CN110741877B - 一种利用金针菇无菌子实体进行超低温冷冻保存及复苏的方法 - Google Patents

一种利用金针菇无菌子实体进行超低温冷冻保存及复苏的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用金针菇无菌子实体进行超低温冷冻保存及复苏的方法，其特征在于包括如下步骤：保存材料的获取：以无菌培养获得的子实体作为保存材料；保存材料的前处理：分别用保护液Ⅰ和保护液Ⅱ处理保存材料；降温保存：将保存材料放入冷冻管，采用0.8～1.2℃/min降温速率降温至‑40℃，然后直接投入液氮中速冻，并在液氮中长期保存；解冻复苏：将保存的冷冻盒取出，迅速将冻存管放入35～37℃水浴中快速解冻；然后室温下用保护液Ⅲ洗涤组织块，最后用灭菌的滤纸吸干组织块上的保护液Ⅲ，将组织块接种于复合PDA平板培养基上恒温培养。本发明获得的保存菌种污染率低、成活率高、不退化且有复壮作用。

Description

一种利用金针菇无菌子实体进行超低温冷冻保存及复苏的 方法
技术领域
本发明涉及一种利用金针菇无菌子实体进行超低温冷冻保存及复苏的方法，属于菌种超低温保存技术领域。
背景技术
金针菇是我国主栽菇种之一，也是当前我国工厂化生产规模最大的菇种，其口感脆嫩，营养丰富，深受消费者喜爱。菌种是食用菌生产的基础，直接关系到最终产品的产量、品质和效益。实验室和工厂菌种室对菌种常用的保藏方法是菌丝斜面低温保藏法，即将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌丝充分生长后，移至2～6℃的冰箱中保藏，其优点是操作简单，使用方便，能随时检查所保藏菌株是否死亡与污染等；其缺点是在2～6℃条件下，菌种仍会缓慢代谢生长，培养基会逐渐干缩，需要不断转接继代培养，而频繁的继代培养会积累遗传变异，导致菌种退化。
超低温保存是指将待保存的细胞、组织或器官置于极低温度条件下(通常用液氮，-196℃)的保存技术。超低温保存的原理是，保存材料在超低温条件下几乎所有的细胞代谢活动和生长过程都停止，但细胞活力和形态分化的潜能却可保存，因而可以保持保存物的遗传稳定性。它是现今最理想、最有效的种质资源保存方法。
目前关于动植物资源超低温保存的研究很多，关于食用真菌的研究较少，同时针对不同物种，其适宜的超低温保存方法和程序技术都有所不同。影响超低温保存效果的因素很多，比如材料的大小、特性、预处理方式、降温过程、解冻方式、后处理技术等均会影响保存效果，任何一个环节处理不当，均可能导致整个保存的失败。目前关于食用菌等大型真菌的超低温保存多以菌丝体作为保存材料，如中国专利文献CN103718830A(申请号：201310734527.2)公开了一种工厂化生产用杏鲍菇菌种超低温保存方法，该方法以带培养基的菌丝块作为保存材料，以甘油或二甲基亚砜作为保护剂，保存温度为-80～-150℃，一般保存3～5年。以菌丝体作为保存材料的优点是易于获取无菌材料，缺点是菌丝易退化、劣变。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用金针菇子实体材料进行超低温冷冻保存及复苏的方法，该方法无需频繁传代，能实现菌种长期保存，保持菌种性状稳定，减少或避免菌种污染。
本发明的技术方案如下：
一种利用金针菇无菌子实体进行超低温冷冻保存的方法，包括如下步骤：
(1)将待保存的金针菇菌种，通过无菌培养获得金针菇子实体，切取子实体菌柄上端的菌柄组织作为待保存的子实体材料；
(2)将步骤(1)得到的待保存的子实体材料转入保护液Ⅰ中，于20～25℃下处理30～60min；
所述保护液Ⅰ的成分如下：0.8～1.2mol/L蔗糖、1.8～2.2mol/L甘油、6～8mmol/LKH2PO4、4～6mmol/L MgSO4、水为溶剂；
(3)将步骤(2)处理后的子实体材料，加入保护液Ⅱ将子实体材料浸没，0～4℃条件下处理1～4h，制得保存材料；
所述保护液Ⅱ的成分如下：0.3～0.5mol/L蔗糖、3.5～4.5mol/L甘油、2～3mol/L乙二醇、6～8mmol/L KH2PO4、4～6mmol/L MgSO4，水为溶剂；
(4)将步骤(3)制得的保存材料，按0.8～1.2℃/min的速度降温至-40℃，然后置于液氮中长期保存，制得超低温冷冻保存的金针菇子实体材料。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的金针菇子实体采用如下方法制备：
将金针菇菌种的菌丝接种到复壮培养基平板上，在20℃恒温密闭环境下培养至菌丝长满平板，然后将平板置于10～12℃下诱导培养至子实体形成，即得；
所述的复壮培养基，每升组份如下：马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、玉米芯100g、麦麸100g、大豆浓缩蛋白3g、琼脂20g，余量水。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中切取的菌柄组织为菌柄上端与菌盖连接处，长度为1～3mm。
根据本发明优选的，所述步骤(2)保护液Ⅰ的成分如下：1.0mol/L蔗糖、2.0mol/L甘油、7mmol/L KH2PO4、5mmol/L MgSO4、水为溶剂。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中子实体材料放入无菌冻存管中，每管放8～10块。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中保护液Ⅱ的成分如下：4.0mol/L甘油、2.5mol/L乙二醇、0.4mol/L蔗糖、7mmol/L KH2PO4、5mmol/L MgSO4，水为溶剂。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中降温速率为1℃/min。
金针菇子实体超低温冷冻保存后的复苏方法，包括如下步骤：
a、将超低温冷冻保存的金针菇子实体冻存管从液氮中取出，迅速将冻存管放入35～37℃水浴中快速解冻3～5min，制得解冻子实体材料；
b、用保护液Ⅲ洗涤步骤a制得的解冻子实体材料2～3次，然后吸干解冻子实体材料上的保护液Ⅲ，将解冻子实体材料接种于真菌培养基上，置于20-23℃条件下培养至长出菌丝体，选择长势健壮、菌丝浓白，镜检具有锁状联合的菌落转接保存或/和用于生产。
所述保护液Ⅲ的成分如下：1～1.2mol/L蔗糖、6～8mmol/LKH2PO4、4～6mmol/LMgSO4，水为溶剂。
根据本发明优选的，所述步骤b中保护液Ⅲ的成分如下：1.2mol/L蔗糖、7mmol/LKH2PO4、5mmol/LMgSO4，水为溶剂。
根据本发明优选的，所述步骤b中真菌培养基每升组份如下：马铃薯180～200份、葡萄糖18～21份、麦麸8～11份、蛋白胨2.5～3.5份、KH2PO4 0.8～1.2份、MgSO4·7H2O 0.45～0.55份、琼脂15～20份，余量水。
进一步优选的，所述步骤b中真菌培养基每升组份如下：马铃薯200g、葡萄糖20g、麦麸10g、蛋白胨3g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、琼脂20g，余量水。
本发明的有益效果
1、本发明利用金针菇无菌子实体作为超低温冷冻保存的材料，与利用金针菇菌丝块作为超低温保存材料或常规试管斜面冷藏传代保存相比，保存期限长、存活率高、菌种不易退化，保证了菌种的生物活性并具有复壮作用。
2、本发明在保存前对金针菇子实体材料进行两步保护处理，复苏时利用保护液Ⅲ进行洗涤活化，经过上述处理，可减少金针菇子实体细胞内冰晶的形成，保持了子实体稳定的生物活性，有效防止退化和死亡。
3、在保护液中加入适宜浓度的硫酸镁、磷酸二氢钾，优化保护液的成分和浓度可以有效提高保存子实体的成活率。
4、降温的速度，直接关系到冷冻效果。当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性；但冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较多冰晶，造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤，本发明采用0～4℃条件下预冷处理1～4h，然后按0.8～1.2℃/min降温速率逐步降温至-40℃，最后垂直降温至-196℃的方式进行降温，最大程度避免了细胞受损。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的内容均按本领域的现有技术。
实施例中使用的白金针菇菌株(W48)、黄金针菇菌株(Y991)，均购自江苏高邮市科学食用菌研究所，普通市售产品。
实施例1
一株白金针菇子实体材料的超低温冷冻保存的方法，包括如下步骤：
(1)无菌保存材料的制备
无菌培养皿中加入灭菌后的复壮培养基，制成培养基平板，培养基厚度为8mm，挑取待保存白金针菇菌种(W48)的菌丝接种到复壮培养基平板上，将接种后的培养基平板用封口膜封口后置于20℃恒温培养箱中进行培养，得到长满菌丝的平板菌落；将长满菌丝的平板菌落置于12℃恒温箱中进行诱导培养至子实体形成，由培养获得的子实体菌柄上端与菌盖连接处切取1mm的菌柄组织作为待保存的子实体材料；
复壮培养基组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、玉米芯100g/L、麦麸100g/L、大豆浓缩蛋白3g/L、琼脂20g/L，余量水。
(2)将步骤(1)获得的待保存子实体材料转入保护液Ⅰ中，于25℃下预处理30min；
保护液Ⅰ的组成为：1.0mol/L蔗糖、2.0mol/L甘油、7mmol/L KH2PO4、5mmol/LMgSO4，余量水。
(3)将步骤(2)预处理后的子实体材料放入1mL冻存管中，每管放10块，加入0.5mL保护液Ⅱ浸没子实体材料，于4℃条件下处理2h；
保护液Ⅱ的组成为：4.0mol/L甘油、2.5mol/L乙二醇、0.4mol/L蔗糖、7mmol/LKH2PO4、5mmol/L MgSO4、余量水。
(4)将步骤(3)的冷冻管装入冷冻盒，采用程序降温仪按1℃/min降温速率降温至-40℃，然后直接投入液氮中速冻，并在液氮中长期保存3年。
上述白色金针菇子实体超低温冷冻保存复苏的方法，包括如下步骤：
将步骤(4)中保存3年的冷冻盒从液氮中取出，迅速将冻存管放入37℃水浴中3min快速解冻；然后室温下用保护液Ⅲ洗涤子实体材料3次；最后用灭菌的滤纸吸干组织块上的保护液Ⅲ，将组织块接种于复合PDA平板培养基上，置于22℃条件下培养至长出菌丝，选择长势健壮、菌丝浓白，镜检具有锁状联合的菌落转接至复合PDA斜面上保存；
复合PDA培养基为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、麦麸10g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、琼脂20g/L，余量水；
保护液Ⅲ为：1.2mol/L蔗糖、7mmol/LKH2PO4、5mmol/LMgSO4，余量水。
实施例2
一株白金针菇子实体材料的超低温冷冻保存的方法，包括如下步骤：
(1)无菌保存材料的制备
无菌培养皿中加入灭菌后的复壮培养基，制成培养基平板，培养基厚度为8mm，挑取待保存白金针菇菌种(W48)的菌丝接种到复壮培养基平板上，将接种后的培养基平板用封口膜封口后置于20℃恒温培养箱中进行培养，得到长满菌丝的平板菌落；将长满菌丝的平板菌落置于12℃恒温箱中进行诱导培养至子实体形成，由培养获得的子实体菌柄上端与菌盖连接处切取1mm的菌柄组织作为待保存的子实体材料；
复壮培养基组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、玉米芯100g/L、麦麸100g/L、大豆浓缩蛋白3g/L、琼脂20g/L，余量水。
(2)将步骤(1)获得的待保存子实体材料转入保护液Ⅰ中，于25℃下预处理30min；
保护液Ⅰ的组成为：0.8mol/L蔗糖、1.8mol/L甘油、6mmol/L KH2PO4、4mmol/LMgSO4，余量水。
(3)将步骤(2)处理后的子实体材料放入1mL冻存管中，每管放10块，加入0.5mL保护液Ⅱ浸没子实体材料，于4℃条件下处理2h；
保护液Ⅱ的组成为：3.5mol/L甘油、2mol/L乙二醇、0.3mol/L蔗糖、6mmol/LKH2PO4、4mmol/L MgSO4、余量水。
(4)将步骤(3)的冷冻管装入冷冻盒，采用程序降温仪按0.8℃/min降温速率降温至-40℃，然后直接投入液氮中速冻，并在液氮中长期保存3年。
上述白色金针菇子实体超低温冷冻保存复苏的方法，包括如下步骤：
将步骤(4)中保存3年的冷冻盒从液氮中取出，迅速将冻存管放入37℃水浴中5min快速解冻；然后室温下用保护液Ⅲ洗涤子实体材料3次；最后用灭菌的滤纸吸干组织块上的保护液Ⅲ，将组织块接种于复合PDA平板培养基上，置于22℃条件下培养至长出菌丝，选择长势健壮、菌丝浓白，镜检具有锁状联合的菌落转接至复合PDA斜面上保存；
复合PDA培养基为：马铃薯180g/L、葡萄糖18g/L、麦麸8g/L、蛋白胨2.5g/L、KH2PO40.8g/L、MgSO4·7H2O 0.45g/L、琼脂20g/L，余量水；
保护液Ⅲ为1.0mol/L蔗糖、6mmol/LKH2PO4、4mmol/LMgSO4，余量水。
实施例3
一株白金针菇子实体材料的超低温冷冻保存的方法，包括如下步骤：
(1)无菌保存材料的制备
无菌培养皿中加入灭菌后的复壮培养基，制成培养基平板，培养基厚度为8mm，挑取待保存白金针菇菌种的菌丝接种到复壮培养基平板上，将接种后的培养基平板用封口膜封口后置于20℃恒温培养箱中进行培养，得到长满菌丝的平板菌落；将长满菌丝的平板菌落置于12℃恒温箱中进行诱导培养至子实体形成，由培养获得的子实体菌柄上端与菌盖连接处切取1mm的菌柄组织作为待保存的子实体材料；
复壮培养基组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、玉米芯100g/L、麦麸100g/L、大豆浓缩蛋白3g/L、琼脂20g/L，余量水。
(2)将步骤(1)获得的待保存子实体材料转入保护液Ⅰ中，于25℃下预处理30min；
保护液Ⅰ的组成为：1.2mol/L蔗糖、2.2mol/L甘油、8mmol/L KH2PO4、6mmol/LMgSO4、余量水。
(3)将步骤(2)处理后的子实体材料放入1mL冻存管中，每管放10块，加入0.5mL保护液Ⅱ浸没子实体材料，于4℃条件下处理2h；
保护液Ⅱ的组成为：4.5mol/L甘油、3mol/L乙二醇、0.5mol/L蔗糖、8mmol/LKH2PO4、6mmol/L MgSO4、余量水。
(4)将步骤(3)的冷冻管装入冷冻盒，采用程序降温仪按1.2℃/min降温速率降温至-40℃，然后直接投入液氮中速冻，并在液氮中长期保存3年。
上述白色金针菇子实体超低温冷冻保存复苏的方法，包括如下步骤：
将步骤(4)中保存3年的冷冻盒从液氮中取出，迅速将冻存管放入37℃水浴中5min快速解冻；然后室温下用保护液Ⅲ洗涤子实体材料3次；最后用灭菌的滤纸吸干组织块上的保护液Ⅲ，将组织块接种于复合PDA平板培养基上，置于22℃条件下培养至长出菌丝，选择长势健壮、菌丝浓白，镜检具有锁状联合的菌落转接至复合PDA斜面上保存；
复合PDA培养基为：马铃薯200g/L、葡萄糖21g/L、麦麸11g/L、蛋白胨3.5g/L、KH2PO41.2g/L、MgSO4·7H2O 0.55g/L、琼脂15g/L，余量水；
保护液Ⅲ为1.2mol/L蔗糖、8mmol/LKH2PO4、6mmol/LMgSO4，余量水。
实施例4
一株黄金针菇子实体材料的超低温冷冻保存复苏方法。
(1)无菌保存材料的制备
无菌培养皿中加入灭菌后的复壮培养基，制成培养基平板，培养基厚度为8mm，挑取待保存黄金针菇菌种(Y991)，的菌丝接种到复壮培养基平板上，将接种后的培养基平板用封口膜封口后置于20℃恒温培养箱中进行培养，得到长满菌丝的平板菌落；将长满菌丝的平板菌落置于10℃恒温箱中进行诱导培养至子实体形成，由培养获得的子实体菌柄上端与菌盖连接处切取2mm的菌柄组织作为待保存的子实体材料。
复壮培养基组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、玉米芯100g/L、麦麸100g/L、大豆浓缩蛋白3g/L、琼脂20g/L，余量水。
(2)将步骤(1)获得的待保存子实体材料转入保护液Ⅰ中，于22℃下预处理60min。
保护液Ⅰ的组成为：1.0mol/L蔗糖、2.0mol/L甘油、7mmol/L KH2PO4、5mmol/LMgSO4，余量水。
(3)将步骤(2)预处理处理后的子实体材料放入1mL冻存管中，每管放10块，加入0.5mL保护液Ⅱ浸没子实体材料，于0℃条件下处理4h。
保护液Ⅱ的组成为：4.0mol/L甘油、2.5mol/L乙二醇、0.4mol/L蔗糖、7mmol/LKH2PO4、5mmol/L MgSO4、余量水。
(4)将步骤(3)的冷冻管装入冷冻盒。采用程序降温仪按1℃/min降温速率降温至-40℃，后直接投入液氮中速冻，并在液氮中长期保存2年。
上述黄色金针菇子实体超低温冷冻保存复苏的方法，包括如下步骤：
将上述步骤(4)中保存2年的冷冻盒从液氮中取出，迅速将冻存管放入35℃水浴4min中快速解冻；然后室温下用保护液Ⅲ洗涤子实体材料2次；最后用灭菌的滤纸吸干组织块上的保护液Ⅲ，将组织块接种于复合PDA平板培养基上，置于20℃条件下培养至长出菌丝，选择长势健壮、菌丝浓白，镜检具有锁状联合的菌落转接至复合PDA平板培养基上保存。
复合PDA培养基为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、麦麸10g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、琼脂20g/L，余量水。
保护液Ⅲ为1.2mol/L蔗糖、7mmol/LKH2PO4、5mmol/LMgSO4、余量水。
对比例1
与实施例1相比，不同之处是保存金针菇的菌丝块，不保存金针菇的子实体，其他均相同。
对比例2
与实施例1相比，不同之处是保存材料来自常规开放式栽培获得的子实体组织块，且每个组织块单独保存在一个冷冻管中，其他均相同。
对比例3
与实施例1相比，不同之处是金针菇子实体不经过预冷处理直接投入液氮中，其他均相同。
对比例4
与实施例1相比，不同之处是二甲基亚砜代替保护液Ⅱ中的甘油，其他均相同。
对比例5
与实施例1相比，不同之处是保护液Ⅰ、保护液Ⅱ以及保护液Ⅲ种不加KH2PO4、MgSO4，其他均相同。
实验例
实施例1-4与对比例1-5获得的保存菌株均用于平板培养和生产栽培，每例各接种栽培瓶50瓶，常规工厂化栽培管理，测定子实体生物学效率。以常规试管斜面传代保存的白金针菇菌种(W48)作为对照1(CK1)；以常规试管斜面传代保存的黄金针菇菌种(Y991)作为对照2(CK2)。
不同菌种在PDA平板培养基生长特性测定:取直径为0.5cm供试菌株菌圆片转接至PDA培养基平板上，置于22℃恒温培养箱中避光培养，培养至第3天时在菌落边缘划一条起始生长线，继续培养至菌落边缘距培养皿边缘约0.5-1cm时，在菌落边缘再划一条终止线，量取两线之间的距离，计算菌丝日均生长速度并观察菌丝长势。
生物学效率测定：当子实体生长至12-14cm且菌盖将要开伞时采收、测定不同菌株生物学效率。
生物学效率(％)＝子实体鲜重(g)/培养料干重(g)*100
结果与分析
由上述实验例得到不同保存处理菌种恢复生长及栽培实施结果见表1：
表1
Figure BDA0002252127130000071
Figure BDA0002252127130000081
注：子实体生物转化率为工厂化瓶栽第一潮菇的平均生物转化率。
由表1可以看出各不同保存处理的菌种复苏后表现差异较大，主要区别如下：
(1)萌发时间：实施例1、2、3、4以及对比例2、3、4、5复活后菌丝萌发时间为3天，而对比例1的菌丝萌发时间为4天，常规试管斜面传代的萌发时间为1天。
(2)成活率：实施例1-3的成活率与对照CK1成活率相同达到100％，实施例4的成活率与对照CK2成活率相同达到100％；对比例1-5成活率都有所降低，成活率分别为：65％、55％、58％、46％、85％。
(3)生长速度：实施例1-3复活后的菌丝生长速度高于对比例1-5复活后的菌丝生长速度，但都低于CK1，长势也较CK1稍弱；实施例4复活后的菌丝生长速度低于CK2，长势较CK2稍弱；经过2次转接后实施例1-3与对比例1-5的菌丝长速、长势均恢复至与CK1相近；实施例4的菌丝长速、长势均恢复至与CK2相近。
(4)污染率：对比例2的复苏污染率高达到45％，未污染的均成活，其余处理污染率为0，为了避免交叉污染，对比例2每个冻存管中仅保存一块材料，占用了较多的保存空间。
(5)子实体生物转化率不同，实施例1-3白金针菇(W48)的子实体生物转化率均高于对比例1-5及常规试管斜面传代保存的CK1(W48)，实施例4黄金针菇(Y991)的子实体生物转化率也高于常规试管斜面传代保存的CK2(Y991)。
综上所述利用本发明进行金针菇菌种保存，不仅能实现菌种长期保存的目的，还具有菌种复壮、增产的作用，而利用本发明优选的保存工艺参数进行菌种保存可以达到最佳的保存效果：菌种复苏成活率高、污染率低、菌丝长势旺、长速快、栽培子实体生物转化率提高。

Claims (3)

1.一种金针菇子实体超低温冷冻保存后的复苏方法，包括如下步骤：
( a) 将超低温冷冻保存的金针菇子实体冻存管从液氮中取出，迅速将冻存管放入35~37℃水浴中快速解冻3~5min，制得解冻子实体材料；
( b) 用保护液Ⅲ洗涤步骤（a）制得的解冻子实体材料2～3次，然后吸干解冻子实体材料上的保护液Ⅲ，将解冻子实体材料接种于真菌培养基上，置于20-23℃条件下培养至长出菌丝体，选择长势健壮、菌丝浓白，镜检具有锁状联合的菌落转接保存或/和用于生产；
所述保护液Ⅲ的成分如下：1～1.2mol/L蔗糖、6～8mmol/LKH2PO4、4～6mmol/LMgSO4，水为溶剂；
所述步骤( b) 中真菌培养基每升组份如下：马铃薯180～200份、葡萄糖18～21份、麦麸8～11份、蛋白胨2.5～3.5份、KH2PO4 0.8～1.2份、MgSO4· 7H2O 0.45～0.55 份、琼脂15～20 份，余量水。
2.如权利要求1所述金针菇子实体超低温冷冻保存后的复苏方法，其特征在于，所述步骤（b）中保护液Ⅲ的成分如下：1.2mol/L蔗糖、7mmol/LKH2PO4、5mmol/LMgSO4，水为溶剂。
3.如权利要求1所述金针菇子实体超低温冷冻保存后的复苏方法，其特征在于，所述步骤( b) 中真菌培养基每升组份如下：马铃薯200g、葡萄糖20g、麦麸10g、蛋白胨3g、KH2PO41g、MgSO4· 7H2O 0.5 g、琼脂20g，余量水。
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