CN104663251A - 一种黑牛肝菌母种长期保藏方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及菌种保藏领域，具体而言，涉及一种黑牛肝菌母种长期保藏方法。一种黑牛肝菌母种长期保藏方法，以海藻糖作为保护剂保藏黑牛肝菌母种。本发明提供的一种黑牛肝菌母种长期保藏方法，选用海藻糖作为保护剂保藏黑牛肝菌母种，彻底解决了黑牛肝菌菌种长期保藏问题，其操作简单，成本低廉，并且不易退化和变异，成活率高，具有良好的应用前景。同时，也为其他高温食用菌菌种保藏技术的完善提供积极的促进作用。

Description

一种黑牛肝菌母种长期保藏方法

技术领域

本发明涉及菌种保藏领域，具体而言，涉及一种黑牛肝菌母种长期保藏方法。

背景技术

黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)，是一种珍贵的热带食用菌，深受出产地人们的喜爱，也是此属中唯一可以使用腐生方法栽培的食用菌，目前已可用袋栽及瓶栽的方法进行中等规模的栽培推广。黑牛肝菌是一种高温食用菌，菌丝体不耐低温，微生物及一般食用菌菌种常用的低温(4℃)保藏法，保藏黑牛肝菌菌种24小时死亡率100％。因此，菌种的中短期保藏需要保存在中温条件下进行，而长期保藏未见报道。黑牛肝菌是一种新型的可进行人工栽培的小牛肝菌科真菌，获得一株具有商业栽培价值的菌株极其困难，加之菌种的不耐低温及中短期保藏多次转接产生的退化，限制了黑牛肝菌的研发及产业化栽培。

常规液氮保藏方法使用甘油或二甲亚砜，而黑牛肝菌在这些保护剂下不萌发或复苏后退化现象明显；由于是高温菇，中低温菇的预冷方式(如降温速率为1℃降温至-40℃再移入液氮中)并不适合，萌发率并不高；常用38℃水温下水浴复苏本菌种萌发率为0。保藏菌种常采用长满斜面或平皿菌种，其他一些食用菌菌丝生长速度快，长满斜面或平皿只需10d左右，菌丝旺盛，而本菌种需要25-30天，此时液泡过大，胞液结晶时对菌丝损伤大，不适合保藏。因此，中低温食用菌液氮保藏方法并不适合本菌种，急需寻求一种适宜黑牛肝菌菌种长期保藏的方法，提高其菌种的稳定性，为黑牛肝菌的研发以及实现其产业化栽培提供菌种保障。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑牛肝菌母种长期保藏方法，以提高黑牛肝菌的稳定性，为黑牛肝菌的研发以及实现其产业化栽培提供菌种保障。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种黑牛肝菌母种长期保藏方法，以海藻糖作为保护剂保藏黑牛肝菌母种。

本发明提供的一种黑牛肝菌母种长期保藏方法，选用海藻糖作为保护剂保藏黑牛肝菌母种，彻底解决了黑牛肝菌菌种长期保藏问题，其操作简单，成本低廉，并且不易退化和变异，成活率高，具有良好的应用前景。同时，也为其他高温食用菌菌种保藏技术的完善提供积极的促进作用。

为了防止保藏过程中发生退化和变异，提升保藏后的黑牛肝菌的稳定性，使保藏后成活率高，优选地，所述保护剂为质量百分数为20％-40％的海藻糖水溶液。

优选地，所述黑牛肝菌母种具有以下特征：

颜色乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好。

颜色乳黄至金色，说明菌丝生长旺盛；而菌皮、菌索以及吐水是菌丝生长老化的特征。本发明保藏的黑牛肝菌母种处于生长旺盛阶段，母种在保藏过程中对外界抗逆性强，能很好的保持自身的性状。

进一步地，所述黑牛肝菌母种通过以下培养方式获得：

将菌丝块接种于母种培养基上，于28-30℃恒温培养15～20天。

菌丝块是由黑牛肝菌子实体的组织块培养得到，用于短期保藏的菌种。即直接取短期保藏的菌丝块进行培养，至其颜色乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好即可。得到的母种处于生长旺盛阶段。

此外，黑牛肝菌母种也可以直接将黑牛肝菌子实体的组织块培养获得，即将黑牛肝菌子实体的组织块于28-30℃恒温培养28-32天，至其颜色乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好即可。

进一步地，所述母种培养基包含以下成分：

该母种培养基能很好的满足黑牛肝菌生长需求，黑牛肝菌在该培养基上生长旺盛，得到的菌丝多。

进一步地，保藏过程具体为：

将所述黑牛肝菌母种浸入保护剂中，先在-110℃～-130℃条件下预冷30min～60min，然后放入液态氮或气相氮中保藏。

黑牛肝菌母种浸入保护剂中，先于较低温度下预冷，使黑牛肝菌母种适应一段时间后再放入液氮中长期保藏，经过这样的处理，尽量减少了对黑牛肝菌母种的损伤。

进一步地，将所述黑牛肝菌母种按无菌操作装入已灭菌的低温冻存管中，使所述黑牛肝菌母种放入无菌的保护剂中。保藏所用的黑牛肝菌母种、冻存管以及保护剂均为无菌的状态，以防止其他杂菌对黑牛肝菌母种的破坏。

为了进一步保持黑牛肝菌母种处于无菌的状态，并防止外界环境的干扰，优选地，所述低温冻存管扭紧管塞后再用医用胶带封口。

为了复苏过程中尽量减少对黑牛肝菌母种的损害，优选地，复苏时，取出所述低温冻存管，放入39℃～42℃的恒温温水中快速恢复至室温。

为了保持菌丝活力及菌种栽培性状，且易于保藏，优选地，所述黑牛肝菌母种的长宽为0.9-1.1cm×0.3-0.5cm。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明发现选用海藻糖作为保护剂，特别是选用质量百分数为20％-40％的海藻糖水溶液保藏黑牛肝菌母种，防止了保藏过程中黑牛肝菌母种发生退化和变异，是黑牛肝菌母种性状稳定性，成活率高；

(2)本发明保藏的黑牛肝菌母种处于生长旺盛阶段，母种在保藏过程中对外界抗逆性强，很好的保持了菌丝活力及菌种栽培性状；

(3)本发明将黑牛肝菌母种浸入保护剂中，先于较低温度下预冷，使黑牛肝菌母种适应一段时间后再放入液氮中长期保藏，经过这样的处理，尽量减少了对黑牛肝菌母种的损伤；

(4)本发明选用特定大小的黑牛肝菌母种进行保藏，保藏后很好的保持了其菌丝活力及菌种栽培性状；

(5)本发明对保藏后的母种复苏后斜面培养，1～3天菌种萌发，萌发率100％，20～30天长满斜面；本发明彻底解决了黑牛肝菌菌种长期保藏问题，其操作简单，成本低廉，并且不易退化和变异，成活率高，具有良好的应用前景；同时，也为其他高温食用菌菌种保藏技术的完善提供积极的促进作用。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。

实施例1

将菌丝块接种于母种培养基上，于30℃恒温培养，15天获得用于保藏的黑牛肝菌母种，其中，母种培养基包含以下成分：

得到的黑牛肝菌母种颜色为乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好；

将黑牛肝菌母种制成长宽为0.9cm×0.5cm的菌丝块，按无菌操作装入已灭菌的低温冻存管中，低温冻存管的规格为2ml，内旋式，低温冻存管含有无菌的20％海藻糖0.5ml；扭紧管塞后用医用胶带封口两圈，轻微震荡，使菌丝块完全浸入保护剂中，其中一支低温冻存管放入菌块数量为1块；

低温冻存管先在-110℃条件下预冷30min，然后浸入液态氮或气相氮中保藏；

保藏3年后，取出所述低温冻存管，放入39℃的恒温温水中快速恢复至室温。

实施例2

将菌丝块接种于母种培养基上，于29℃恒温培养，18天获得用于保藏的黑牛肝菌母种，其中，母种培养基包含以下成分：

得到的黑牛肝菌母种颜色为乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好；

将黑牛肝菌母种制成长宽为1cm×0.3cm的菌丝块，按无菌操作装入已灭菌的低温冻存管中，低温冻存管的规格为2ml，内旋式，低温冻存管含有无菌的30％海藻糖1ml，扭紧管塞后再用医用胶带封口两圈，轻微震荡，使菌丝块完全浸入保护剂中，其中一支低温冻存管放入菌块数量为2块；

低温冻存管先在-120℃条件下预冷40min，然后浸入液态氮或气相氮中保藏；

保藏3年后，取出所述低温冻存管，放入40℃的恒温温水中快速恢复至室温。

实施例3

将菌丝块接种于母种培养基上，于28℃恒温培养，20天获得用于保藏的黑牛肝菌母种，其中，母种培养基包含以下成分：

得到的黑牛肝菌母种颜色为乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好；

将黑牛肝菌母种制成长宽为1.1cm×0.4cm的菌丝块，按无菌操作装入已灭菌的低温冻存管中，低温冻存管的规格为2ml，内旋式，低温冻存管含有无菌的40％海藻糖1.5ml，扭紧管塞后再用医用胶带封口两圈，轻微震荡，使菌丝块完全浸入保护剂中，其中一支低温冻存管放入菌块数量为3块；

低温冻存管先在-130℃条件下预冷60min，然后浸入液态氮或气相氮中保藏；

保藏3年后，取出所述低温冻存管，放入42℃的恒温温水中快速恢复至室温。

实验例1

同时，本发明设置了三个对照组，对照组1：将黑牛肝菌母种浸入到蒸馏水中，于15℃保藏1年；

对照组2：将黑牛肝菌母种于斜面培养基上保藏，保藏的温度为15℃，保藏时间为8个月；

对照组3：未经保藏的黑牛肝菌母种。

将实施例1-3得到的复苏的黑牛肝菌母种以及对照组1-3中的黑牛肝菌母种进行性状测试，具体为：

1、对于实施例1-3中的黑牛肝菌母种：从低温冻存管中取出菌丝块，用滤纸、吸附剂等将菌丝块上的保护剂充分吸收后，转入母种培养基上，再移入29℃恒温箱中培养；

对于对照组1的黑牛肝菌母种：从低温冻存管中取出菌丝块，用滤纸、吸附剂等将菌丝块上的蒸馏水充分吸收后，转入母种培养基上，再移入29℃恒温箱中培养；

对于对照组2的黑牛肝菌母种：将斜面上的菌丝块去除，去除培养基，转入母种培养基上，再移入29℃恒温箱中培养；

对于对照组3的黑牛肝菌母种：直接将菌丝块转入母种培养基上，再移入29℃恒温箱中培养；

2、栽培出菇试验

测定对照组1-3与实施例1-3保藏后的黑牛肝菌母种在转代次数、萌发时间、菌丝特征和平均子实体重等参数差异。萌发时间和产量的差异结果如表1所示。

表1不同组别之间的萌发时间和产量的差异

组别	萌发时间	平均菇重
			实施例1	1～2d	107.8g
实施例2	1～2d	108.0g
			实施例3	1～2d	108.5g
对照组1	3～7d	102.5g
			对照组2	1～2d	89.2g
对照组3	1～2d	109.6g

具体地，本发明提供的黑牛肝菌母种长期保藏方法，采用超低温保藏，保藏后的黑牛肝菌母种转代1次，1天后开始萌发，萌发率均为100％，菌丝生长旺盛，25天长满斜面，具有极少量发白菌丝，出菇试验平均菇重为107.8g-108.5；蒸馏水保藏转代3次，7天后开始萌发，萌发率为85％，菌丝生长缓慢，约10％的菌种25天能长满斜面，大部分菌落不延伸，出菇试验平均菇重为102.5g；斜面保藏1天后开始萌发，萌发率为100％，菌丝生长速度快，25-30天长满斜面，具有大量发白菌丝，出菇试验畸形菇较多，平均菇重为89.2g。

此外，还采用本发明提供的黑牛肝菌母种长期保藏方法将黑牛肝菌母种分别保藏5年、6年和8年，得到的结果与上述保藏3年的结果一致。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种黑牛肝菌母种长期保藏方法，其特征在于，以海藻糖作为保护剂保藏黑牛肝菌母种。

2.根据权利要求1所述的黑牛肝菌母种长期保藏方法，其特征在于，所述保护剂为质量百分数为20％-40％的海藻糖水溶液。

3.根据权利要求1所述的黑牛肝菌母种长期保藏方法，其特征在于，所述黑牛肝菌母种具有以下特征：

颜色乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好。

4.根据权利要求1所述的黑牛肝菌母种长期保藏方法，其特征在于，所述黑牛肝菌母种通过以下培养方式获得：

将菌丝块接种于母种培养基上，于28-30℃恒温培养15～20天。

5.根据权利要求4所述的黑牛肝菌母种长期保藏方法，其特征在于，所述母种培养基包含以下成分：

6.根据权利要求1所述的黑牛肝菌母种长期保藏方法，其特征在于，保藏过程具体为：

将所述黑牛肝菌母种浸入保护剂中，先在-110℃～-130℃条件下预冷30min～60min，然后浸入液态氮或气相氮中保藏。

7.根据权利要求6所述的黑牛肝菌母种长期保藏方法，其特征在于，将所述黑牛肝菌母种按无菌操作装入已灭菌的低温冻存管中，使所述黑牛肝菌母种放入无菌的保护剂中。

8.根据权利要求7所述的黑牛肝菌母种长期保藏方法，其特征在于，所述低温冻存管扭紧管塞后再用医用胶带封口。

9.根据权利要求8所述的黑牛肝菌母种长期保藏方法，其特征在于，复苏时，取出所述低温冻存管，放入39℃～42℃的恒温温水中快速恢复至室温。

10.根据权利要求1-9任一项所述的黑牛肝菌母种长期保藏方法，其特征在于，所述黑牛肝菌母种的长宽为0.9-1.1cm×0.3-0.5cm。