CN114252424A - 一种鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法，包括：1）筛选蜜蜂待鉴双倍体胚胎的特异性抗原物质，将该特异性抗原物质的抗体与该抗原物质结合；2）将结合有该特异性抗原物质的抗体载有荧光染料，并用一定波长的激光激发该抗体；3）根据该被结合的抗体在激光激发下的发光情况确定该特异性抗原物质的存在，从而鉴别单双倍体的存在。

Description

一种鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域里蜜蜂研究技术，尤其涉及鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法。

背景技术

蜜蜂的单倍体胚胎是由未受精的卵细胞经过孤雌生殖发育而来的，蜜蜂的双倍体胚胎是由卵细胞与雄蜂精子结合形成的受精卵发育而来的。蜜蜂单倍体胚胎发育为雄性蜂，即雄蜂；蜜蜂双倍体胚胎发育为雌性蜂，即工蜂或蜂王。

在蜜蜂社会里，工蜂和雄蜂是对蜂群社会组织和种群繁衍具有重要贡献的两个级型。其中，工蜂是由受精卵发育而来的双倍体蜜蜂，而雄蜂是由未受精的卵细胞经过孤雌生殖发育而来的单倍体蜜蜂，二者在遗传上的差异决定了其生理发育和社会行为的完全不同。工蜂和雄蜂的生长发育期不同，其中工蜂生长发育期为21天，雄蜂为24天。

工蜂为雌性蜂，不具有生殖能力，主要从事酿蜜、哺育幼蜂、建造巢房、抵御外敌的各种蜂群劳动；而雄蜂作为蜂群中唯一的雄性群体，其唯一使命是与处女蜂王交尾，为蜂群提供一半遗传物质。由受精卵发育而来的双倍体工蜂，与由未受精的卵细胞经过孤雌生殖发育而来的单倍体雄蜂，两者本质差异在于它们各为双倍体、单倍体，这导致它们后续生理结构和职责分工的不同，如雄蜂没有咽下腺、蜡腺、花粉筐等工蜂器官，但其具有敏锐的感知器官（复眼，触角等）、强大的飞行能力以便及时识别蜂王信息素以及追逐蜂王进行空中交尾的能力。

雄蜂具有独特的遗传育种的优越性。由于双倍杂合体中含有优良性状的隐性等位基因，它会受显性等位基因的制约而不能表达；而雄蜂是单倍体（N=16），它的每个基因仅有一个拷贝，不存在显隐性关系，故其所有基因都可直接选择表达，使得其有益性状的表达频率高于双倍体的蜂王和工蜂，利用单倍体雄蜂进行遗传改良较利用双倍体蜂王和工蜂的速度快33％。雄蜂是蜜蜂基因改良和遗传育种的理想工具。

通常，工蜂巢房和雄蜂巢房尺寸不一样，后者会比前者大些。请参见图1。正常情况下蜂王会在工蜂巢房里产下双倍体的工蜂卵，在雄蜂巢房里产下单倍体的雄蜂卵。如果蜂王在工蜂巢房里产下的都是双倍体的工蜂卵，说明蜂王授精成功了。而如果在工蜂巢房里检测到有单倍体的雄蜂卵，说明该蜂王精子储备稀缺了，需要被更换了。由此可见，分辨工蜂巢脾里蜜蜂胚胎的单双倍体是判断蜂王产卵状态是否正常的关键。

识别工蜂巢脾里蜜蜂胚胎的单双倍体，可以快速判断对蜂王的人工授精是否功。处女蜂王在人工授精后，放归至蜂群中，若人工授精成功，蜂王会在工蜂巢房内产下双倍体工蜂卵；若不成功则在工蜂巢房内产下单倍体雄蜂卵，此时则需要重新对蜂王进行人工授精。在生产实践中，夏天长期的高温（40度左右）境况下蜂王体内的精子会失活（或蜂王产卵时间过长，体内精子消耗殆尽），导致无法产下授精的双倍体工蜂卵，而只能产出单倍体雄蜂卵，从而影响蜂群正常发展。此时，若人工介入进行单双倍体胚胎的鉴定，可以指导蜂农判断蜂王产卵状态是否正常，如果发现蜂王状态不正常，则可及时替换蜂王。

若从表形上分辨蜜蜂的单双倍体胚胎状态，需等到幼虫封盖成蛹之后，亦即产卵后10天（工蜂及雄蜂卵期3天；幼虫期工蜂6天，雄蜂7天）左右的时间。等待时间如此之长，已很不利于科学实验和生产实践的开展。如图1所示，即为用现有的表形方法（用人眼鉴别）进行蜜蜂的单双倍体的模式，其中雄蜂的巢房封盖后高高的很丰满，而工蜂巢房封盖后是齐平的个比较小，由此可识别蜜蜂的单双倍体状态。虽然它能很有效地识别二者，但它是以时间长为代价的，这种时长已远不能满足科研和生产的需要。

实验室中蜜蜂单双倍体的鉴定方法，目前主要包括直接鉴定法（如染色体计数法）、间接鉴定法（如流式细胞测定法）。其中，染色体计数法，需将收集的蜜蜂胚胎制备成细胞，将细胞进行固定染色，而后在显微镜下进行观察，以分辨单双倍体。采用染色体计数法进行蜜蜂单双倍体胚胎的鉴定时，对胚胎处理的过程复杂，实验室开展实验研究尚可，但在实际生产应用中，蜂农无法利用该方法开展检测。

刊载在期刊杂志《中国农业科学》2014，47（22）：4533-4539上的一篇论文“中华蜜蜂二倍体雄蜂人工培育及形态测定”，里面提到的蜜蜂单双倍体的鉴定方法是上面提到后一种方法，即间接鉴定法中的一种 “流式细胞测定法”。利用流式细胞仪检测人工室内培育的雄蜂和自然羽化疑似二倍体的雄蜂，取刚羽化的人工培育的雄蜂和疑似二倍体的自然羽化的雄蜂它们的胸部，利用胰酶将其消化成单细胞，处理后进行染色，再上机检测判断单双倍体。使用流式细胞仪进行检测时，因要满足样品上样量，故检测时需要收集约200只蜜蜂胚胎，不仅消耗量大，而且需明确知道目标样品的属性（单倍体/双倍体）；而单双倍体胚胎混合上样根本无法区分哪个样品是单倍体，哪个样品是双倍体。故可见流式细胞检测法不适用于蜜蜂胚胎单双倍体胚胎的鉴定，它只能用来鉴定羽化后的雄蜂的单双倍体。

在科学研究中，如蜜蜂经人工授精操作后要尽快确定是否对其授精成功，以及在生产中对巢内蜂王产卵状态的优劣，这些关键环节都依赖单双倍体蜜蜂胚胎得到精确快速地检测。传统的表形鉴定方法虽然有效，但在时效性上已经远跟不上科研和生产的迫切需求；而染色体计数法，操作复杂，不利于使用在生产实践中，故而迫切需要一种快速鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法，能够解决现有的表形鉴别单双倍体耗时长、染色体计数法鉴别操作复杂的问题，从而既能够适应科学研究的需要，亦能满足对生产实践中蜂农的科学指导。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法，能够快速有效地鉴别出蜜蜂单双倍体胚胎。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法，包括：

筛选蜜蜂待鉴双倍体胚胎的特异性抗原物质，将该特异性抗原物质的抗体与该抗原物质结合；

将结合有该特异性抗原物质的抗体载有荧光染料，并用一定波长的激光激发该抗体。

优选地，该方法还包括：

根据该被结合的抗体在激光激发下的发光情况确定该特异性抗原物质的存在，从而鉴别单双倍体的存在。

优选地，根据该被结合的抗体在激光激发下的发光情况确定该特异性抗原物质的存在，具体包括：

该被结合的抗体在检测波长390至480nm紫外光的激发下发出蓝色荧光，则鉴别为蜜蜂双倍体胚胎的存在。

优选地，该方法包括试剂及设备耗材准备之步骤，其中：

要准备的试剂包括：

1）抗体：购自Abcam公司的合成产品；

2）抗体稀释液，含：2g脱脂奶粉 + 100毫升TBST溶液；其中，

TBST溶液，含有：TRIS 6.057g，氯化钠8.8g，吐温20溶液500微升，浓盐酸3.1～3.2毫升，并用超纯水定容至1000毫升；

3）生理盐水，含有：0.9g NaCl + 100毫升超纯水；

要准备的设备耗材有：移虫针、卵固定装置、紫外灯、放大镜；

其中，该卵固定装置包括：

底部凹陷的凹槽，用于放置所取的卵；

在凹槽的顶部配有可连接的开合网状板，用于防止添加抗体溶液后卵浮在液体表面。

优选地，该方法具体包括：

（1）从蜂箱中取出待测巢脾，用所述移虫针随机移取20～25只蜂卵，置于所述卵固定装置的凹槽内，闭合槽顶部配备的网状板；

（2）在所述凹槽中加入所述抗体与抗体稀释液比例为1:2000～5000的所述抗体溶液4.5～5.5毫升，将凹槽内的蜂卵浸泡该抗体溶液中，30℃±2℃孵育10分钟；

（3）用10±1毫升生理盐水冲去凹槽内的抗体溶液，重复冲洗3次；

（4）用所述检测波长的紫外灯照射凹槽内的蜂卵，并在放大镜下观察卵孔处的发光情况，卵孔处发出蓝色荧光的是双倍体胚胎，不发光的则是单倍体胚胎。

优选地，筛选蜜蜂待鉴双倍体胚胎的特异性抗原物质，具体包括：

（1）收集20～25只性成熟雄蜂的精液样品；

（2）提取所述精液样品中的蛋白质；

（3）利用质谱仪检测该精液样品的蛋白质表达情况；

（4）利用PEAKS蛋白质数据分析软件对精液样品的蛋白质表达情况进行定性分析；

（5）根据定性分析的数据，对表达的蛋白进行蛋白质功能分析，进而筛选出特异性蛋白。

本发明的上述鉴别方法能快速、高效地鉴别蜜蜂工蜂巢脾中双倍体的情况，由此判断出蜂王授精的成功与否及其产卵状况的好坏，及时决定更换蜂王，以避免科研方向的失误或生产上的损失，从而能够满足科研和生产的紧迫要求。

附图说明

图1为现有的用表形方法分辨蜜蜂的单双倍体状态之示意；

图2为本发明的鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法的应用实例之流程图；

图3为本发明的鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法中用到的卵固定装置实施例的结构示意。

具体实施方式

以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。应该理解，以下列举的实施例仅用于说明和解释本发明的技术方案，而不能用于限制本发明。

本发明提供了一种鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法实施例，包括：

筛选蜜蜂待鉴双倍体胚胎的特异性抗原物质，将其抗体与其结合；

将结合有该特异性抗原物质的抗体载有荧光染料，并用一定波长的激光激发该抗体。

上述方法实施例还包括：

根据该被结合的抗体在激光激发下的发光情况确定该特异性抗原物质的存在，从而鉴别出单双倍体的存在。

上述方法实施例具体包括：

该被结合的抗体在检测波长390至480nm紫外光的激发下发出蓝色荧光，则鉴别为蜜蜂双倍体胚胎的存在。

由于蜜蜂双倍体胚胎有精子从卵孔注入，其包含雄蜂（父本）一半的遗传物质。本发明经试验筛选出的特异性抗原物质，是特异性蛋白（testis-specific Cytochrome c，即睾丸特异性细胞色素c），它是雄蜂的精液中所特有的，蜂王所产的双倍体胚胎中包含该特异性蛋白，而单倍体胚胎的遗传物质仅由蜂王提供，故不包含该特异性蛋白。

对于上述经试验筛选出的特异性抗原物质，即特异性蛋白，本发明是这样做的：

（1）收集20～25只性成熟雄蜂的精液样品；

（2）提取该精液样品中的蛋白质；

（3）利用质谱仪检测该精液样品的蛋白质表达情况；

（4）利用PEAKS蛋白质数据分析软件对精液样品的蛋白质表达情况进行定性分析；

（5）根据定性分析数据，对表达的蛋白进行蛋白质功能分析，进而筛选出特异性蛋白（testis-specific Cytochrome c）。

对于抗原的检测，通常会利用带荧光染料的抗体与抗原结合，经一定波长的激光激发，使抗体发出荧光，以确定该抗原的存在。亦即将本身不发光的抗原与抗体的特异性结合，使两者结为一个整体，用抗体发光证明抗原的存在。

本发明制备偶联荧光染料香豆素的精液特异蛋白质（testis-specificcytochrome c）抗体溶液，令蜜蜂双倍体胚胎经过该抗体溶液的孵育，在检测波长390至480nm紫外光的激发下会发出蓝色荧光，而单倍体蜜蜂胚胎没有该激发后的蓝色荧光信号。

试剂及设备：

（1）试剂准备：

抗体：购自Abcam公司的合成产品；

抗体稀释液：2g脱脂奶粉 + 100毫升TBST溶液；其中，TBST溶液含有：TRIS6.057g，氯化钠8.8g，吐温20溶液500微升，浓盐酸3.1～3.2毫升，并用超纯水定容至1000毫升；

生理盐水，含0.9g NaCl + 100毫升超纯水

（2）设备耗材：移虫针、卵固定装置、紫外灯、放大镜；

其中卵固定装置的结构如图3所示，包括：

底部凹陷下去的凹槽，用于放置所取的蜂卵；

在凹槽的顶部配有通过一个或两个合页连接的开合网状板，用于防止添加抗体溶液后卵浮在液体表面。

本发明的上述一种鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法实施例，其应用实例的流程图请参见图2，包括如下步骤：

1）从蜂箱中取出待测巢脾，用移虫针随机移取20～25只蜂卵，置于卵固定装置的凹槽内，闭合槽顶部配备的网状板；

2）在凹槽中加入抗体与抗体稀释液比例为1:2000～5000的抗体溶液4.5～5.5毫升，将凹槽内的蜂卵浸泡抗体溶液中，30℃±2℃孵育10分钟；

3）用10±1毫升生理盐水冲去凹槽内的抗体溶液，重复冲洗3次；

4）用上述检测波长（390至480nm）的紫外灯照射凹槽内的蜂卵，并在放大镜下观察卵孔处的发光情况，卵孔处发出蓝色荧光的是双倍体胚胎，不发光的则是单倍体胚胎。

用本发明的上述方法能快速、高效地鉴别蜜蜂工蜂巢脾中双倍体的情况，由此判断出蜂王授精的成功与否及其产卵状况的好坏，从而能够满足科研和生产上的紧迫需求。

Claims (7)

1.一种鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法，包括：

筛选蜜蜂待鉴双倍体胚胎的特异性抗原物质，将所述特异性抗原物质的抗体与该抗原物质结合；将结合有该特异性抗原物质的抗体载有荧光染料，并用一定波长的激光激发该抗体。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：

根据该被结合的抗体在激光激发下的发光情况确定该特异性抗原物质的存在，从而鉴别单双倍体的存在。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，所述根据该被结合的抗体在激光激发下的发光情况确定该特异性抗原物质的存在，具体包括：

该被结合的抗体在检测波长390至480nm紫外光的激发下发出蓝色荧光，则鉴别为蜜蜂双倍体胚胎的存在。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，包括试剂及设备耗材准备之步骤，其中：

要准备的试剂包括：

1）抗体：购自Abcam公司的合成产品；

2）抗体稀释液，含：2g脱脂奶粉 + 100毫升TBST溶液；其中，

TBST溶液，含有：TRIS 6.057g，氯化钠8.8g，吐温20溶液500微升，浓盐酸3.1～3.2毫升，并用超纯水定容至1000毫升；

3）生理盐水，含有：0.9g NaCl + 100毫升超纯水；

要准备的设备耗材有：移虫针、卵固定装置、紫外灯、放大镜；

其中，所述卵固定装置包括：

底部凹陷的凹槽，用于放置所取的卵；

在凹槽的顶部配有可连接的开合网状板，用于防止添加抗体溶液后卵浮在液体表面。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，具体包括：

（1）从蜂箱中取出待测巢脾，用所述移虫针随机移取20～25只蜂卵，置于所述卵固定装置的凹槽内，闭合槽顶部配备的网状板；

（2）在所述凹槽中加入所述抗体与抗体稀释液比例为1:2000～5000的所述抗体溶液4.5～5.5毫升，将凹槽内的蜂卵浸泡该抗体溶液中，30℃±2℃孵育10分钟；

（3）用10±1毫升生理盐水冲去凹槽内的抗体溶液，重复冲洗3次；

（4）用所述检测波长的紫外灯照射凹槽内的蜂卵，并在放大镜下观察卵孔处的发光情况，卵孔处发出蓝色荧光的是双倍体胚胎，不发光的则是单倍体胚胎。

6.按照权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述筛选蜜蜂待鉴双倍体胚胎的特异性抗原物质，具体包括：

（1）收集20～25只性成熟雄蜂的精液样品；

（2）提取所述精液样品中的蛋白质；

（3）利用质谱仪检测该精液样品的蛋白质表达情况；

（4）利用PEAKS蛋白质数据分析软件对精液样品的蛋白质表达情况进行定性分析；

（5）根据所述定性分析的数据，对表达的蛋白进行蛋白质功能分析，进而筛选出特异性蛋白。

7.一种于权利要求5所述方法中使用的卵固定装置，其特征在于，包括：

底部凹陷的凹槽，用于放置所取的蜂卵；

在凹槽的顶部配有通过一个或两个合页连接的开合网状板，用于防止添加抗体溶液后卵浮在液体表面。

Images