CN103202225B - 一种植物微茎尖超低温保存和解冻、恢复培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种以滤纸条为操作载体的植物微茎尖小液滴包埋玻璃化超低温保存、解冻及恢复培养方法，包含步骤有：在解剖镜下剥取无菌苗茎尖，浸入2%~5％无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸，将茎尖排列在无菌滤纸条上，将其浸入0.1%氯化钙溶液中，经10~20min固定，再将带有茎尖的滤纸条放入0.3~0.5mol·L^-1蔗糖的MS液体中培养1~3天，置于预处理溶液中处理20-40min转入玻璃化保护剂中处理10~80min，然后将带有茎尖的滤纸条转移到无菌冷冻管中放入液氮中保存。解冻时，将带有茎尖的滤纸条由管中取出放入含1.2mol·L^-1蔗糖的MS培养液解冻及洗涤20min将带茎尖的滤纸条放入恢复培养基进行培养，直至生长成植株，本发明方法以滤纸条为操作载体，减少接种器具与植物细嫩茎尖的直接接触，降低机械损伤。

Description

一种植物微茎尖超低温保存和解冻、恢复培养的方法

技术领域

本发明涉及到一种种质资源保存和解冻培育的方法，具体的说，涉及到一种植物微茎尖小液滴包埋玻璃化超低温保存和解冻培养的方法，属植物细胞工程技术领域。

背景技术

种质资源的保存广义上有现地保存和异地保存两种。对于那些无法用种子进行长期保存的植物如营养繁殖植物及顽拗性种子植物来说：田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险。而在超低温保存条件下，植物的生理生化活性近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内。被认为是这类植物目前安全、有效、经济的基因资源长期保存的最有希望的保存方法。

大多数植物材料如悬浮细胞、愈伤组织、茎尖、芽尖、胚等，含有大量的细胞间水分，对冷冻伤害特别敏感。特别是植物分生组织、芽端的细胞质分布均匀而且稠密，对低温冰冻极为敏感,冰冻过程中的损伤效应特别突出，哪怕是局部的冰冻损伤都会影响冻后的正常分化与再生。同时，分生组织、芽端必须保持结构的完整性才能快速分化。在操作过程中，细嫩组织容易受到机械损伤，从而造成成活率下降。因此，超低温保存面临的课题是尽可能采取更多的、更有效的手段来保证分生组织、芽端在超低温保存过程中免受损伤。

在20世纪的90年代后，以PVS2作为冷冻保存液的玻璃化法成为植物超低温保存的主要方法(参见Sakai A,Engelmann F.Vitrification,encapsulation-vitrification and droplet-vitrification:a review.Cryoletters,2007,28(3):151-172.)。植物材料经高浓度的保护液中处理后，迅速投入液氮中，水分形成玻璃化状态，从而避免形成冰晶造成机械损伤，有效保护植物组织，被成功运用于100多种植物不同组织的超低温保存。

随着玻璃化方法的发展，保存技术的进一步多样化与简易化，近年来在传统玻璃化法上发展出来的包埋玻璃化法(参见D.Hira,A Sakai,Simplified cryopreservation of sweet potato[Ipomoeabatatas(L.)]by optimizing conditions for osmoprotection,Plant CellReports,(2003)21:961-966)，即将植物组织在海藻酸酸中形成包埋小珠，再经玻璃化法处理后进行冷冻的方法，综合了传统玻璃化法与包埋脱水法的优点，操作较简便且减少玻璃化过程中对茎尖的机械损伤，成功应用于苹果、薄荷、草莓、柿、山药、大蒜等植物的超低温保存。最新发展的小液滴法（参见Halmagyi A,Delie C,Isac V.Cryopreservation of Maluscultivars:Comparison of two droplet protocols[J].Scientia Horticulturae,2010,124(3):387-392.），将植物材料经玻璃化处理后，在铝箔上滴成小液滴，后直接投入液氮进行迅速冷冻。由于冻存及解冻速度快，组织不易形成冰晶，易成活再生，是一有发展前景的方法。

超低温保存中，茎尖大小及结构的完整性对超低温保存的成活率及恢复培养均有影响。材料体积小，在冻存中容易脱水，受冰晶伤害小，但对操作水平要求较高，容易造成机械损伤，在其后的恢复生长中不易成活。故在超低温保存过程中，应尽量减少对茎尖的操作损伤以及冻存过程中冰晶对组织造成的损伤，从而达到较高的成活率。现有技术在超低温保存过程中，需对细嫩茎尖进行数次操作，对技术人员要求较高且易造成茎尖二次机械损伤。

发明内容

本发明中针对现有技术的不足，采用滤纸小条作为操作载体，批量处理茎尖以提高操作效率，减少接种器具与植物细嫩茎尖的直接接触，从而减少机械损伤，提供一种适用于植物微茎尖小液滴包埋玻璃化超低温保存方法及冷冻植株后再生的技术。

为了实现上述的技术目的，本发明采用的技术方案是提供一种植物微茎尖超低温保存和解冻、恢复培养方法，其保存方法包括如下步骤：在解剖镜下剥取无菌苗茎尖，浸入2%～5％无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸后，将茎尖排列在无菌滤纸条上，然后将其浸入0.1%氯化钙溶液中，经10～20min固定后，再将带有茎尖的滤纸条放入0.3～0.5mol·L-1蔗糖的MS液体中培养1～3天，置于预处理溶液中处理20-40min转入玻璃化保护剂中处理10～80min，然后将带有茎尖的滤纸条转移到无菌冷冻管中放入液氮中保存。

本发明一种优选的实施方案是，所述经10～20min固定是指将含有茎尖的滤纸小条浸入到0.1%氯化钙溶液中进行包埋固化。

本发明一种优选的实施方案是，所述无菌滤纸小条为3mm x20mm的无菌滤纸小条。

本发明一种优选的实施方案是，所述预处理溶液为包含1-3mol·L^-1甘油和0.2-0.6mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基,优选的预处理溶液为含2mol·L^-1甘油和0.4mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基。

本发明一种优选的实施方案是，所述玻璃化保护剂包含1.63-4.89mol·L^-1甘油、1.61-4.84mol·L^-1乙二醇、1.27-3.81mol·L^-1DMSO和0.3-0.5mol·L^-1蔗糖，优选的玻璃化保护剂包含3.26mol·L^-1甘油、2.42mol·L^-1乙二醇、1.9mol·L^-1DMSO和0.4mol·L^-1蔗糖。

本发明还提供一种植物微茎尖超低温解冻、恢复培养的方法，其包括以下步骤：将权利要求1～5保存的带有茎尖的滤纸小条由冷冻管中取出，然后放入含1.2mol·L^-1蔗糖的MS培养液解冻及洗涤20min，将解冻及洗涤后的茎尖放入恢复培养基进行暗光或弱光培养3天后转入到常光培养，等茎尖返绿并有萌动迹象时再转入MS固体培养基中，茎尖可直接长成植株。

本发明一种优选的实施方案是，，所述恢复培养基为MS半固体培养基,所述MS半固体培养基包含0.5mg·L^-1BA、0.1mg·L^-1NAA和0.5mg·L^-1GA3。

在本发明中，若无特别指出，本发明中所涉及的溶液均为水溶液；本发明中涉及到的预冷的温度是指4℃。

本发明的技术效果是，采用的保存和解冻培育方法操作简便，稳定可靠，减少了在各项操作过程中对茎尖的机械损伤，保存后恢复生长状况良好，植株再生率高的可达60％以上，取得了良好的经济和社会效果。

附图说明

图1是本发明的操作流程图。

（a、拣选优良的植物外植体；b、将获取的外植体经组织培养形成无菌组培苗；c、剥取无菌苗茎尖，浸入2%～5％的无钙离子的海藻酸钠溶液中轻蘸，用镊子将茎尖排列在3mm×20mm无菌滤纸小条上；d、将含有茎尖的无菌滤纸小条浸入到0.1%氯化钙溶液中，经10～20分钟固定；e、将固定后带有茎尖的滤纸小条放入0.3～0.5mol·L-1蔗糖的MS液体或固体培养基中，培养1～3天；f、将茎尖置于预处理溶液中在室温下处理20-40分钟；g、将茎尖转入玻璃化保护剂中在4℃或室温下处理10～80分钟；h、将带有茎尖的滤纸小条转移无菌冷冻管中；i、将冷冻管直接投入到液氮中保存；j、将带有茎尖的滤纸小条由冷冻管中取出后放入选含1.2mol·L^-1蔗糖的MS培养液解冻及洗涤20分钟；k、将获取的带茎尖的滤纸条或把茎尖剥离后放入恢复培养基，经暗培养或弱光培养后转入常光培养；L、常光培养等茎尖返绿并有萌动迹象时转入MS固体培养基中再进行培养，茎尖可直接长成植株）。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明保护的范围。

在本发明中，若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

图1叙述的是本发明保存方法的操作流程图，其操作步骤如下：在解剖镜下剥取无菌苗茎尖，浸入2%～5％无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸后，将茎尖排列在无菌滤纸条上，然后将其浸入0.1%氯化钙溶液中，经10～20min固定后，再将带有茎尖的滤纸条放入0.3～0.5mol·L-1蔗糖的MS液体中培养1～3天，置于预处理溶液中处理20-40min转入玻璃化保护剂中处理10～80min，然后将带有茎尖的滤纸条转移到无菌冷冻管中放入液氮中保存。

图1还叙述了超低温保存植株的解冻、恢复培养的方法，其操作步骤包括：将带有茎尖的滤纸小条由冷冻管中取出后放入选含1.2mol·L^-1蔗糖的MS培养液解冻及洗涤20分钟，将获取的带茎尖的滤纸条或把茎尖剥离后放入恢复培养基，经暗培养或弱光培养后转入常光培养，常光培养等茎尖返绿并有萌动迹象时转入MS固体培养基中再进行培养，茎尖可直接长成植株。

茎尖暗培养或弱光培养所用的培养基是含有适量生长激素的MS半固体培养基,暗培养或弱光培养的培养时间为3天。

]MS半固体培养基的成份包含0.5mg·L^-1BA、0.1mg·L^-1NAA和0.5mg·L^-1GA3。

为了更详细的说明本发明的具体实施方法，下面结合各个实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。

实施例1香石竹的超低温保存

材料：

香石竹品种：红花品种，从花卉市场购买。切取花茎繁殖试管苗，获得花茎无性繁殖系。

预培养培养基：含0.3mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基

预处理溶液：含2mol·L^-1甘油和0.4mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基

玻璃化保护剂：含有3.26mol·L^-1甘油、2.42mol·L^-1乙二醇、1.9mol·L^-1DMSO和0.4mol·L^-1蔗糖

方法：

选取上述香石竹品种的健壮组培苗，在解剖镜下剥取无菌苗茎尖（1～2mm），浸入2%～5％的无钙离子的海藻酸钠溶液中轻蘸，即用镊子将茎尖整齐放在3mm×20mm无菌滤纸小条上。将含有茎尖的滤纸小条浸入到0.1%氯化钙溶液中，经10～20分钟固定后，将带有茎尖的滤纸小条放入0.3mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基中，浅层培养3天，将含有茎尖的滤纸小条在预处理液中室温下浸泡30分钟，然后转入玻璃化保护剂中在4℃下处理60分钟，然后直接投入装满液氮的安培管中，放入液氮中保存即可。

再培养及存活率考察

取出在液氮中冻存24h以上的冷冻管，直接将带有茎尖的滤纸小条投入含1.2mol·L^-1蔗糖的MS培养液洗涤液中进行解冻及洗涤20分钟。洗涤后带茎尖的滤纸条用滤纸吸干，移至含0.5mg·L^-1BA、0.1mg·L^-1NAA和0.5mg·L^-1GA3的MS半固体培养基中，暗培养3天，等茎尖返绿并有萌动迹象时再转入MS固体培养基中，常规光照培养-。

结果表明，茎尖保存后香石竹新植株恢复生长状况良好，植株再生率可达80％

实施例2菊花的超低温保藏

材料：

菊花品种：切花菊‘神马’（独本菊），从花卉市场购买。切取花托繁殖试管苗，获得花托无性繁殖系。

预培养培养基：含0.3mol·L^-1蔗糖的MS固体培养基

预处理溶液：含2mol·L^-1甘油和0.4mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基

玻璃化保护剂：含有3.26mol·L^-1甘油、2.42mol·L^-1乙二醇、1.9mol·L^-1DMSO和0.4mol·L^-1蔗糖

方法：

选取上述菊花品种的健壮组培苗，在解剖镜下切取茎尖（1.5～2mm），浸入2%～5％的无钙离子的海藻酸钠溶液中轻蘸，即用镊子将茎尖整齐放在3mm×20mm无菌滤纸小条上。将含有茎尖的滤纸小条浸入到0.1%氯化钙溶液中，经10～20分钟固定后，将带有茎尖的滤纸小条放入0.3mol·L^-1蔗糖的MS固体培养基中，暗培养3天，将带有茎尖的滤纸小条在预处理液中室温下浸泡30分钟，再转移至玻璃化保护剂中4℃下处理20分钟，再将带有茎尖的滤纸小条转移无菌冷冻管中，直接投入液氮中保存。

再培养及存活率考察

取出在液氮中冻存24h以上的冷冻管，解冻时将带有茎尖的滤纸小条由管中拿出后直接放入选含1.2mol·L^-1蔗糖的MS培养液解冻及洗涤20分钟。后将带茎尖的滤纸条用滤纸吸干，在解剖镜下将茎尖由滤纸上剥离，移至含0.5mg·L^-1BA、0.1mg·L^-1NAA和0.5mg·L^-1GA3的MS半固体培养基中，暗培养3天，等茎尖返绿并有萌动迹象时再转入MS固体培养基中，常规光照培养。

结果表明，茎尖保存后菊花新植株恢复生长状况良好，植株再生率可达为60％～80%。

实施例3百合的超低温保藏

材料：

食用百合(Lilium davidii Var.Unicolor(Hoog)Cotton)

方法：

选取上述品种的健壮组培苗，将1～2mm的小鳞茎(含茎尖生长点)浸入2%～5％的无钙离子的海藻酸钠溶液中轻蘸，即用镊子将茎尖整齐放在3mm×20mm无菌滤纸小条上。将含有茎尖的滤纸小条浸入到0.1%氯化钙溶液中，经20分钟固定后，将带有茎尖的滤纸小条放入MS+0.5mol·L-1蔗糖的培养基上于4℃低温预培养5d，转至25℃预处理液中处理20分钟，接着在冰浴中用PVS2处理80分钟后，换入新鲜PVS2并迅速投入液氮。

再培养及存活率考察：

取出在液氮中冻存24h以上的冷冻管，直接将带有茎尖的滤纸小条投入含1.2mol·L^-1蔗糖的MS培养液洗涤液中进行解冻及洗涤20分钟。洗涤后带茎尖的滤纸条用滤纸吸干，转移至含6-BA0.5mol·L^-1+NAA0.1mol·L^-1+GA30.5mol·L^-1的MS半固体培养基中暗培养7天，再转入同小鳞茎诱导的条件下培养。30d后再生率可达53.0%。

Claims (3)

1.一种植物微茎尖超低温保存和解冻、恢复培养的方法，其特征在于，

所述保存方法包含的步骤有：在解剖镜下剥取无菌苗茎尖，浸入2％～5％无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸后，将茎尖排列在无菌滤纸条上，然后将其浸入0.1％氯化钙溶液中，经10～20min固定后，再将带有茎尖的滤纸条放入0.3～0.5mol·L^-1蔗糖的MS液体中培养1～3天，置于预处理溶液中处理20-40min转入玻璃化保护剂中处理10～80min，然后将带有茎尖的滤纸条转移到无菌冷冻管中放入液氮中保存，其中，所述无菌滤纸条为3mmx20mm的无菌滤纸小条，所述经10～20min固定是指将含有茎尖的滤纸小条浸入到0.1％氯化钙溶液中进行包埋固化；

所述解冻、恢复培养的方法包含步骤有：将保存的带有茎尖的滤纸小条由冷冻管中取出，然后放入含1.2mol·L^-1蔗糖的MS培养液解冻及洗涤20min；将解冻及洗涤后的带茎尖的滤纸小条放入恢复培养基进行暗光或弱光培养3天后转入到常光培养，等茎尖返绿并有萌动迹象时再转入MS固体培养基中，茎尖直接长成植株；

其中，所述预处理溶液为包含1-3mol·L^-1甘油和0.2-0.6mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基，所述玻璃化保护剂为包含1.63-4.89mol·L^-1甘油、1.61-4.84mol·L^-1乙二醇、1.27-3.81mol·L^-1DMSO和0.3-0.5mol·L^-1蔗糖，所述恢复培养基为MS半固体培养基,所述MS半固体培养基包含0.5mg·L^-1BA、0.1mg·L^-1NAA和0.5mg·L^-1GA₃。

2.根据权利要求1所述的植物微茎尖超低温保存和解冻、恢复培养的方法，其特征在于，所述预处理溶液为包含2mol·L^-1甘油和0.4mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基。

3.根据权利要求1所述的植物微茎尖超低温保存和解冻、恢复培养的方法，其特征在于，所述玻璃化保护剂为包含3.26mol·L^-1甘油、2.42mol·L^-1乙二醇、1.9mol·L^-1DMSO和0.4mol·L^-1蔗糖。