CN104719285B - 卵巢常温保存液及保存方法 - Google Patents
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Abstract
卵巢常温保存液及卵巢常温保存方法。它涉及一种卵巢保存液及卵巢保存方法。解决了目前常温保存卵巢的时间过短，影响卵母细胞数量和质量的问题。卵巢常温保存液包括磷酸盐缓冲液、葡萄糖和茶多酚。常温保存方法：一、去掉卵巢周围脂肪组织，再用生理盐水漂洗卵巢；二、将步骤一清洗干净的卵巢放入卵巢常温保存液中。本发明卵巢常温保存液具有高效、廉价、方便以及对细胞没有毒性的优点。本发明卵巢的常温保存方法简单，操作容易，无需其他制冷设备，特别适合野外收集、采集野生动物卵巢，以及动物卵巢采集后需要常温长途运输的情况。
Description
技术领域
本发明涉及一种卵巢保存液及卵巢保存方法。
背景技术
随着生殖生物技术(如细胞核移植和转基因等胚胎工程技术)的深入研究，以及胚胎体外生产和胚胎移植商业化的发展，如何获得数量更多的高质量卵母细胞已成为重中之重。卵巢的收集和运输一般需要较长的时间，如野外取得野生动物卵巢，城市间或国际间运输雌性动物生殖细胞，屠宰场取得家畜卵巢等情况下，卵巢都会置于体外较长时间，导致卵母细胞发育能力下降。
尽管通过冷冻保存卵巢进行胚胎体外生产已经成功；但是解冻后卵母细胞成熟率和胚胎发育能力较低，而且冷冻保存过程繁琐，需要冷冻和保持低温的设备，冷冻保存成本较高。
目前常温保存卵巢的最长时间仅为8小时左右，对于需要长途运输或者野外采集的情况来说过于紧迫。一旦超过8小时可采集到的卵母细胞数量和质量大幅度下降，造成了卵母细胞的极大浪费。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前常温保存卵巢的时间过短，影响卵母细胞数量和质量的问题，而提供的一种卵巢常温保存液及卵巢常温保存方法。
卵巢常温保存液包括磷酸盐缓冲液、葡萄糖和茶多酚；卵巢常温保存液以磷酸盐缓冲液为基础液，卵巢常温保存液中葡萄糖的浓度为15mmol/L、茶多酚的浓度为20μmol/L。
使用上述卵巢常温保存液的卵巢常温保存方法按以下步骤进行：
一、去掉卵巢周围脂肪组织，再用生理盐水漂洗卵巢；
二、将步骤一清洗干净的卵巢放入卵巢常温保存液中；即完成卵巢的常温保存。
本发明中磷酸盐缓冲液(PBS)每升1L由8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾和余量的蒸馏水组成，其pH值为7.2。
采用本发明卵巢常温保存液对卵巢进行常温(10～25℃)保存的时间均≥12h。在15℃的常温条件下本发明卵巢常温保存液保存32小时的牛卵巢的卵母细胞成熟率，孤雌激活后囊胚率仍能够达到与新鲜卵巢卵母细胞相同的发育能力，因此保证了卵母细胞数量和质 量，避免了卵母细胞的浪费，其保存时间4倍于现有技术。本发明卵巢常温保存液中茶多酚不仅具有抗氧化的功能，葡萄糖也不单单是能量供给，而是通过葡萄糖和茶多酚间的相互作用，有效地延长了常温条件下卵巢的体外保存时间，增加了卵母细胞采集数量，提高体外成熟后胚胎发育能力。
本发明卵巢的常温保存方法简单，操作容易，无需其他制冷设备，特别适合野外收集、采集野生动物卵巢，以及动物卵巢采集后需要常温长途运输的情况。
本发明卵巢常温保存方法可以解决GV期卵母细胞在常温下保存，保存后成熟率和发育率下降的问题，可直接保存卵巢组织，获得优质卵母细胞。
本发明卵巢常温保存液具有高效、廉价、方便以及对细胞没有毒性的优点。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式卵巢常温保存液包括磷酸盐缓冲液、葡萄糖和茶多酚；卵巢常温保存液以磷酸盐缓冲液为基础液，卵巢常温保存液中葡萄糖的浓度为15mmol/L、茶多酚的浓度为20μmol/L。
磷酸盐缓冲液(PBS)每升1L由8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾和余量的蒸馏水组成，其pH值为7.2。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：卵巢常温保存液还包括抗生素；卵巢常温保存液中抗生素为青霉素和链霉素，青霉素的浓度为0.06g/L，链霉素的浓度为0.05g/L。其它与实施方式一相同。
本实施方式加入抗生素，避免了微生物的滋生，更好的保证了卵巢的质量。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：卵巢常温保存液还包括果糖；卵巢常温保存液中果糖的浓度为0.12g/L。其它与实施方式一或二相同。
本实施方式加入果糖，果糖能够较快地穿透细胞组织，抑制卵巢微生物生长，迅速给卵巢组织提供能量。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一、二或三的不同点是：卵巢常温保存液的渗透压为320～330mOsmol/kg、pH值为7.2。其它与实施方式一、二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式卵巢的常温保存方法按以下步骤进行：
一、去掉卵巢周围脂肪组织，再用生理盐水漂洗卵巢；
二、将步骤一清洗干净的卵巢放入卵巢常温保存液中；即完成卵巢的常温保存。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤二中卵巢保存温度为10～25℃。其它步骤及参数与实施方式五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤二中卵巢保存温度为15℃。其它步骤及参数与实施方式五相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式五、六或七的不同点是：步骤二每升卵巢常温保存液中保存卵巢40～50个。其它步骤及参数与实施方式五、六或七相同。
本实施方式中所述卵巢为牛动物的卵巢，根据卵巢的体积可适当调整每升卵巢常温保存液中保存卵巢的数量。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式五至八之一的不同点是：步骤二卵巢常温保存液还包括抗生素；卵巢常温保存液中抗生素为青霉素和链霉素，青霉素的浓度为0.06g/L，链霉素的浓度为0.05g/L。其它步骤及参数与实施方式五至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式五至九之一的不同点是：步骤二卵巢常温保存液还包括果糖；卵巢常温保存液中果糖的浓度为0.12g/L。其它步骤及参数与实施方式五至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式五至十之一的不同点是：步骤二卵巢常温保存液的渗透压为320～330mOsmol/kg、pH值为7.2。其它步骤及参数与实施方式五至十之一相同。
实施例1
卵巢的常温保存方法按以下步骤进行：
一、去掉卵巢周围脂肪组织，再用生理盐水漂洗卵巢；
二、将步骤一清洗干净的卵巢放入卵巢常温保存液中；即完成卵巢的常温保存；
其中，步骤二中卵巢保存温度分别为5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和37℃；
步骤二每升卵巢常温保存液中保存牛卵巢50个；
步骤二卵巢常温保存液包括磷酸盐缓冲液、葡萄糖、茶多酚青霉素和链霉素；卵巢常温保存液以磷酸盐缓冲液为基础液，卵巢常温保存液中葡萄糖的浓度为15mmol/L、茶多酚的浓度为20μmol/L，青霉素的浓度为0.06g/L，链霉素的浓度为0.05g/L。
磷酸盐缓冲液(PBS)每升1L由8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾和余量的蒸馏水组成，其pH值为7.2。
实施例2
实施例2与实施例1除所使用的卵巢常温保存液和保存温度不同之外，其余均相同。
实施例2卵巢常温保存液包括磷酸盐缓冲液、蔗糖和胡萝卜素；卵巢常温保存液以磷酸盐缓冲液为基础液，卵巢常温保存液中蔗糖的浓度为0.15mol/L、胡萝卜素的浓度为20mg/L；
实施例2保存温度为15～25℃。
实施例3
实施例3与实施例1除所使用的卵巢常温保存液和保存温度不同之外，其余均相同。
实施例3卵巢常温保存液包括磷酸盐缓冲液、蔗糖和维生素C；卵巢常温保存液以磷酸盐缓冲液为基础液，卵巢常温保存液中蔗糖的浓度为0.15mol/L、维生素C的浓度为400mg/L；
实施例3保存温度为15～25℃。
实施例4
采新鲜的牛卵巢。实施例4保存温度为15～25℃。
对比试验：
实施例1、实施例2和实施例3获得的卵巢均采用以下步骤进行处理：卵巢在25℃恢复20min，将卵巢移入38℃生理盐水中。
之后采用固定有18号针头的20ml注射器，吸取少量D-PBS(Dulbecco`s Phosphate Buffered Saline)，采用抽吸法采集卵巢表面直径为2～6mm卵泡中的卵母细胞，在体视显微镜下收集可用于体外成熟的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，COCs用洗卵液洗涤3～5次；然后在培养皿中培养24h，1个卵母细胞/5μl成熟培养液，石蜡油覆盖液滴，培养条件为CO2浓度为5％、温度为38.5℃、饱和湿度。
其中，成熟培养液为TCM-199培养液：基础培养液为TCM199(Gibco,Grand Island，New York,USA)，添加胎牛血清浓度至10％(V/V)、FSH浓度至0.05IU/ml、LH浓度至0.05IU/ml、17β-雌二醇浓度至1μg/ml、丙酮酸钠浓度至24.2mg/L、EGF浓度至10ng/ml、青霉素浓度至100IU/ml和硫酸链霉素浓度至100μg/ml。
把实施例1、实施例2和实施例3成熟培养后的COCs和实施例4新鲜的COCs分别移入0.1％(w/v)的透明质酸酶中作用0.5分钟，用适当口径的微吸管反复吹打，去净卵丘细胞。选择具有第一极体的成熟卵母细胞进行激活；Ionomycin(Sigma，I-0634)和 6-DMAP(Sigma，D-2629)用DMSO溶解，使用前用含有3mg/ml BSA和5％FCS的CR1aa(Rosenkrans et al.,1991)稀释到使用浓度。成熟卵母细胞在5μmol/L的Ionomycin中室温处理5分钟，用CR1aa充分洗净，然后在含2mmol/L 6-DMAP的CR1aa中处理4h。激活处理后，卵母细胞在不含6-DMAP的CR1aa中继续培养，每隔48h换半液，培养结束后，在显微镜下检查实施例1、实施例2、实施例3和实施例4中牛卵母细胞胚胎发育的各个阶段。
以实施例4获得的新鲜牛卵母细胞的成熟率和孤雌激活后囊胚率为基准，测量在维持该基准不降低的情况下，实施例1、实施例2和实施例3中卵巢可保存的最长时间。试验结果如表1所示。
表1
对比试验结果证明，采用本发明卵巢常温保存液对卵巢进行常温保存，并非保存温度越低卵母细胞的保存效果越好，本发明卵巢常温保存液最佳的保存卵巢(使用)温度为15～25℃，保存时间长达16～32h，至少为目前常温保存时间的2倍以上。试验说明本发明卵巢常温保存液不是通过降低环境温度的方法来抑制或减缓细胞代谢的。
Claims (8)
1.卵巢常温保存液，其特征在于卵巢常温保存液包括磷酸盐缓冲液、葡萄糖、抗生素和茶多酚；卵巢常温保存液以磷酸盐缓冲液为基础液，卵巢常温保存液中葡萄糖的浓度为15mmol/L、茶多酚的浓度为20µmol/L，卵巢常温保存液中抗生素为青霉素和链霉素，青霉素的浓度为0.06g/L，链霉素的浓度为0.05g/L。
2.根据权利要求1所述的卵巢常温保存液，其特征在于卵巢常温保存液还包括果糖；卵巢常温保存液中果糖的浓度为0.12g/L。
3.根据权利要求1所述的卵巢常温保存液，其特征在于卵巢常温保存液的渗透压为320~330mOsmol/kg、pH值为7.2。
4.使用权利要求1卵巢常温保存液的卵巢常温保存方法，其特征在于卵巢的常温保存方法按以下步骤进行：
一、去掉卵巢周围脂肪组织，再用生理盐水漂洗卵巢；
二、将步骤一清洗干净的卵巢放入卵巢常温保存液中；即完成卵巢的常温保存。
5.根据权利要求4所述的卵巢常温保存方法，其特征在于步骤二中卵巢保存温度为10~25℃。
6.根据权利要求4所述的卵巢常温保存方法，其特征在于步骤二中卵巢保存温度为15℃。
7.根据权利要求4所述的卵巢常温保存方法，其特征在于步骤二每升卵巢常温保存液中保存卵巢40~50个。
8.根据权利要求4所述的卵巢常温保存方法，其特征在于步骤二卵巢常温保存液还包括果糖；卵巢常温保存液中果糖的浓度为0.12g/L。
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