JPWO2007058308A1 - 細胞保存用水溶液 - Google Patents
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Abstract
Description
背景技術
特に医療等として用いようとした場合には、血清や基礎培地に含まれる成分が保存される細胞に与える影響を考慮して、保存される細胞に影響を与えない、由来が明確な成分のみからなる細胞保存液や、天然の動物由来の成分を極力含まない細胞保存液の開発が望まれている。このような細胞保存液は成分が明確なため、品質が一定に保たれるという利点も期待できる。
しかし、従来の細胞保存溶液は、いずれも基礎培地や血清、又は血清代替物として血清アルブミン、精製アルブミン等を用いなければ長期間安定して保存することができず、完全に天然の動物由来成分を含まない細胞保存液は未だ得られていない。
課題を解決するための手段
(1)増粘剤、凍害防御剤、糖類を含む細胞保存用水溶液であって、天然の動物由来成分を含まない細胞保存用水溶液。
(2)さらにpH調整剤を含む上記(1)に記載の細胞保存用水溶液。
(3)天然の動物由来成分が血清及び基礎培地成分である上記(1)又は(2)に記載の細胞保存用水溶液。
(4)以下の(a)〜(e)の組成を含み、pH6.5〜9.0である細胞保存用水溶液。
(a)凍害防御剤 1.0〜20.0w/v%
(b)糖類 1.0〜10.0w/v%
(c)増粘剤 0.1〜1.0w/v%
(d)pH調整剤 0.01〜1.0w/v%
(e)水 適量
(5)浸透圧が1000mOsm以上である上記(1)〜(4)のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
(6)浸透圧が1000〜2700mOsmである上記(5)に記載の細胞保存用水溶液。
(7)増粘剤が、カルボキシメチルセルロース(CMC)、カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC-Na)又は有機酸ポリマーである上記(1)〜(6)のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
(8)有機酸ポリマーが、ポリアクリル酸ナトリウムである上記(7)に記載の細胞保存用水溶液。
(9)凍害防御剤が、ジメチルスルホキシド(DMSO)又はプロピレングリコールである、上記(1)〜(8)のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
(10)糖類がグルコースである上記(1)〜(9)のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
(11)pH調整剤が、リン酸緩衝液である上記(1)〜(10)のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
(12)以下の(a)〜(e)の組成からなり、pH6.5〜9.0である細胞保存用水溶液。
(a)DMSO 5.0〜12.0w/v%
(b)グルコース 3.0〜5.0w/v%
(c)増粘剤 0.2〜0.7w/v%
(d)リン酸緩衝液 0.01〜1.0w/v%
(e)水 適量
(13)保存する細胞が、リンパ球、脾臓細胞及び胸腺細胞、動物細胞、生体幹細胞及び胚性幹細胞のいずれかである上記(1)〜(12)のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
(14)医療用に用いられる上記(1)〜(13)のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
(15)細胞の保存方法が凍結保存である上記(1)〜(14)のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
(16)保存後の細胞の生存率が少なくとも80%以上である上記(1)〜(15)のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
(17)-80℃で4日間保存した後、さらに-196℃で72日間保存後の細胞の増殖能が保持されている上記(1)〜(15)のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
(18)保存後の細胞の分化能が保持されている上記(1)〜(15)のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
(19)上記(1)〜(15)のいずれかに記載の細胞保存用水溶液に細胞を分散させた後、容器中に分注して凍結保存する細胞の保存方法。
(20)分注される細胞が、1×105〜1×107個/mLである上記(19)に記載の細胞の保存方法。
本発明の細胞保存用水溶液において、含まないことが望ましい天然の動物由来成分には、従来、細胞の保存、培養において用いられる天然の動物由来の成分及びその他の天然の動物由来の成分のいずれもが含まれる。例えば、細胞の培養に用いられる血清、由来の不明な基礎培地等が挙げられる。また、精製アルブミン、精製タンパク、鶏卵黄、脂肪乳剤、ラクテート(乳酸塩・母乳等)、等も含まれる。血清としては成牛血清、仔牛血清、新生仔牛血清、牛胎児血清などが挙げられ、基礎培地としてはRPMI培地、MEM培地、HamF-12培地、DM-160培地等が挙げられる。即ち、本発明の細胞保存用水溶液とは、例示のような天然の動物由来成分を含まず、化学合成品のみ又は化学薬品及び植物由来成分を含んでなる水溶液のことをいう。
pH調整剤は細胞保存用水溶液中に0.01〜1.0w/v%含まれることが好ましく、さらに0.05〜0.5w/v%含まれることが好ましい。
本発明の細胞保存用水溶液は、保存の対象とする細胞によって異なるが、少なくとも保存1週間経過後又はそれ以上経過後において80%以上、好ましくは90%以上、さらに好ましくは100%の生存率を示すものであることが望ましい。
保存に用いる細胞の細胞保存用水溶液あたりの細胞数は特に問わないが、1×105〜1×107個/mL、好ましくは5×105〜5×106個/mLになるように、調製することが好ましい。
1.各成分の調製
細胞保存用水溶液の各成分を以下のように調製した。
1)増粘剤
a. CMC
カルボキシメチルセルロース(和光純薬社製)5gを高温又は常温の蒸留水で溶解し、全量750mLとして製した。
b. CMC-Na
カルボキシメチルセルロースナトリウム(和光純薬社製)5gを高温又は常温の蒸留水で溶解し、全量750mLとして製した。
c. ポリアクリル酸ナトリウム
ポリアクリル酸ナトリウム (和光純薬社製)5gを蒸留水で溶解し、全量750mLとして製した。
2)凍害防御剤
d. ジメチルスルホキシド(DMSO)
ジメチルスルホキシド(和光純薬社製)100mLを用いた。
e. プロピレングリコール
プロピレングリコール(和光純薬社製)100mLを用いた。
3)糖類・pH調整剤等
f.リン酸緩衝液
リン酸緩衝液(日水製薬社製)を用いた。
g. Basic Stock Solution(BSS)
グルコース30.0g、炭酸水素ナトリウム0.8g、HEPES(和光純薬社製)0.36g、PBS(日水製薬社製)1.576gを二段蒸留水に加え全量を150mLとした。
4) 基礎培地(比較用)
h. RPMI1640
RPMI1640(大日本製薬社製)1.576gを用いた。
上記1.で調製した各成分を表1に記載の組成となるように、攪拌混合した。これをそれぞれ1.0μm、0.5μm、さらに0.22μmのフィルター(ミリポア社製)で、無菌的にろ過して調製した。
1.性能試験
細胞保存用水溶液の性能を、細胞の保存における生存率を測定することにより評価した。
あらかじめRPMI1640 10v/v%FBS添加培地で培養したX63Ag8-6.5.3(マウス骨髄腫)細胞を遠心処理で集め、細胞数5×105〜5×106個/mLになるように、細胞保存用水溶液C、I及びMをそれぞれ1mL加えて懸濁し、2mL容のクライオチューブ(ヌンク社製)に小分けした。速やかに-80℃で急速凍結を行い7日間保存した(n=3)。
2.規格試験
上記で調製した各細胞保存用水溶液のpH及び浸透圧を調べた。
また、各細胞保存用水溶液における性能試験及び規格試験の結果を表2に示した(n=3)。表2に示すように、保存用水溶液C、Iはいずれも80%以上の生存率を示した。
これらより、表1に示したいずれの保存用水溶液C、Iも血清及び基礎培地成分を含んでいないにも関わらず、基礎培地成分を含む保存用水溶液Mと同程度の保存性能を有することが確認された。
あらかじめRPMI1640 10v/v%FBS添加培地で採取、分画した表3に記載の細胞を遠心処理で集め、細胞数5×105〜5×106個/mLになるように、細胞保存用水溶液J及び比較細胞保存用水溶液Mをそれぞれ1mL加えて懸濁し、2mL容のクライオチューブ(ヌンク社製)に小分けした。速やかに-80℃で急速凍結を行い、一定期間保存した。リンパ球における各保存期間後の細胞の生存率を表3に、脾臓細胞における各保存期間後の細胞の生存率を表4に、及び胸腺細胞における各保存期間後の細胞の生存率を表5にそれぞれ示した。
上記実施例1、1.で調製した各成分を用い、表6に記載の組成となるように細胞保存溶液C及びN〜Rを調製した。また、上記実施例1と同様に、X63Ag8-6.5.3細胞を用いて、各細胞保存用水溶液の性能試験及び規格試験を行った。これらの結果を表6に示した。
表6に示すように、グルコースを2w/v%以下又は7w/v%含む保存用水溶液では、生存率が低かったが、少なくとも3〜5w/v%含む保存水溶液では、80%以上の生存率を示した。
上記実施例1、1.で調製した各成分を用い、表7に記載の組成となるように細胞保存溶液C及びS〜Xを調製した。また、上記実施例1と同様に、SK-007細胞又はJurkat細胞を用いて、各細胞保存用水溶液の性能試験及び規格試験を行った。これらの結果を表7に示した。
表7に示すように、凍害防御剤としてDMSOを3w/v%以下又は15w/v%含む保存用水溶液では、いずれの細胞も生存率が低かったが、少なくとも5〜12w/v%含む保存水溶液では、80%以上の生存率を示した。
<SK-007細胞、Jurkat細胞>
SK-007:ヒト骨髄性白血病細胞(B細胞系白血病細胞)
Jurkat:ヒトT細胞系白血病細胞
いずれの細胞も、10%牛胎児血清加RPMI1640培地で、37℃、5%CO2条件下にて培養した。
上記実施例1、1.で調製した各成分を用い、表8に記載の組成となるように細胞保存溶液Y〜ACを調製した。また、上記実施例1と同様に、SK-007細胞又はJurkat細胞を用いて、各細胞保存用水溶液の性能試験及び規格試験を行った。これらの結果を表8に示した。
表8に示すように、増粘剤として有機酸ポリマーを0.1w/v%〜1.0w/v%含む保存用水溶液では、いずれの細胞も90%以上の生存率を示した。
細胞保存用水溶液の性能を、細胞の保存における生存率と、増殖能、分化能を検討することにより評価した。
1.生存率の検討
細胞保存用水溶液M,I及びKの性能を、細胞の保存における生存率により評価した。あらかじめIMDM 10v/v%FBS添加培地、37℃、5%CO2条件下で培養したヒト臍帯血由来間葉系幹細胞を、細胞数2×105個/mLになるように、細胞保存用水溶液M,I及びKをそれぞれ1mL加えて懸濁し、2mL容のクライオチューブ(ヌンク社製)に小分けした。速やかに-80℃で急速凍結を行い4日間保存した後、-196℃(液体窒素タンク)で72日間保存した(n=3)。
37℃水浴にて融解を行い、9mLのIMDMと1mLのFBSを混和して各チューブを2回共洗いした。細胞を遠心処理で集め、細胞数を計測した。図1aに示すように、細胞保存用水溶液I及びKは、細胞保存用水溶液Mで保存した場合と同等の細胞生存率を示した。それぞれの細胞保存用水溶液における細胞生存率は、Mが97%、Iが90%、Kが86%であり、いずれも細胞の保存において高い性能を有することが示された。
細胞保存用水溶液M,I及びKが、細胞の増殖能を保持して細胞を保存しうるかを調べた。上記1にて保存した細胞を、細胞数5×104個になるように培養皿(35mm)に播種した後培養し、4日後、8日後の細胞数を計測した。細胞の計測にあたり、死細胞はトリパンブルーを用いて除外した。図1bに示すように、細胞保存用水溶液I及びKで保存した細胞は、細胞保存用水溶液Mで保存した細胞と同等の細胞増殖を示した。従って、細胞保存用水溶液M,I及びKはいずれも細胞の増殖能を保持したまま、細胞を保存できることが確認された。
上記1にて保存した細胞を、細胞数5×104個になるように培養皿(35mm)に播種した後、表9に示した骨芽細胞又は脂肪細胞への分化誘導培地にて28日間培養し、分化能を維持しているか否かを調べた。
産業上の利用可能性
Claims (20)
- 増粘剤、凍害防御剤、糖類を含む細胞保存用水溶液であって、天然の動物由来成分を含まない細胞保存用水溶液。
- さらにpH調整剤を含む請求項1に記載の細胞保存用水溶液。
- 天然の動物由来成分が血清及び基礎培地成分である請求項1又は2に記載の細胞保存用水溶液。
- 以下の(a)〜(e)の組成を含み、pH6.5〜9.0である細胞保存用水溶液。
(a)凍害防御剤 1.0〜20.0w/v%
(b)糖類 1.0〜10.0w/v%
(c)増粘剤 0.1〜1.0w/v%
(d)pH調整剤 0.01〜1.0w/v%
(e)水 適量 - 浸透圧が1000mOsm以上である請求項1〜4のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
- 浸透圧が1000〜2700mOsmである請求項5に記載の細胞保存用水溶液。
- 増粘剤が、カルボキシメチルセルロース(CMC)、カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC-Na)又は有機酸ポリマーである請求項1〜6のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
- 有機酸ポリマーが、ポリアクリル酸ナトリウムである請求項7に記載の細胞保存用水溶液。
- 凍害防御剤が、ジメチルスルホキシド(DMSO)又はプロピレングリコールである、請求項1〜8のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
- 糖類がグルコースである請求項1〜9のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
- pH調整剤が、リン酸緩衝液である請求項1〜10のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
- 以下の(a)〜(e)の組成からなり、pH6.5〜9.0である細胞保存用水溶液。
(a)DMSO 5.0〜12.0w/v%
(b)グルコース 3.0〜5.0w/v%
(c)増粘剤 0.2〜0.7w/v%
(d)リン酸緩衝液 0.01〜1.0w/v%
(e)水 適量 - 保存する細胞が、リンパ球、脾臓細胞及び胸腺細胞、動物細胞、生体幹細胞、間葉系幹細胞及び胚性幹細胞のいずれかである請求項1〜12のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
- 医療用に用いられる請求項1〜13のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
- 細胞の保存方法が凍結保存である請求項1〜14のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
- 保存後の細胞の生存率が少なくとも80%以上である請求項1〜15のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
- -80℃で4日間保存した後、さらに-196℃で72日間保存後の細胞の増殖能が保持されている請求項1〜15のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
- 保存後の細胞の分化能が保持されている請求項1〜15のいずれかに記載の細胞保存用水溶液。
- 請求項1〜15のいずれかに記載の細胞保存用水溶液に細胞を分散させた後、容器中に分注して凍結保存する細胞の保存方法。
- 分注される細胞が、1×105〜1×107個/mLである請求項19に記載の細胞の保存方法。
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