DE2161820A1

DE2161820A1 - Verfahren zur Lagerung von biologischen Substanzen

Info

Publication number: DE2161820A1
Application number: DE19712161820
Authority: DE
Inventors: Ralph Edward Elgin Ariz. Schwartz (V.St.A.)
Original assignee: Ovitron Research Corp., Elgin, Ariz. (V.StA.)
Priority date: 1970-12-14
Filing date: 1971-12-13
Publication date: 1972-06-22
Also published as: DK131881B; FR2118522A5; IL38254A0; DK131881C; BE776635A; GB1364896A; IT945899B; US3753357A

Description

MDNCHEN 'HAMBURG 2lOlo20

TELEFON: 555476 8000 MÖNCHEN 15,

TELBGRAMME.. KARPATENT _v NUSSBAUMSTRASSe₁O

13. Dezember 1971 W₁ 40 780/71/ES

Ovitron Research Corporation Elgin, Arizona (V.St.A.)

Verfahren zuj? Lagerung von biologischen Substanzen

Die Erfindung bezieht sich auf die Konservierung von biologischen Substanzen, wie Impfstoffen, Seren, Enzymen, Hormonen, Blut, bakteriologischen Kulturen von verschiedenen Formen, Gewebe, Knochen, Knochenmark, Nahrungsmittel und menschlichen und tierischen Organen und Körperteilen aller Art.

Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Konservierung von Zellen und zellartigen Strukturen. Der Ausdruck "zeUartig" wird im allgemeinen Sinn verwendet und umfaßt biologische Materialien, die sich untor dem Einfluß der Arbeitsweise gemäß der Erfindung

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ähnlich verhalten, wie dies nachstehend näher auseinandergesetzt wird.

Die Grundlebenseinheit ist die Zelle. Ein Organ ißt ein Aggregat von verschiedenen Zellen, die in Nebeneinander lage durch Traggerüste gehalten werden. Jede Zellart ist besonders geeignet, ihre funktionellen Erfordernisse innerhalb des Systems, in dem sie angeordnet ist, auszuführen. Die rote Blutzelle zum Beispiel, von der es 75 Trillionen (Billionen) in dem menschlichen Körper gibt, hat als Hauptfunktion den Transport von Sauerstoff von den Lungen zu den Geweben. In dem menschlichen Körper sind zusätzlich 25 Trillionen (Billionen) Zellen von verschiedener Art aufgebaut. Beispiele von verschiedenen Körperzellen, welche die 25 Trillionen (Billionen) ausmachen, sind Bindegewebe, weiße Blutzellen,"Nervengewebe, Muskelgewebe und Nierengewebe. Tiere (keine menschlichen Lebewesen) (und niedrigere Lebensformen) sind im allgemeinen analog, obwohl die Art und die zellenmäßige Überlegenheit von besonderen Zellen über andere verschieden sind.

Während die Zellen des Körpers sich voneinander unterscheiden, haben sie gewisse gemeinsame G-rundeigenschaften. Jede Zelle erfordert eine Ernährung, um ihre Entwicklungs- oder Lebensfähigkeit aufrechtzuerhalten, und die meisten nutzen die gleiche Art von Nährstoffen. Zellen leiten ihre Energie vom Sauerstoff her, der im allgemeinen sich mit entweder Kohlenhydraten, Fett oder Protein vereinigt, um die für die Funktion der Zelle erforderliche Energie freizusetzen. Allgemeine Mechanismen für die Umwandlung von Nährstoffen in Energie sind grundlegend die gleichen, und wenn die Zelle diese Umwandlung herbeigeführt hat, muß das Endprodukt der che-

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mischen. Reaktion in die umgebende Flüssigkeit, transportiert werden.

Außerdem haben die meisten Zellen (von denen eine bemerken:; aworte Ausnahme die Blutzellen sind) die Fähigkeit, sich durch Mitosis zu erneuern, und wenn Zellen einer besonderen Art zerstört sind, teilen sich die übriggebliebenen Zellen dieser Art, bis die zweckentsprechende Anzahl wieder aufgefüllt isti Zellen sind, mit anderen Worten, Automaten, die fähig sind zu leben, zu wachsen und ihre eigenen speziellen Punktionen auszuführen, solange die richtigen Konzentrationen von Sauerstoff, Glucose, den verschiedenen Elektrolyten, Amino säuren und Fettsubstanzen in ihrer Umgebung zur Verfügung stehen.

Allgemein sind die Zellen hauptsächlich aus . fünf Grundöubstanzen zusammengesetzt: Wasser, Elektrolyten, Proteinen, Lipiden und Kohlenhydraten. Die Elektrolyten werden in V/asser gelöst und liefern anorganische Chemikalien für Zellreaktionen. Sie gestatten auch eine Übertragung von elektrochemischen Impulsen in Nerven ■und Muskelfasern und bestimmen die Aktivität von verschiedenen enzymatisch katalysierten Reaktionen, die für den Metabolismus oder Stoffwechsel notwendig sind. Proteine sind sowohl Gerüststoffe als auch Enzyme. Die Gerüstproteine halten die Strukturen der Zelle zusammen und sind im allgemeinen fibrillar. Enzyme sind Proteine in allgemein kugelartiger Form; sie kommen in unmittelbare Berührung mit anderen Substanzen im Inneren der Zelle und katalysieren chemische Reaktionen. Lipide machen 2 bis 35» aus und liegen in hoher Konzentration in der Membran vor. Die Lipide sind unlöslich oder nur tei3.weise löslich in Wasser und vereinigen sich mit Gerüstproteinen zur Bildung der Membran, welche die Wirkung haben,

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die verschiedenen Y/asserabteile der Zellen voneinander zu trennen. Kohlenhydrate haben sehr wenig G-erüstfunktion in der Zelle. Sie spielen jedoch eine Hauptrolle bei der Ernährung der Zellen.

Physikalisch ist eine Zelle nicht ein Beutel, welcher die vorgenannten Bestandteile enthält, sondern eine organisierte Struktur, die mit Membranen ausgekleidet ist, welche eine tatsächliche Dicke von 75 bis loo S. haben und elastisch sind. Wenn die Zelle leben und wachsen " soll, muß sie Nährstoffe und andere Substanzen aus den umgebenden Flüssigkeiten enthalten.

Substanzen können durch eine Zellmembran auf drei V/eisen treten:

(1) durch Diffusion durch die Poren in der Membran oder durch die Mernbranmatrix von Zellen;

(2) durch aktiven Transport durch die Membran, einen Mechanismus, bei dem Enzymsysteme in* einer besonderen Trägersubstanz das Material durch die Membran tragen;

P (3) durch Pinocytosis, einen Mechanismus, durch den die Membran tatsächlich etwas von der !flüssigkeit außerhalb der Zellen und ihren Inhalt hineinzieht«,

Tabelle I veranschaulicht die Zusammensetzung von extracsllulärer Flüssigkeit im Vergleich mit intracellulärer Flüssigkeit. Es ist besonders wichtig, daß die extracelluläre Flüssigkeit große Mengen von Natrium, jedoch nur geringe Mengen von Kalium enthält. Das genaue Gegenteil ist bei intracellulörer Flüssigkeit der Fall. Die gleiche Diehotomieoder Teilung trifft auf Chloride und Phosphate zu, die äußerst wichtig für das Leben der ZeI-

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1e s ind.

Yon den vorstehend erwähnten drei Methoden werden Substanzen durch die Zellmembran durch zwei Hauptverfahren transportiert, d.h. Diffusion und aktiven Transport gefördert. Die Diffusion ist eine komplexe Erscheinung, die von einer großen Anzahl von Paktoren einschließlich des Konzentrationsgradienten, der Löslichkeit der diffundierten Substanz in dem Lipid der Zelle, der Membranporengröße gegenüber der Größe der diffundierenden Moleküle, der elektrischen Ladung bei dem diffundierenden Ion und seiner Affinität für nicht-geladene Moleküle,der Existenz oder Nichtexistanz eines elektrischen Gradienten über die Membran und von osmotischem Druck abhängt. (In diesem Zusammenhang ist zu beachten, daß der Gesamtdruck, der auf jeder Seite der Membran in z.B. dem. menschlichen Körper bei Körpertemperatur wirkt, 1 Million mm Quecksilber beträgt). Die Größe des durch ein Solut. oder einen gelösten Stoff ausgeübten osmotischen Drucks ist proportional der Konzentration des gelösten Stoffs in Anzahlen von Molekü- · len oder Ionen.

Der aktive Transport ist ein Mechanismus, der für die Bewegung von Stoffen gegen den Konzentrationsgradienten oder, mit anderen Worten,"bergauf" verantwortlich ist. Der Grundmechanismus ist vermutlich von dem Transport durch Träger abhängig, von denen wenig bekannt i3t. Vermutlich besteht die Trägersubstanz gewöhnlich entweder aus einem Phospholipid(oder Phosphatid) oder einem Protein. In Abhängigkeit von der besonderen Lage der Zelle in ihrer Umgebung ist der aktive Transport für solche Stoffe, wie Natrium, Kalium, und andere Elektrolyten, Zucker, Aminosäuren und andere verantwortlich.

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Die vorstehende Erläuterung ist trots ihrer Länge in Wirklichkeit eine starke Vereinfachung der grundlegenden Zellprozesse. Die Erläuterung wurde .zur Schaffung einer Grundlage für die Diskussion der bisherigen Techniken gegeben, die, obwohl sie physikalisch einfach sind, dieser großen Vielzahl von Eigenschaften Rechnung tragen müssen, wenn die Zeil-Lebensfähigkeit bzw. das Zellwachstum aufrechterhalten werden soll. Überdies ist aus dem Vorhergehenden ersichtlich, daß Konservierungsarbeitsweisen, die auf Zellstrukturen anwendbar sind, in gleicher Weise auf zellartige Strukturen anwendbar sind, die in diesem Zusammenhang allgemein als Strukturen definiert werden, welche in großem Umfang aus V/asser aufgebaut sind und welche daher genügend analoge Eigenschaften haben, so daß sie günstig auf das Temperatur-Druck-Verfahren gemäß der Erfindung reagieren und durch ein solches Verfahren aufbewahrt werden können. Wahrungsmittel sind allgemein Zellstrukturen und obwohl sie nicht länger lebensfähig sind (obgleich sie es sein können) reagieren sie ebenso v/ie lebende Zellen insofern, als die durch die Aufbewahrungstechnik zurückerhaltenen Eigenschaften (Geschmack und Konsistenz) betroffen sind.

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Tabelle I

Chemische ZusammensetzungGn von extracelluläron und intracellulären Flüssigkeiten

Extrac ellulär e Flüssigkeit

Na⁺ 142 mäq/1.

K+ 5 n-.äq/l.-

•H-

HCO-

phpsphate

Glucose

Aminosäuren
Cholesterin

phospho lipide.

(Phosphatide)

Neutrale.

PcO.

— 3 mäq/1.

— 103 mäq/1. -- 28 it.äq/1.

— 4 mäq/1.

— 1 mäq/l.

— 90 mg %

— 30 mg % ·

0.5 g % -

- 35 rom.Hg

- 46 mm.Hg 7.4

Intrac ellulär e Flüssigkeit

10 rnäq/1.

141 mäq/1.

50 rnäq/1.

._ ~~— 4

10

75

. 2 m:äq/l.

0 to 20 mg % — 200 mg .%

2 to 95 g %

- 20 mm.Hg?

- 50 mm.Hg? 7.0

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Historisch, hat sich die Konservierung von lebenden Zellmaterialien zu der Ultra-Kälte für die Methodologie in eine als Cryobiologie genannte Untergruppe der Wissenschaft gewendet. .Interesse hinsichtlich der Ultra-Kälte ergibt sich aus der Tatsache, daß Zellen in einen Zustand von suspendiertem oder ausgesetztem Leben gebracht werden können, injdem weder Alterung noch Tod eintritt und die Stoffwechselprozesse beträchtlich herabgesetzt werden können.

Die hervorragendste Anregung zum Erwecken dieses Interesses war eine Demonstration im Jahre 1949, bei der der Zusatz von Glycerin zu dem Suspensionsmedium das Überleben von Samen (Sperma) nach Frieren bei Temperaturen von -79°0 gestattete. Im Jahre 1956'zeigte Smith, daß in Gegenwart von 3o bis 5o$ Glycerin rote Zellen auf -79⁰O gekühlt und mit einem Minimum an Hämolyse aufgetaut werden können. Danach begann die Arbeit in der Cryobiologie mit Nachdruck.

'Der Weg war nicht leicht. Vor der Anwendung von Glycerin war gefunden worden, daß Kälte zwar den Stoffwechsel verlangsamt, ihn aber nicht von selbst tötet. Zellstrukturentod wird durch eine Kombination von Paktoren verursacht, die folgendes einschließen können:

(1) mechanische Verletzung durch Eiskristalle;

(2) chemische Verletzung infolge erhöhter Konzentration von Salzen;

(3) Dehydratation und

(4) andere Faktoren, die in keiner Weise verständlich sind, wie z.B.das Stoffweehselungleichgewicht infolge von Aufbewahrung bei Temperaturen, bei denen einige Enzyme ihre Wirkung fortsetzen.

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Während eines langsamen Gefrierens wachsen Eiskristalle von reinem Wasser extracellular und wachsen in ihrer Größe, wenn Y/asser aus der Zelle extrahiert wird. Gelöste Stoffe werden innerhalb der Zelle konzentriert, wenn das Wasser kristallisiert, wobei osmotische Änderungen geschaffen werden, uie beträchtlich intracelluläre Komponenten beeinflussen und pH-Wertänderungen, Fällung von Puffersalzen und Denaturierung von Protein herbeiführen, wobei eine Zerstörung des zuvor beschriebenen Gleichgewichts verursacht wird. Da die Geschwindigkeit dieser Änderungen temperaturabhängig ist, tritt eine Gefrier-Auftauschädigung hauptsächlich während der Gefrier- und Auftauprozesse bei Temperaturen zwischen O und -5o°C ein.

Gelöste Stoffe, wie Glycerin, erniedrigen den Gefrierpunkt, erleichtern die Bewegung von Wasser aus der Zelle heraus und erhöhen das in der Zelle gebundene Wasser, wodurch der Grad der Elektrolytkonzentration und der Dehydratation begrenzt v/ird. 1 Mol Glycerin hindert annähernd 3 Mol Wasser am Gefrieren. Die Gefriergeschwindigkeit muß langsam genug sein, um eine Diffusion von Glycerin durch Zellmembrane zu gestatten, um das osmotische Gleichgewicht aufrechtzuerhalten. Dementsprechend haben sich niedrige Abkühlgeschwindigkeiten in dem Bereich von l°C/min als am besten für mit Glycerin versehene Zellen gezeigt.

Eine jüngere Richtung beim Gefrieren von Zellen ist die Anwendung von Dime thy lsulfoxy.d anstelle von Glycerin, da es rascher durch die Zellmembranen diffundiert und bei Anwendung in der. gleichen Konzentration wie Glycerin, überlegene Ergebnisse beim langsamen Gefrieren ergibt.

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Es ist von den Verfassern und Forschern auf diesem Gebiet allgemein anerkannt worden, daß die Methoden empirisch sind. Ferner ist das Verständnis der grundlegenden physikalischen und chemischen Vorgänge bruchstückartig. Der Y/ert von -79 G war z.B. keine magische Zahl, sondern war zufällig der Schmelzpunkt von leicht erhältlichem festen Kohlendioxyd. Bei der Ausnutzung von technischem flüssigen Stickstoff kann eine Aufbewahrungs- oder Lagertemperatur von -196 C verwirklicht

I werden.

Selbst wenn eine sofortige Denaturierung durch Herabsetzung der Dehydratation mit Glycerin verhindert wird, ist noch ein langsamer Abfall in der Lebensfähigkeit vorhanden. Obwohl der genaue Grund hierfür nicht bekannt ist, ist anzunehmen, daß dies die Folge der Anwendung von Glycerin selbst ist, das infolge seiner Eigenschaften als starker Y/asserstoffbinder Protein unmittelbar denaturieren kann. Dieser Effekt kann durch Herabsetzung der Temperatur verzögert werden und wird bei Temperaturen von -8o°C oder darunter vernachlässigbar·

Die vorstehende Methodologie zum langsamen Gefrieren hat zwar einen Fortschritt in den Lagertechniken gebracht, sie erfordert jedoch größte Sorgfalt, die wesentlich über der Fähigkeit der gewöhnlichen Techniker liegt. Ferner muß die Gegenwart von Glycerin oder Dimethylsulfoxyd sorgfältig eingestellt werden,und diese Stoffe müssen in geeigneten Stufen in das Verfahren eingeführt und aus diesem entfernt werden. Überdies bietet keiner dieser Zusatzstoffe das Universalmittel für alle Zellstrukt.uren,und es findet noch Versuchsarbeit statt, um die Grenzen ihrer Anwendung zu bestimmen. Rasches Gefrieren hat andererseits drei Erfordernisse für eine erfolgreiche Konservierung:

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(1) das Gefrieren muß äußerst rasch erfolgen;

(2) die Lagerung muß bei einer äußerst niedrigen Temperatur stattfinden und

(3) das Auftauen muß äußerst rasch geschehen.

Die meisten Fehlergebnisse bei den früheren Versuchen sind entweder der unzureichenden Erkenntnis einer dieser Erfordernisse oder der Unfähigkeit, sie zu erzielen, zuzuschreiben. Die Muster müssen nicht nur in eine Flüssiggasumgebung (wie flüssige Luft) getaucht werden, sondern die Huster müssen auch eine solche geometrische Form haben, daß ein gleichförmiges rasches Gefrieren durch sie stattfindet. Die meisten Techniken konzentrieren sich auf die Verwendung einer sehr kleinen Kugel, die durch Versprühen der Muster aus einer rasch schwingenden Düse gebildet wird.

Bei Blut erfordert die Erzielung eines günstigen Oberflächeri-su-Voluinenverhältnisaes, daß die. obere Grossenbegrenzung des Gesantbluts eine Kugel von 1 mm Durchmesser ist. Die Lagerung ist nur erfolgreich, wenn sie bei einer Temperatur unter derjenigen, bei welcher Eiskristalle zu einer tödlichen Größe wachsen können oder eine Denaturierung mit irgendeiner merklichen Geschwindigkeit fortEichreiten kann, erfolgt.

Zusammenfassend ist festzustellen, daß das langsame Gefrieren wahrscheinlich die praktischere Arbeitsweise ist. Kristalle werden extracellular wachsen gelassen und eine Dehydratationsdenaturierung wird mit einem Zusatzstoff ,gewöhnlich Glycerin oder Dimethylsulfoxyd, verhindert. Diese Arbeitsweise ist jedoch auf solche Mustor beschränkt, bei denen hohe Glycerin- oder Dirnethylsulfoxydkonzentrationen geduldet werden können. Die" nachfolgende Entfernung des Glycerins durch Dialyse ist eine

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zeitraubende und genau auszuführende Arbeit, die jedoch notwendig ist. Ein rasches Gefrieren hat jedoch andererseits den Hauptnachteil, daß es die Unterteilung der Muster in Teilchen von äußerst geringer Größe fordert, um einen raschen Wärineaustausch zu erreichen. Eine noch mehr in's Einzelne gehende Analyse der vorstehend erläuterten Arbeitsweisen kann aufgrund der Zeitschrift "Cryobiologie" ab 1963 gemacht v/erden.

Eine Prüfung der signifikantesten Veröffentlichungen über Cryobiologie führt zu dem unvermeidlichen Schluß, daß die Forscher auf diesem Gebiet routinemäßig den Fußstapfen ihrer Vorgänger gefolgt sind, indem sie die Wand zu vermeiden suchten, der jeder schließlich gegenüberstand, wenn er den Versuch machte, die Technik des langsamen und des schnellen Gefrierens weiter zu entwickeln. Niemand ist jedoch auf den Beginn zurückgegangen und hat die Frage des ursprünglichen Gefrierens selbst untersucht.

Die Erfindung gründet sich auf die sorgfältige Kontrolle von Temperatur und Druck in einer solchen Weise, daß die Eigenschaften der Substanz, die man zu konservieren sucht, aufrechterhalten werden. Bei der ersten Ausführungsform der Erfindung wird dies dadurch erreicht, daß Gefrierschocks ebenso wie die Erscheinung des Gefrierens selbst vermieden werden. Bei der zweiten Ausführungsform, die eine Weiterbildung der ersten Ausführungsform iot, findet ein Gefrieren statt, jedoch ohne die Erscheinung der sich durch die Substanz hindurchbewegenden Front und den sie begleitenden Schock. Die vorstehende Arbeitsweise gestattet die Aufrechterhaltung der Zellenintegrität ebenso wie ihres chemischen Zuotands,während sie die Stoffwechselgeschwindigkeit genügend herabsetzt, um eine Schädigung zu vermeiden.

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Im besonderen wird die zu konservierende biologische Substanz mit einem isotonisch inerten und verträglichen Medium umgeben, das selbst in einem nicht-ausdehnbaren Gefäß eingeschlossen ist (bei Blut ist die rote Zelle schon von einem solchen Medium umfaßt). Diese Kombination wird da,nn bei einer Temperatur über dem Gefrieren vorkomprimiert. Vorzugsweise findet diese Vorkomprimierung bei einer Temperatur statt, die annähernd derjenigen des maximalen Dichtepunkts entspricht. Da das nicht-ausdehnbare Gefäß i'sovolumetrisch ist, wird jede Erniedrigung der Temperatur von einem . erhöhten Druck begleitet. Durch sorgfältige Kontrolle der Temperatur und des Drucks ist ersichtlich, daß der selbst erzeugte Druck (infolge von Temperaturabnahme) zuzüglich des Vorkomprimierungsdrucks innerhalb gewisser Temperaturgrenzen ausreichend ist', um das Medium und die biologische Substanz in einem nicht-gefrorenen Zustand zu halten, obwohl eine Temperatur unter O⁰C vorhanden ist.

Während das Vorhergehende beträchtlich die brauchbare Lagerdauer von solchen Substanzen erhöht, indem die Stoffwechselgeschwindigkeit herabgesetzt wird, ist gefunden worden, daß die Erfindung beträchtlich ausgedehnt werden kann, indem eine Bewegung in die gefrorene Phase erfolgt.

Kurz zusammengefaßt, es ist gefunden worden, daß wenn das Medium und die biologische Substanz auf zum Beispiel -lo°C in der zuvor beschriebenen ?feise gebracht worden ist und auf dieser Temperatur während einer ausreichenden Zeitdauer gehalten wird, um einen vollständigen V/ärmeübergang von der Zelle und dem Medium zu dem Behälter zu gestatten, dann die Entfernung einer vorbestimmten Menge des Drucks das Gleichgewicht aus der flüssigen Phase zu dar festen Phase verschiebt

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und ein Gefrieren gleichzeitig durch die Zelle und das Medium hindurch stattfindet.

Die vorstehend aufgeführten Merkmale und weitere Merkmale und Aufgaben der Erfindung und die Art und Weise zur Erzielung derselben v/erden anhand der Zeichnung

und von Beschreibungen von Ausführung«formeη der Erfindung näher erläutert.

Pig. I veranschaulicht graphisch die zulässigen Vorkompressionsparameter gegenüber den endgültigen Lagerungstemperaturparametern in kg/cm (psi) und ⁰G zur Ausführung einer Flüssigphasenlagerung unter O⁰G.

Fig. 2 ist ein Schnitt durch .ein Lagerungsgefäß und seinen Organgehalt gemäß der Erfindung, und

Pig. 3 ist eine schematische Darstellung der Rege].- oder Steuervorrichtung- zur Lagerung in.flüssiger und fester Phase.

Wie vorstehend ausgeführt,bewirkt· die übliche Lagerungstechnik mit Lagerung in fester Lage den Tod der Zellstruktur oder ihre Nichtlebensfähigkeit durch.eine Kombination von Paktoren, die im allgemeinen von der Eisbildung stammen? Während es allgemein anerkannt ist, daß Zellen in großem Umfang aus Wasser bestehen, sind sehr wenig Untersuchungen hinsichtlich der vollen Y/asseranalogie ausgeführt worden. Anders ausgedrückt, die Menge von Wasser in den Zeil- und zellähnlichen Gebilden

daß
zeigt,ihre statischen, dynamischen und physikalischen Eigenschaften derart sind, daß ihr Verhalten durch die Wasseranalogie in mehrfacher wichtiger Hinsicht vorausgesehen werden kann. Beispielsweise haben sowohl \7asser als auch Zellstrukturen die maximale Dicht.e zwischen

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3 und 4⁰C. Demgemäß suchen sich Zellen sowohl über als auch unter 3 his 4⁰C auszudehnen.

Fast analog ist die Erscheinung des G-efrierens. Infolge eines fast unvermeidlichen Temperaturgradienten zwischen der Kitte der Zellmasse und den äußeren Zellen findet ein Gefrieren notwendigerweise in laminaren Stufen oder Schalen statt, wobei es sich als eine Front von der Außenseite zu der Innenseite bewegt, wenn die latente Wärme verbraucht ist. Dies ist auch für einen Druckschauer vorantwortlich, der durch die intra- und extracellulären Flüssigkeiten übertragen wird. Während allgemein angenommen wird, daß Zellmembranen durchlässig und duktil sind, gestatten plötzliche Änderungen nicht die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts zwischen intra- und extracellularen Flüssigkeiten des osmotischen Gleichgewichts usw., wie dies vorstehend erörtert ist. Es ist gerade dieser Effekt, der die Verwendung von Glycerin und Dimethylsulfoxyd bei Arbeitsweisen, mit langsamem Gefrieren und die maximale Auslegung von Oberflächen/Volumen bei Arbeitsweisen mit schnellem Gefrieren erfordert.

Die freie Ausdehnung von V/asser und analog von ZeIlflünsigkeiten, wenn ein Gefrieren z.B. bei einer Atmosphäre (etwa O⁰C) stattfindet, beträgt 9$; die Zusammendrückbarkeit von Wasser und Zellflüssigkeiten bei dieser Temperatur und diesem Druck beträgt infolge der Zustandsänderung nur 4, 2^. Wenn so eine rasche Ausdehnung in einem geregelten Volumen stattfindet, v/ürde sich Eis zu einem Gesamtbetrag der Ausdehnung bilden, um eine Änderung von 4,2^· des Volumens herbeizuführen; jenseits dieses Punkts könnte sich kein Eis mehr bei dieser Temperatur bilden.

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Die Fälligkeit von Wasser oder Zellflüssigkeiten zur Umwandlung in einen festen Zustand hängt daher von ihrer Zusammendrückbarkeit ab. Es ist gefunden worden, daß, wenn dieser Zusammendrückbarkeit in gewisser Weise Rechnung getragen v/erden kann, eine Kristallisation oder ein Gefrieren eines Anteils vermieden werden kann. Insbesondere ist gefunden worden, daß eine ausreichende Menge von Yorkompression auf die Zellen oder zellartigen Strukturen angewendet werden kann, um die verfügbare Zusammendrückbarkeit aufzunehmen, v/o durch die Quellen von Druck ausgeschaltet oder geregelt und ein Gefrieren ausgeschaltet v/erden können.

Wie ersichtlich, hängt der Gefrierpunkt einer Flüssigkeit von der herrschenden Temperatur uiu^; dem herrschenden Druck ab. So würde bei feinem Druck

1der Gefrierpunkt T^sein, bei einem Druck V^ (wenn Pp ^> P-) würde jedoch die Gefriertemperatur bei Tp liegen d. h. einer niedrigeren Temperatur als T₁.

Die Vorkomprimierung kann in dem vorliegenden Zusammenhang als die mechanische Anwendung von positivem Druck bei irgendeiner Temperatur über dem Gefrierpunkt der zu bearbeitenden Substanz definiert werden.

Die Vorkomprimierung kann in einheitlicher Weise bei einer Temperatur angewendet werden oder sie kann in Stufen unter Einführung eines definierten Drucks angewendet v/erden, der an vorbestimmten Temperaturpunkten erhöht wird, (z.B. 365,56kg/cm' (5200 p.s.i) bei 4°C, 211 kg/cm² (3000 p.s.i.) b|g -5°C, 14-1 kg/crn² (2000 p.s.i.) bei -10 C usw. wobeiVsich um absoluten Druck bei allen Druckv/erten handelt).

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Die Vorkomprimierung kann bei irgendeiner Temperatur über dem Gefrieren angewendet werden; zur Definierung seiner Größe wird jedoch der Wert des Vorkomprimierungsdrucks bei der maximalen Dichte gemessen. In Abhängigkeit von der Zeil- oder aellartigen Struktur ist dies irgendwo zwischen 2 und 6⁰C. , '

Es sei z. B. angenommen, daß in einem nicht nach-

gebenden Gefäß ein Druck von 281 kg/cm (4000 p.s.i.) bei einer Temperatur von 5°C angewendet wird. Es sei ferner angenommen, daß die besondere Zellstruktur sich danach zusammenzieht, wenn die Temperatur auf 4 C herabgesetzt wird $ die tatsächliche Größe des

"Vorkomprimierungsdrucks" beträgt dann 281 kg/cm (4000 p.s.i.) abzüglich des Druckabfalls infolge der volumetrischen Zusammenziehung auf die maximale Dichte. Das gleiche Zusammenziehungsprinzip würde zur Anwendung kommen, wenn Druck bei 2⁰C eingeführt würde

und ein Vorkomprimierungsdruck von 281 kg/cm (4000 p.s.i.) abzüglich des Druckabfalls infolge der Zusammenziehung vorhanden sein würde, wenn theoretisch die Temperatur auf den Punkt maximaler Dichte erhöht wurde.

Während es verhältnismäßig leicht ist, z. B. Blut vrenn es In Behälter gebracht und unter Druck gesetzt ist, zu betrachten, kann es für den Beschauer schwierig sein, sich ein Bild zu machen, wenn der gleiche Effekt bei Zellstrukturen verschiedener Art, wie Hornhaut (Cornea), Nieren, Geweben, Knochenmark, Knochen, Gehirnzellen, Enzyme, Seren, Nahrungsmittel usw. In diesen Fällen wird jedoch das Muster, das man zu lagern wünscht, zuerst in ein isotonisch inertes zellverträgliches Medium eingetaucht. Die Wirkungserfordernisse für ein solches Medium sind : daß es keine chemische Auslaugung herbeiführt; 209826/1075

daß sein Gefrierpunkt annähernd der gleiche ist, wie derjenige der biologischenSubstanz, die darin eingetaucht ist; daß es steril ist und daß es keine schäd-· .liehen Wirkungen innerhalb des in Betracht kommenden Temperatur-und Druckbereichs hat, d. h. daß es sowohl chemisch als auch physikalisch verträglich ist. Beispiele von Lösungen, welche den vorstehenden Wirkungserfordernissen entsprechen, sind Buckley-Lösung, Macrodex, Collins-Lösung,Plasma, Ganzblut und Salzlösung.

Welche Lösung am verträglichsten mit der in Betracht kommenden Zellstruktur ist, muß im einzelnen empirisch für die betreffende Zellstruktur bestimmt werden. Es wurde jedoch gefunden, daß Buckley-Lösungj die einen variablen pH-Wert und eins variable Elektrolytzusammensetzung ähnlich wie Plasma hat, am universalsten unter den vorstehenden Beispielen ist, und bei den meisten menschlichen Zellen gut -.... oeitet.

Die Erfindung umfaßt auch die Anwendung von sich selbst erzeugenden Drücken nach oder zwischen den mechanischen Vorkomprimierungsstufen. Dien, wird durch isovolumetrische Temperaturänderungen herbeigeführt. Das heißt, wenn eine wäßrige Substanz innerhalb eines nicht-ausdehnbaren oder nicht-nach giebigen Gefäßes enthalten ist (d.h. ein Gefäß mit einem genügend hohen Elastizitätsmodul und einem genügend hohen Fließpunkt, sddaß die Größe der radialen Verschiebung auf einen fast zu vernachlässigenden Wert herabgesetzt ist, wenn die Temperatur unter 4⁰C erniedrigt wird.) undjdie Temperatur von dem Punkt maximaler Dichte erniedrigt wird, wird ein Druck (als sich'Selbst erzeugender Druck" bezeicluict^, infolge des Bestrebens der Flüssigkeit zur Ausdehnung erzeugt. Das Ergebnis ist, daß der Punkt rascher

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Ausdehnung, "bei welchem Eis gebildet wird ( gewöhnlich bei annähernd O⁰C bei einer Atmosphäre Druck) herabgesetzt wird, bis die auf die Flüssigkeit wirkenden Kräfte und ihre Neigung zur Erreichung den featen Zustands die Druckhemmung überwinden.

Bei dor Vorrichtung gemäß Figur 2 wird eine Zellstruktur z. B. eine Cornea 10 in Buckley-Lösung Λ2 j λ. einer, nicht-ausdehnbaren Gefäß 14 eingetaucht, c3--c, -'χ;.-.--, cLn'V-i becherförmigen Teil 16, dessen öl- ;v:i3 Bud¹.: 16' mit Gewinde versehen ist, und einem Di".'--.}-el£lied. 18 mit entsprechendem Gewinde 18' zusamneng.v-.:,-t:ta"L ist . Vorzugsweise ist eine dichte Innentoleranz -vorgesehen, wenn ein konkaver Mittelteil 19 i?" ί·~η becherförmigen Teil 16 hineinragt. Ein Mutter!,e-pf 20 ist auf dem Deckel 18 konzentrisch aufr,^f^ehweißt. um eine zweckmäßige Stelle zu schaffen, VvO ein Hebel zum Drohen des Deckels relativ zu dem Becher angebracht worden kann. Eine Öffnung -21 ist iij der Fiitte des Deckels angeordnet und kann mittels OJIiGi-. mit.-Gewinde versehenen Stopfens 22 verschlossen wcjQcjj, Diese Öffnung in Verbindung mit der konkaven :Av=3l>ilflunG 19* des Deckelmittelteils gestattet das Entveichen von eingeschlossenen Gasen und von Luft wahrend de;.; anfänglichen Weges des Deckels gegen den Becher, Es ßird Dichtungsringe 23 und 24 vorgesehen, uu einen hermetischen Abschluß zu bewirkender nicht benetzt wird und leicht Autoklavenarbeit ermöglicht.

Bei der vorstehenden Anordnung ist ein unmittelb;rfs Eintauchen des Organs in das Gefäß vorgesehen. Es k.-:.nn sich jedoch als wirtschaftlicher erweisen, einer.« Kunststoffbeutel zu benutzen, der in Figur 2, strichpunktiert, gezeigt ist. \-!erm der Beutel zur Anvc^iäiing n«langt, ist die Flüssigkeit zwischen der Außcntrite des Beutels und cer Innenseite des Behälters

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nur hinsichtlich ihrer Temperatureigenscharten kritisch, und Sterilitätsprobleme werden wesentlich herabgesetzt. In einem solchen Fall würde das Organ vorzugsweise in sterile Gaze eingehüllt, die in Buckley- oder Collins-Lö'sung gesättigt ist (um die Oberfläche des Organs zu schützen), wobei eine minimale Menge von zusätzlicher Lösung in den Beutel eingeführt wird, um eine gleichförmige Druckanwendung zu gestatten. Der Beutel wird dann verschlossen und evakuiert. Wo die Beuteltechnik benutzt wird, kann eine zufriedenstellende

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Eintauchlösung aus destilliertem Wasser gebildet v/erden, das mit 5 % Iodide behandelt ist oder sie kann aus der gleichen inerten verträglichen Lösung bestehen, die unmittelbar das Organ umgibt.

Das Gefäß 14 soll aus einem genügend starken Material gebildet sein, um Innendrücken in der Größenordnung von 1406 bis 2812 kg/cm² (20 000 bis 40 000 p.s.i.) Widerstand zu leisten und soll ausreichend hohe. Spannungs-Dehnungsverhältnisse haben, sodaß während des Gebrauchsdruckbereichs nur eine zu vernachlässigende Ausdehnung oder radiale Verschiebung eintritt. Der Wärmeausdehnungskoeffizient soll andererseits derart sein, daß seine
Wirkung über dem beabsichtigtön Temperaturbereich entweder den Druck erhöht oder durch elastische Deformation infolge Ausdehnung kompensiert wird. Es ist erwünscht, daß das Gefäß auch leicht für autoklavenartige Sterilisation geeignet ist und daß seine Innenflächen mit
den in ihm zu verwendenden Flüssigkeiten nicht benetzt werden.

EinpraktiBch.es Gefäßmaterial ist Nickel, und das
Gefäß kann durch Elektroaufbau auf einen zylindrisch
gestalteten Dorn, der mit Silber oder einem anderen
geeigneten Elektrodenmaterial überzogen und zu einer
Mikrooberflächc poliert sein keini, gebildet- vrordUn. Das Verfahren zur Herstellung eines solchen Gefäßes ist in der Technik bekannt.

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Beispielsweise kann eine frisch, empfangene Cornea 10, die in Bucklqf-Lösung 12 eingetaucht ist, auf eine gleichförmige Temperatur von annähernd 3»9 G (dem Punkt maximaler Dichte ) gebracht werden Der Deckel 18 würde dann aufgeschraubt werden, bis Lösung 12 aus der öffnung 22 austritt. Zu dieser Zeit würde dann der hermetisch abdichtende Stopfen 21 an seine Stelle eingeschraubt sein.. Ein Hebel wird jetzt an die Mutter 20 angesetzt, wodurch, der Mittelabschnitt des Deckels in.die Flüssigkeit gedrückt und dadurch Druck in dem Gefäß angelegt wird. Die Größe des anzulegenden Drucks hängt von der in Betracht gezogenen Lagertemperatur ab. Figur 1 ist eine grafische Darstellung der Vorkomprimierung ( inp.s.i.), die für die Lagerungstemperatur notwendig ist, welche auf der waagrechten Achse angegeben ist . Angenommen, es sei eine Lagerungstemperatur von -1Ü°C vorgesehen, dann hat sich ein Vorkomprimierungs-

druck von 352 kg/cm (5000 p.s.i.) als ausreichend herausgestellt.

Während die Steigung des Gewindes zwischen dem Becherteil und dem Deckel beliebig gewählt werden kann, ist ersichtlich, daß die Gewindetiefe ausreichend sein muß, um den in Betracht kommenden Innendrücken widerstehen zu können. Eine Steigerung von 11 Gewindegängen je engl, Zoll hat sich als geeignet zur Verwendung mit einem Drehmomentschlüssel, der einen Hebelarm von 4-5,7 cm (18 inch) hat, erwiesen. Für die betrachtete Ausführungsform würde dar; in Figur 2 gezeigte Gefäß ein annäherndos Volumen von 0,5 1(1 pint.) haben.

Gev;ansehtenfalls kann ein Druckmeßgerät an der Außenseite des Gefäßes angebracht werden. Es hat sich jedoch iia praktischen' Gebrauch erwiesen, daß Toleranzen

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während der Herstellung genau genug eingehalten v/erden können, sodaß eine Feineinstellungsnurkierung an der Außenseite des Gefäßes die Einstellung des Innendruckes gestattet.

Figur 3 veranschaulicht eine Ausfülirungsweise zur Erzielung der richtigen Temperaturen. Vorzugsweise wird der Behälter gemäß Figur 2 in die Umgebung eines temperaturgeregelten Bades gesetzt, indem eine Flüssigkeit wie ein übliches nicht gefrierendes Mittel mittels einer Pumpe 32 in Umlauf gesetzt wird. Die Temperatur des Bades wird in üblicher Weise mittels der Gefriereinheit 33 j den schematisch dargestellten Kühlschlangen 34-, die zur Entfernung von Wärme aus dem umlaufenden nicht gefrierenden Mitfcel(Gefrier3chutzmd ttel) angeordnet sind, geregelt. Ein Temperaturfühler 35 ist in dem Bad angeordnet^ um seine Temperatur in angemessener V/eise zu regeln.

Bei dem vorstehenden Beispiel wird de Temperatur des : rilßes zuerst so rasch als möglich auf 3,9°C durch seine Einführung in das _{Bad konstanter Temp}eratur gebracht. V/enn genügend Zeit vergangen ist, damit das Gefäß und sein Inhalt eine gleichförmige Temperatur angenommen haben, wird der Kolben der den Mittelteil oder die Untex^seite des Gefäßdeckels ■ umfaßt^ mit der Oberfläche auf die im Gefäß enthaltene Flüssigkeit gebracht. Dann wird das Abschlußglied 21 in die Öffnung,wie beschrieben, eingeschraubt und der Vorkomprimierungsdruck wird angelegt. Der Vorkomprimierungsdruck \·}±τά in geregelter

ο Weise angelegt, vorzugsweise bei etwa 70 kg/cm

( 1000 p.s.i.) oder weniger je Minute, wobei der Druck so linear wie möglich erhöht wird, um Druck— stoße durch die Flüssigkeit zu vermeiden. Dies kann durch eine im wesentlichen konstante Winkelgeschwindigkeit, die dem Gefäßdeckel erteilt wird, bewerkstelligt werden. Es ist gefunden itforden, daß dies in

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stellender Weise innerhalb geeigneter Grenzen von Hand durch einen Drehmomentschlüssel erreicht v/erden kann. Wenn die gewünschte Vorverdichtung erreicht worden ist , wird das Gefäß auf -40°C

, auch in einer geregelten

Badumgebung, gebracht. Dies kann auch das Bad gemäß Figur 3 sein, das veränderlich sein kann,oder es kann gegebenenfalls ein getrenntes Bad vorgesehen sein. Die Temperaturänderung wird \irieder so rasch wie möglich herbeigeführt· Wenn die Cornea zur Verwendung erforderlich ist, wird das Verfahren umgekehrt und die Temperatur wird auf 3»9°C gebracht, wonach die Vorkomprimierung,wieder in einem Ausmaß von vorzugsweise etwa 70 kg/cm (1000 p.s.i.) je Minute, zur Vermeidung von nachteiligen Druckstößen oder -Kleinübergängen, aufgehoben wird.

Wenn die Temperatur auf die Lagertemperatur von -10⁰C gefallen ist, wird der Druck in dem Gefäß "selbsterzeugt^:iDa dieser Druck denjenigen überschreite^ der ein Gefrieren gestatten würde, kann die Lagerung bei dieser Temperatur während einer Zeit stattfinden, die nur durch die Sr-offwechselabfallrate der Zelle begrenzt ist. Obwohl es nicht vollständig verständlich ist, wurde gefunden, daß die Stoffwechselabfallrate (metabolic decay rate) nur von der Lagerungs-^temperatur sondern ebenso von dem Druck abhängt.

V/ährend ferner eine Vorkompriraierung bis zu 843,6 kg/cm ( 12 000 pounds) gewährleistet, dass ein Gefrieren in den meisten Zellen bis -22°C nicht stattfindet, haben Versuche gezeigt, daß, wenn die Lagerung zwischen -15^PC und -20°C stattfinden sollj das Ausmaß der Vorkomprimierung, die in einer Stufe notwendig sein kann, unerwünschte Zellschädigung in einigen Fällen herbeiführen kann.

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Dies kann vermieden v.^rerden, indem man den Druck allmählich oder in Stufen anlegt. In einem solchen Fall j Kenn es s. B. erwünscht ist, -15°C als Lagerungstemper tür zu erreichen, könnte "bei dem oben genannten Beispiel eine zusätzliche Yorkomprimierung von 211 kg/ cm" ( 3000 p.s«.i„) mechanisch bei -10⁰G angewendet

Ep- ist ersichtlich, daß die Linie in Fip;ur 1 nur eine grobe Jiesbimmung von sicheren und unsicheren Bedingungen darstellt. Für Gewebednrstellungen ist z« B. eine gewisse Zellenzerstörung annehmbar·. Dementsprechend kann eine viel nähere Annäherung an die Linie dabei erfolgen, als z. B. bei der Lagerung einer Niere, wobei nur eine minimale Zellenschädigung geduldet werden kann. In dem letzt genannten Fall sollen die Lagerungsbedingungen derart sein, daß die Parameter Bedingungen erzeugen, die gut links von der Linie liegen.

Tabelle H zeigt zufriedenstellende Temperatur- und Druckbereiche für verschiedene Materialien, die gemäß der Erfindung gelagert werden.Sie gibt auch Aufschluß über die Materialien und Flüssigkeiten, in die sie eingetaucht werden.

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	JS	Vorkomprimierung Druck kg p.s.i. cm?	2161	820
	Tabelle II	703 (10,000)
	Flüssigphasenlagerung	281 ( 4,000)	Lager- Temp. ⁰C	Lager- druckjcg p.s.i". es²
Substanz	Flüssigkeit* Umgebung	103 (10,000)	- 15°	1550 (22,050)
Hautgewebe	Macrodex 6 %	703 (10,000)	- 5°	516,7 ( 7,350)
Cornea	Buekley-Lösung	562 ( 8,000)	- 7°	723,38 (10,290)
Knochen	Plasma	562 ( 8,000)	- 7°	725,38 (10,290)
Knochenmark	Plasma	352 ( 5,000)	- 8°	927,96 (13,200)
Niere	Collins-Lösung	281 ( 4,000)	- 8°	927,96 (13,200)
Herz	Collins-Lösung	422 ( 6,000)	- 10°	1054,50 (15,000)
Ganzblut	__ ** Plasma		- 4°	422 ( 6,000)
Plättchen	^-, ** Plasma	- 9°	949,05 (13,500)
Weiße Zellen	Plasma

Organe, wie Nieren, die für Ödeme anfällig sind, werden vorzugsweise in steriler Gaze eingehüllt, die in Collins-Lösung gesättigt ist, und in einen Kunststoffbeutel eingebracht, der verschlossen und evakuiert und in das Gefäß eingebracht wird, welches mit destilliertem Wasser gefüllt ist, das mit 5 % Ioclide behandelt ist.

Dies kann das eigene Plasma sein, das zentrifugiert, auf 4°C gekühlt und filtriert worden ist, um Fibrin und Lipoide zu entfernen,

Kein zusätzliches Plasma erforderlich.

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Bei allen vorstehenden Ausführungen ist angenommen worden, daß die Lagerung in flüssiger Phase — im Gegensatz zu dem in der Beschreibungseinleitung besehriebenen Stand der Technik - stattfinden soll. Es ist gefunden worden, daß die Erfindung auch vorteilhaft dazu angewendet werden kann, eine Lagerung im festen Zustand bei cryogenen Temperaturen zu erreichen,ohne daß die schädlichen Wirkungen auftreten, die zur Zeit beim Gefrieren von Zellstrukturen od. dgl. in Betracht gezogen werden. "Cryogene Temperatur" bezeichnet hier Temperaturen zwischen derjenigen von festem Kohlendioxid (-70⁰C) und der niedrigsten erzielbaren Flüssigkeit, (zur Zeit flüssiges Helium -269°C).

Um den Vorteil einer Lagerung bei solchen niedrigen Temperaturen zu erreichen, bei denen die Stoffweciiselrate oder Geschwindigkeit vernachlässigbar ist, kann, wie gefunden wurde, die Arbeitsweise gemäß der Erfindung ausgenutzt werden, indem Vorteil aus der Unter-Gefrier— temperatur, die schon zuvor,wie vorstehend beschrieben» erhalten wurde, gezogen wird. "Unter-gefrieren"soll in dem vorliegenden Zusammenhang eine Temperatur bezeichnen, bei welcher bei normalem Druck ein Gefrieren stattfinden würde. Es ist zu beachten, daß vorstehend die Verwendung von Vorkomprimierung und selbsterzeugten Drücken zur Erzielung einer Flüssigphasenlagerung beschrieben wurde. Es ist jetzt ersichtlich, daß die Aufhebung eines Teils dieses Druckes gestattet, daß ein Gefrieren stattfindet, d.h. wenn man die zu lagernde Substanz ebenso wie das Medium, in das sie eingetaucht ist, eine gleichförmige Temperatur durch und durch annehmen läßt, (d.h. daß das Gefäß in dem flüssigen Bad während einer ausreichenden Zeitdauer bleibt, sodaß die Temperatur in der Mitte der Bubstanz ähnlich derjenigen an dem Umfang ist) dann erzeugt die Entfernung einer Menge von Druck, die gerade ausreicht, um die flüssige Phase aufrecht zu erhalten, ein gleichförmiges Gefrieren

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durch die ganze Substanz hindurch. Bei dein zuvor "beschriebenen Beispiel wird die Cornea bei --1O⁰C währen aurreichender Zeit gehalten, um die Entwicklung eir-er gj^r j chf öx'mif,en Temperatur zu gestatten (diesen Zoii,-element ist eine Funktion, der Masse und dor Wärmet ri.eigt-ijseh-uf"L;n)»Das Material wird dann gl eicM'örip.i

in die feste Phase umgewandelt, indem einfach etv.',?. ⁷y_y γ.γ,/:χΤ (V*; p.c.i.) Druck entfernt wa-öca. Dug Aücnoß tlc " Dr;i"]")li! Us ist variabel in Abhängigkeit von den Ei;'' i!')Ci!';f1en^'S in Betracht kommenden Gov/ebes und des V.'f ·■ ts der¹ latenten V/äriae beim Gefrieren oiner gegebenen Mi^ se. Die Lagerung kann dann b^i cryogonon Temperaturen boi oder unter dem neuen Druck stattfinden.

hr- 3 st errichtlicli, daß die Erreichung von gleich-%ti\tj.j■ <;.. , ßieichförnii_i3or Gefriorung durch die /.rbcitsvrise gcriäß der Erfindung erzielt worden ist, ohne daß die Notwendigkeit sehr kleiner Kügelchen gegeben ist, welche bisher für die x-eschen Gefrierarbeitsweisen erforderlich waren.und daß sie auch ohne die schädlichen Wirkungen einer isotherm durch die Substanz, fortschreitende Gefrierfront erhalten worden ist·

Vähi-end "Schnellgefrieren" (snap-freezing) durch Druckentfernung bei Temperaturen unter O C bisher bekannt geworden ist, ist es niemals mit Erfolg auf lebende oder lebensfähige Zellen angewendet worden· Der Mangel an Erfolg ist unmittelbar der Art und Weise der Druckanlegung , ..um Temperaturen unter.Null in flüssiger Phase zu erreichen, ebenso wie dem Ausmaß der Druckherabsetzung und der Gasdruckumgebung zuzuschreiben.

Während bisher die Erläuterung der Gefriertechnik nur kurz erfolgt ist, ist dies keine Herabsetzung ihrer Wichtigkeit. Die Erläuterung zeigt lediglich die universelle Einfachheit der Erfindung. Wenn rtio Temperatur- und Druckregolungen.wie beschrieben, in einum solchen Ausmaß erteilt werden, daß "Unter~Gefrierungs" Temperaturen bei lebenden Zellen in einer

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flüssigen Umgebung erreicht werden, dann kann eine Gefrierumgebung durch Aufhebung, von Druck erzielt werden. Druckentfernung oder-.aufhebung kann durch Drehung des Deckels entgegengesetzt der Richtung , welche Druck erteilt hat, erreicht werden. Gegebenenfalls kann auch, wenn sämtliche Parameter hinsichtlich der gewünschten Temperatur und des gewünschten Drucks für die Substanz und die sie umgebende Flüssigkeit festgelegt worden sind, eine Druckentlastung^ (Dekompression) entweder durch eine Nockenanordnung, welche gestattet, daß ein Kolben in einer Kammer ( im Innern des Deckels) in einem spezifischen Ausmaß emporsteigt, um die genaue gewünschte Druckentlastung zu ergeben oder durch Ausnutzung der Austrittsöffnung 22 erfolgen. Im letzt genannten Fall, muß die Öffnung eine solche Größe haben, daß eine vorbestimmte Anzahl von Drehungen bei dem Verschlußstopfen 21 gestattet, daß der Druck in dem gewünschten Ausmaß aufgehoben wird,ohne daß dadurch die strukturelle Unversehrtheit des Deckels gestört \tfird.

Wenn eine Festjhasenlagerung in der vorstehend beschriebenen Weise bewerkstelligt worden ist, kann die Gefrierflüssigkeit aus dem Bad entfernt werden^und es kann flüssiger Stickstoff durch irgend welche üblichen Mittel, wie dies in Figur 3 gezeigt ist, eingeführt werden. Gegebenenfalls kann ein getrenntes Stickstoffbad zur Anwendung gelangen.

Die TabelleHI zeigt zufriedenstellende Temperatur und Druckparameter für die erste Stufe und Druckentlaatungs-oder Dekompressionsbereiche für verschiedene Materialien, die gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung gelagert werden. Die TabelleHI gibt ferner

Medien an, in welche -verschiedene· Materialien eingetaucht werden können.

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	Flüssigkeit Umgebung	Tabelle III	•ung	2	161820
	Kacrodex 6 %		Anfangstemp.
	Buckley-Lösung	F'e s tpha s enlager	- 15°	Nachkomprimierung Druck kg/cm²	Endgültige Lagerung
Substanz	Plasma	Anfangsdruck kg/cm2 ρ.s.i.	- 5°	1472,78 (2o,950)	- 196⁰C
Kautgewebe	Plasma	1550 (22,050)	- 7°	478,04 ( 6,800)	- 196°
Cornea	Collins-Lösung	516.7 ( 7,350)	- 7°	667,85 ( 9,500)	- 196°
Knochen	Collins-Lösung	723,38 (10,290)	8°	667,85 ( 9,500)	- 196°
Knochenmark	Pia sma	723.38 (10,290)		892,81 (12,700)	- 196°
Niere	Plasma	927,96 (13,200)	- 10°	892,81 (12,700)	- 196°
Herz	M-Hr Plasma	927,96 (13,200)	- 4°	998,26 (14,200)	- 196° 1
Ganzblut	1054.50 (15,000)	- 9°	386,65 ( 5,500)	- 196° N. I
Plättchen	422 ( 6,000)	899,89 (12,800)
Weiße Zellen	949,05 (13,500)

Organe, wie Nieren, die für Ödeme anfällig sind, v/erden vorzugsweise in steriler Gaze eingehüllt, die in Collins-Lösung gesättigt ist und in einen Kunststoffbeutel eingebracht, der verschlossen und evakuiert, und in das Gefäß eingebracht wird, welches mit destilliertem Wasser gefüllt ist, das mit 5 % Iodide behandelt ist.

**Dies kann das eigene Plasma sein, das zentrifugiert, auf 4°C gekühlt und filtriert worden ist, um Fibrin und Lipoide zu entfernen.

Kein zusätzliches Plasma erforderlich.

Claims

1. Verfahren zur Lagerung von biologischen Substanzen, insbesondere von Zeil- und zellartigen Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man die biologische Substanz auf einen Druck über Atmosphärendruck mit einer Geschwindigkeit, die genügend langsam ist, um schädigende Druckstöße oder -ausgleichsvorgänge zu vermeiden, und bei einer Temperatur über ihrem Gefrierpunkt vorkomprimiert, wobei der Vorkomprimierungsdruck von einer vorbestimmten niedrigeren Temperatur, die während des Verfahrens erreicht werden soll, abhängig ist, und die Temperatur der biologischen Substanz und eines Mediums auf die genannte niedrigere Temperatur herabsetzt, während sein Volumen im wesentlichen konstant gehalten wird, wobei die niedrigere Temperatur über derjenigen,, die ein Gefrieren der biologischen Substanz

und des Mediums bei dem dadurch erzeugten Druck gestatten oder

würde_?und bei /unter der normalen Gefriertemperatur des Mediums τ ad der biologischen Substanz bei Atmosphären— Cu „ok liegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man . ' · die biologische Substanz und das Medium in Stufen nach der genannten anfänglichenVorkomprimierungsstufe bei abnehmenden vorbestimmten Temperaturen weiter vorkomprimiert·

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Vprkomprimierung die biologische Substanz in ein druckübertragendes flüssiges Medium taucht, wobei der Vorkomprimierungsdruck auf die Substanz durch dieses Medium angelegt wird.

4·. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 y dadurch gekennzeichnet, daß der Druck und die Lagerungstemperatur gemäß der Kurve von Figur 1 und ihrer linken Fläche bestimmt v/erden.

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5· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch

gekennzeichnet, daß der Vorkomprimierungsdruclc bis zu

etwa 84-3,6 kg/cm beträgt und die niedrigere Temperatur niedriger als O⁰C und höher als -22°C ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die biologische Substanz in ein Gefäß eintaucht, das ein druckübertragendes flüssiges Medium enthält, wobei das Gefäß die Fähigkeit hat, den zu erzeugenden Innendrücken und dem während des Verfahrens auszuführenden Temperaturänderungen im wesentlichen ohne Änderung des Volumens zu widerstehen, daß man das Medium und die eingetauchte Substanz in dem Gefäß auf einen Druck über Atmosphärendruck mit einer Geschwindigkeit, die genügend langsam ist um schädigende Druckstöße oder -Ausgledclrvorgänge zu vermeiden,und bei einer Temperatur über ihrem Gefrierpunkt vorkomprimiert und die Temperatur des Gefäßes und seines Inhalts auf eine Temperatur unter O⁰C und über -22°C herabsetzt.

7. Vorrichtung zur Lagerung von biologischen Substanzen, gekennzeichnet durch eine Gefäßeinrichtung zum Vorkomprimieren der biologischen Substanz mit einer Geschwindigkeit, die genügend niedrig ist, um schädigende Druckstöße oiler- Ausglechsvorgänge zu vermeiden, wobei die Einrichtung ein Gefäß einschließt, das fähig ist,

einem ausgewählten Innendruck von wenigstens ¹JO,3 kg/cm im wesentlichen ohne Änderung des Volumens zu widerätehen, und eine Einrichtung zum Kühlen der Gefäßeinrichtung auf eine ausgewählte Temperatur zwischen 4°C und -22°C,

8. Vorrichtung nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß die Gefäßeinrichtung ein isotonisch inerte·;,verträgliches Medium einschließt.

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9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine . Einrichtung zur Druckentlastung der biologischen Substanzen bei einer Temperatur unter O⁰C^die ausreicht, um ein gleichförmiges Gefrieren der Substanz und des Mediums zu gestatten, und eine Einrichtung zum Kühlen der Gefäßeinrichtung auf cryogene Temperaturen umfaßt.

10· Vorrichtung nach Anspruch 7? dadurch gekennzeichnet daß die Kühleinrichtung ein geregeltes Temperaturbad umfaßt.

11. Vorriöhtung nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Kühlen der Gefaßeinriclitung auf erlogene Temperaturen eine Zufuhr von Flüssiggas "umfasst·

12. Verfahren zur Lagerung von biologischen Bubstanzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die biologische Substanz bei der niedrigeren Temperatur während einer Zeit lagert, die ausreicht, daß sie

das Temperaturgloichgewicht erreicht, die biologische Substanz und das Medium bei der genannten niedrigeren Temperatur in einem Ausmaß druckentlastet, daß gerade ausreicht, um ein gleichförmiges Gefrieren der biologischen Substanz zu gestatten.

13· Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Gefrierstufe die Temperatur der biologischen Substanz auf eine cryogene Temperatur erniedrigt und die biologische Substanz bei dieser Tem peratur lagert.

14. Verfahren gemäß Anspruch J, dadurch gekennzeichnet, daß man die biologische Substanz und das Medium bei der genannten niedrigeren Temperatur während einer Zeit lagert,die ausreicht, um sie das Temperaturgleichgewicht erreichen zu lassen_}und den Druck auf die biologische Substanz und das Medium bei der niedrigeren Temperatur in einem Ausmaß entlastet, daß gerade

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ausreicht, um ein vollständiges Gefrieren der biologischen Substanz und des Mediums zu gestatten.

15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet j daß man nach .der Gefrierstufe die Temperatur der biologischen Substanz und des Mediums auf cryogene Temperaturen herabsetzt und die biologische Substanz und das Medium bei diesen Temperaturen lagert.

16. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die druckübertragende Flüssigkeit aus einem isotonisch inertenxjndverträglichen Medium besteht.

17· Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Eintauchstufe zunächst ein Einschließen der biologischen Substanz und eines isotonisch inerten und verträglichen Mediums in einem Kunststoffbeutel und danach ein Eintauchen des Beutels in dem druckübertragenden flüssigen Medium umfaßt.

18. Verfahren nach Anspruch 17» dadurch gekennzeichnet, daß man die biologische Substanz in einer sterilen Gaze einhüllt, die in einem isotonisch inerten und verträglichen Medium gesättigt ist.

19· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die druckübertragende Flüssigkeit aus einem isotonisch inerten und verträglichen Medium besteht.

20. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Eintauchstufe zunächst ein Einschließen derbiologischen Substanz und eines isotonisch inerten und verträglichen Mediums in einem Kunststoffbeutel und danach ein Eintauchen des Beutels in einem druckübertragenden flüssigen Medium umfaßt.

21. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß äie einenKunsstoffbeutel, welcher die biologische Substanz und ein isotonisch inertes und verträgliches Medium einschließt und ein den Beutel umgebendes druckübertragendes flüssiges Medium umfaßt.

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