DE102021116694B4 - Wässrige Lösung zur Zellkonservierung - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft eine wässrige Lösung zur Zellkonservierung von vorzugsweise Säugerzellen, die zur Zellkonservierung als Kälteschutzmittel bzw. als Arzneimittel oder Hilfsstoff verwendet werden kann. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Konservieren von Zellen unter Anwendung der wässrigen Lösung zur Zellkonservierung sowie ein Verfahren zum Auftauen von Zellen, die in der wässrigen Lösung eingefroren sind.
Description
- Gebiet der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine wässrige Lösung zur Zellkonservierung von vorzugsweise Säugerzellen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung zur Zellkonservierung als Kälteschutzmittel bzw. zur Verwendung als Arzneimittel oder Hilfsstoff. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Konservieren von Zellen unter Anwendung der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung zur Zellkonservierung sowie ein Verfahren zum Auftauen von Zellen, die in der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung eingefroren sind.
- Stand der Technik
- Die Kryokonservierung von Säuger-Zellen kann prinzipiell auf zwei verschiedene Arten erfolgen, welche sich in der Geschwindigkeit des Einfriervorgangs unterscheiden, nämlich das sogenannte „slow freezing“ und die Vitrifikation.
- Slow freezing (Temperaturabfall 0,3 bis 10°C pro Minute)
- Ein Musterbeispiel für die insbesondere im akademischen Bereich angewendete, einfachste Variante dieser Methode, das Einfrieren ohne kontrollierter Einfrierrate, ist der weit verbreitete „Mr. Frosty“: Der Aufbau des Gefäßes sowie die Füllung mit Isopropanol garantieren in Trockeneis oder einem -80°C Gefrierschrank ein relativ gleichmäßiges Abkühlen der Zellen mit ca. 1°C pro Minute, d.h. einen passiven, aber gleichmäßigen Einfriervorgang. Als kontrolliert kann diese Art der Abkühlung dennoch nicht bezeichnet werden, da äußere Einflüsse (Position im Trockeneisbehälter), Öffnen des -80°C Gefrierschranks etc.) nicht auszuschließen sind. Die mit dieser Art von Einfriereinrichtung erzielbaren Resultate bei der Kryokonservierung von Säugerzellen sind für Routineanwendungen oft ausreichend - wenn auch nicht optimal. Auf Grund des geringen materiellen Aufwands ist diese Methode in der Forschung die verbreitetste Methode.
- Das Einfrieren mit kontrollierter Einfrierrate (definierter, aber variabler Temperaturabfall/Zeit), das sog. „controlled rate slow-freezing“, ist im industriellen Bereich bzw. bei Zellbanken weit verbreitet. Die in Einfriermedium resuspendierten Zellen werden computergesteuert mit einer kontrollierten (aber nicht zwangsläufig konstanten) Abkühlrate eingefroren. Optimale Resultate werden -neben den standardisierten Bedingungen- durch einen geänderten Temperaturverlauf beim Einfriervorgang erzielt. Während die Abkühlung bis zur kritischen Phase mit potentieller Bildung schädlicher Eiskristalle („supercooling“) langsam mit 1-3°C pro Minute stattfindet, werden die Proben nach Passieren dieser Phase mit ca. 10°C pro Minute schneller abgekühlt. Im Idealfall findet über mehrere Sonden ein Soll/Ist-Abgleich zwischen Probentemperatur und der angestrebten Zieltemperatur statt. Das kontrollierte slow-freezing ist insbesondere in der kommerziellen / industriellen Kryokonservierung von Zellen die am häufigsten verwendete Methode, da sie neben den physikalisch-technischen Vorteilen zusätzlich die besten Möglichkeiten zur Standardisierung und maschinellen Protokollierung jeden Einfriervorgangs bietet.
- Vitrifikation („flash-freezing“; unkontrollierter Temperaturabfall: mehrere Hundert °C pro Sekunde).
- Unter Vitrifikation (lat. für „Verglasung“) versteht man das Schockfrosten biologischer Proben in flüssigem Stickstoff. Vor allem üblich ist die Vitrifikation bei der Kryokonservierung von Spermien, Eizellen und Embryonen - aber neuerdings teils auch bei pluripotenten Stammzellen. Die Abfüllung des Probenmaterials erfolgt hierbei nicht in Cryovials, sondern in sog. „straws“ („Strohhalme“), beidseitig verschweißte, dünne Röhrchen aus einem speziellen Kunststoff. Durch die extrem schnelle Abkühlung erstarren die Proben in Sekundenbruchteilen in einem amorphen, glasartigen Zustand - ohne schädliche Kristalle zu bilden. Vorteil der Methode ist, dass diese auch „im Feld“ oder anderen Bereichen ohne aufwändige Labor- bzw. Cryo-Technik mittels flüssigem Stickstoff anwendbar ist. Daher fand sie bislang vor allem in der Reproduktionsmedizin (Mensch / Tier) Anwendung und wurde infolgedessen hauptsächlich für diese Applikationen optimiert.
- Limitierungen der Vitrifikation sind, dass sie lediglich für Proben mit sehr kleinem Volumen bis ca. 200 µl geeignet ist und dass der Auftauvorgang auf Grund des hohen Kryoprotektant (CPA)-Gehalts im Vitrifikationsmedium sehr viel kritischer ist als bei Kryomedien für das slow-freezing [2]. Zudem bietet die Technik als solche zwar ein hohes Potential zur Standardisierung, jedoch ist es von Nachteil, dass eine maschinelle Protokollierung des Einfriervorganges nicht möglich ist. Daher ist die Verbreitung dieser Methode im wissenschaftlichen und industriellen Bereich vergleichsweise gering.
- Lagerung von mittels „slow-freezing“ kryokonservierten Zellen/Proben
- Während des Kryokonservierungsvorgangs werden die Proben auf -80 bis -90°C abgekühlt. Der Einfriervorgang ist an diesem Punkt jedoch noch nicht abgeschlossen, da der sog. „Glasübergang“, d.h. die vollständige Erstarrung des CPA-Gemischs in Form einer glasartigen, amorphen und kristallfreien Masse erst bei ca. -130°C stattfindet. Somit ist der Einfriervorgang in Wirklichkeit erst durch das Überführen der Zellen aus dem Einfriergerät in den flüssigen Stickstoff beendet [3].
- Der kritische Faktor hierbei ist, dass die Zellen bei allen Temperaturen über -130°C durch Bildung von Eiskristallen langsam, aber konstant fortschreitend, geschädigt werden. Dieses Phänomen ist auch der Grund dafür, weshalb kryokonservierte Zellen bei einer Lagerung bei - 80°C, selbst wenn diese ohne Unterbrechungen erfolgt, im Laufe der Zeit an Viabilität und Funktionalität verlieren. Intakte Gewebestücke können unter -130°C über Jahre hinweg, unter voller Erhaltung ihrer biologischen Funktionsfähigkeit, gelagert werden, während eine Lagerung bei -100°C binnen 2 Jahren zum graduellen Funktionsverlust führt. Erfolgen solche Erwärmungsvorgänge während der Lagerzeit temporär und zyklisch, z.B. durch bestimmte regelmäßig stattfindende Ereignisse, so addieren sich die schädlichen Effekte. Daher sollte bei der Langzeit-Lagerung von kryokonservierten Zellen darauf geachtet werden, die Exposition bei Temperaturen von über -130°C möglichst gering zu halten [3].
- Obgleich es im Stand der Technik verschiedene Medien zum Konservieren von Zellen gibt (siehe
EP 1950 283 B1 ), so weisen diese Medien den einen oder anderen Nachteil auf, z.B. wächst nur eine geringe Zahl von Zellen nach dem Auftauen an oder die aufgetauten Zellen wachsen sehr langsam. -
EP 1950 283 B1 , welches zum Stand der Technik gehört, offenbart z.B. eine wässrige Lösung zur Zellkonservierung entsprechend der „STEM-CELLBANKER®“ GMP Lot# 211118 der Firma Zenoaq (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd). Diese Lösung zur Zellkonservierung enthält jedoch keine Antioxidantien, wie Ascorbinsäure, Cystein und/oder Glutathion. - Es besteht daher der Bedarf an weiteren, idealerweise verbesserten Medien zum Konservieren von Zellen, die idealerweise eine schonende Kryokonservierung, das heißt vor allem ein Einfrieren mit geringem Verlust der Vitalität und Lebendzellzahl bzw. ein schonendes Auftauen mit hoher Überlebensrate ermöglichen.
- Aufgabenstellung
- Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht in der Bereitstellung von idealerweise verbesserten Medien zur Konservierung von Zellen.
- Die zugrundeliegende Aufgabe wird gelöst durch die Gegenstände der Ansprüche, die hierin beschriebenen Ausführungsformen bzw. die Beispiele.
- Gegenstand der Erfindung
- Die zugrundeliegende Erfindung betrifft eine wässrige Lösung zur Zellkonservierung, umfassend
- 0,0185 % w/v Kaliumchlorid,
- 0,0185 % w/v Kaliumphosphat, vorzugsweise Kaliumphosphat monobasisch wasserfrei
- 0,8695 % w/v Natriumchlorid,
- 0,1064 % w/v Natriumphosphat, vorzugsweise Natriumphosphat dibasisch wasserfrei,
- 0,0925 % w/v Glukose, vorzugsweise D(+)-Glukose wasserfrei,
- 0,1203 % w/v Ascorbinsäure, vorzugsweise Magnesium-L-ascorbat-2-phosphat,
- 0,0028 % w/v Cystein, vorzugsweise L-Cystein HCl × H2O,
- 0,0925 % w/v Glutathion, vorzugsweise Glutathion reduziert,
- 0,1013 % w/v Methylzellulose, und
- 8,25 % w/v Dimethylsulfoxid (DMSO).
- „Zellkonservierung“ oder „Konservierung von Zellen“ beinhaltet vorzugsweise die Zellkryokonservierung bzw. Kryokonservierung von Zellen. Unter Kryokonservierung wird eine meist langfristige Lagerung von Zellen unterhalb von 0 °C, insbesondere bei -20 °C bis -200 °C verstanden. Das Einfrieren erfolgt in der Regel bei 1 °C/min.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform, wird die erfindungsgemäße wässrige Lösung zum Konservieren von Zellen wie folgt zubereitet:
[mg/Liter] Kaliumchlorid 185 Kaliumphosphat, monobasisch wasserfrei 185 Natriumchlorid 8695 Natriumphosphat dibasisch wasserfrei 1064 D(+)-Glukose wasserfrei 925 Magnesium-L-ascorbat-2-phosphat 1203 L-Cystein HCl × H2O 28 Glutathion reduziert 925 Methylzellulose 1013 DMSO 82500 - Die erfindungsgemäße wässrige Lösung zur Zellkonservierung wird vorzugsweise für „slowfreezing“ Verfahren zum Konservieren von Zellen verwendet. Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße wässrige Lösung zur Zellkonservierung nicht für Verfahren verwendet, die Vitrifikation anwenden.
- Vorzugsweise kann die erfindungsgemäße wässrige Lösung zur Zellkonservierung weiterhin Phenolrot, vorzugsweise Phenolrot Natriumsalz umfassen.
- Die erfindungsgemäße wässrige Lösung zur Zellkonservierung umfasst vorzugsweise ferner Zellen, die konserviert werden sollen. Diese zu konservierenden Zellen sind vorzugsweise Säugerzellen. Der Begriff „Zelle“ oder „Zellen“ umfasst auch Zellaggregate.
- Bevorzugte Säugerzellen sind Lymphozyten, Milzzellen, Thymozyten, Tierzellen, somatische Stammzellen, mesenchymale Stammzellen, nicht-humane embryonale Stammzellen, induzierte pluripotente Stammzellen, oder Krebsstammzellen.
- Besonders bevorzugte Säugerzellen sind humane induzierte pluripotente Stammzellen (hipSC), humane mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark (hMSC-BM), humane mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut (hMNC-PB / PBMC), humane dermale Fibroblasten aus der adulten Haut (NHDF-a), humane dermale Melanozyten aus der adulten Haut (NHEM-a) oder humane glatte Muskelzellen aus der Aorta (HAoSMC).
- Weitere besonders bevorzugte Säugerzellen sind humane Krebszelllinien, z.B. die humane Brustkrebs-Zelllinie MCF-7.
- Bei den zu konservierenden Zellen kann es sich sowohl um frisch aus Gewebe isolierte Zellen handeln oder um Zellen, welche bereits in vitro kultiviert bzw. expandiert wurden.
- Die Zellzahl pro Milliliter Zellsuspension, die konserviert werden soll, liegt vorzugsweise zwischen 100.000 und 100 Millionen Zellen.
- Vorzugsweise werden Zellen von ihrem Kultur- bzw. Isolations-Medium/Puffer separiert, bevor sie mit Hilfe der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung zum Konservieren von Zellen konserviert werden. Alle Arbeiten erfolgen vorzugsweise unter sterilen Bedingungen.
- Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung zur Zellkonservierung wie oben definiert als Kälteschutzmittel.
- Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung eine erfindungsgemäße wässrige Lösung zur Zellkonservierung wie oben definiert zur Verwendung als Arzneimittel oder Hilfsstoff.
- Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Konservieren von Zellen, umfassend
- (a) Dispergieren von Zellen in der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung zur Zellkonservierung wie oben definiert in einem Behälter; und
- (b) Zuführen des Behälters zu einer Kryokonservierung.
- Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Auftauen von Zellen, die in der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung zur Zellkonservierung wie oben definiert dispergiert und eingefroren sind, umfassend
- (a) Auftauen eines Behälters, in dem die eingefrorenen Zellen in der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung zur Zellkonservierung wie oben definiert dispergiert und eingefroren sind; und
- (b) Zugeben der aufgetauten Zellen zu einem für die Zellen geeigneten Kulturmedium.
- Beispiel 1: Separation der einzufrierenden Zellen von deren Kulturmedium
- Es können sowohl adhärent wachsende Zellen als auch nicht-adhärent in Suspension wachsende Zellen eingefroren werden. Der Begriff „Zellen“ steht hier für einzelne Zellen wie auch Zellaggregate aus bis zu mehreren hundert Zellen.
- Beispiel 1A: Ablösen adhärent wachsender Zellen
- Um adhärent wachsende Zellen abzulösen, wird zuerst das Kulturmedium abgesaugt. Dann wird die Zellschicht zweimal mit einer großzügigen Menge PBS-Puffer (ohne Ca2+ / Mg2+) gewaschen und ebenfalls wieder abgesaugt. Nach Zugabe eines geeigneten Ablösereagenz, z.B. Accutase (https://www.accutase.com/accutase.html) oder Trypsin-EDTA/TNS, werden die Zellen nach Herstellervorgaben abgelöst. Der Ablöseprozess wird mikroskopisch überwacht. Sobald die Zellen beginnen sich abzurunden, wird deren vollständige Ablösung durch leichtes Klopfen des Zellkulturbehälters herbeigeführt. Die abgelösten Zellen werden in ein Probenröhrchen überführt und im Anschluss die Konzentration und Gesamtzahl der Zellen mittels Zellzählung bestimmt. Nach Pelletierung der Zellen durch Zentrifugation (z.B. für 3 Minuten bei 300 x g und Raumtemperatur) wird der Überstand vorsichtig abgesaugt. Im Probenröhrchen bleibt das Zellpellet zurück, welches wie in Beispiel 2 beschrieben weiter behandelt wird.
- Beispiel 1B: Ernte nicht-adhärent wachsender Suspensionszellen
- In Suspension vorliegende bzw. wachsende Zellen werden mitsamt Medium in ein Röhrchen überführt. Im Anschluss die Konzentration und Gesamtzahl der Zellen mittels Zellzählung bestimmt. Nach Pelletierung der Zellen durch Zentrifugation (z.B. für 3 Minuten bei 300 x g und Raumtemperatur) wird der Überstand vorsichtig abgesaugt. Im Probenröhrchen bleibt das Zellpellet zurück, welches wie in Beispiel 2 beschrieben weiter behandelt wird.
- Beispiel 2: Einfrieren von Zellen mit der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung zum Konservieren von Zellen
- Das in Beispiel 1 erzeugte Zellpellet wird bei Raumtemperatur in einer entsprechenden Menge (s.u.) der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung zum Konservieren von Zellen aufgenommen und mittels behutsamen Auf- und Abpipettierens mit einer serologischen Pipette resuspendiert. Die Zellzahl pro Milliliter Zellsuspension sollte hierbei zwischen 100.000 und 100 Millionen Zellen liegen. Die Zellsuspension wird zügig zu je 1 ml auf Einfrierröhrchen verteilt.
- Die Röhrchen werden dann ohne Verzögerung in eine computergesteuerte Einfriermaschine (IceCube 14M) überführt. Diese verfügt über zwei Referenz-Temperatursonden (eine Probensonde und eine für die Einfrierkammer der Maschine), welche vor dem Start des Einfrierprozesses entsprechend positioniert werden. Danach wird der kontrollierte automatische Einfrierprozess mit einem geeigneten Einfrierprotokoll gestartet. Der Einfriervorgang ist abgeschlossen, wenn die Proben eine Temperatur von ≤ -80°C erreicht haben.
- Alternativ können die Zellen auf Trockeneis für mindestens 4 Stunden in mit 2-Propanol befüllten Einfrierbehältern, z.B. „Mr. Frosty“, kryokonserviert werden.
- Die Röhrchen mit den eingefrorenen Zellen werden nachfolgend aus der Einfriermaschine oder dem Einfrierbehälter entnommen. Auf Trockeneis bei -80°C werden sie -ohne Unterbrechung der Kühlkette- zum Lagerort transportiert und dort umgehend in Flüssigstickstoff eingelagert. Dort sind sie unbegrenzt haltbar.
- Die erfindungsgemäße wässrige Lösung zum Konservieren von Zellen wird wie folgt zubereitet:
[mg/Liter] Kaliumchlorid 185 Kaliumphosphat, monobasisch wasserfrei 185 Natriumchlorid 8695 Natriumphosphat dibasisch wasserfrei 1064 D(+)-Glukose wasserfrei 925 Magnesium-L-ascorbat-2-phosphat 1203 L-Cystein HCl × H2O 28 Glutathion reduziert 925 Methylzellulose 1013 Dimethylsulfoxid (DMSO) 82500 - Beispiel 3: Auftauen und Aussaat von Zellen
- In ein Röhrchen werden 9 ml Kulturmedium (Raumtemperatur) vorgelegt. Des Weiteren wird ein geeignetes Kulturgefäß mit einer entsprechenden Menge Kulturmedium (z.B. 0,2 bis 0,3 ml / cm2 Kulturfläche) befüllt und dieses im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 für mindestens 30 Minuten voräquilibriert.
- Das Röhrchen mit den kryokonservierten Zellen wird aus dem flüssigen Stickstoff entnommen und auf Trockeneis transportiert. Das Auftauen erfolgt für 2 Minuten mittels kontinuierlicher Schwenkbewegung in einem mit 37°C temperierten Wasserbad. Das Röhrchen wird mit 70% (v/v) Ethanol desinfiziert und unter die Sterilbank überführt. Dort wird das Röhrchen mit den aufgetauten Zellen geöffnet und die Zellen zügig in die in einem Röhrchen vorgelegten 9 ml Kulturmedium überführt. Optional kann zu diesem Zeitpunkt eine Bestimmung der viablen Zellzahl erfolgen, um die für die optimale Aussaatdichte exakt erforderliche Zellzahl zu ermitteln.
- Danach werden die Zellen mittels Zentrifugation (z.B. für 3 Minuten bei 300 x g und Raumtemperatur) pelletiert und der Überstand abgesaugt. Das Zellpellet wird in einer geeigneten Menge frischem Kulturmedium aufgenommen und die Zellsuspension (unter Beachtung der empfohlenen Aussaatdichte für den jeweiligen Zelltyp) in den prääquilibrierten Kulturbehälter überführt. Die weitere Inkubation erfolgt im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2.
| Verwendete Materialien | ||
| Bestell-Nr. | Name | Lieferant |
| M7140 | Methylcellulose | Sigma |
| D4540 | DMSO | Sigma |
| A8960 | L-Ascorbic Acid 2-Phosphate Mg | Sigma |
| C6852 | L-Cystein × HCl × H2O | Sigma |
| G6013 | Glutathione (reduced) | Sigma |
| G7021 | D(+)-Glucose anhydrous | Sigma |
| 207790250 P5530 | Sodium Chloride Phenolred Sodium Salt optional für Version mit Phenolrot | Acros / Fisher Sigma |
| P0750-N 10L | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline w/o Ca/Mg (Pulver) Potassium Chloride Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous Sodium Chloride Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Biowest |
Claims (9)
- Wässrige Lösung zur Zellkonservierung, umfassend 0,0185 % w/v Kaliumchlorid, 0,0185 % w/v Kaliumphosphat, vorzugsweise Kaliumphosphat monobasisch wasserfrei 0,8695 % w/v Natriumchlorid, 0,1064 % w/v Natriumphosphat, vorzugsweise Natriumphosphat dibasisch wasserfrei, 0,0925 % w/v Glukose, vorzugsweise D(+)-Glukose wasserfrei, 0,1203 % w/v Ascorbinsäure, vorzugsweise Magnesium-L-ascorbat-2-phosphat, 0,0028 % w/v Cystein, vorzugsweise L-Cystein HCl × H2O, 0,0925 % w/v Glutathion, vorzugsweise Glutathion reduziert, 0,1013 % w/v Methylzellulose, und 8,25 % w/v DMSO.
- Wässrige Lösung zur Zellkonservierung nach
Anspruch 1 , weiterhin umfassend Phenolrot, vorzugsweise Phenolrot Natriumsalz. - Wässrige Lösung zur Zellkonservierung nach
Anspruch 1 oder2 , ferner umfassend Zellen, die konserviert werden sollen. - Wässrige Lösung zur Zellkonservierung nach
Anspruch 3 , wobei die zu konservierenden Zellen Säugerzellen sind. - Wässrige Lösung zur Zellkonservierung nach
Anspruch 4 , wobei die Säugerzellen humane induzierte pluripotente Stammzellen (hipSC), humane mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark (hMSC-BM), humane mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut (hMNC-PB / PBMC), humane dermale Fibroblasten aus der adulten Haut (NHDF-a), humane dermale Melanozyten aus der adulten Haut (NHEM-a), humane glatte Muskelzellen aus der Aorta (HAoSMC) oder humane Krebszelllinien, z.B. die humane Brustkrebs-Zellinie MCF-7, sind. - Verwendung der wässrigen Lösung zur Zellkonservierung nach einem der
Ansprüche 1 bis5 als Kälteschutzmittel. - Wässrige Lösung zur Zellkonservierung nach einem der
Ansprüche 1 bis5 zur Verwendung als Arzneimittel oder Hilfsstoff. - Verfahren zum Konservieren von Zellen, umfassend (a) Dispergieren von Zellen in der wässrigen Lösung zur Zellkonservierung nach einem der
Ansprüche 1 bis5 in einem Behälter; und (c) Zuführen des Behälters zu einer Kryokonservierung. - Verfahren zum Auftauen von Zellen, die in der wässrigen Lösung zur Zellkonservierung nach einem der
Ansprüche 1 bis5 dispergiert und eingefroren sind, umfassend (a) Auftauen eines Behälters, in dem die eingefrorenen Zellen in der wässrigen Lösung zur Zellkonservierung nach einem derAnsprüche 1 bis5 dispergiert und eingefroren sind; und (b) Zugeben der aufgetauten Zellen zu einem für die Zellen geeigneten Kulturmedium.
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