CN107372361A - 一种蜜蜂卵超低温冷冻方法及其配套工具 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蜜蜂卵超低温冷冻方法及其配套工具，涉及生物技术领域，其方法包括蜂卵获取、蜂卵收集、蜂卵渗透平衡、蜂卵冻前准备、蜂卵滴冻、蜂卵集中冻存、蜂卵解冻与复水、蜂卵移植和培养共八个工艺过程，本发明的方法操作简单，基于配合蜜蜂卵超低温冷冻贮存技术而实现，配合所使用的成套专用工具，提高了蜜蜂卵在冷冻解冻过程中的存活率，重复性和稳定性好，操作方便；且所使用的工具结构简单，实用性强，制造成本低廉，无需复杂的设备即可完成蜂卵的超低温冷冻。

Description

一种蜜蜂卵超低温冷冻方法及其配套工具

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蜜蜂卵超低温冷冻方法及其配套工具。

背景技术

蜜蜂卵(胚胎)的超低温冷冻贮存技术是我国蜜蜂遗传资源保护和利用的重要技术手段，该技术已经应用于国家级蜜蜂基因库建设。

蜜蜂卵冷冻是指在实验室条件下，将蜜蜂卵经过某些药物处理，于液氮(-196℃)中冷冻保存，解冻后仍能继续发育的一种技术。其基本步骤为:移卵出巢房，用冷冻保护剂进行冻前平衡，预冻，冷冻，解冻，稀释脱除冷冻保护剂，恒温培育至孵化。如果冷冻保存后的蜜蜂卵经人工室内或蜜蜂箱内自然哺育能进一步发育，即孵化、化蛹、羽化乃至性成熟，可使蜂王做为两性遗传物质之载体的功能更具完美，并可根据需要培育蜂王，从而使杂交育种和纯种选育前景更加美好。

王丽华等，1997年在《福建农业大学学报》26(4):470～472上发表了“中华蜜蜂卵冷冻贮存技术”论文，蜜蜂卵冷冻贮存技术实现突破，其使用的仪器设备包括液氮罐、广口保温瓶、三用恒温水箱、放大镜、体视显微镜及一些养蜂小工具和常规玻璃器皿等。据查新，她们没有研制出专门与该技术配套的工具及其使用方法，其技术也没有得到转化和应用。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种稳定性好、操作简单、对蜜蜂卵伤害小的蜜蜂卵超低温冷冻方法。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：所提供的一种蜜蜂卵超低温冷冻方法，包括下述步骤：

(1)蜂卵获取：将蜂王装入蜂王产卵控制笼内，送入蜂群，囚禁蜂王控制笼内产卵，次日取出产有蜂卵的台基条备用；

(2)蜂卵收集：将产有蜜蜂卵的台基条固定到木质支架上，用滴管吸取预先配制好的生理液，逐滴滴加到粘有蜂卵的台基上，将卵覆盖，用卵的塑料剥离针在20倍体式显微镜下将生理液内的蜂卵逐粒剥离台基，使卵悬浮于液体内，再将该台基条立于一洁净培养皿内，用吸有生理液的滴管将剥离的蜂卵全部冲入培养皿内，逐条冲洗，将所有蜂卵都收集到该培养皿内；

(3)蜂卵渗透平衡：用滴管吸取培养皿内收集到一起的蜂卵，将其加入到平衡漏斗内，打开止水夹，生理液流出至废液皿，关闭止水夹，依次加入适量的蜂卵梯度渗透液一，分别渗透处理一定时间，使蜂卵脱水和渗透平衡，最后加入蜂卵冷冻保护液继续平衡；

(4)蜂卵冻前准备：在3L的广口玻璃内胆保温瓶内加入一定量制冷的液氮，将玻璃化冷冻滴冻盘悬于液氮之上，通过调节提钩位置，使盘体距离液氮面适当高度位置，降温平衡后用于蜂卵的滴冻；

(5)蜂卵滴冻：用滴管吸取悬有蜂卵的冷冻保护液，逐滴滴入玻璃化冷冻滴冻盘上的圆形凹陷内，冷冻保护液会迅速冷冻进入玻璃化状态；

(6)蜂卵集中冻存：将玻璃化冷冻的蜂卵集中入冻存管内密封并标记，投入到液氮内长期保存；

(7)蜂卵解冻与复水：取出装有蜂卵的冻存管，升温平衡一定时间后，将玻璃态颗粒投入解冻液内，迅速解冻，再将悬浮有蜂卵的解冻液转移入平衡漏斗内，将蜂卵集中，依次加入适量的蜂卵梯度渗透液二，分别渗透处理一定时间，使蜂卵吸水和渗透复原，最后加入蜂卵生理液继续复水；

(8)蜂卵移植和培养：用配有进样器的塑料吸持针吸持住经过检验合格的蜜蜂卵的头部，将其移动并立于台基条的台基上，所有蜂卵移植完毕后，将台基条固定到蜂卵培养盒内，并将培养盒置于恒温恒湿培养箱中，调节适宜的温湿度进行蜂卵培养。

进一步地，所述木质支架的上部中间开具一条长130mm、宽3.5mm、深5.0mm的凹槽。

进一步地，所述卵的脱水/复水平衡装置包括平衡漏斗、漏斗架、筛网、滴管、止水夹和废液皿，所述平衡漏斗固定在漏斗架上，所述筛网安装在平衡漏斗内，所述止水夹固定在平衡漏斗的底部，所述漏斗架的底部放置在废液皿内。

进一步地，所述玻璃化冷冻滴冻盘包括盘体、提柄和提钩，所述提柄连接于盘体的侧面，所述提钩滑动连接在提柄的下部，所述盘体上设有若干圆形凹陷。

进一步地，所述圆形凹陷的直径为6mm。

进一步地，所述蜂卵培养盒包括盒体和固定架，所述盒体的一侧设有开口，所述固定架竖直固定在盒体的内壁上，且固定架上设有若干用于卡接台基条的卡口。

进一步地，所述盒体的侧面形状为梯形。

进一步地，所述固定架的数量为2个。

本发明的有益效果：

(1)本发明的方法操作简单，基于配合蜜蜂卵超低温冷冻贮存技术而实现，配合所使用的工具，提高了蜜蜂卵在冷冻及解冻过程中的存活率，重复性和稳定性好，操作方便；

(2)本发明所使用的工具结构简单，实用性强，制造成本低廉，无需复杂的设备即可完成蜂卵的超低温冷冻。

附图说明

图1为本发明中所述的台基条的结构示意图。

图2为本发明中所述的台基条的台基条与木质支架的装配图。

图3为本发明中所述的卵的脱水/复水平衡装置的结构示意图。

图4为本发明中所述的塑料剥离针的结构示意图。

图5为本发明中所述的玻璃化冷冻滴冻盘的结构示意图。

图6为本发明中所述的塑料吸持针的结构示意图。

图7为本发明中所述的蜂卵培养盒的结构示意图。

图8为本发明中所述的蜜蜂卵超低温冷冻方法的流程图。

其中：1-台基条，11-台基，2-木质支架，21-凹槽，3-卵的脱水/复水平衡装置，31-平衡漏斗，32-漏斗架，33-筛网，34-滴管，35-止水夹，36-废液皿，4-玻璃化冷冻滴冻盘，41-盘体，42-提柄，43-提钩，44-圆形凹陷，5-蜂卵培养盒，51-盒体，52-固定架，53-卡口。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

如图8所示，一种蜜蜂卵超低温冷冻方法，包括下述步骤：

(1)蜂卵获取：将蜂王装入蜂王产卵控制笼内，送入蜂群，囚禁蜂王控制笼内产卵，次日取出产有蜂卵的台基条1备用；

(2)蜂卵收集：将产有蜜蜂卵的台基条1固定到木质支架2上，用滴管34吸取预先配制好的生理液，逐滴滴加到粘有蜂卵的台基11上，将卵覆盖，用卵的塑料剥离针在20倍体式显微镜下将生理液内的蜂卵逐粒剥离台基11，使卵悬浮于液体内，再将该台基条1立于一洁净培养皿内，用吸有生理液的滴管34将剥离的蜂卵全部冲入培养皿内，逐条冲洗，将所有蜂卵都收集到该培养皿内；

(3)蜂卵渗透平衡：用滴管34吸取培养皿内收集到一起的蜂卵，将其加入到平衡漏斗31内，打开止水夹35，生理液流出至废液皿36，关闭止水夹35，依次加入适量的蜂卵梯度渗透液一，分别渗透处理一定时间，使蜂卵脱水和渗透平衡，最后加入蜂卵冷冻保护液继续平衡；

(4)蜂卵冻前准备：在3L的广口玻璃内胆保温瓶内加入一定量制冷的液氮，将玻璃化冷冻滴冻盘4悬于液氮之上，通过调节提钩43位置，使盘体41距离液氮面适当高度位置，具体可为2厘米，降温平衡后用于蜂卵的滴冻；

(5)蜂卵滴冻：用滴管34吸取悬有蜂卵的冷冻保护液，逐滴滴入玻璃化冷冻滴冻盘4上的圆形凹陷44内，冷冻保护液会迅速冷冻进入玻璃化状态；

(6)蜂卵集中冻存：将玻璃化冷冻的蜂卵集中入冻存管内密封并标记，投入到液氮内长期保存；

(7)蜂卵解冻与复水：取出装有蜂卵的冻存管，升温平衡一定时间后，将玻璃态颗粒投入解冻液内，迅速解冻，再将悬浮有蜂卵的解冻液转移入平衡漏斗31内，将蜂卵集中，依次加入适量的蜂卵梯度渗透液二，分别渗透处理一定时间，使蜂卵吸水和渗透复原，最后加入蜂卵生理液继续复水；

(8)蜂卵移植和培养：用配有进样器的塑料吸持针吸持住经过检验合格的蜜蜂卵的头部，将其移动并立于台基条1的台基11上，所有蜂卵移植完毕后，将台基条1固定到蜂卵培养盒5内，并将培养盒置于恒温恒湿培养箱中，调节适宜的温湿度进行蜂卵培养。

如图1至图7所示，本发明中所述木质支架2的上部中间开具一条长130mm、宽3.5mm、深5.0mm的凹槽21。

在本实施例中，所述卵的脱水/复水平衡装置3包括平衡漏斗31、漏斗架32、筛网33、滴管34、止水夹35和废液皿36，所述平衡漏斗31固定在漏斗架32上，所述筛网33安装在平衡漏斗31内，所述止水夹35固定在平衡漏斗31的底部，所述漏斗架32的底部放置在废液皿36内。

在本实施例中，所述玻璃化冷冻滴冻盘4包括盘体41、提柄42和提钩43，所述提柄42连接于盘体41的侧面，所述提钩43滑动连接在提柄42的下部，所述盘体41上设有若干圆形凹陷44，所述圆形凹陷44的直径为6mm。

在本实施例中，所述蜂卵培养盒5包括盒体51和固定架52，所述盒体51的一侧设有开口，所述固定架52上竖直固定在盒体51的内壁上，且固定架52上设有若干用于卡接台基条1的卡口53，所述盒体51的侧面形状为梯形，所述固定架52的数量为2个。

显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种蜜蜂卵超低温冷冻方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)蜂卵获取：将蜂王装入蜂王产卵控制笼内，送入蜂群，囚禁蜂王控制笼内产卵，次日取出产有蜂卵的台基条备用；

(2)蜂卵收集：将产有蜜蜂卵的台基条固定到木质支架上，用滴管吸取预先配制好的生理液，逐滴滴加到粘有蜂卵的台基上，将卵覆盖，用卵的塑料剥离针在20倍体式显微镜下将生理液内的蜂卵逐粒剥离台基，使卵悬浮于液体内，再将该台基条立于一洁净培养皿内，用吸有生理液的滴管将剥离的蜂卵全部冲入培养皿内，逐条冲洗，将所有蜂卵都收集到该培养皿内；

(3)蜂卵渗透平衡：用滴管吸取培养皿内收集到一起的蜂卵，将其加入到平衡漏斗内，打开止水夹，生理液流出至废液皿，关闭止水夹，依次加入适量的蜂卵梯度渗透液一，分别渗透处理一定时间，使蜂卵脱水和渗透平衡，最后加入蜂卵冷冻保护液继续平衡；

(4)蜂卵冻前准备：在3L的广口玻璃内胆保温瓶内加入一定量制冷的液氮，将玻璃化冷冻滴冻盘悬于液氮之上，通过调节提钩位置，使盘体距离液氮面适当高度位置，降温平衡后用于蜂卵的滴冻；

(5)蜂卵滴冻：用滴管吸取悬有蜂卵的冷冻保护液，逐滴滴入玻璃化冷冻滴冻盘上的圆形凹陷内，冷冻保护液会迅速冷冻进入玻璃化状态；

(6)蜂卵集中冻存：将玻璃化冷冻的蜂卵集中入冻存管内密封并标记，投入到液氮内长期保存；

(7)蜂卵解冻与复水：取出装有蜂卵的冻存管，升温平衡一定时间后，将玻璃态颗粒投入解冻液内，迅速解冻，再将悬浮有蜂卵的解冻液转移入平衡漏斗内，将蜂卵集中，依次加入适量的蜂卵梯度渗透液二，分别渗透处理一定时间，使蜂卵吸水和渗透复原，最后加入蜂卵生理液继续复水；

(8)蜂卵移植和培养：用配有进样器的塑料吸持针吸持住经过检验合格的蜜蜂卵的头部，将其移动并立于台基条的台基上，所有蜂卵移植完毕后，将台基条固定到蜂卵培养盒内，并将培养盒置于恒温恒湿培养箱中，调节适宜的温湿度进行蜂卵培养。

2.一种应用于权利要求1所述的蜜蜂卵超低温冷冻方法的木质支架，其特征在于：所述木质支架的上部中间开具一条长130mm、宽3.5mm、深5.0mm的凹槽。

3.一种应用于权利要求1所述的蜜蜂卵超低温冷冻方法的卵的脱水/复水平衡装置，其特征在于：所述卵的脱水/复水平衡装置包括平衡漏斗、漏斗架、筛网、滴管、止水夹和废液皿，所述平衡漏斗固定在漏斗架上，所述筛网安装在平衡漏斗内，所述止水夹固定在平衡漏斗的底部，所述漏斗架的底部放置在废液皿内。

4.一种应用于权利要求1所述的蜜蜂卵超低温冷冻方法的玻璃化冷冻滴冻盘，其特征在于：所述玻璃化冷冻滴冻盘包括盘体、提柄和提钩，所述提柄连接于盘体的侧面，所述提钩滑动连接在提柄的下部，所述盘体上设有若干圆形凹陷。

5.根据权利要求4所述的一种玻璃化冷冻滴冻盘，其特征在于：所述圆形凹陷的直径为6mm。

6.一种应用于权利要求1所述的蜜蜂卵超低温冷冻方法的蜂卵培养盒，其特征在于：所述蜂卵培养盒包括盒体和固定架，所述盒体的一侧设有开口，所述固定架竖直固定在盒体的内壁上，且固定架上设有若干用于卡接台基条的卡口。

7.根据权利要求6所述的一种蜂卵培养盒，其特征在于：所述盒体的侧面形状为梯形。

8.根据权利要求7所述的一种蜂卵培养盒，其特征在于：所述固定架的数量为2个。