CN105475133A - 程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法，将程序降温法和玻璃化法科学有机结合，在枇杷属植物茎尖超低温保存前预处理的培养基配方和冷冻保护剂配方、枇杷茎尖超低温保存的降温程序设计、枇杷属植物超低温保存后植株再生培养基配方以及培养条件等关键的技术难点进行了创造性改进，首创一套效果稳定、高成活率的新型枇杷属植物超低温保存的程序方法，成活率稳定在90.0%～97.50%，本发明可很好地应用到栽培枇杷、野生枇杷以及枇杷属植物的种间杂交材料，能有效替代种植保存耗费大量的人力物力、土地，并防止病虫害、自然灾害对种植保存枇杷的损害。

Description

程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法

技术领域

本发明涉及植物种质低温保存技术领域，更具体地，涉及一种程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法。

背景技术

植物种质资源是人类所拥有的最宝贵的自然资源。

上个世纪60年代以来，许多国家对植物种质资源的收集和保存工作都加大了投入和研究力度，特别是经济体发达的国家已建立了比较完善的田间基因库。不足的是，田间种质保存占地广，会耗费大量的人力、物力和财力，也容易受各种自然灾害的影响，从而迫使人们探索更实用、安全、经济的保存方法。直到上世纪中叶，植物离体培养技术开始出现并不断完善和发展之后。有学者首次提出离体保存植物种质资源的策略（Henshaw，1975）。离体保存从而开始频繁的出现在各种植物种质资保存的报道中，它以无菌培养条下，占用空间、劳动力和维持开大大减小，同时方便于世界之间交流等特点优点，从而得到了各国的重视（钟兰，2009）。

枇杷属（EriobotryaLindl.）植物属于蔷薇科（Rosaceae）苹果亚科（Maloideae）。我国是枇杷种质资源最丰富的国家，原产我国的枇杷属植物约有16个种（21个种类），主要分布于长江流域及长江以南各省（林顺权等，2004）；此外，东南亚原产的枇杷属植物约有6个种（11个种类），主要分布在老挝、越南、缅甸、菲律宾、柬埔寨等地（杨向晖等，2005）。

枇杷属植物的种质资源保存方面，栽培枇杷的品种资源已在国家种质资源圃（福州）进行了很好的种植保存（郑少泉，2006），栽培枇杷的离体保存方面也进行了一些研究（刘月学等，2004；王家福等，2004，2006；Wangetal.2007），只是尚未能广泛应用。枇杷属只有一个栽培种，即普通枇杷（EriobotryajaponicaLindl.），其余的约30个种的种质资源保存很少研究，种植保存方面仅胡又厘等（Huetal.2007）报道保存了10多个种；鉴于野生枇杷的材料的取得比栽培枇杷更为困难，而且远离人们的关注视线，其种质资源保存的迫切性更甚，更有必要进行离体保存的研究，相关报道很少。

枇杷属植物离体保存种质资源目前有研究主要是缓慢生长法。缓慢生长法是通过调节培养条件，抑制保存材料的生长和减少营养消耗来延长继代时间、减少操作和劳力的保存方法（刘月学等，2004；王家福等，2004，2006）。减缓保存材料生长的具体方法如下：

主要方法是通过调整培养基配方，如降低培养基内营养水平；在培养基中添加化学物质如多效唑等抑制生长的方式（王家福，2002）；其次，还有脱水处理和复合限制生长措施减缓保存材料的生长（刘月学，2004）。虽然运用组织培养技术保存种质已取得了很好的效果，但是保存即使为1～3年后仍然要再继代，致体细胞无性系变异的老问题还是可能会发生，从而使保存的原始种质丢失。

果树超低温保存自2000年以来，已进行了若干研究，例如：巴旦杏(Channuntapipatetal.2000)，柑橘（王子成等，2001），圆金柑（Choetal.2002），柿子（艾鹏飞等，2003），芒果（Wuetal.2003)，欧洲板栗（Corredoiraetal.2004），中华猕猴桃（Xuetal.2006），番木瓜（曾继吾等，2005；Ashmoreetal.2007），欧李（张成婉等，2007）；还有赵艳华等先后也进行了多种果树种质的超低温保存研究，包括樱桃（1999）、葡萄（2001）、梨（2004）、桃（2006）和李（2008）。但大部分果树的超低保存技术并不成熟，经超低温保存后，恢复生长获得再生植只有少数，如柿子，其余的研究属于阶段性研究或生理性的研究。在枇杷超低温保存方面只有一项利用程序降温仪进行花粉处理的试验（刘月学，2004）。

将程序降温应用于蔷薇科果树乃至植物的超低温保存，成功的例子较少，仅有少数几个报道。例如马锋旺等在《杏愈伤组织的超低温保存》（[J].西北植物学报,1999,19（1):67-70）中研究了蔷薇科果树的杏子种质资源的超低温保存，将杏愈伤组织加入预冷的冰冻保护剂，平衡后用Paris750008型程序冷冻机冷却至-40℃，停留2h后投入液氮罐保存48h，化冻后用TTC法检测相对存活率，接于继代培养基上培养，恢复生长。但技术方案愈伤组织存活率不高，最高相对成活率为57.9%，总的生长量比对照小，多次转移培养，均未分化出不定芽。

并指出不同品种基因型间超低温保存的效果不同。

玻璃化法超低温保存植物种质资源是目前的主流方法，有数以千计的论文发表，果树方面的也有几十篇。但正如木本果树的离体再生一样，并没有一个方法或程序可以应用到每一种果树上都可以获得成功。娄汉平等在《树莓试管苗茎尖包埋玻璃化法超低温保存》（[J].中国农学通报，2010,26(18):59-62）提供了蔷薇科的树莓的种质资源超低温保存研究，其玻璃化处理及超低温保存玻璃化液采用成分组成为：30%甘油+15%乙二醇+5%二甲基亚矾+0.4mol/L蔗糖，pH5.8，分别在0℃和24℃下处理不同的时间，将玻璃化液处理过的茎尖包埋丸经液氮冷冻保护，化冻后的包埋丸经洗涤、暗培养、光培养，6周后统计成活率。该技术方案的最高成活率为87%。与现有的果树上超低温保存大多数采用玻璃化法保存报道一样，技术不成熟，只停留在证实某个植物种的超低温保存可行性和保存技术的试验当中，成活率低且不稳定，重复性差。本申请人将该技术方案应用到枇杷属植物上不能成功，进一步采用其他的蔷薇科植物所用的玻璃化法超低温保存程序及其相应的冷冻保护剂配方，在枇杷属植物上也不能成功。

将玻璃化法用于枇杷的超低温保存，成功的例子也极少，迄今只有一个枇杷茎尖保存成活的报道。王家福等以二步玻璃化法超低温保存枇杷茎尖（[J].植物资源与环境学报,2006,15(2):75-76），取健康成年枇杷树品种“解放钟”的嫩梢，处理后接种至诱导培养基上，待茎尖抽芽至一定高度后，转移到增殖培养基上，4周后，切取长约10mm的幼芽，接种于含5%DMSO（二甲基亚砜）、2mg·L^-16-BA和5%蔗糖的MS培养基上预培养；切取长约2～4mm的茎尖，室温条件下加入60%的玻璃化保护剂PVS2（0.15mol·L^-1蔗糖液体培养基与PVS2溶液的体积比为40∶60）处理不同时间，吸去保护剂后再加入PVS2(含30%甘油、15%乙二醇、15%二甲基亚砜和0.4mol·L^-1蔗糖)，于0℃下处理不同时间后，吸去保护剂，再重新加入PVS2保护剂，立即置于-17℃处理若干小时至过夜，然后用纱布包裹后投入液氮保存24h后取出，化冻洗涤后转入含2.0mg·L^-16-BA和0.5mg·L^-1NAA的MS培养基中继代培养，部分茎尖可形成小苗，再生植株。该技术方案只适用于枇杷属植物中的栽培枇杷品种，没有报道对现有的枇杷属植物其他种进行试验，没有种间重复性，不可重复；该技术方案使用的玻璃化保护剂成分比较复杂，而且要反复重新加入玻璃化保护剂，加保护剂操作相对复杂，影响成活率，其最高成活率为52.3%。没有提供恢复植株再生培养可重复50%左右的具体技术方案。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有枇杷属植物超低温保存的技术不足，提供一种程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法，本发明将程序降温法和玻璃化法有机结合，首创一套稳定、高成活率、新型的枇杷属植物超低温保存的程序方法，为程序降温玻璃化法。

本发明要解决的另一技术问题是提供所述方法的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法，包括以下步骤：

S1.程序降温前材料预处理：将枇杷属植物茎尖置于预培养基中预培养2～4d；

S2.将预培养后的茎尖转入冷冻保护剂（PVS）中，在0℃～4℃下装载6～10h；

S3.按照程序进行降温处理后迅速转入液氮保存；

S4.将在液氮中保存的材料解冻复温；

S5.材料清洗：将解冻复温完成的材料，用卸载液（MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.1mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1）和无菌去离子水分别清洗；

S6.植株再生培养；

其中，步骤S1所述预培养基组成为：MS+BA1.0mg·L^-1+NAA0.1mg·L^-1+蔗糖0.1mol·L^-1+DMSO（二甲基亚砜）5%。

步骤S1所述枇杷属植物茎尖为栽培枇杷、野生枇杷或枇杷种间杂交后代的组培苗的茎尖。优选取茎尖长约0.5cm，按常规方法消毒后置于预培养基预培养。

步骤S2所述冷冻保护剂的组成为：MS溶液+0.4mol·L^-1蔗糖+2mol·L^-1甘油。

步骤S3所述降温的程序为初始温度为4℃，从4℃降至0℃，从0℃降至-7℃，-7℃进行温度平衡，从-7℃降至-20℃，从-20℃降至结束温度-40℃，在结束温度进行温度平衡；

步骤S6所述植物再生培养的培养基配方为：MS+TDZ0.1mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+30g蔗糖+5g琼脂粉；

步骤S6所述植物再生培养的培养条件：置于温度20±1℃，湿度65%～70%，条件下，24h全黑暗培养后再转为24h/d光照下培养。

进一步优选地，步骤S3所述降温的程序中的降温速率为：在0℃之前降温速率-0.3℃/min，从0℃降至-7℃降温速率-0.1℃/min，并在-7℃停留10min进行温度平衡，从-7℃降至-20℃降温速率仍然为-0.1℃/min，从-20℃降至结束温度-40℃的降温速率转为-0.5℃/min，在结束温度保持5min进行温度平衡，然后迅速转入液氮保存；

优选地，步骤S3液氮保持2小时以上；进一步优选地，步骤S3液氮保持2小时～72小时。

优选地，步骤S4所述是将在液氮中保存的材料迅速置于36℃～40℃的水浴中解冻复温3～6min。进一步优选地，置于38℃的水浴中解冻复温3min。

优选地，步骤S6所述植物再生培养中，光照条件为24h全黑暗的培养箱中培养20d；24h/d光照条件下培养50d。

本发明方法可以适用于栽培枇杷、野生枇杷或枇杷种间杂交后代的超低温保存植物种质方面。

本发明的有益效果：

本发明经过创造性地针对分析和大量实验总结，将程序降温法和玻璃化法有机结合，在枇杷属植物茎尖超低温保存前预处理的培养基配方和冷冻保护剂配方、枇杷茎尖超低温保存的降温程序设计、枇杷属植物超低温保存后植株再生培养基配方以及培养条件等关键的技术难点进行了创造性改进，首创一套稳定、高成活率、新型的枇杷属植物超低温保存的程序方法，为程序降温玻璃化法。

本发明在以下几个方面为本领域提供了技术思路和方案：

（1）解决了材料进入程序降温之前的预处理关键技术，尤其是采用最适的冷冻保护剂作为玻璃化液，避免反复重新加入玻璃化保护剂，加保护剂操作步骤复杂，影响成活率的问题。

（2）解决了最佳的降温程序过程设计技术难题，科学精确设计降温点和降温程序，结合攻克降温速率的控制、保证材料逐步脱水、材料本身的释热控制方面技术难题，充分发挥了玻璃化温度转变控制的优点，最终获得稳定的技术数据和技术效果。

（3）同时解决了枇杷属植物玻璃化法和程序降温法超低温保存各自存在的不足，有机结合两者的优点产生增效作用，获得稳定的再生成活率，完美克服随机性和不确定性，方法重复性好，填补野生枇杷的茎尖离体超低温保存技术空白，建立起枇杷属植物种质资源的超低温保存的技术程序。能应用到栽培枇杷、野生枇杷以及枇杷属植物的种间杂交材料，能有效替代种植保存耗费大量的人力物力、土地，并防止病虫害、自然灾害对种植保存枇杷的损害。

附图说明

图1玻璃化液装载的时间与枇杷超低温保存后成活率的关系图。

图2本发明材料4℃下玻璃化液装载，图为已玻璃化的枇杷属植物茎尖。

图3本发明材料在液氮中保存，图为液氮中保存的枇杷属植物。

图4再生培养过程植物材料生长情况图，图为栎叶枇杷茎尖液氮保存后的再生培养第30d。

图5再生培养过程植物材料生长情况图，图为枇杷属间杂种(石斑木×台湾枇杷)后代材料液氮保存后的再生培养第30d。

图6再生培养过程植物材料生长情况图，图为栎叶枇杷茎尖液氮保存后的再生培养第60d。

图7再生培养过程植物材料生长情况图，图为枇杷属间杂种(石斑木×台湾枇杷)后代材料液氮保存后的再生培养第60d。

图8再生培养过程植物材料生长情况图，图为栎叶枇杷茎尖液氮保存后的再生培养第90d。

图9再生培养过程植物材料生长情况图，图为枇杷属间杂种（石斑木×台湾枇杷）后代材料液氮保存后的再生培养第120d。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的原料为常规市购或商业途径获得的原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1

本实施例提供一种稳定、高成活率、新型的枇杷属植物超低温保存的程序方法，称为程序降温玻璃化法。具体的处理方法流程为：

S1.程序降温前材料预处理。将枇杷属植物茎尖（栽培枇杷、野生枇杷或枇杷种间杂交后代的组培苗，取其茎尖，长约0.5cm，按常规方法消毒后）置于预培养基MS+BA1.0mg·L^-1+NAA0.1mg·L^-1+0.1mol·L^-1蔗糖+5%DMSO预培养3d；

S2.转入PVS（MS溶液+0.4mol·L^-1蔗糖+2mol·L^-1甘油）在4℃下装载9h，图2所示为已玻璃化的枇杷属植物茎尖。

步骤S2的处理条件建立在长期大量基于玻璃化液装载的时间（6小时内）与枇杷超低温保存后成活率的关系成果基础上，附图1所示为以栎叶枇杷为例，玻璃化液装载的时间（6小时内）与枇杷超低温保存后成活率的关系图。由附图1可见，在一定装载时间范围内，成活率随装载时间的延长而提高。

S3.程序降温处理：本实施例采用英国Planner公司出品的Kry0550-16型程序降温仪（但并不因此限定本发明范围），初始温度为4℃，在0℃之前降温速率-0.3℃/min，从0℃降至-7℃降温速率-0.1℃/min，并在-7℃停留10min进行温度平衡，从-7℃降至-20℃降温速率仍然为-0.1℃/min，从-20℃降至结束温度-40℃的降温速率转为-0.5℃/min，在结束温度保持5min进行温度平衡，然后迅速转入液氮保存，见图3所示。材料在液氮中保存2h以上。

S4.解冻。将在液氮中保存的材料，迅速置于38℃的水浴中解冻3min；

S5.材料清洗。将解冻复温完成的茎尖，用卸载液（MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.1mg·L^-1+30g·L^-1蔗糖）和无菌去离子水各洗2遍；

S6.植株再生培养。清洗完毕的茎尖快速（在0.5h内）接种到再生培养基（MS+TDZ0.1mg·L^-1+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.1mg·L^-1+30g蔗糖+5g琼脂粉）上，置于温度20±1℃，湿度65%-70%，光照条件为24h全黑暗的培养箱中培养20d，再转为24h/d光照，培养50d。

再生培养结果如附图4所示，由图4可见，本发明方法植株再生情况非常好，成活率高，长势茁壮，茎尖均保存绿色。附图4中，C.枇杷茎尖液氮保存后的再生培养第30d，D.液氮保存后的再生培养第30d，E液氮保存后的再生培养第60d，F.液氮保存后的再生培养第60d，G.液氮保存后的再生培养第90d，H.液氮保存后的再生培养第120d。

按照本实施例方法分别对不同栽培枇杷、野生枇杷或枇杷种间杂交后代的组培苗茎尖进行处理，每次处理随机取40～100个茎尖，重复3次以上，每批次处理结果，成活率均稳定在90%以上。试验数据用SPSS19.0软件进行方差分析，采用邓肯氏新复极差测验法进行平均数比较，得到的成活率数据为90.0%～97.50%。成活率（%）=成活的茎尖数/接种的茎尖数×100%。

对比例1

取与实施例1相同的茎尖，按照以下步骤操作：

1）取与实施例1相同的茎尖，切成2～3mm，放入液氮冷冻管中，加入预冷的冰冻保护剂，在0℃条件下平衡30min；

2）用Paris750008型程序冷冻机以1℃/min的冷却速度降至-40℃，停留2h后投入液氮罐保存。

3）在液氮中保存48h后将处理的愈伤组织用40℃温水浴快速化冻，用TTC法检测相对存活率。

4）用培养基反复冲洗，接于继代培养基上培养，恢复生长。

对比例2

取与实施例1相同的茎尖，按照以下步骤操作：

1）包埋剥取长约1mm的茎尖。将离体茎尖悬浮在含有3%（w/v）海藻酸钠和0.4mol/L蔗糖的无钙离子MS培养基中。用无菌的1.0mL一次性注射器吸取茎尖，转移到含有0.4mol/L蔗糖的0.1mol/LCaCl2水溶液中，室温下（24℃）静置30min，形成直径约4mm左右的包埋丸，每个包埋丸中含有1个茎尖。

2）预培养的培养基为MS基本培养中附加不同浓度的蔗糖，采用逐步加大蔗糖浓度的方法：即在初始蔗糖浓度为0.3mol/L的培养基处理1天，以后每天增加0.3mol/L各处理1天，直到1.2mol/L。

3）装载液处理的方法，是在MS中附2mol/L的甘油和0.9mol/L蔗糖的装载液中处理不同的时间，处理时间设为90min。

4）玻璃化处理及超低温保存玻璃化液，其采用成分组成为：30%甘油+15%乙二醇+5%二甲基亚矾+0.4mol/L蔗糖，pH5.8。分别在0℃和24℃下处理不同的时间。将玻璃化液处理过的包埋丸迅速用滤纸吸干，转到2mL的冷冻管中，直接浸入到液氮中1h。

5）解冻与再培养在液氮中保存1天后，取出冻存管放入40℃的温水中化冻3min，化冻后的包埋丸用含1mol/L蔗糖的MS液体培养基洗涤20min，再用滤纸吸干，在恢复培养基中暗培养3天，然后转到光下条件培养。6周后统计成活率（茎尖仍保存绿色的为成活）。

实施例2

将实施例1、对比例1、对比例2实验结果进行比较，试验数据用SPSS19.0软件进行方差分析，采用邓肯氏新复极差测验法进行平均数比较。成活率（%）=成活的茎尖数/接种的茎尖数×100%。比较结果见表1所示：

表1

	再生成活率（%）
		对比例1	0
对比例2	0
		实施例1	90.0%～ 97.50%

注：表中字母表示均值通过Duncan氏新复级差检验差异显著性（P<0.05）。

Claims (10)

1.一种程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.程序降温前材料预处理：将枇杷属植物茎尖置于预培养基中预培养2～4d；

S2.将预培养后的茎尖转入冷冻保护剂（PVS）中，在0℃～4℃下装载6～10h；

S3.按照程序进行降温处理后迅速转入液氮保存；

S4.将在液氮中保存的材料解冻复温；

S5.材料清洗：将解冻复温完成的材料，用卸载液和无菌去离子水分别清洗；所述

S6.植株再生培养；

其中，步骤S1所述预培养基组成为：MS+BA（6苄基腺嘌呤）1.0mg·L^-1+NAA0.1mg·L^-1+蔗糖0.1mol·L^-1+DMSO（二甲基亚砜）5%；

步骤S2所述冷冻保护剂的组成为：MS溶液+0.4mol·L^-1蔗糖+甘油2mol·L^-1；

步骤S3所述降温的程序为初始温度为4℃，从4℃降至0℃，从0℃降至-7℃，-7℃进行温度平衡，从-7℃降至-20℃，从-20℃降至结束温度-40℃，在结束温度进行温度平衡；

步骤S6所述植物再生培养的培养基配方为：MS+TDZ（噻苯隆）0.1mg·L-1+6-BA（6苄基腺嘌呤）1.0mg·L-1+NAA（萘乙酸）0.1mg·L-1+蔗糖30g+琼脂粉5g；

步骤S6所述植物再生培养的培养条件：置于温度20±1℃，湿度65%～70%条件下，24h全黑暗培养后再转为24h/d光照下培养。

2.根据权利要求1所述程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法，其特征在于，步骤S1所述枇杷属植物茎尖为栽培枇杷、野生枇杷或枇杷种间杂交后代的组培苗的茎尖。

3.根据权利要求1所述程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法，其特征在于，步骤S1所述枇杷属植物茎尖长0.5cm。

4.根据权利要求1所述程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法，其特征在于，步骤S3所述降温的程序中的降温速率为：在0℃之前降温速率-0.3℃/min，从0℃降至-7℃降温速率-0.1℃/min，并在-7℃停留10min进行温度平衡，从-7℃降至-20℃降温速率仍然为-0.1℃/min，从-20℃降至结束温度-40℃的降温速率转为-0.5℃/min，在结束温度保持5min进行温度平衡，然后迅速转入液氮保存。

5.根据权利要求1所述程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法，其特征在于，步骤S3液氮保持2小时以上。

6.根据权利要求5所述程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法，其特征在于，步骤S3液氮保持2小时～72小时。

7.根据权利要求1所述程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法，其特征在于，步骤S4所述是将在液氮中保存的材料迅速置于36℃～40℃的水浴中解冻复温3～6min。

8.根据权利要求1所述程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法，其特征在于，步骤S5所述卸载液的组成为MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.1mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1。

9.根据权利要求1所述程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法，其特征在于，步骤S6所述植物再生培养中，光照条件为24h全黑暗的培养箱中培养20d；24h/d光照条件下培养50d。

10.权利要求1至9任一项所述方法的应用，其特征在于，应用于栽培枇杷、野生枇杷或枇杷种间杂交后代的超低温保存植物种质方面。