CN104694391A - 一种黑牛肝菌菌种长期保藏的复合保护剂及其保藏方法 - Google Patents
一种黑牛肝菌菌种长期保藏的复合保护剂及其保藏方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及真菌保藏领域，特别涉及一种黑牛肝菌菌种长期保藏的复合保护剂及其保藏方法。复合保护剂包括：以水的体积计，蔗糖100-400g/L，磷酸二氢钾1.0-2.0g/L，硫酸镁1.0-2.0g/L，酒石酸铵1.0-2.0g/L。保藏方法是将黑牛肝菌菌种浸入复合保护剂中，先在-110℃～-130℃条件下预冷30min～60min，然后浸入液态氮或气相氮中保藏。采用该复合保护剂进行保藏，各成分协同配合，保护黑牛肝菌菌种在超低温条件下不受损害，特定的保藏方法使保藏时间更长，遗传稳定性更好，产量与保藏前无明显差异等优点，具有良好的应用前景，同时为工厂化大面积栽培菌种提供可靠保障。
Description
技术领域
本发明涉及真菌保藏领域，具体而言，涉及一种黑牛肝菌菌种长期保藏的复合保护剂及其保藏方法。
背景技术
液氮温度为-196℃，在此温度下真菌细胞新陈代谢完全停止，从而避免真菌菌种的退化和变异。自1960年HWANG成功使用液氮保存方法保存真菌菌种后，该方法不断被完善，技术也越来越成熟。保护剂的种类及浓度是液氮保藏方法中的关键问题之一，虽然MATA在不使用保护剂和程序降温仪条件下成功保藏菌种，但黑牛肝菌这些对低温敏感的菌种仍需使用保护剂。常用的保护剂包括二甲亚砜、甘油，蔗糖、海藻糖等，这些保护剂有的在细胞内外发生水合作用，弱化水的结晶过程，达到保护作用；有的使溶液呈过冷状态，即在特定温度下降低溶质(电解质)浓度，起到保护作用。
黑牛肝菌(Phlebopus Portentosus)是一种高温食用菌，对低温敏感，品质鲜嫩、味道鲜美，目前已经尝试进行商业化栽培，国内外也都一直开展对该菌进行研究和选育，获得优良菌株之后，如何稳定、有效地将其长期保藏是一个急需解决的问题。常用保护剂二甲亚砜保藏后菌种生长缓慢，出现菌丝发白现象；甘油保藏后菌种不萌发；蔗糖、海藻糖保藏菌种效果较好，但也有少数菌落凸起不延伸，吐水较少等退化现象，栽培出菇时产量也有降低。因此，需要寻找一种更适合黑牛肝菌菌种长期保藏的保护剂，降低退化和变异，为以后商业化栽培提供稳定的菌种。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种黑牛肝菌菌种长期保藏的复合保护剂，所述的复合保护剂适用于黑牛肝菌菌种的长期超低温保藏。
本发明的第二目的在于提供一种所述的复合保护剂保藏黑牛肝菌菌种的方法，该方法简单易行。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种黑牛肝菌菌种长期保藏的复合保护剂，主要包括以下成分：以水的体积计，蔗糖100-400g/L，磷酸二氢钾1.0-2.0g/L，硫酸镁1.0-2.0g/L，酒石酸铵1.0-2.0g/L。
本发明提供的黑牛肝菌菌种长期保藏的复合保护剂，各成分协同配合，保护黑牛肝菌菌种在超低温条件下不受损害，该复合保护剂与常用保护剂相比，保藏时间更长，遗传稳定性更好，产量与保藏前无明显差异等优点，具有良好的应用前景，同时为工厂化大面积栽培菌种提供可靠保障。
为了进一步增加各成分之间的协同增强作用，以达到更好的保护效果，优选地，主要包括以下成分：以水的体积计，蔗糖350-400g/L，磷酸二氢钾1.8-2.0g/L，硫酸镁1.8-2.0g/L，酒石酸铵1.8-2.0g/L。
本发明还提供了采用所述的复合保护剂保藏黑牛肝菌菌种的方法，将所述黑牛肝菌菌种浸入复合保护剂中，先在-110℃～-130℃条件下预冷30min～60min，然后浸入液态氮或气相氮中保藏。
本发明提供的保藏黑牛肝菌菌种的方法，将黑牛肝菌菌种浸入复合保护剂中，先于较低温度下预冷，使黑牛肝菌菌种适应一段时间后再放入液氮中长期保藏，经过这样的处理，尽量减少了对黑牛肝菌菌种的损伤，使保藏后的黑牛肝菌菌种依然保持很好的活性和栽培性状。
优选地，所述黑牛肝菌菌种具有以下特征：
颜色乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好。
颜色乳黄至金色，说明菌丝生长旺盛；而菌皮、菌索以及吐水是菌丝生长老化的特征。本发明保藏的黑牛肝菌菌种处于生长旺盛阶段，菌种在保藏过程中对外界抗逆性强，能很好的保持自身的性状。
进一步地，所述黑牛肝菌菌种通过以下培养方式获得：
将菌丝块接种于菌种培养基上，于28-30℃恒温培养15～20天。
菌丝块是由黑牛肝菌子实体的组织块培养得到，用于短期保藏的菌种。即直接取短期保藏的菌丝块进行培养，至其颜色乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好即可。得到的菌种处于生长旺盛阶段。
此外，黑牛肝菌菌种也可以直接将黑牛肝菌子实体的组织块培养获得，即将黑牛肝菌子实体的组织块于28-30℃恒温培养28-32天，至其颜色乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好即可。
进一步地，所述菌种培养基包含以下成分：
该菌种培养基能很好的满足黑牛肝菌生长需求，黑牛肝菌在该培养基上生长旺盛，得到的菌丝多。
进一步地，将所述黑牛肝菌菌种按无菌操作装入已灭菌的低温冻存管中，使所述黑牛肝菌菌种放入无菌的复合保护剂中。保藏所用的黑牛肝菌菌种、冻存管以及保护剂均为无菌的状态，以防止其他杂菌对黑牛肝菌菌种的破坏。
为了进一步保持黑牛肝菌菌种处于无菌的状态，并防止外界环境的干扰，优选地，所述低温冻存管扭紧管塞后再用医用胶带封口。
为了复苏过程中尽量减少对黑牛肝菌菌种的损害，优选地，复苏时，取出所述低温冻存管，放入39℃～42℃的恒温温水中快速恢复至室温。
为了保持菌丝活力及菌种栽培性状，且易于保藏，优选地，所述黑牛肝菌菌种的长宽为0.9-1.1cm×0.3-0.5cm。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的复合保护剂，各成分协同配合，保护黑牛肝菌菌种在超低温条件下不受损害，该复合保护剂与常用保护剂相比，保藏时间更长，遗传稳定性更好，产量与保藏前无明显差异等优点，具有良好的应用前景，同时为工厂化大面积栽培菌种提供可靠保障；
(2)本发明保藏的黑牛肝菌菌种处于生长旺盛阶段，菌种在保藏过程中对外界抗逆性强，很好的保持了菌丝活力及菌种栽培性状；
(3)本发明将黑牛肝菌菌种浸入复合保护剂中，先于较低温度下预冷，使黑牛肝菌菌种适应一段时间后再放入液氮中长期保藏，经过这样的处理，尽量减少了对黑牛肝菌菌种的损伤；
(4)本发明选用特定大小的黑牛肝菌菌种进行保藏，保藏后很好的保持了其菌丝活力及菌种栽培性状；
(5)本发明对保藏后的菌种复苏后斜面培养，萌发率100％，本发明彻底解决了黑牛肝菌菌种长期保藏问题，其操作简单，成本低廉，并且不易退化和变异，成活率高，具有良好的应用前景；同时，也为其他高温食用菌菌种保藏技术的完善提供积极的促进作用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
将菌丝块接种于母种培养基上，于30℃恒温培养，15天获得用于保藏的黑牛肝菌母种，其中，母种培养基包含以下成分：
得到的黑牛肝菌母种颜色为乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好；
将黑牛肝菌母种制成长宽为0.9cm×0.5cm的菌丝块，按无菌操作装入已灭菌的低温冻存管中，低温冻存管的规格为2ml，内旋式，低温冻存管含有无菌的复合保护剂0.5ml，其中，复合保护剂包括以下成分：以水的体积计，蔗糖100g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁1.0g/L，酒石酸铵1.0g/L；
扭紧管塞后用医用胶带封口两圈，轻微震荡，使菌丝块完全浸入保护剂中，其中一支低温冻存管放入菌块数量为1块；
低温冻存管先在-110℃条件下预冷30min，然后浸入液态氮或气相氮中保藏；
保藏3年后，取出所述低温冻存管，放入39℃的恒温温水中快速恢复至室温。
实施例2
将菌丝块接种于母种培养基上，于29℃恒温培养，18天获得用于保藏的黑牛肝菌母种，其中，母种培养基包含以下成分：
得到的黑牛肝菌母种颜色为乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好；
将黑牛肝菌母种制成长宽为1cm×0.3cm的菌丝块，按无菌操作装入已灭菌的低温冻存管中，低温冻存管的规格为2ml，内旋式，低温冻存管含有无菌的复合保护剂1ml，其中，复合保护剂包括以下成分：以水的体积计，蔗糖200g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁1.5g/L，酒石酸铵1.5g/L；
扭紧管塞后再用医用胶带封口两圈，轻微震荡，使菌丝块完全浸入保护剂中，其中一支低温冻存管放入菌块数量为2块；
低温冻存管先在-120℃条件下预冷40min，然后浸入液态氮或气相氮中保藏；
保藏3年后，取出所述低温冻存管，放入40℃的恒温温水中快速恢复至室温。
实施例3
将菌丝块接种于母种培养基上，于28℃恒温培养，20天获得用于保藏的黑牛肝菌母种，其中，母种培养基包含以下成分：
得到的黑牛肝菌母种颜色为乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好；
将黑牛肝菌母种制成长宽为1.1cm×0.4cm的菌丝块，按无菌操作装入已灭菌的低温冻存管中，低温冻存管的规格为2ml，内旋式，低温冻存管含有无菌的复合保护剂1.5ml，其中，复合保护剂包括以下成分：以水的体积计，蔗糖350g/L，磷酸二氢钾1.8g/L，硫酸镁1.8g/L，酒石酸铵1.8g/L；
扭紧管塞后再用医用胶带封口两圈，轻微震荡，使菌丝块完全浸入保护剂中，其中一支低温冻存管放入菌块数量为3块；
低温冻存管先在-130℃条件下预冷60min，然后浸入液态氮或气相氮中保藏；
保藏3年后，取出所述低温冻存管，放入42℃的恒温温水中快速恢复至室温。
实施例4
将菌丝块接种于母种培养基上，于28℃恒温培养，20天获得用于保藏的黑牛肝菌母种，其中，母种培养基包含以下成分：
得到的黑牛肝菌母种颜色为乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好；
将黑牛肝菌母种制成长宽为1.1cm×0.4cm的菌丝块，按无菌操作装入已灭菌的低温冻存管中，低温冻存管的规格为2ml，内旋式，低温冻存管含有无菌的复合保护剂1.5ml，其中，复合保护剂包括以下成分：以水的体积计，蔗糖400g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，硫酸镁2.0g/L，酒石酸铵2.0g/L；
扭紧管塞后再用医用胶带封口两圈，轻微震荡，使菌丝块完全浸入保护剂中，其中一支低温冻存管放入菌块数量为3块；
低温冻存管先在-130℃条件下预冷60min，然后浸入液态氮或气相氮中保藏；
保藏3年后，取出所述低温冻存管，放入40℃的恒温温水中快速恢复至室温。
实验例1
同时，本发明设置了4个对照组，对照组1：将黑牛肝菌菌种保藏于重量百分数为10％的二甲亚砜水溶液中，先在-130℃条件下预冷60min，然后浸入液态氮或气相氮中保藏3年；
对照组2：将黑牛肝菌菌种保藏于重量百分数为20％的海藻糖水溶液中，先在-130℃条件下预冷60min，然后浸入液态氮或气相氮中保藏3年；
对照组3：将黑牛肝菌菌种保藏于重量百分数为20％的蔗糖水溶液中，先在-130℃条件下预冷60min，然后浸入液态氮或气相氮中保藏3年；
对照组4：未经保藏的黑牛肝菌菌种。
将实施例1-4以及对照组1-3得到的复苏的黑牛肝菌母种和对照组4中的黑牛肝菌菌种进行性状测试，具体为：
1、对于实施例1-3和对照组1-3中的黑牛肝菌母种：从低温冻存管中取出菌丝块，用滤纸、吸附剂等将菌丝块上的保护剂充分吸收后，转入母种培养基上，再移入29℃恒温箱中培养；
对于对照组4的黑牛肝菌菌种：直接将菌丝块转入母种培养基上，再移入29℃恒温箱中培养；
2、栽培出菇试验
测定对照组1-4与实施例1-4保藏后的黑牛肝菌菌种在萌发时间、菌丝特征和平均子实体重等参数差异。具体如表1所示。
表1不同组别之间的黑牛肝菌菌种保藏后的性状差异
| 组别 | 萌发率 | 菌丝特性 | 菌丝生长速 | 平均菇重 |
| 度(mm/d) | (g) | |||
| 对照组1 | 90％ | 较多发白 | 1.26 | 105 |
| 对照组2 | 100％ | 极少量发白 | 1.56 | 107.5 |
| 对照组3 | 100％ | 少量发白 | 1.46 | 110.1 |
| 对照组4 | 100％ | 正常 | 1.71 | 118.0 |
| 实施例1 | 100％ | 正常 | 1.69 | 117.2 |
| 实施例2 | 100％ | 正常 | 1.70 | 117.3 |
| 实施例3 | 100％ | 正常 | 1.70 | 117.5 |
| 实施例4 | 100％ | 正常 | 1.70 | 117.4 |
本发明提供的黑牛肝菌母种长期保藏方法采用复合保护剂进行超低温保藏，保藏后的黑牛肝菌菌种萌发率均为100％，菌丝无发白现象，菌丝萌发后生长旺盛，生长速率达到1.69-1.70 mm/d，平均菇重为117.2g-117.5，相对于其他的保护剂具有非常显著的优势。
此外，本发明还采用复合保护剂将黑牛肝菌菌种分别保藏5年、6年和8年，得到的结果与上述保藏3年的结果一致。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种黑牛肝菌菌种长期保藏的复合保护剂，其特征在于，主要包括以下成分：以水的体积计，蔗糖100-400g/L，磷酸二氢钾1.0-2.0g/L，硫酸镁1.0-2.0g/L，酒石酸铵1.0-2.0g/L。
2.根据权利要求1所述的复合保护剂，其特征在于，主要包括以下成分：以水的体积计，蔗糖350-400g/L，磷酸二氢钾1.8-2.0g/L，硫酸镁1.8-2.0g/L，酒石酸铵1.8-2.0g/L。
3.采用权利要求1或2所述的复合保护剂保藏黑牛肝菌菌种的方法，其特征在于，将所述黑牛肝菌菌种浸入复合保护剂中，先在-110℃～-130℃条件下预冷30min～60min，然后浸入液态氮或气相氮中保藏。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述黑牛肝菌菌种具有以下特征：
颜色乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述黑牛肝菌菌种通过以下培养方式获得：
将菌丝块接种于菌种培养基上，于28-30℃恒温培养15～20天。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述菌种培养基包含以下成分：
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述黑牛肝菌菌种按无菌操作装入已灭菌的低温冻存管中，使所述黑牛肝菌菌种放入无菌的复合保护剂中。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述低温冻存管扭紧管塞后再用医用胶带封口。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，复苏时，取出所述低温冻存管，放入39℃～42℃的恒温温水中快速恢复至室温。
10.根据权利要求3-9任一项所述的方法，其特征在于，所述黑牛肝菌菌种的长宽为0.9-1.1cm×0.3-0.5cm。
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