KR101368924B1 - 세포 보존용 수용액 - Google Patents

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니뽄젠야쿠코교 가부시키가이샤
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Abstract

기초 배지, 혈청 등의 천연의 동물 유래 성분을 포함하지 않는 세포 보존용 수용액의 제공을 과제로 한다. 기초 배지, 혈청 등의 천연의 동물 유래 성분을 제외하고, 그 외의 성분 및 농도를 조정하는 것에 의해 높은 세포 생존율을 나타내는 보존용 수용액을 얻었다.

Description

세포 보존용 수용액{AQUEOUS SOLUTION FOR CELL PRESERVATION}
본 발명은 세포를 간이한 조작으로 장기간 보존할 수 있는 세포 보존용 수용액에 관한 것이다. 더 자세히는 기초 배지, 혈청 등의 천연의 동물 유래 성분을 포함하지 않는 세포 보존용 수용액에 관한 것이다.
종래, 배양 세포의 계대에 의한 세포의 변질이나 잡균에 의한 오염을 방지하고, 세포를 장기적으로 이용하기 위해 동결 보존이 행해지고 있다. 이 세포 보존은 일반적인 방법으로서, 디메틸술폭시드(이하, DMSO로 함)나 혈청을 포함하는 배양액에 세포를 현탁하고, 크라이오튜브나 앰플에 채워 프로그램 프리저를 이용하여 냉각하며, 액체질소 중(-196℃)에서 보존하는 방법이 알려져 있다.
이 동결 보존에 이용하는 보존 용액은 보존하는 세포의 종류에 의해서 여러 가지 조성의 물건이 조제되어 있다. 예컨대 혈청을 포함하지 않는 배지로 배양되는 배양 세포에 대하여, 혈청을 포함하지 않는 동결 보존용 배지가 개발되어 있다(예컨대 특허문헌 1 참조). 또한 혈청은 로트에 따라 다르기 때문에, 동결 보존액의 품질을 일정하게 할 수 없는 것이나, 혈청에 포함되는 각종 사이토카인이나 증식인자, 호르몬 등의 원래 세포 보존에 불필요한 성분이 보존 세포의 성질을 바꿀 우려가 있기 때문에 혈청을 이용하지 않는 동결 보존액이 개발되어 있다(예컨대 특허문 헌 2 참조).
그러나 특허문헌 1은 혈청을 포함하지 않지만 기초 배지를 포함하고 있고, 이 기초 배지에는 여러 가지 성분이 포함되어 있다. 예컨대 RPMI 1640 배지에는 유래가 불명한 다수의 아미노산이 이용되고 있고, 이들 배지 성분이 보존 세포에 부여하는 영향도 불명하다. 또한 특허문헌 2는 정제 알부민이 이용되고 있지만, 정제도 여하에 따라서는 역시 여러 가지 성분이 혼입될 가능성이 있고, 세포에 부여하는 영향에 문제가 있다.
특히 의료 등으로서 이용하고자 하는 경우에는 혈청이나 기초 배지에 포함되는 성분이 보존되는 세포에 부여하는 영향을 고려하여, 보존되는 세포에 영향을 부여하지 않는, 유래가 명확한 성분만으로 이루어지는 세포 보존액이나, 천연의 동물 유래의 성분을 전혀 포함하지 않는 세포 보존액의 개발이 요구되고 있다. 이러한 세포 보존액은 성분이 명확하기 때문에 품질이 일정하게 유지된다고 하는 이점도 기대할 수 있다.
그러나 종래의 세포 보존 용액은 모두 기초 배지나 혈청, 또는 혈청 대체물로서 혈청 알부민, 정제 알부민 등을 이용하지 않으면 장기간 안정적으로 보존할 수 없고, 완전히 천연의 동물 유래 성분을 포함하지 않는 세포 보존액은 아직 얻어져 있지 않다.
특허문헌 1: 일본 특허 공개 소63-216476호 공보
특허문헌 2: 일본 특허 공개 제2002-233356호 공보
본 발명은 기초 배지, 혈청 등의 천연의 동물 유래 성분을 포함하지 않는 세포 보존용 수용액의 제공을 과제로 한다. 또한 이 보존용 수용액을 이용하는 세포의 보존 방법의 제공을 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행한 결과, 기초 배지, 혈청 등의 천연의 동물 유래 성분을 제외하고, 그 밖의 성분 및 농도를 조정함으로써 보존 후의 세포가 높은 생존율을 나타내는 보존용 수용액을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 또한 본 발명의 보존용 수용액을 이용하여 세포를 조제함으로써, 세포의 보존 방법을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 다음 (1)∼(17)의 세포 보존용 수용액을 이용하는 세포의 보존 방법에 관한 것이다.
(1) 증점제, 동해방지제, 당류를 포함하는 세포 보존용 수용액으로서, 천연의 동물 유래 성분을 포함하지 않는 세포 보존용 수용액.
(2) pH 조정제를 더 포함하는 상기 (1)에 기재한 세포 보존용 수용액.
(3) 천연의 동물 유래 성분이 혈청 및 기초 배지 성분인 상기 (1) 또는 (2)에 기재한 세포 보존용 수용액.
(4) 이하의 (a)∼(e)의 조성을 포함하고, pH 6.5∼9.0인 세포 보존용 수용액.
(a) 동해방지제 1.0 w/v%∼20.0 w/v%
(b) 당류 1.0 w/v%∼10.0 w/v%
(c) 증점제 0.1 w/v%∼1.0 w/v%
(d) pH 조정제 0.01 w/v%∼1.0 w/v%
(e) 물 적량
(5) 침투압이 1000 mOsm 이상인 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재한 세포 보존용 수용액.
(6) 침투압이 1000 mOsm∼2700 mOsm인 상기 (5)에 기재한 세포 보존용 수용액.
(7) 증점제가 카르복시메틸셀룰로오스(CMC), 카르복시메틸셀룰로오스나트륨(CMC-Na) 또는 유기산 폴리머인 상기 (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재한 세포 보존용 수용액.
(8) 유기산 폴리머가 폴리아크릴산나트륨인 상기 (7)에 기재한 세포 보존용 수용액.
(9) 동해방지제가 디메틸술폭시드(DMSO) 또는 프로필렌글리콜인 상기 (1)∼(8) 중 어느 하나에 기재한 세포 보존용 수용액.
(10) 당류가 글루코오스인 상기 (1)∼(9) 중 어느 하나에 기재한 세포 보존용 수용액.
(11) pH 조정제가 인산 완충액인 상기 (1)∼(10) 중 어느 하나에 기재한 세포 보존용 수용액.
(12) 이하의 (a)∼(e)의 조성으로 이루어지고, pH 6.5∼9.0인 세포 보존용 수용액.
(a) DMSO 5.0 w/v%∼12.0 w/v%
(b) 글루코오스 3.0 w/v%∼5.0 w/v%
(c) 증점제 0.2 w/v%∼0.7 w/v%
(d) 인산 완충액 0.01 w/v%∼1.0 w/v%
(e) 물 적량
(13) 보존하는 세포가 림프구, 비장세포 및 흉선세포, 동물세포, 생체 줄기세포 및 배아 줄기세포 중 어느 하나인 상기 (1)∼(12) 중 어느 하나에 기재한 세포 보존용 수용액.
(14) 의료용으로 이용되는 상기 (1)∼(13) 중 어느 하나에 기재한 세포 보존용 수용액.
(15) 세포의 보존 방법이 동결 보존인 상기 (1)∼(14) 중 어느 하나에 기재한 세포 보존용 수용액.
(16) 보존 후의 세포의 생존율이 적어도 80% 이상인 상기 (1)∼(15) 중 어느 하나에 기재한 세포 보존용 수용액.
(17) -80℃에서 4일간 보존한 후, -196℃에서 72일간 더 보존한 후의 세포의 증식능이 유지되어 있는 상기 (1)∼(15) 중 어느 하나에 기재한 세포 보존용 수용액.
(18) 보존 후의 세포의 분화능이 유지되어 있는 상기 (1)∼(15) 중 어느 하나에 기재한 세포 보존용 수용액.
(19) 상기 (1)∼(15) 중 어느 하나에 기재한 세포 보존용 수용액에 세포를 분산시킨 후, 용기 안에 분주(分注)하여 동결 보존하는 세포의 보존 방법.
(20) 분주되는 세포가 1×105∼1×107개/mL인 상기 (19)에 기재한 세포의 보존 방법.
본 발명에 의해 확립된 세포 보존용 수용액은 기초 배지, 혈청 등의 천연의 동물 유래 성분을 포함하지 않기 때문에 보존된 세포에 대한 불순물, 예컨대 소 백혈병 바이러스·프리온 등의 혼입의 위험성이 낮아, 의료용으로서 안전하게 이용할 수 있다. 또한 본 발명의 세포 보존용 수용액을 이용하는 보존 방법에 의하면 높은 세포 생존율을 얻을 수 있고, 및/또는 세포의 증식능 및 분화능을 유지할 수 있다. 또한 유래가 불명한 기초 배지, 혈청 등을 이용하지 않기 때문에 저렴하게 세포를 보존할 수 있다.
도 1a는 세포 보존용 수용액 M, I 및 K로 보존한 세포의 생존수를 도시한 도면이다(실시예 6)
도 1b는 세포 보존용 수용액 M, I 및 K로 보존한 세포의 증식수를 도시한 도면이다(실시예 6)
도 2a는 세포 보존용 수용액 M, I 및 K로 보존한 세포의 골아세포에 대한 분화를 도시한 도면이다(실시예 6)
도 2b는 세포 보존용 수용액 M, I 및 K로 보존한 세포의 지방세포에 대한 분화를 도시한 도면이다(실시예 6)
본 발명의 세포 보존용 수용액이란, 세포를 보존하기 위해 증점제, 동해방지제, 당류를 포함하고, 한편 천연의 동물 유래 성분을 포함하지 않는 수용액인 것을 말한다. 또한 pH 조정제를 포함하는 천연의 동물 유래 성분을 포함하지 않는 수용액인 것을 말한다. 이들 천연의 동물 유래 성분이 보존되는 세포에 부여하는 영향이 불명하기 때문이다. 본 발명의 세포 보존용 수용액은 그 조성이 보존되는 세포에 영향을 부여하지 않는, 유래가 명확한 성분만으로 이루어지는 것을 특징으로 하기 때문에, 어떤 성분의 조합이어도 천연의 동물 유래 성분은 전혀 포함하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 세포 보존용 수용액에 있어서, 포함하지 않는 것이 바람직한 천연의 동물 유래 성분에는, 종래 세포의 보존, 배양에 있어서 이용되는 천연의 동물 유래의 성분 및 그 밖의 천연의 동물 유래의 성분 모두가 포함된다. 예컨대 세포의 배양에 이용되는 혈청, 유래가 불명한 기초 배지 등을 들 수 있다. 또한 정제 알부민, 정제 단백, 계란 황, 지방 유제, 락테이트(유산염·모유 등) 등도 포함된다. 혈청으로서는 성우(成牛) 혈청, 자우(仔牛) 혈청, 신생자우(新生仔牛) 혈청, 우태아 혈청 등을 들 수 있고, 기초 배지로서는 RPMI 배지, MEM 배지, HamF-12 배지, DM-160 배지 등을 들 수 있다. 즉 본 발명의 세포 보존용 수용액이란, 예시와 같은 천연의 동물 유래 성분을 포함하지 않고, 화학 합성품만 또는 화학 약품 및 식물 유래 성분을 포함하여 이루어지는 수용액인 것을 말한다.
본 발명의 세포 보존용 수용액이란, 증점제, 동해방지제, 당류를 조합시킨 것을 말하고, 추가로 pH 조정제를 조합시킨 것도 포함한다. 그리고 이들 성분은 수 용액의 상태로 이용되지만, 동결 건조 등을 한 분말을, 사용할 때에 물 등에 용해하여 수용액으로서 이용하는 경우, 또한 미리 수용액 상태로 조제된 것을 그대로 이용하는 경우 등 어떤 사용 형태라도 본 발명의 사용에 해당한다.
본 발명의 증점제는 천연의 동물 유래 성분을 전혀 이용하지 않는 수용액에 있어서도, 세포를 충분히 보존할 수 있는 세포 보존용 수용액을 구성할 수 있는 증점제이면 모두 이용할 수 있다. 예컨대 카르복시메틸셀룰로오스(이하 CMC로 함), 카르복시메틸셀룰로오스-Na(이하 CMC-Na로 함), 유기산 폴리머, 알긴산프로필렌글리콜, 알긴산나트륨 등을 들 수 있다. 이 중, CMC, 또는 CMC-Na을 이용하는 것이 바람직하고, 특히 CMC-Na을 이용하는 것이 바람직하다. 또한 유기산 폴리머 중에서는 폴리아크릴산나트륨이 바람직하게 이용된다. 증점제는 세포 보존용 수용액중에 0.1 w/v%∼1.0 w/v% 포함되는 것이 바람직하고, 0.1 w/v%∼0.5 w/v% 포함되는 것이 더 바람직하며, 0.25 w/v% 포함되는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 동해방지제는 천연의 동물 유래 성분을 전혀 이용하지 않는 수용액에 있어서도, 세포를 충분히 보존할 수 있는 세포 보존용 수용액을 구성할 수 있는 동해방지제이면 모두 이용할 수 있다. 예컨대 DMSO, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1-메틸-2 피롤리돈 등을 들 수 있다. 이 중 DMSO, 프로필렌글리콜을 이용하는 것이 바람직하고, 특히 DMSO를 이용하는 것이 바람직하다. 동해방지제는 세포 보존용 수용액중에 5 w/v%∼15 w/v% 미만 포함되는 것이 바람직하고, 5 w/v%∼12 w/v% 포함되는 것이 가장 바람직하며, 그 중에서도 10 w/v% 포함되는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 당류는, 천연의 동물 유래 성분을 전혀 이용하지 않는 수용액에 있어서도, 세포를 충분히 보존할 수 있는 세포 보존용 수용액을 구성할 수 있는 당류이면 모두 이용할 수 있다. 예컨대 글루코오스, 트레할로스, 수크로오스, 락토오스 등을 들 수 있다. 이 중, 글루코오스를 이용하는 것이 특히 바람직하다. 당류는 세포 보존용 수용액 중에 1.0 w/v%∼10.0 w/v% 포함되는 것이 바람직하고, 3 w/v%∼5 w/v% 포함되는 것이 더 바람직하며, 그 중에서도 3 w/v% 포함되는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 pH 조정제는 천연의 동물 유래 성분을 전혀 이용하지 않는 수용액에 있어서도, 세포를 충분히 보존할 수 있는 세포 보존용 수용액을 구성할 수 있는 pH 조정제이면 모두 이용할 수 있다. 예컨대 탄산수소나트륨, HEPES, 인산완충액 등을 들 수 있다. 또한 Basic Stock Solution(BSS)에 인산완충액을 첨가하지 않는 경우에는 세포에 적합한 pH 부근에서 완충능을 갖게 하는 기능을 갖는 염화나트륨을 첨가한 것도 이용할 수 있다. 이 중 인산완충액을 이용하는 것이 특히 바람직하다. pH 조정제는 세포 보존용 수용액 중 pH를 대략 6.5∼9.0, 바람직하게는 7.0∼8.5로 조정하기 위해 적절하게 이용하는 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 인산완충액이란, 염화나트륨, 인산1나트륨(무수), 인산1칼륨(무수), 인산2나트륨(무수), 인산3나트륨(무수), 염화칼륨, 인산2수소칼륨(무수) 등인 것을 말하고, 특히 염화나트륨, 인산1나트륨(무수), 염화칼륨, 인산2수소칼륨(무수)을 이용하는 것이 바람직하다. pH 조정제는 세포 보존용 수용액중에 0.01 w/v%∼1.0 w/v% 포함되는 것이 바람직하고, 또한 0.05 w/v%∼0.5 w/v% 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 세포 보존용 수용액의 침투압은 보존액으로서의 성능을 유지하기 위해 1000 mOsm 이상인 것이 바람직하고, 1000 mOsm∼2700 mOsm인 것이 바람직하다.
본 발명의 세포 보존용 수용액의 조성은 세포를 충분히 보존할 수 있는 조성이면 상기에서 열거한 각 성분의 구체예 중 어떤 성분의 조합이라도 이용할 수 있다. 예컨대 증점제로서 CMC, 동해방지제로서 DMSO, 당류로서 글루코오스, pH 조정제로서 탄산수소나트륨, HEPES를 적량 조합한 세포 보존용 수용액이나, 이에 추가로 인산완충액을 가한 세포 보존용 수용액을 들 수 있다. 또한, 이 조성에 있어서 증점제로서 CMC 대신에 CMC-Na 또는 유기산 폴리머를 이용한 것, 동해방지제로서 DMSO 대신에 프로필렌글리콜을 이용한 것 등도 들 수 있다.
본 발명의 세포 보존용 수용액은 보존의 대상으로 하는 세포에 의해서 다르지만, 적어도 보존 일주일 경과 후 또는 그 이상 경과 후에 있어서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 100%의 생존율을 나타내는 것이 바람직하다.
본 발명의 세포의 보존 방법은 세포를 충분히 보존할 수 있는 방법이면 어떤 방법도 이용할 수 있다. 예컨대 본 발명의 세포 보존용 수용액을 이용하고, 이것에 보존의 대상이 되는 세포를 분산한 후, 앰플이나 크라이오튜브 등의 용기에 분주하며, 20분간∼30분간 예비 동결 후, -80℃ 또는 -196℃에서 동결 보존하는 방법 등을 들 수 있다. 본 발명의 보존 방법에 의하면 프로그래밍 프리저를 이용하지 않아도 동결 보존을 행할 수 있다.
보존에 이용하는 세포의 세포 보존용 수용액당 세포수는 특별히 상관없지만, 1×105∼1×107개/mL, 바람직하게는 5×105∼5×106개/mL가 되도록 조제하는 것이 바람직하다.
보존의 대상이 되는 세포는, 본 발명의 세포 보존용 수용액을 이용하여 보존할 수 있는 세포이면 어떤 세포라도 대상이 된다. 예컨대 여러 가지 동물의 주화세포, 림프구, 비장세포, 흉선세포, 수정란, 골수종세포, 생체 줄기세포, 간엽계 줄기세포 및 배아 줄기세포(ES 세포) 등을 들 수 있다. 동물로서 구체적으로는, 마우스(BALB/C, ICR, C3H 등), 래트, 토끼, 모르모트, 고양이, 소, 염소, 개, 돼지 및 사람 등을 들 수 있다. 또한 본 발명의 세포 보존용 수용액은 세포뿐만 아니라, 조직의 보존 및 장기의 보존에 이용할 수도 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더 상세히 설명하지만, 본 발명은 이에 전혀 한정되는 것이 아니다.
실시예 1
<세포 보존용 수용액의 조제>
1. 각 성분의 조제
세포 보존용 수용액의 각 성분을 이하와 같이 조제하였다.
1) 증점제
a. CMC
카르복시메틸셀룰로오스(와코준야쿠사제) 5g을 고온 또는 상온의 증류수로 용해하고, 전량 750 mL로서 제조하였다.
b. CMC-Na
카르복시메틸셀룰로오스나트륨(와코준야쿠사제조) 5g을 고온 또는 상온의 증류수로 용해하고, 전량 750 mL로서 제조하였다.
c. 폴리아크릴산나트륨
폴리아크릴산나트륨(와코준야쿠사제) 5 g을 증류수로 용해하고, 전량 750 mL로서 제조하였다.
2) 동해방지제
d. 디메틸술폭시드(DMSO)
디메틸술폭시드(와코준야쿠사제) 100 mL를 이용하였다.
e. 프로필렌글리콜
프로필렌글리콜(와코준야쿠사제) 100 mL를 이용하였다.
3) 당류·pH 조정제 등
f. 인산완충액
인산완충액(닛스이제약사제)을 이용하였다.
g. Basic Stock Solution(BSS)
글루코오스 30.0 g, 탄산수소나트륨 0.8 g, HEPES(와코준야쿠사제) 0.36 g, PBS(닛스이제약사제) 1.576 g을 이단 증류수에 가하여 전량을 150 mL로 하였다.
4) 기초 배지(비교용)
h. RPMI 1640
RPMI 1640(다이니폰제약사제) 1.576 g을 이용하였다.
2. 조합
상기 1.에서 조제한 각 성분을 표 1에 기재한 조성이 되도록 교반 혼합하였다. 이것을 각각 1.0 μm, 0.5 μm, 또한 0.22 μm의 필터(밀리포아사제)로, 무균으로 여과하여 조제하였다.
[표 1]

 성분
 세포보존용 수용액(g/L) 비교
A B C D E F G H I J K L M
증
점
제		 CMC 5 - - 5 - - 5
CMC-Na - 5 - - 5 - -
유기산 폴리머 - - 5 - - 5
동해방지제 DMSO 100 - 100 - 100 - 100 - 100 - 100 - 100
프로필렌글리콜 - 100 - 100 - 100 - 100 - 100 - 100 -
당류
·
pH
조정액		 인산완충액 - 1.576 -
B
S
S		 글루코오스 30 30
탄산수소Na 0.8 0.8
HEPES 0.36 0.36
기초
배지		 RPMI1640 - 1.576
물 증류수 적량
<세포 보존용 수용액의 성능 및 규격 시험>
1. 성능 시험
세포 보존용 수용액의 성능을, 세포의 보존에 있어서의 생존율을 측정함으로써 평가하였다.
미리 RPMI1640 10v/v% FBS 첨가 배지로 배양한 X63Ag8-6. 5. 3(마우스 골수종) 세포를 원심 처리로 모으고, 세포수 5×105∼5×106개/mL가 되도록 세포 보존용 수용액 C, I 및 M을 각각 1 mL 가하여 현탁하며, 2 mL용의 크라이오튜브(눈크사제)로 작게 나눴다. 조속히 -80℃에서 급속 동결을 행하여 7일간 보존하였다(n= 3).
2. 규격 시험
상기에서 조제한 각 세포 보존용 수용액의 pH 및 침투압을 조사하였다.
또한 각 세포 보존용 수용액에 있어서의 성능 시험 및 규격 시험의 결과를 표 2에 나타내었다(n=3). 표 2에 나타내는 바와 같이, 보존용 수용액 C, I는 모두 80% 이상의 생존율을 나타내었다. 이것으로부터 표 1에 나타낸 보존용 수용액 C, I도 혈청 및 기초 배지 성분을 포함하고 있지 않음에도 불구하고, 기초 배지 성분을 포함하는 보존용 수용액 M과 같은 정도의 보존 성능을 갖는 것이 확인되었다.
[표 2]
보존용 수용액 C I M
성능
시험		 생존율(%) 90.5 90.1 88.8 95.1 92.7 95.3 97.2 98.2 95.7
평균(%) 89.8 94.4 97.0
규격
시험		 pH 7.89 7.86 7.98
침투압(mOsm) 2062 2107 2131
실시예 2
<각종 세포를 이용한 경우의 세포의 생존율>
미리 RPMI1640 10 v/v% FBS 첨가 배지로 채취, 분획한 표 3에 기재한 세포를 원심 처리로 모으고, 세포수 5×105∼5×106개/mL가 되도록 세포 보존용 수용액 J 및 비교 세포 보존용 수용액 M을 각각 1 mL 가하여 현탁하고, 2 mL용의 크라이오튜브(눈크사제조)로 작게 나눴다. 조속히 -80℃에서 급속 동결을 행하고, 일정 기간 보존하였다. 림프구에서의 각 보존 기간 후의 세포의 생존율을 표 3에, 비장세포에서의 각 보존 기간 후의 세포의 생존율을 표 4에, 및 흉선세포에서의 각 보존 기간 후의 세포의 생존율을 표 5에 각각 나타내었다.
[표 3]
<림프구>
동물종		 보존기간
(일)		 생존율(%)
I M
고양이 7




 98.6 100.0 97.1 100.0 100.0 100.0
소 97.6 93.5 99.9 97.9 96.4 100.0
염소 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
개 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
돼지 100.0 99.8 100.0 100.0 100.0 100.0
사람 97.0 99.4 ＼ 97.4 98.5 ＼
소(2회째)
시간경과에
따른 안정성 시험		 7 100.0 100.0
14 100.0 100.0
30 100.0 100.0
60 100.0 100.0
[표 4]
<비장세포>
마우스 종류		 보존기간
(일)		 생존율(%)
I M
BALB/C(1년) 7


 98.0 97.9
BALB/C(6W) 96.1 98.4
ICR(8W) 100.0 100.0
C3H(7W) 100.0 100.0
[표 5]
<흉선세포>
마우스 종류		 보존기간
(일)		 생존율(%)
I M
BALB/C(1년) 7


 96.0 93.4
BALB/C(6W) 93.6 98.3
ICR(8W) 99.9 99.8
C3H(7W) 99.9 99.7
표 3∼5에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 세포 보존용 수용액을 이용한 여러 가지 동물종의 림프구, 비장세포 및 흉선세포의 보존에 있어서, 100.0%에 가까운 생존율을 나타내었다. 이 결과로부터 본 발명의 세포 보존용 수용액이 천연의 동물 유래 성분을 함유하지 않아도 충분히 세포를 보존할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 3
<글루코오스 농도의 검토>
상기 실시예 1, 1.에서 조제한 각 성분을 이용하여, 표 6에 기재한 조성이 되도록 세포 보존 용액 C 및 N∼R을 조제하였다. 또한 상기 실시예 1과 마찬가지로, X63Ag8-6. 5. 3 세포를 이용하여, 각 세포 보존용 수용액의 성능 시험 및 규격 시험을 행하였다. 이들 결과를 표 6에 나타내었다.
표 6에 나타내는 바와 같이, 글루코오스를 2 w/v% 이하 또는 7 w/v% 포함하는 보존용 수용액으로는 생존율이 낮았지만, 적어도 3 w/v%∼5 w/v% 포함하는 보존 수용액으로는 80% 이상의 생존율을 나타내었다.
[표 6]

 성분
 세포보존용 수용액(g/L)
N O C P Q R
증점제 CMC-Na 5
동해방지제 DMSO 100
당류
·
pH 조정제
 인산완충액 1.576
BSS

 글루코오스 10 20 30 40 50 70
탄산수소Na 0.8
HEPES 0.36
물 증류수 적량
성능시험 생존율(%) 15.0 18.0 95.0 93.0 82.0 20.0
실시예 4
<동해방지제 농도의 검토>
상기 실시예 1, 1.에서 조제한 각 성분을 이용하여, 표 7에 기재한 조성이 되도록 세포 보존 용액 C 및 S∼X를 조제하였다. 또한 상기 실시예 1과 마찬가지로 SK-007 세포 또는 Jurkat 세포를 이용하여, 각 세포 보존용 수용액의 성능 시험 및 규격 시험을 행하였다. 이들 결과를 표 7에 나타내었다.
표 7에 나타내는 바와 같이, 동해방지제로서 DMSO를 3 w/v% 이하 또는 15 w/v% 포함하는 보존용 수용액으로는 어떤 세포라도 생존율이 낮았지만, 적어도 5 w/v%∼12 w/v% 포함하는 보존 수용액으로는 80% 이상의 생존율을 나타내었다.
<SK-007 세포, Jurkat 세포>
SK-007: 사람 골수성 백혈병 세포(B 세포계 백혈병 세포)
Jurkat: 사람 T 세포계 백혈병 세포
어떤 세포라도 10% 우태아 혈청 첨가 RPMI1640 배지로, 37℃, 5% CO2 조건 하로써 배양하였다.
[표 7]

 성분 세포보존용 수용액(g/L)
S T U V C W X
증점제 CMC-Na 5
동해방지제 DMSO 30 50 70 90 100 120 150
당류
·
pH 조정제
 인산완충액 1.576
BSS

 글루코오스 30
탄산수소Na 0.8
HEPES 0.36
물 증류수 적량
성능시험
 생존율(%) SK-007 세포 15.0 80.0 82.0 85.0 95.0 91.0 63.0
Jurkat 세포 26.0 86.0 90.0 84.0 95.0 88.0 58.0
규격시험
 pH 7.64 7.65 7.73 7.78 7.74 7.77 7.8
침투압(mOsm) 740 1080 1523 1956 2274 2698 3564
실시예 5
증점제 농도의 검토
상기 실시예 1, 1.에서 조제한 각 성분을 이용하여, 표 8에 기재한 조성이 되도록 세포 보존 용액 Y∼AC를 조제하였다. 또한 상기 실시예 1과 마찬가지로, SK-007 세포 또는 Jurkat 세포를 이용하여, 각 세포 보존용 수용액의 성능 시험 및 규격 시험을 행하였다. 이들의 결과를 표 8에 나타내었다.
표 8에 나타내는 바와 같이, 증점제로서 유기산 폴리머를 0.1 w/v%∼1.0 w/v% 포함하는 보존용 수용액으로는 어떤 세포라도 90% 이상의 생존율을 나타내었다.
[표 8]

성분 세포보존용 수용액(g/L)
Y Z AA AB AC
증점제 유기산 폴리머 1.0 2.5 5.0 7.5 10.0
동해방지제 DMSO 100
당류
·
pH 조정제
 인산완충액 1.576
BSS

 글루코오스 30
탄산수소Na 0.8
HEPES 0.36
물 증류수 적량
성능시험
 생존율(%) SK-007 세포 97.0 100.0 99.0 98.0 98.0
Jurkat 세포 94.0 99.0 97.0 96.0 95.0
규격시험
 pH 7.97 7.99 8.02 8.1 8.08
침투압(mOsm) 2098 2119 2124 2123 2172
실시예 6
<세포 보존용 수용액의 성능 시험>
세포 보존용 수용액의 성능을, 세포의 보존에 있어서의 생존율과, 증식능, 분화능을 검토함으로써 평가하였다.
1. 생존율의 검토
세포 보존용 수용액 M, I 및 K의 성능을, 세포의 보존에 있어서의 생존율에 의해 평가하였다. 미리 IMDM 10 v/v% FBS 첨가 배지, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양한 사람 제대혈 유래 간엽계 줄기세포를, 세포수 2×105 개/mL가 되도록 세포 보존용 수용액 M, I 및 K를 각각 1 mL 가하여 현탁하고, 2 mL용의 크라이오튜브(눈크사제조)로 작게 나눴다. 조속히 -80℃에서 급속 동결을 행하여 4일간 보존한 후, -196℃(액체질소 탱크)에서 72일간 보존하였다(n=3).
37℃ 수욕으로써 융해를 행하고, 9 mL의 IMDM과 1 mL의 FBS를 혼합하여 각 튜브를 2회 함께 세정하였다. 세포를 원심 처리로 모으고, 세포수를 계측하였다. 도 1a에 도시하는 바와 같이, 세포 보존용 수용액 I 및 K는 세포 보존용 수용액 M으로 보존한 경우와 동등한 세포 생존율을 나타내었다. 각각의 세포 보존용 수용액에 있어서의 세포 생존율은 M이 97%, I가 90%, K가 86%이며, 모두 세포의 보존에 있어서 높은 성능을 갖는 것이 나타났다.
2. 증식능의 검토
세포 보존용 수용액 M, I 및 K가 세포의 증식능을 유지하여 세포를 보존할 수 있을지를 조사하였다. 상기 1로써 보존한 세포를, 세포수 5×104개가 되도록 배양 접시(35 mm)에 파종한 후 배양하고, 4일 후, 8일 후의 세포수를 계측하였다. 세포의 계측에 있어서, 사세포는 트리판 블루를 이용하여 제외하였다. 도 1b에 도시하는 바와 같이, 세포 보존용 수용액 I 및 K로 보존한 세포는 세포 보존용 수용액 M으로 보존한 세포와 동등한 세포 증식을 나타내었다. 따라서 세포 보존용 수용액 M, I 및 K는 모두 세포의 증식능을 유지한 채, 세포를 보존할 수 있는 것이 확인되었다.
3. 분화능의 검토
상기 1로써 보존한 세포를, 세포수 5×104개가 되도록 배양 접시(35 mm)에 파종한 후, 표 9에 나타낸 골아세포 또는 지방세포에 대한 분화 유도 배지로써 28일간 배양하고, 분화능을 유지하고 있는지를 조사하였다.
[표 9]
골아세포분화유도배지 지방세포분화유도배지
배지성분 IMDM + 1v/v% FBS
0.1μM 덱사메타손
50μg/ml 아스코브산
10mM β-글리세롤 포스페이트
10ng/mL hEGF		 IMDM + 10v/v% FBS
0.1μM 덱사메타손
0.5mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴
0.1mM 인도메타신
도 2a에 도시하는 바와 같이, 배양 후 28일째에 알리자린 레드 염색한 바, 세포 보존용 수용액 M, I 및 K로 보존한 어떤 세포에 대해서도 골아세포에 대한 분화 유도가 발생하는 것이 도시되었다. 또한 도 2b에서도 마찬가지로, 오일 레드 O 염색한 바, 세포 보존용 수용액 M, I 및 K로 보존한 어떤 세포에 대해서도 지방세포에 대한 분화 유도가 발생하는 것이 도시되었다. 따라서 세포 보존용 수용액 M, I 및 K는 모두 세포의 분화능을 유지한 채, 세포를 보존할 수 있는 것이 확인되었다.
본 발명의 세포 보존용 수용액은 기초 배지, 혈청 등의 천연의 동물 유래 성 분을 포함하지 않기 때문에, 보존된 세포에 대한 불순물의 영향이 낮고, 의료용으로서 안전하게 이용할 수 있다. 또한 기초 배지, 혈청 등을 이용하지 않기 때문에 저렴하게 이용할 수 있다.

Claims (20)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 이하의 (a)∼(e)의 조성을 포함하고, 천연의 동물 유래 성분을 포함하지 않으며, pH 6.5∼9.0인 세포 보존용 수용액.
    (a) 동해방지제 1.0 w/v%∼20.0 w/v%
    (b) 당류 1.0 w/v%∼10.0 w/v%
    (c) 증점제 0.1 w/v%∼1.0 w/v%
    (d) pH 조정제 0.01 w/v%∼1.0 w/v%
    (e) 물 적량
  5. 제4항에 있어서, 침투압이 1000 mOsm 이상인 세포 보존용 수용액.
  6. 제5항에 있어서, 침투압이 1000 mOsm∼2700 mOsm인 세포 보존용 수용액.
  7. 제4항에 있어서, 증점제가 카르복시메틸셀룰로오스(CMC), 카르복시메틸셀룰로오스나트륨(CMC-Na) 또는 유기산 폴리머인 세포 보존용 수용액.
  8. 제7항에 있어서, 유기산 폴리머가 폴리아크릴산나트륨인 세포 보존용 수용액.
  9. 제4항에 있어서, 동해방지제가 디메틸술폭시드(DMSO) 또는 프로필렌글리콜인 세포 보존용 수용액.
  10. 제4항에 있어서, 당류가 글루코오스인 세포 보존용 수용액.
  11. 제4항에 있어서, pH 조정제가 인산완충액인 세포 보존용 수용액.
  12. 이하의 (a)∼(e)의 조성으로 이루어지고, 천연의 동물 유래 성분을 포함하지 않으며, pH 6.5∼9.0인 세포 보존용 수용액.
    (a) DMSO 5.0 w/v%∼12.0 w/v%
    (b) 글루코오스 3.0 w/v%∼5.0 w/v%
    (c) 증점제 0.2 w/v%∼0.7 w/v%
    (d) 인산완충액 0.01 w/v%∼1.0 w/v%
    (e) 물 적량
  13. 제4항 또는 제12항에 있어서, 보존하는 세포가 림프구, 비장세포 및 흉선세포, 동물세포, 생체 줄기세포, 간엽계 줄기세포 및 배아 줄기세포 중 어느 하나인 세포 보존용 수용액.
  14. 제4항 또는 제12항에 있어서, 의료용으로 이용되는 세포 보존용 수용액.
  15. 제4항 또는 제12항에 있어서, 세포의 보존 방법이 동결 보존인 세포 보존용 수용액.
  16. 제4항 또는 제12항에 있어서, 보존 후의 세포의 생존율이 적어도 80% 이상인 세포 보존용 수용액.
  17. 제4항 또는 제12항에 있어서, -80℃에서 4일간 보존한 후, -196℃에서 72일간 더 보존한 후의 세포의 증식능이 유지되어 있는 세포 보존용 수용액.
  18. 제4항 또는 제12항에 있어서, 보존 후의 세포의 분화능이 유지되어 있는 세포 보존용 수용액.
  19. 제4항 또는 제12항에 기재한 세포 보존용 수용액에 세포를 분산시킨 후, 용기 안에 분주하여 동결 보존하는 세포의 보존 방법.
  20. 제19항에 있어서, 분주되는 세포가 1×105∼1×107개/mL인 세포의 보존 방법.
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