示了几乎100％的存活率。该结果确定：即使没有任何天然动物源的组分，本发明的细胞保存用水溶液也能够充分地保存细胞。
实施例3
<检测葡萄糖浓度>
用上述实施例1的1中制备的各个组分制备细胞保存溶液C和N至R以致能得到表6所述的它们的组成。此外，以与上述实施例1相似的方式，通过使用X63Ag8-6.5.3.细胞进行每种细胞保存用水溶液的性能测试和规格测试。测试结果示于表6中。
如表6所示，每种包含2w/v％以下或7w/v％葡萄糖的保存用水溶液显示低的存活率。相反，每种包含至少3w/v％至5w/v％葡萄糖的保存用水溶液显示80％以上的存活率。
[表6]
实施例4
<检测防冷冻剂浓度>
用上述实施例1的1中制备的各个组分制备细胞保存溶液C和S至X以致能得到表7所述的它们的组成。此外，以与上述实施例1相似的方式，通过使用SK-007细胞或Jurkat细胞进行每种细胞保存用水溶液的性能测试和规格测试。测试结果示于表7中。
如表7所示，各自包含3w/v％以下DMSO或15w/v％DMSO作为防冷冻剂的保存用水溶液对于任何细胞都显示低的存活率。相反，各自包含至少5w/v％至12w/v％DMSO的保存用水溶液显示80％以上的存活率。
<SK-007细胞，Jurkat细胞>
SK-007：人类骨髓性白血病细胞(B-细胞白血病细胞)
Jurkat：人类T-细胞白血病细胞
在37℃5％CO2条件下在加入10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养每种细胞。
[表7]
实施例5
<检测增稠剂浓度>
用上述实施例1的1中制备的各个组分制备细胞保存溶液Y至AC以致能得到表8所述的它们的组成。此外，以与上述实施例1相似的方式，通过使用SK-007细胞或Jurkat细胞进行每种细胞保存用水溶液的性能测试和规格测试。测试结果示于表8中。
如表8所示，包含0.1w/v％至1.0w/v％有机酸聚合物作为增稠剂的保存用水溶液对于任何细胞都显示90％以上的存活率。
[表8]
实施例6
<细胞保存用水溶液的性能测试>
通过检测保存中的细胞的存活率、增殖能力和分化能力评价细胞保存用水溶液的性能。
1.检测细胞存活率
关于保存中的细胞的存活率，评价细胞保存用水溶液M、I和K中的每一种的性能。向在37℃5％CO2条件下在补充有10v/v％FBS的IMDM培养基中预先培养的源自人类脐带血的间充质干细胞中加入1ml细胞保存用水溶液M、I和K中的每一种，以使在该溶液中以2×105个细胞/毫升悬浮该细胞，接着分配该悬浮液进入2-毫升-容积的冷冻管中(由NuncCo.，Ltd.制造)。之后立即将该冷冻管在-80℃迅速冷冻，保存4天，然后在-196℃(液氮罐)保存72天(n＝3)。
在水浴中在37℃解冻含有细胞的冷冻管，用9mlIMDM和1mlFBS的混合物洗两次。通过离心收集细胞，并计算细胞的数量。如图1a所示，细胞保存用水溶液I和K各自显示与保存在细胞保存用水溶液M中的情况相似的细胞存活率。在各种细胞保存用水溶液中的细胞存活率为：M为97％，I为90％和K为86％，它们中的每种在细胞保存方面都显示高的性能。
2.检测增殖能力
对在用保存溶液M、I和K冷冻贮藏的细胞检测细胞增殖能力的保持。在培养皿(35mm)上接种在以上项1中保存的细胞以使细胞数量为5×104个细胞，然后培养，接着计算4天和8天后的细胞数量。为计算细胞，使用台盼蓝排除死细胞。如图1b所示，保存在细胞保存用水溶液I和K中的每一种的细胞与保存在细胞保存用水溶液M中的细胞显示相似的细胞生长。因此，该结果确定细胞保存溶液M、I和K中的每一种都能在保持细胞增殖能力的同时保存细胞。
3.检测分化能力
在培养皿(35mm)上接种在以上项1中保存的细胞以使细胞数量为5×104个细胞，然后在表9所示的用于成骨细胞或脂肪细胞的分化诱导培养基中培养28天，接着检测每种细胞是否保持其分化能力。
[表9]
用于成骨细胞的分化诱导培养基 用于脂肪细胞的分化诱导培养基
培养基 成分 IMDM+1v/v％FBS 0.1μM地基米松 50μg/mL抗坏血酸 10mMβ-磷酸甘油酯 10ng/mL hEGF IMDM+10v/v％FBS 0.1μM地基米松 0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 0.1mM吲哚美辛
如图2a所示，培养后28天进行茜素红染色。结果，保存在细胞保存用水溶液M、I和K中的任何一种中的细胞显示诱导成骨细胞分化。在图2b中，同样地，油红O染色显示保存在细胞保存用水溶液M、I和K中的任何一种细胞出现诱导脂肪细胞分化。因此，确认细胞保存用水溶液M、I和K中的每一种都能够在保持细胞分化能力的同时保存细胞。
工业应用性
由于本发明的细胞保存用水溶液无来自基础培养基和血清中的天然动物源组分，从而对于医学应用是安全的，这是因为可能对要保存的细胞有影响的杂质污染的危险性低。此外，因为该溶液不使用任何基础培养基、血清等，所以可低成本得到该溶液。

Claims (16)

1.一种动物细胞保存用水溶液，其包括以下组成(a)至(e)并具有pH6.5至9.0，该水溶液无天然动物源组分：
(a)5.0至12.0w/v％的DMSO；
(b)3.0至5.0w/v％的葡萄糖；
(c)0.1至1.0w/v％的增稠剂；
(d)0.01至1.0w/v％的pH调节剂；和
(e)适量水；
所述增稠剂为羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或有机酸聚合物；
所述pH调节剂为碳酸氢钠、HEPES或磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的动物细胞保存用水溶液，其由以下组成(a)至(e)组成并具有pH6.5至9.0，其中所述水溶液无天然动物源组分：
(a)5.0至12.0w/v％的DMSO；
(b)3.0至5.0w/v％的葡萄糖；
(c)0.1至1.0w/v％的增稠剂；
(d)0.01至1.0w/v％的pH调节剂；和
(e)适量水。
3.根据权利要求1或2所述的动物细胞保存用水溶液，其中渗透压为1,000mOsm以上。
4.根据权利要求1或2所述的动物细胞保存用水溶液，其中该渗透压为1,000至2,700mOsm。
5.根据权利要求1或2所述的动物细胞保存用水溶液，其中该有机酸聚合物包括聚丙烯酸钠。
6.根据权利要求1或2所述的动物细胞保存用水溶液，其中该pH调节剂为磷酸盐缓冲液。
7.一种动物细胞保存用水溶液，其包括以下组成(a)至(e)并具有pH6.5至9.0，其中所述水溶液无天然动物源组分：
(a)5.0至12.0w/v％的DMSO；
(b)3.0至5.0w/v％的葡萄糖；
(c)0.2至0.7w/v％的增稠剂；
(d)0.01至1.0w/v％的磷酸盐缓冲液；和
(e)适量水；
所述增稠剂为羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或有机酸聚合物。
8.根据权利要求7所述的动物细胞保存用水溶液，其由以下组成(a)至(e)组成并具有pH6.5至9.0，其中所述水溶液无天然动物源组分：
(a)5.0至12.0w/v％的DMSO；
(b)3.0至5.0w/v％的葡萄糖；
(c)0.2至0.7w/v％的增稠剂；
(d)0.01至1.0w/v％的磷酸盐缓冲液；和
(e)适量水。
9.根据权利要求1、2、7或8所述的动物细胞保存用水溶液，其中保存的动物细胞包括以下任何细胞：淋巴细胞、脾细胞、胸腺细胞、体干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞。
10.根据权利要求1、2、7或8所述的动物细胞保存用水溶液，其中将该水溶液用于医学应用。
11.根据权利要求1、2、7或8所述的动物细胞保存用水溶液，其中动物细胞保存方法包括深低温保藏。
12.根据权利要求1、2、7或8所述的动物细胞保存用水溶液，其中保存后的细胞存活率为至少80％。
13.根据权利要求1、2、7或8所述的动物细胞保存用水溶液，其中在-80℃保存4天后和进一步在-196℃保存72天后保持了细胞的增殖能力。
14.根据权利要求1、2、7或8所述的动物细胞保存用水溶液，其中保存后保持了细胞的分化能力。
15.一种动物细胞保存方法，其包括：在根据权利要求1-14任一项所述的动物细胞保存用水溶液中分散细胞；分配该细胞进入容器中；和使该细胞进行深低温保藏。
16.根据权利要求15所述的动物细胞保存方法，其中该分配细胞的数量为1×105至1×107个细胞/毫升。
CN200680042980.5A 2005-11-17 2006-11-17 细胞保存用水溶液 Active CN101310009B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005333203 2005-11-17
JP333203/2005 2005-11-17
PCT/JP2006/322985 WO2007058308A1 (ja) 2005-11-17 2006-11-17 細胞保存用水溶液

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101310009A CN101310009A (zh) 2008-11-19
CN101310009B true CN101310009B (zh) 2016-01-06

Family

ID=38048691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200680042980.5A Active CN101310009B (zh) 2005-11-17 2006-11-17 细胞保存用水溶液

Country Status (7)

Country Link
US (1) US8460926B2 (zh)
EP (1) EP1950283B1 (zh)
JP (2) JP5763288B2 (zh)
KR (2) KR20140014318A (zh)
CN (1) CN101310009B (zh)
ES (1) ES2544747T3 (zh)
WO (1) WO2007058308A1 (zh)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8409846B2 (en) 1997-09-23 2013-04-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Veteran Affairs Compositions, methods and devices for maintaining an organ
IL273422B (en) 2004-10-07 2022-07-01 Transmedics Inc Methods and systems for extracorporeal organ treatment
US9301519B2 (en) * 2004-10-07 2016-04-05 Transmedics, Inc. Systems and methods for ex-vivo organ care
US8304181B2 (en) 2004-10-07 2012-11-06 Transmedics, Inc. Method for ex-vivo organ care and for using lactate as an indication of donor organ status
US9078428B2 (en) 2005-06-28 2015-07-14 Transmedics, Inc. Systems, methods, compositions and solutions for perfusing an organ
US8460926B2 (en) * 2005-11-17 2013-06-11 Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd Aqueous solution for cell preservation
ES2772676T3 (es) * 2006-04-19 2020-07-08 Transmedics Inc Sistema de cuidado de órganos ex vivo
US9457179B2 (en) * 2007-03-20 2016-10-04 Transmedics, Inc. Systems for monitoring and applying electrical currents in an organ perfusion system
NO331476B1 (no) * 2007-12-21 2012-01-16 Jaffar Ali Bin M Abdullah Proteinfri gamete- og embryo-handtering samt dyrkningsmedieprodukter inneholdende metylcellulose
US9462802B2 (en) * 2008-01-31 2016-10-11 Transmedics, Inc. Systems and methods for ex vivo lung care
CN103858859B (zh) 2008-06-27 2015-11-04 博傲沃德株式会社 细胞及组织的冷冻保存用组合物
KR101092411B1 (ko) * 2009-07-22 2011-12-09 (주)시지바이오 이식용 동종 피부의 처리 방법 및 그로부터 제조된 동결보존동종피부
EP2641966A4 (en) * 2010-11-19 2014-04-30 Seiren Kabushiki Kaisha VITRIFIED STORAGE SOLUTION FOR CELLS
EP4032401A1 (en) * 2011-04-14 2022-07-27 Transmedics, Inc. Organ care solution for ex-vivo machine perfusion of donor lungs
JP6200883B2 (ja) * 2011-04-29 2017-09-20 ユニヴァーシティー オブ サザン カリフォルニア ポリマー基質上の幹細胞由来網膜色素上皮細胞の低温保存方法
TWI535377B (zh) 2011-09-01 2016-06-01 Storage, culture and application of umbilical cord tissue and its derived cells
CN102487939B (zh) * 2011-12-29 2014-04-09 上海润生生物技术有限公司 一种间充质干细胞储存液
CN102669087A (zh) * 2012-05-15 2012-09-19 深圳市博泰生物医疗机构管理有限公司 一种外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法
CN103027032B (zh) * 2012-09-29 2014-09-17 浙江大学 一种鼠李糖脂作为细胞低温或超低温保存的保护剂应用
EP2885969B1 (en) * 2013-12-19 2018-06-27 FertiPro N.V. Cryopreservation tools and methods
JP6745449B2 (ja) * 2013-12-27 2020-08-26 ゼノアックリソース株式会社 臍帯組織の凍結保存方法
ES2839202T3 (es) 2014-06-02 2021-07-05 Transmedics Inc Sistema de cuidado de órganos ex vivo
KR102355306B1 (ko) * 2014-07-09 2022-01-24 제넨테크, 인크. 세포 은행의 해동 회수를 개선하는 ph 조정
WO2016076428A1 (ja) * 2014-11-14 2016-05-19 日本赤十字社 臍帯血および末梢血の凍結保存方法および凍結保存用溶液
CN104593321A (zh) * 2014-11-17 2015-05-06 天津美欧盛医生物科技有限公司 一种复合式细胞悬浮培养基及其制备方法与应用
US11083191B2 (en) 2014-12-12 2021-08-10 Tevosol, Inc. Apparatus and method for organ perfusion
CN104719285B (zh) * 2015-04-16 2016-08-31 中国农业科学院特产研究所 卵巢常温保存液及保存方法
IL310004A (en) 2015-09-09 2024-03-01 Transmedics Inc A tube and a catheter for a system to treat organs outside the body
US11160271B2 (en) * 2016-09-30 2021-11-02 Taipei Veterans General Hospital Anti-freezing agent for protecting biological tissue during freezing treatment and preparation method therefor
CN109803665A (zh) 2016-10-18 2019-05-24 国立大学法人大阪大学 疾病治疗剂制备用试剂盒、疾病治疗剂和疾病治疗剂的制备方法
JP7134416B2 (ja) 2016-10-28 2022-09-12 国立研究開発法人国立がん研究センター ヒト肝前駆細胞の調製方法
CN106719604A (zh) * 2017-02-04 2017-05-31 上海尚维生物科技有限公司 宠物外周血直接冻存试剂和方法
CN110139657A (zh) 2017-02-15 2019-08-16 日本乐敦制药株式会社 肺纤维化治疗剂、ptprr表达促进剂及肺纤维化治疗用试剂盒
US20200016211A1 (en) 2017-03-03 2020-01-16 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. Mesenchymal stem cells and pharmaceutical composition
EP3591037A4 (en) 2017-03-03 2020-11-11 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. MESENCHYMATIC STEM CELL AND THERAPEUTIC AGENT AGAINST LIVER DISEASES
JPWO2018225440A1 (ja) 2017-06-09 2020-04-09 国立大学法人大阪大学 拡張型心筋症治療剤
CN107027743B (zh) * 2017-06-14 2020-12-29 沃昕生物科技(深圳)有限公司 细胞冻存液及细胞冻存方法
EP3456343A1 (en) * 2017-08-09 2019-03-20 Dodge Private Equity Ltd. Vaccine formulation of dendritic cells
CN107996558A (zh) * 2017-12-21 2018-05-08 湖南丰晖生物科技有限公司 细胞冻存液及其应用
JPWO2019172112A1 (ja) * 2018-03-06 2021-02-18 ゼノアックリソース株式会社 細胞凍結保存用溶液およびその利用
KR20210075986A (ko) 2018-09-07 2021-06-23 유니버시티 오브 써던 캘리포니아 세포 시딩된 기질의 동결보존 및 관련 방법
CN109874780A (zh) * 2019-03-08 2019-06-14 北京美迪阿姆科技发展有限公司 渗透性保护剂、无血清冻存液以及该无血清冻存液的制备与使用方法
CN109938010A (zh) * 2019-03-20 2019-06-28 江苏瑞思坦生物科技有限公司 一种人脂肪间充质干细胞运输液及其制备方法
CN110637810A (zh) * 2019-10-18 2020-01-03 中生康元生物科技(北京)有限公司 一种临床级树突状细胞冻存液
CN112544611B (zh) * 2020-12-16 2021-10-29 生物岛实验室 细胞冻存剂及细胞的冻存方法
WO2023276873A1 (ja) 2021-06-28 2023-01-05 三井化学株式会社 環状オレフィン重合体、環状オレフィン重合体組成物および成形体
DE102021116694B4 (de) 2021-06-29 2023-03-09 Promocell Gmbh Wässrige Lösung zur Zellkonservierung
CN114019175A (zh) * 2021-09-17 2022-02-08 广西康柏莱科技有限公司 用于糖化血红蛋白试剂盒的抗冻剂及其应用方法
KR20230171168A (ko) 2022-06-13 2023-12-20 주식회사 엔디소프트 화자분할 기술이 적용된 앱을 이용한 단말기 음성 대화 방법

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63216476A (ja) * 1987-03-05 1988-09-08 Rikagaku Kenkyusho 無血清凍結保存用培地
US5213814A (en) 1989-04-10 1993-05-25 Cryopharm Corporation Lyophilized and reconstituted blood platelet compositions
US8067149B2 (en) 1990-09-12 2011-11-29 Lifecell Corporation Acellular dermal matrix and method of use thereof for grafting
CA2078004A1 (en) * 1991-02-15 1992-08-16 Christine M. Williams Method of lyophilization and reconstitution of mixtures of nucleated non-mammalian cells and blood matter
JPH0646840A (ja) 1992-08-04 1994-02-22 Nippon Zenyaku Kogyo Kk 細胞凍結保存液
US6680305B1 (en) * 1993-06-04 2004-01-20 Biotime, Inc. Physiologically acceptable aqueous solutions and methods for their use
JPH11292701A (ja) * 1998-04-03 1999-10-26 Shimizu Pharmaceutical Co Ltd 細胞保護液
ES2367352T3 (es) * 1999-04-28 2011-11-02 Genetics Institute, Llc Tratamiento de la fibrosis meidante el antagonismo de la il-3 y de las cadenas del receptor del il-3.
GB9916790D0 (en) * 1999-07-16 1999-09-22 Health Lab Service Board Storage of microorganisms,cells and tissue
JP3694730B2 (ja) * 2000-03-02 2005-09-14 国立大学法人京都大学 組織の冷却保存液
WO2001070021A1 (fr) * 2000-03-24 2001-09-27 Menicon Co., Ltd. Procede de conservation d'equivalent au tissu et equivalent au tissu conserver a l'etat congele
AU2004269405A1 (en) * 2003-09-02 2005-03-10 University Of North Carolina At Chapel Hill Biodegradable polymer-ligand conjugates and their uses in isolation of cellular subpopulations and in cryopreservation, culture and transplantation of cells
WO2006033429A1 (ja) * 2004-09-24 2006-03-30 Seiren Kabushiki Kaisha 細胞凍結保存用組成物
US8460926B2 (en) * 2005-11-17 2013-06-11 Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd Aqueous solution for cell preservation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
项黎新等.衣藻细胞玻璃化超低温保存技术的研究.《细胞生物学杂志》.2001,第23卷(第2期),第110-113页. *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140014318A (ko) 2014-02-05
JP2014113166A (ja) 2014-06-26
US20090142830A1 (en) 2009-06-04
WO2007058308A1 (ja) 2007-05-24
JPWO2007058308A1 (ja) 2009-05-07
ES2544747T3 (es) 2015-09-03
EP1950283B1 (en) 2015-07-29
JP5835853B2 (ja) 2015-12-24
EP1950283A1 (en) 2008-07-30
CN101310009A (zh) 2008-11-19
JP5763288B2 (ja) 2015-08-12
EP1950283A4 (en) 2013-04-24
US8460926B2 (en) 2013-06-11
KR20080068897A (ko) 2008-07-24
KR101368924B1 (ko) 2014-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101310009B (zh) 细胞保存用水溶液
CN102511471B (zh) 一种间充质干细胞冻存液及其制备方法
CN109790514A (zh) 维持细胞存活率的组合物和方法
CN103070161B (zh) 一种脂肪间充质干细胞冻存液及冻存方法
CN104145943B (zh) 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用
CN102807966B (zh) 胎盘全细胞冻存、复苏以及分离和扩增干细胞的方法
CN104962539B (zh) 用于adamts蛋白表达的细胞培养基
CN101479377A (zh) 来自冷冻的脐带组织的活细胞
JP7401865B2 (ja) 機能的な間葉系幹細胞の富化集団を得る方法、それによって得られる細胞、およびその細胞を含む組成物
CN104918486A (zh) 冷冻保护试剂,冷冻保护和冷冻保存的组合物,其用途,和冷冻保存方法
CN109517787A (zh) 一种快速冻存和复苏子宫内膜干细胞的方法
JP7038369B2 (ja) ウシ生殖細胞の凍結保存用組成物及び凍結保存方法
JP4968816B2 (ja) バチルス属細菌の芽胞形成方法
CN110024775A (zh) 临床细胞制剂用保存液的配方和用途
CN109619088A (zh) 一种脂肪间充质干细胞的保存液
ES2614041T3 (es) Método de lavado celular adherentes usando solución de lavado celular que contiene trehalosa
US20100227307A1 (en) Ergothioneine and/or its derivatives as a cell preservative
CN106035315B (zh) 用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的奶牛乳腺组织冻存液及其在乳腺组织冻存方法中的应用
CN107254446A (zh) 一种人原代肿瘤细胞的分离制备方法
CN106282105A (zh) 一种间充质干细胞培养基
CN104152404A (zh) 提高胚胎耐热性的培养液及其使用方法
CN103881967B (zh) 一种含海藻糖的牛卵母细胞体外成熟培养液及培养方法
Hart et al. Differential effect of trypsin and trypsin inhibitors on lipopolysaccharide stimulation of hamster lymphoid cells
CN108220232A (zh) 一种基于胎牛血清的培养基的培养方法
RU2646135C1 (ru) Способ хранения почки поросенка для получения монослоя первичнотрипсинизированных клеток и использования его в вирусологических исследованиях

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant