DE69633854T2

DE69633854T2 - Verfahren und verpackung zur erhaltung und lagerung von kultivierten gewebeäquivalenten bei tieftemperaturen

Info

Publication number: DE69633854T2
Application number: DE69633854T
Authority: DE
Inventors: R. Stephen WATSON; Mehmet Toner; G. Alexander TSCHUMAKOW
Original assignee: Organogenesis Inc
Current assignee: Organogenesis Inc
Priority date: 1995-01-30
Filing date: 1996-01-30
Publication date: 2005-10-20
Anticipated expiration: 2016-01-31
Also published as: ATE376356T1; ES2231804T3; AU4908296A; WO1996024018A1; FI972563A; PL321089A1; RU2178865C2; KR100328742B1; ATE282805T1; JP2006325598A; CN1292651C; PT807234E; NO310491B1; CN1589622A; SG106553A1; JPH11501298A; NZ302913A; DE69637301D1; PL181762B1; CN1119599C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Kältekonservierung sowohl von geerntetem Gewebe als auch kultivierten Gewebeäquivalenten, die unter Anwendung von In-Vitro-Technologie erzeugt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Kältekonservierungs-Verpackungsanordnung sowohl für geerntetes Gewebe als auch kultivierte Gewebeäquivalente, das sowohl eine kosteneffiziente als auch leicht zu handhabende Verpackungsanordnung ist, welche eine maximale Lebensfähigkeit des Gewebes oder des Gewebeäquivalenten ermöglicht, die kältekonserviert werden sollen. Mit Hilfe der Kältekonservierungstechnologie können entweder kältekonserviertes geerntetes Gewebe oder kältekonserviertes kultiviertes Gewebe über unbestimmte Zeiträume vor ihrer Verwendung gelagert werden. Das kultivierte Gewebe ist ein In-Vitro-Modell des äquivalenten menschlichen Gewebes, welches, wenn es aus dem Lager entnommen wird, für Transplantation oder Implantation, in vivo, oder für Screening-Verbindungen in vitro verwendet werden kann.
2. Kurze Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung
Mit der In-Vitro-Technologie wurden Gewebeäquivalente zum Zwecke des In-Vitro-Testens oder der In-Vivo-Verpflanzung zur Wundversorgung entwickelt. Verfahren zur Herstellung dieser Gewebeäquivalente sind in den US-Patentschriften Nr. 4,485,096, 4,604,346, 4,835,102 und 5,374,515 und in EP-A-0418035 und WO 94/10940 offenbart.
Die Haltbarkeit von Lebendgeweben ist beschränkt, und infolgedessen ist ihr Verwendungsfenster kurz, was zu einer großen Menge an Abfall führt. Es besteht ein Bedarf daran, solche Gewebe über längere Zeiträume, beispielsweise für Zeiträume während des Versendens und Lagerns, zu konservieren, bevor diese Gewebe verwendet werden. Sowohl die Entwicklung eines Kältekonservierungsverfahrens als auch einer Verpackung zur Kältekonservierung und Lagerung würden das Verwendungsfenster unbegrenzt verlängern, den Versand erleichtern und die Führung eines Inventars ermöglichen. Die Ermöglichung eines Gewebeinventars in Zentren zur Behandlung von Verbrennungsopfern und Krankenhäusern ist ebenso wünschenswert. Andere Vorteile liegen darin, dass Proben aus verschiedenen Phasen des Herstellungszyklus für Qualitätskontrollarchive einbehalten und größere Produktionschargen hergestellt werden können, da sich diese in einem gefrorenen Zustand aufbewahren lassen.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt wird die Lagerzeit von zellulären biologischen Materialien durch Abkühlen auf „kältekonservierende" Temperaturen verlängert. Der Übergang vom Flüssigzustand in den Festzustand durch Herabsenken der Temperatur des Systems kann entweder als Kristallisierung (Eis), wobei eine ordnungsmäßige Anordnung von Wassermolekülen durchgeführt wird, oder als Vitrifikation oder Amorphisierung (Glasbildung) in Abwesenheit einer solchen ordnungsmäßigen Anordnung von kristalliner Phase erfolgen. Die Herausforderung für einen Kryobiologen besteht darin, Zellen auf kältekonservierende Temperaturen zu bringen und diese dann auf physiologische Bedingungen zurückzuführen, ohne sie zu beschädigen.
Es gibt zwei grundsätzliche Ansätze in Bezug auf die Kältekonservierung von Zellen und Geweben: Gefrierauftauen und Vitrifikation. Bei den Gefrierauftautechniken wird die extrazelluläre Lösung gefroren (z. B. in kristalliner Form), wobei jedoch Maßnahmen ergriffen werden, um die intrazelluläre Eisbildung zu minimieren. Bei Vitrifikationsverfahren wird versucht, die Eisbildung während der gesamten Probe hindurch zu verhindern. Der frühere Ansatz ist insofern problematisch, als für den Fall, dass Eiskristalle innerhalb der Zellen gebildet werden, sich diese beim Auftauen nachteilig auf die Zelllebensfähigkeit auswirken. Dennoch könnten Zellen einen Gefrier-Auftau-Zyklus überleben, wenn sie mit kontrollierten Raten in der Gegenwart von nicht-toxischen Gehalten an Kälteschutzmitteln abgekühlt werden. Letzterer Ansatz bei der Vitrifikation versucht, die potentiell schädlichen Auswirkungen von intra- und extrazellulärem Eis durch Vermindern der Eisbildung unter Verwendung von sehr hohen Konzentrationen an gelösten Stoffen und/oder Polymeren zu vermeiden. Bei langem Ausgesetztsein gegenüber toxischen Gehalten dieser Zusatzstoffe, die für die Vitrifikation erforderlich sind, kann es jedoch zu einer Zellschädigung kommen.
Kälteschutzmittel schützen Lebendzellen vor den Belastungen, die sich im Rahmen des Gefrierverfahrens ergeben. Eine Art, in der Kälteschutzmittel Zellen schützen, besteht darin, dass das Salz verdünnt wird, das in der ungefrorenen Lösung immer konzentrierter wird, während Wasser zu Eis umgewandelt wird. Die Menge an Eis wird durch die Temperatur und die anfängliche Zusammensetzung der Lösung bestimmt, während die Menge an ungefrorenem Anteil nur eine Funktion der Temperatur ist. Kälteschutzmittel weisen mehrere andere Funktionen auf. Eine wichtige Funktion besteht darin, dass sie für gewöhnlich die Temperaturen der intrazellulären Eisbildung reduzieren. Eine weitere Funktion besteht darin, dass sie Membranen und Proteine stabilisieren.
Alle Lösungen werden unter ihren Gefrierpunkt supergekühlt, bis sie eine zufällige Keimbildungsstelle für die Kristallbildung gefunden haben. Bei einer Kältekonservierung durch ein Gefrier-Auftau-Verfahren sollte die Eisbildung in dem extrazellulären Medium bewusst durch Impfen bei niedrigen Graden des Superkühlens initiiert werden. Wenn die Eisbildung nicht durch Impfen herbeigeführt wird, wird sich das Eis spontan bilden, wenn die Lösung ausreichend weit unter ihrem Gleichgewichtsgefrierpunkt abgekühlt wird. Da dieses Verfahren von Natur aus zufällig ist, erfolgt die Eisbildung bei zufälligen, unvorhersehbaren Temperaturen; infolgedessen unterliegen die Überlebensraten zwischen wiederholten Versuchen mit demselben Gefrierprotokoll starken Schwankungen. Ferner kann die extrem schnelle Kristallisierung, zu der es kommt, wenn sich Eis in einer stark supergekühlten Lösung bildet, bei den Zellen und Geweben Schäden anrichten. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass – wenn extrazelluläre Eisbildung bei hohen Graden des Superkühlens initiiert wird – die Wahrscheinlichkeit von intrazellulärer Eisbildung drastisch zunimmt. Dieses Phänomen ergibt sich aus dem verzögerten Beginn der gefrierinduzierten Zelldehydrierung, was zu vermehrter Rückhaltung von intrazellulären Wasser und somit zu einer höheren Wahrscheinlichkeit der Eisbildung in der Zelle führt.
Sobald das extrazelluläre Eis geimpft ist und die Probe von der Eisphase umgeben ist, ist es notwendig, die Probe auf einen kältegefrorenen Zustand abzukühlen. Der Kühlschritt ist einer der kritischsten Schritte in einem Gefrier-Auftau-Protokoll. Aufgrund der Bildung von Eis, d. h. reinem Wasser, ist die teilweise gefrorene extrazelluläre Lösung konzentrierter als das intrazelluläre Kompartiment. Infolgedessen wird die Zelle dehydrieren, indem sie Wasser verliert, in dem Versuch, das thermodynamische Gleichgewicht wiederherzustellen. Während das System abkühlt, wird mehr extrazelluläres Eis erzeugt und die Konzentration an gelösten Stoffen steigt und zwingt die Zellen, weiter zu dehydrieren. Es gibt drei Eigenschaften der Zellen, welche ihre Dehydrierungsrate regeln. Eine ist die Zellmembran-Wasserdurchlässigkeit; je geringer die Wasserdurchlässigkeit, desto länger brauchen die Zellen, um zu dehydrieren. Eine weitere Eigenschaft ist die Temperaturabhängigkeit von der Zellmembran-Wasserdurchlässigkeit; alle Zellen verringern ihre Wasserdurchlässigkeit mit abnehmenden Temperaturen. Die letzte Eigenschaft ist die Zellgröße; größere Zellen brauchen länger, um zu dehydrieren als kleinere. Angesichts des Umstandes, dass jeder Zelltyp deutlich unterschiedliche Eigenschaften aufweisen kann, können die optimalen Kältekonservierungsbedingungen um Größenordnungen für verschiedene Zelltypen variieren.
Obwohl die genauen Mechanismen der Zellschädigung während der Kältekonservierung noch nicht vollständig geklärt wurden, scheinen charakteristische Überlebenssignaturen, die durch Messen des Zellüberlebens als eine Funktion der Kühlrate erzeugt wurden, qualitativ für alle Zelltypen ähnlich zu sein und zeigen eine umgekehrte U-förmige Kurve. Das Zellüberleben ist bei sehr langsamen und sehr schnellen Kühlraten gering, und es gibt eine dazwischen liegende Kühlrate, die optimales Überleben erzielt. Obwohl die optimale Kühlrate und die Breite der Kurve drastisch für verschiedene Zelltypen variieren können, scheint das qualitative Verhalten universell zu sein. Schnellere Kühlraten geben den Zellen nicht genügend Zeit, um zu dehydrieren, und Zellen bilden Eis intern. Die Zellverletzung bei schnellen Kühlraten wird intrazellulärer Eisbildung zugeschrieben. Bei langsamen Kühlraten nimmt man an, dass die Zellverletzung auf die Auswirkungen des Ausgesetztseins gegenüber hoch konzentrierten intra- und extrazellulären Salz- und Kälteschutzmittellösungen oder auf die mechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen und dem extrazellulären Eis zurückzuführen ist.
Es ist notwendig, die Zellen so weit wie möglich zu dehydrieren, bevor sie die intrazelluläre Eiskeimbildungskurve kreuzen. Es ist an diesem Punkt, wo praktisch das gesamte Wasser, das in den Zellen verbleibt, keimbildend wirkt und Eis bildet. Es ist nicht praktikabel, die genaue Temperatur zu bestimmen, bei der dies geschieht, aber sie liegt bei ungefähr –40°C bis –50°C, wenn die Zellen langsam in Gegenwart von 1 M bis 2 M Konzentrationen von Kälteschutzmitteln gefroren werden. Es ist wichtig, festzuhalten, dass die Menge an Wasser, die innerhalb einer Zelle an diesem Punkt zu Eis wird, nicht schädlich ist, wenn sie gefroren ist, aber wenn sie schnell genug aufgetaut wird, wird sie sich ausbreiten und die Zelle beim Auftauen töten (The Biophysics of Organ Cryopreservation. Seite 117–140, herausgegeben von David E. Pegg und Armand M. Karow, Nr., NATO ASI Series A: Life Sciences, Band 147, 1987 Plenum Press, New York, 233 Spring St., New York, NY 10013).
Vor der Entwicklung von kommerziell nutzbarem Hautäquivalent wurde Leichenhaut für die Zwecke der Verpflanzung verwendet. Kältekonservierungsprotokolle wurden entwickelt, so dass Zentren zur Behandlung von Verbrennungsopfern und Krankenhäuser Hautbanken führen konnten. Eine Reihe von unterschiedlichen Protokollen wurden unter Verwendung verschiedener Kälteschutzmittel, Gefrierraten, Verpackungsformate und Lagerbedingungen entwickelt. Die meisten Forscher einigten sich auf ein schnelles Auftauprotokoll. Der Erfolg oder das Scheitern des Protokolls wurde entweder durch eine Transplantatannahme bei einem Wundbett oder durch einen Zell-Lebensfähigkeitstest gemessen.
In der US-Patentschrift 3,842,831 an Beisang wird ein Verfahren zur Kältekonservierung von Leichen-Hautteilen offenbart. Dieses Verfahren schließt das Anbringen der Leichenhaut an einem lose gewobenen Mull oder Trägergewebe ein, wobei die Hautteile und der Mull gemeinsam vor dem Gefrieren gewalzt werden. Es wird kein Kälteschutzmittel verwendet, obwohl die Erfinder die Verwendung von Glycerin oder DMSO vorschlagen. Das Gefrierprotokoll verwendet ein Protokoll mit schneller unkontrollierter (mit feststehender Temperatur) Gefrierrate bei einer kältekonservierenden Temperatur von –70°C.
May SR und FA DeClement (Skin Banking Methodology, 17, 33–45 (1980)) haben eine Bewertung der Verpackungsgeometrie und der Kühl- und Erwärmungsraten unter Verwendung von dermatomer Leichenhaut durchgeführt. Die Ergebnisse ließen den Schluss zu, dass Leichenhaut flach, anstatt gerollt, sein und dass eine geringe kontrollierte Gefrierrate verwendet werden sollte.
Die Patentschrift U.S. 5,040,677 an Tubo offenbart einen gasdichten versiegelbaren Behälter für einzelne Transplantate von Epithelzellblättern. Der Behälter erfordert, dass das Epithelzellblatt an einer haftenden Substratschicht oder einem Trägergewebe durch Verwendung von Klemmen befestigt wird.
Die US-Patentschrift 5,145,770 an Tubo offenbart ein Kältekonservierungsverfahren für Keratinocytenblättern, welches ein Kälteschutzmittel eines nicht zellendurchdringenden Mittels, wie Dextran, und eines zelldurchdringenden Reagens, wie Glycerol, verwendet, mit einer Kühlrate von ungefähr –1°C/Minute. Ähnlich offenbart EP 0 364 306 an Chao et al. ein Verfahren zum Kältekonservieren eines Blattes von lebenden, kultivierten Epithelzellen, aber unter Verwendung von DMSO und Glycerol als Kälteschutzmittel und eines Gefrierprotokolls von vorzugsweise –1°C/Minute.
Die US-Patentschrift 5,298,417 an Cancedda et al. offenbart ein Kältekonservierungsprotokoll, das für einschichtige Konstrukte, wie Epithelblätter, entwickelt wurde, die wie in US 4,016,036 , 4,304,866 und 4,456,687 beschrieben hergestellt werden. Epidermale Blätter wurden mit einem Kälteschutzmittel von entweder 8 bis 15% Glycerol oder DMSO inkubiert und durch Verwendung eines Protokolls mit kontrollierter Rate kältekonserviert, wobei die Kühlrate am Beginn langsamer als am Ende des Protokolls und durch einen Temperaturanstieg vor dem Höhepunkt des Gefrierverfahrens gekennzeichnet ist.
Ein Verfahren zur Kältekonservierung von dermalen Fibroblasten in einem Collagen-Gel wurde von Teasdale et al., Burns, 19 (5) 406–410 (1993) untersucht. Teasdale bestimmte, dass die optimale Zelllebensfähigkeit durch Gefrieren bei –0,5°C/Minute bei Verwendung von DMSO als Kälteschutzmittel erzielt werden konnte.
Nanchahal et al., „Cultured composite skin grafts: Biological skin equivalents permitting massive expansion", The Lancet, 2 (8565), 191–193 (22. Juli 1989), bespricht eine Technik zur Lagerung von kultivierten Verbundgewebetransplantaten unter Verwendung eines Kälteschutzmittels aus 15% Glycerol und 10% FCS in Medium 199. Die Transplantate und das Kälteschutzmittel wurden zwei Stunden lang bei 37°C inkubiert und danach bei –1°C pro Minute auf –70°C gefroren und im Anschluss daran in Flüssigstickstoff gelagert. Nach einem Schnellauftauen der Transplantate wurde ihre Lebensfähigkeit durch zweiwöchiges Kultivieren und durch Verpflanzen auf haarlose Mäuse bestimmt. Eine endgültige Bewertung erfolgte durch Verpflanzung auf drei Patienten, die sich der Entfernung von Tätowierungen unterzogen hatten.
Johnstone et al. „Cryopreservation of Rabbit and Cat Corneas at –18 to –24°C", Cornea, 11(3): 211–220 (1992), behandelt ein einfaches Verfahren zur Kältekonservierung von Kaninchen- und Katzenhornhaut, bei dem ein Haushaltsgefriergerät anstatt Flüssigstickstoff oder Gefriergeräte mit sehr niedrigen Temperaturen verwendet werden. Die Perfusion des Kältekonservierungsmittels wird erhalten, indem die Hornhäute in aufeinander folgenden Lösungen von 50% fötalem Kalbsserum und McCarey-Kaufman-Medium mit zunehmendem Glycerol- und Glucose-Gehalt angeordnet werden.
US 5,131,850 offenbart ein Verfahren zur Kältekonservierung von Skelettmuskulaturgeweben durch Anordnen solchen Gewebes in Kontakt mit einer Zusammensetzung, die ein Kältekonservierungsmittel enthält, das einen zelldurchdringenden organischen gelösten Stoff aufweist, der vorzugsweise Dimethylsulfoxid ist, und ein Glycosaminoglycan, das vorzugsweise Chondroitinsulfat ist, in einer Menge, die ausreichend ist, um eine Kältekonservierung des Skelettmuskelgewebes durchzuführen. Die Zugabe von Glycosaminoglycan zu einem kältekonservierenden Mittel, das einen zelldurchdringenden organischen gelösten Stoff aufweist, ermöglicht die Verwendung einer großen Bandbreite an Kühlraten. Die Kältekonservierung wird vorzugsweise innerhalb von 20 bis 60 Minuten nach der Zugabe des kältekonservierenden Mittels initiiert. Der Wechsel von Wasser zu Eisphase wird bei –2°C bis –6°C durch ein Bersten von Flüssigstickstoff, sterilem Eiskristall oder durch Vibration initiiert. Ferner werden ein Gefrierplan, der so gestaltet ist, dass er die Aufrechterhaltung von Zellgewebelebensfähigkeit und von biomechanischen Eigenschaften während des und nach dem Gefrierverfahren maximiert, und ein Auftauplan offenbart, der die Zelllebensfähigkeit maximiert.
US 5,298,417 beschreibt ein Verfahren zum Konservieren von kultivierten epidermalen Blättern durch Inkubieren der Blätter bei Raumtemperatur in Medien mit einem Glycerol- oder Dimethylsulfoxid-Kältekonservierungsmittel über einen vorbestimmten Zeitraum und anschließendes Gefrieren der kultivierten Blätter. Der Kühlgradient ist durch eine geringe Anfangskühlrate, gefolgt von einer höheren Kühlrate, gekennzeichnet. Das Beispiel beschreibt Taschen, die Gewebestücke enthalten, die thermisch versiegelt sind und bei Raumtemperatur zwischen 5 bis 7 Minuten inkubiert werden. Die Taschen werden in einen geeigneten Behälter gegeben und in eine programmierbare Gefriervorrichtung transferiert. Die Gewebestücke werden danach unter Verwendung eines Gefrierprogramms gefroren. Die Taschen, welche die gefrorenen Epithelblätter enthalten, werden bei einer Temperatur von –80°C gelagert.
Unter Verwendung von Verfahren des bekannten Stands der Technik ist es nicht möglich, eine Kältekonservierung von kultivierten Gewebeäquivalenten durchzuführen, teilweise weil sie relativ dick sind und heterogene Zellschichten aufweisen. Eine der Funktionen dieser Gewebe in vivo besteht darin, eine Durchlässigkeitsbarriere bereitzustellen. Gewebefunktionen müssen bei der Entwicklung eines Kältekonservierungsprotokolls berücksichtigt werden.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ein Verfahren zur Kältekonservierung, und insbesondere eine Verpackungsanordnung, entdeckt, das auf eine Reihe von kultivierten Gewebeäquivalenten und auf Säugetierhaut anwendbar ist, eines, das eine überraschend effektive und kommerziell praktische Verpackung für die Kältekonservierung von kultivierten Gewebeäquivalenten ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur erfolgreichen Kältekonservierung von kultivierten Gewebeäquivalenten bei sehr niedrigen Temperaturen bereit, welches die Bildung von schädlichen intrazellulären Eiskristallen verhindert, eine effektive Konzentration an potentiell schädlichen Chemikalien minimiert und das schnelle Einführen und Entfernen von Kälteschutzmitteln bei machbaren Temperaturen unter Verwendung einer programmierbaren Gefrierausrüstung ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine neue Verpackungsanordnung bereit, die für die Kältekonservierung, die Lagerung und Verteilung von kultivierten Gewebeäquivalenten entwickelt wurde. Die neue Anordnung bietet im Vergleich zu bestehenden Verpackungsanordnungen sehr viele Vorteile. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt gibt es keine im Handel erhältlichen kältekonservierten kultivierten Gewebeäquivalente, daher sind keine serienmäßigen Verpackungsanordnungen verfügbar. Das Design der neuen Verpackung ermöglicht eine bessere Temperaturverfolgung des Verpackungsinneren mit der Außentemperatur der Gefrierkammer aufgrund einer effizienteren Wärmeübertragung. Eine verbesserte Wärmeübertragungsrate ermöglicht einen kontrollierteren Prozess, somit einheitliche Kühl- und Erwärmungsraten des kultivierten Gewebeäquivalents, wodurch die Schwankung bei der Zelllebensfähigkeit reduziert wird.
Die Erfinder haben ein Verfahren zur Kältekonservierung von kultivierten Gewebeäquivalenten hergestellt aus In-Vitro-Techniken entdeckt, so dass die Gewebe ihre Lebensfähigkeit und Nützlichkeit als Äquivalente von menschlichen Geweben beibehalten. Die Erfindung schließt die Anwendung von Schütteln ein, um das Durchdringen einer effektiven Menge von Kälteschutzmittel zu verstärken. Das vorliegende Verfahren stellt die Kältekonservierung von geerntetem Gewebe und kultivierten Gewebeäquivalenten in einer Weise bereit, welche die strukturelle Integrität und die zelluläre Lebensfähigkeit schützt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung schließt folgende Schritte ein:

1) Das geerntete Gewebe oder das kultivierte Gewebeäquivalent werden in eine Kälteschutzmittellösung eingetaucht, und die Kälteschutzmittellösung und das eingetauchte Gewebe werden geschüttelt, um ein effektives Eindringen der Kälteschutzmittellösung in das Gewebe (Perfusion des Gewebes) zu erreichen, und
2) nach der Perfusion der Kälteschutzmittellösung in das Gewebe, Abkühlen auf einen Fest-Flüssigphasen-Gleichgewichtstemperaturbereich für das Kälteschutzmittel, Impfen von extrazellulärem Eis und Abkühlen auf einen kältekonservierten Zustand durch Gefrieren des Gewebes mit einer niedrigen Gefrierrate auf eine Temperatur bei etwa oder tiefer als mindestens –70°C, bevorzugter bei oder tiefer als –120°C, noch bevorzugter bei –140°C und am bevorzugtesten bei –196°C.

Sobald es gefroren ist, kann das kältekonservierte Gewebe über unbestimmte Zeiträume hinweg zwischen Temperaturen von ungefähr –120°C bis ungefähr –196°C, der Temperatur von Flüssigstickstoff gelagert werden.
Das Auftauen des kältekonservierten Gewebes erfolgt durch Wärmen des gefrorenen Gewebes mit einer hohen Rate, was in ungefähr 1 bis 2 Minuten erfolgt. Das gefrorene Gewebe kann durch direktes Ausbringen von erwärmtem Kulturmedium oder durch eine physiologisch gepufferte Lösung oder durch ein anderes schnelles Erhitzungsverfahren aufgetaut werden. Die Verpackungsanordnung ermöglicht ein Auftauen des Gewebes durch Eintauchen der Verpackung in ein Wasserbad, da die Verpackungsanordnung sowohl eine schnelle Erwärmungsrate als auch eine kontrollierte thermale Gleichmäßigkeit gewährleistet, während im Laufe des kritischen Auftauverfahrens die Sterilität aufrecht erhalten wird.
Vor der Verwendung als Äquivalent für menschliches Gewebe, für eine Verpflanzung oder für In-Vitro-Testen, wird das aufgetaute kultivierte Gewebeäquivalent gespült, um die Kälteschutzmittellösung zu entfernen. Die Kälteschutzmittellösung kann durch Spülen mit – zum Beispiel – einer isotonen Pufferlösung mit physiologischem pH-Wert entfernt werden. Die kultivierten Gewebeäquivalente können danach vorübergehend in einer solchen Pufferlösung gelagert oder vor Verwendung in einem geeigneten Zellmedium rekultiviert werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A und 1B zeigen Ansichten des Deckels.
2 zeigt eine Draufsicht der Dichtung.
3A und 3B zeigen Ansichten der auf dem Deckel befestigten Dichtung.
4A und 4B zeigen Ansichten des Trägers.
5A und 5B zeigen Ansichten der Schale.
6A und 6B zeigen Seitenansichten des Zusammenbaus, auseinandergezogen und fertiggestellt.
7 zeigt eine Nahansicht des Zusammenbaus.
8 zeigt eine Draufsicht des fertiggestellten Zusammenbaus.
9 zeigt ein Diagramm der Lebensfähigkeit von kältekonservierten kultivierten Geweben im Vergleich zur Lebensfähigkeit von nicht-kältekonservierten kultivierten Geweben. Die Lebensfähigkeit von kältekonservierten kultivierten Geweben, gemessen durch MTT, wird dargestellt. LSE wurde zusätzlich durch einen LDH-Test gemessen. Alle kultivierten Gewebe werden mit altersmäßig abgestimmten nicht-kältekonservierten Kontrollen verglichen und als Prozentsatz der Kontrolle ausgedrückt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gewebe-Konstruieren ist ein im Aufbau begriffenes Gebiet, das kultivierte Gewebezellen verwendet, um Gewebeäquivalente zu konstruieren, die verwendet werden können, um die Reaktion auf Verletzung durch chemische Wirkstoffe oder pharmazeutische Verbindungen zu überprüfen. Das kultivierte Gewebe kann auch verwendet werden, um verpflanzbares menschliches Gewebe zu bilden.
Gewebeäquivalente wurden ausführlich in vielen Patentschriften beschrieben, einschließlich in den US-Patentschriften Nr. 4,485,096; 4,485,097; 4,539,716; 4,546,500; 4,604,346; 4,837,37 und 5,374,515, von denen alle hiermit durch Bezugnahme aufgenommen werden. Eine erfolgreiche Anwendung des Gewebeäquivalents wird als das „Lebendhaut-Äquivalent" bezeichnet, welches eine Morphologie aufweist, die jener echter menschlicher Haut ähnelt. Das Lebendhaut-Äquivalent [Living Skin Equivalent] (LSE) besteht aus zwei Schichten: Der obere Abschnitt wird aus differenzierten und mehrschichtigen humanen epidermalen Keratinocyten hergestellt, die eine untere Schicht von humanen dermalen Fibroblasten in einer Collagen-Matrix bedecken. Parentau, et al., „Epidermis Generated in Vitro: Practical Considerations and Applications", J. of Cellular Biochemistry, 45: 245: 251 (1991); Parentau, et al., „The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function", Cytotechnology, 9: 163–171 (1992), und Bell et al., „The Living Skin Equivalent: Its Manufacture, Its Organotypic Properties and Its Responses to Irritants", Toxic. in Vitro, 5: 591–596 (1991). LSE für Verpflanzungen wird im Rahmen von klinischen Versuchen auf Indikationen in Bezug auf Hautwunden mit teilweiser und voller Dicke geprüft: Exzisionschirurgie, Verbrennungen, Venostase-Geschwüre, Diabetesgeschwüre, Dekubitus-Geschwüre und chronische entzündliche Geschwüre. Das LSE ist ein zweischichtiges in vitro hergestelltes Hautgewebe mit voller Dicke.
Ein In-Vitro-Organäquivalent der Hornhaut des Auges wurde, wie in der US-Patentschrift Nr. 5,374,515 beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird, entwickelt. Das Hornhautgewebeäquivalent weist drei ausgeprägte Zellschichten auf, die Außenschicht, ein mehrschichtiges Plattenepithel, die Mittelschicht aus Collagenfasern und Stromazellen; und eine Innenschicht, einschichtiges Plattenepithel, auch als Korneaendothel bezeichnet. Ein In-Vitro-Hornhautäquivalent kann für In-Vitro-Toxizitätstests verwendet werden, um als genaues und kostengünstiges nicht-tierisches prädiktives Modell von in vivo okularem und dermalem Irritationspotential für viele Arten von Produkten und Rohmaterialien zu dienen.
Das Ziel der Kältekonservierung besteht in der Bewahrung der strukturellen Integrität und Lebensfähigkeit von biologischen Materialien für einen unbestimmten Zeitraum, so dass diese Materialien verfügbar sind und nach Bedarf verwendet werden können. Komplexe Gewebe mit endlicher Lebensdauer erfordern eine Kältekonservierung, um die Produktverfügbarkeit und -nützlichkeit zu verlängern. Die Geschichte der Kältekonservierung von biologischem Material hat jedoch gezeigt, dass die Optimierung eines Kältekonservierungsprotokolls für eine bestimmte Zelle nicht unbedingt gute Ergebnisse hervorbringt, wenn sie mit einem anderen Zelltyp oder mit anderen Zellen in einem Gewebe verwendet wird. Die Entwicklung von spezielleren Verfahren war aufgrund der Unterschiede in der Zelldichte, in Bezug auf den Wassergehalt und der Ebene der strukturellen Organisation der Gewebeäquivalente mit voller Dicke erforderlich. Die Kältekonservierungsprotokolle der vorliegenden Erfindung sind überraschender Weise auf die einschichtigen epidermalen und dermalen Schichten alleine, Zweischicht-Gewebeäquivalente, dreischichtige Hornhautäquivalente und geerntete Säugetierhaut anwendbar. Die Entwicklung einer Verpackungsanordnung macht die Kältekonservierung dieser Gewebe für Verfahren im Produktionsumfang anwendbar.
So wie hierin verwendet, steht der Begriff „kultivierte Gewebeäquivalente" für Gewebeäquivalente aus Säugetier-Geweben, wobei die Gewebeäquivalente durch In-Vitro-Techniken hergestellt werden und einschichtige Hautäquivalente, entweder ein dermales Äquivalent oder ein epidermales Blatt, Zweischicht-Hautäquivalent, insbesondere LSE, und dreischichtige Hornhautäquivalente und Hautäquivalente einschließen. Die Morphologie der kultivierten Gewebeäquivalente ist jener von In-Vivo-Säugetierorganen, typischerweise einem menschlichen Organ, ähnlich. Zur Veranschaulichung sei erwähnt, dass die Morphologie von LSE viele Ähnlichkeiten mit menschlicher Haut hat. Metabolisch und mitotisch aktive humane dermale Fibroblasten (HDF) werden in der gesamten dermalen Schicht des Konstruktes gefunden, wobei gezeigt wurde, dass sie Collagen und andere Matrixkomponenten in das Gitter absondern. Die Epidermis besteht aus einer basalen Schicht, von der gezeigt wurde, dass sie sich mit einer mitotischen Rate teilt, die jener von menschlicher Haut ähnlich ist. Die suprabasale Epidermis zeigt dieselben Strata wie Haut in vivo, mit gut definierten stacheligen und granulären Schichten, die Keratohyalin und lamellare Granula enthalten, die durch ein Stratum Corneum bedeckt sind. Immunohistochemie zeigt die Gegenwart von extrazellulären Matrixkomponenten, die routinemäßig an der dermo-epidermalen Verbindungsstelle in normaler menschlicher Haut gefunden werden, wie Laminin, Typ-IV-Collagen und Kalanin (GB3).
Kultivierte Gewebeäquivalente, die durch organotypische Kulturverfahren erhalten werden, wie das Lebendhautäquivalent (LSE), verwenden einen Träger als Gerüst, auf dem die Äquivalente gebildet werden. Kultivierte Gewebeäquivalente werden auf einem Träger hergestellt, der die Handhabung des Konstruktes während der Herstellung, des Versands und der Endnutzung ermöglicht, ohne das Konstrukt direkt zu berühren. Verfahren zur Herstellung von kultivierten Gewebeäquivalenten auf einem Träger werden in der US-Patentschrift Nr. 5,374,515 und in EP-A-0418035 und in WO 94/10940 offenbart.
Ein Träger schließt eine flache durchlässige Membran ein, die an einem Ende einer im Wesentlichen rohrförmigen Stütze befestigt ist. Das andere Ende der rohrförmigen Stütze schließt einen sich nach außen erstreckenden Flansch ein, der wiederum einen Rand trägt, der am oberen Ende einer Vertiefung in einer Gewebekulturschale und in der Verpackungsanordnung der vorliegenden Erfindung hängen kann. Der Membran-Stütze-Bauteil ist größenmäßig so gestaltet, dass er mit einer Kulturschale verwendet wird, welche mindestens eine Vertiefung einer spezifischen Größe aufweist, um über der Stütze den geeigneten Abstand bereitzustellen und in das obere Ende der Vertiefung einzugreifen. Der Membran-Stütze-Bauteil kann in unterschiedlichen Größen ausgeführt werden, um mit verschiedenen Größen von Kulturschalen und Kältekonservierungs- und Lagerverpackungen verwendet zu werden. Ein Beispiel für solche Träger ist ein TRANSWELL® (Costar), wie in der US-Patentschrift Nr. 5,466,602 beschrieben. Änderungen an der Verpackungsanordnung können von einem Fachmann durchgeführt werden, um ähnliche Träger unterzubringen, welche unterschiedliche Stützmittel und Eingreifmittel in den Kulturgefäßen verwenden. Ähnliche Träger werden in den US-Patentschriften Nr. 5,358,871 und 5,366,893 bzw. in der US-Patentschrift Nr. 4,871,674 beschrieben.
Die bevorzugte Verpackungsanordnung, die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, nimmt das Trägergerüst auf und definiert eine Umgebung um das Gewebeäquivalent herum, die auf vorbestimmte Spezifikationen hin geregelt werden kann. Die vorliegende Erfindung verwendet Materialien, die vorzugsweise von medizinischer Qualität sind und einer großen Bandbreite an Temperaturen widerstehen können. Diese Materialien werden geformt, um eine Schale und einen Deckel zu bilden, die durch ein Dichtungsmittel miteinander dicht verbunden werden können. Die neue Verpackung ist so gestaltet, dass sie eine Trägerstütze aufnimmt, auf der Gewebeäquivalente gebildet werden.
Die neue Verpackungsanordnung weist eine Schale, einen Deckel und eine feste Dichtung dazwischen auf. Die Schale und der Deckel sind so gestaltet, dass sie zum bestehenden Träger passen, der die angebrachten Gewebeäquivalente enthält. Der Träger, an dem das Gewebeäquivalent angebracht ist, wird in die Schale gegeben, und es wird eine Kälteschutzmittellösung hinzugefügt. Der Deckel wird daraufhin auf die Schale gelegt, und die zwei Teile werden miteinander dicht verschlossen, um eine feste Abdichtung zwischen der inneren und der äußeren Umgebung der Verpackung herzustellen.
Die Verpackungsanordnung ermöglicht eine gleichmäßige Verteilung von Kälteschutzmittel unterhalb des Trägers und oberhalb der Oberfläche des Gewebeäquivalents, während der Kontakt des Kälteschutzmittels mit dem Gewebeäquivalent und der Schale sowie dem Deckel aufrechterhalten wird. Die Anordnung der Verpackung beruht auf dem Konzept, dass kontrollierte Kühl- und Gefrierraten mit einem gleichen Volumen an Kälteschutzmittel aufrechterhalten werden können, bei Anordnung mit ähnlicher Geometrie ober- und unterhalb des kultivierten Gewebes, das kältekonserviert werden soll. Diese Anordnung stellt eine gleichmäßige Entfernung bereit, gemessen sowohl von der oberen als auch der unteren Fläche des kultivierten Gewebeäquivalentes zur Außenwand der Verpackung (vorausgesetzt, die Verpackung weist auch eine gleichmäßige Dicke auf). Diese Gleichmäßigkeit sollte beim Kühlen einen gleichmäßigen Wärmeaustausch vom Gewebeäquivalent zur Gefrierkammer bereitstellen, und von der äußeren Umgebung zum Gewebeäquivalent beim Auftauen.
Die Schale weist eine Bodenfläche auf, die an eine Seitenwand und einen Flansch angrenzt. Der Flansch stellt eine ebene Fläche zum Abdichten der Schale mit dem Deckel bereit. Die Seitenwand der Schale weist eine einzelne fortlaufende oder eine Mehrzahl von unterbrochenen Stützen auf, die sich nach innen von und einstöckig mit der Seitenwand erstrecken. Die Oberkante des Trägers, welcher das kultivierte Gewebeäquivalent enthält, wenn er sich in der Schale befindet, wird auf den Stützen aufgehängt, die durch die Seitenwand der Schale bereitgestellt werden. Zwischen dem aufgehängten Träger und der Bodenfläche der Schale ist ein Raum abgegrenzt, der ungefähr 1,0 mm Dicke mit einer Fläche misst, die ungefähr der Größe des Gewebeäquivalentes entspricht.
Der Deckel weist eine ebene Bodenfläche auf, die an eine Seitenwand und einen Flansch grenzt. Der Durchmesser des Deckelflansches ist etwas kleiner als der Durchmesser des Schalenflansches. Der Deckelflansch ruht, wenn er auf die einen Träger enthaltende Schale platziert wird, so auf dem Träger, dass die oberen Flächen des Schalenflansches und des Deckelflansches mit derselben oder annähernd derselben Ebene ausgerichtet in Kontakt sind. Ein zweiter Raum wird durch den Deckel und die Oberfläche des kultivierten Gewebeäquivalents abgegrenzt, wobei dieser Raum ebenfalls ungefähr 1,0 mm Dicke mißt mit einer Fläche, die ungefähr die Größe des Gewebeäquivalents aufweist.
Die Anordnung ermöglicht insgesamt ungefähr 1 mm zwischen der Schale und dem Boden des Trägers, welcher das Gewebeäquivalent enthält, das darauf angeordnet ist, und ungefähr 1 mm zwischen dem Deckel und dem Gewebeäquivalent, wobei das Kälteschutzmittel oberhalb und unterhalb des Gewebeäquivalentes sowohl mit dem Deckel als auch der Schale in Kontakt ist. Wenn der Deckel in die Schale platziert wird, welche das Medium enthält, verdrängt der Deckel jegliche Luft in der Verpackung an den peripheren Raum, welcher die rohrförmige Stütze des Trägers enthält.
Der Deckel wird mit der Schale entlang der exponierten Ebene abgedichtet, die durch die oberen Flächen des Schalen- und des Deckelflansches gebildet ist. Das Abdichten kann durch Hitze, Klebstoff oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Mittel erfolgen. Die Dichtung zwischen dem Deckel und der Schale verhindert ein Austreten des Kühlschutzmittels und bewahrt die Sterilität des Inneren der Einheit. Vorzugsweise wird eine ringförmige Schicht von hitzeversiegelbarem Deckelmaterial sowohl an den Schalenflansch als auch den Deckelflansch hitzeversiegelt. Das Deckelmaterial weist vorzugsweise eine Lasche zum abziehbaren Entfernen und somit zum Entsiegeln des Deckels von der Schale auf, um Zugang zum Gewebeäquivalent zu erhalten. In einer anderen Ausführungsform wird ein Deckel mit einem Flansch von ungefähr demselben Durchmesser wie der Schalenflansch auf einer Schale mit einem darin angeordneten Träger platziert, so dass die Bodenfläche des Deckelflansches in engem Kontakt zur oberen Fläche des Schalenflansches steht. Die Flansche werden danach durch ein versiegelbares Mittel miteinander versiegelt.
1A und 1B zeigen den Deckel 10, den Deckelflansch 11, die Deckelseitenwand 12 und die Bodenfläche 13. Der Deckelflansch 11, die Deckelseitenwand 12 und die Bodenfläche 13 bilden eine zusammenhängende Fläche.
2 zeigt die ringförmige Dichtung 20 und das Abziehelement 21.
3A und 3B zeigen die Dichtung 20, den Deckel 10, den Deckelflansch 11. Die Dichtung 20 wird vor der Verwendung auf dem Deckelflansch 11 des Deckels 10 befestigt, um die Ausrichtung der Abdichtung während des Versiegelungsverfahrens zu erleichtern.
4A und 4B zeigen den Träger 30, den Trägerrand 31, die durchlässige Membran 32 und die rohrförmige Stütze 33. Die durchlässige Membran 32 enthält ein Kulturgewebeäquivalent, das darauf durch die rohrförmige Stütze 33 gehalten angeordnet ist. Der Träger 30 ermöglicht den Transfer des Gewebeäquivalentes ohne Kontakt oder Entfernung des Gewebeäquivalentes während des gesamten Kältekonservierungsprozesses
5A und 5B zeigen die Schale 40, die Bodenfläche 41 der Schale, die Schalenseitenwand 42, den Schalenflansch 43 und die Trägerstützen 44. Die Bodenfläche 41 der Schale, die Schalenseitenwand 42, der Schalenflansch 43 und die Trägerstütze 44 bilden eine zusammenhängende Fläche. Die Trägerstützen 44 berühren und stützen den Träger innerhalb der Schale.
6A und 6B zeigen die Dichtung 20, den Deckel 10, den Träger 30 und die Schale 40. Der Träger 30, welcher ein Gewebeäquivalent enthält, ist in der Schale 40 angeordnet und innerhalb der Schale aufgehängt. Der Deckel 10 mit der Dichtung 20 ist über dem Träger 30 angeordnet und über dem Träger aufgehängt.
7 zeigt die Dichtung 20, den Deckelflansch 11, den Deckel 10, den Träger 30, den Trägerrand 31, die Trägerstützen 44 und die Schale 40. Der Träger 30, der ein Gewebeäquivalent enthält, ist in der Schale 40 angeordnet und innerhalb der Schale durch Kontakt der Bodenfläche des Trägerrandes 31 mit den oberen Flächen der Trägerstützen 44 aufgehängt. Der Deckel 10 mit der Dichtung 20 wird über dem Träger 30 angeordnet und über dem Träger durch Kontakt der Bodenfläche des Deckelflansches 11 mit der oberen Fläche des Trägerrandes 31 aufgehängt. Die oberen Flächen des Deckelflansches 11 und des Schalenflansches 43 bilden eine ebene Fläche für die Dichtung 20.
8 zeigt eine Draufsicht des Zusammenbaus.
Materialien, aus denen die Schalen und die Deckel hergestellt werden können, sind steife oder halbflexible thermoplastische Materialien, die – wenn sie erhitzt sind – durch ein Vakuum geformt oder durch Spritzguss geformt werden, beispielsweise Polytetrafluorethylen (PTFE) oder Polyethylenterephthalatglycol (PETG). Die Verpackungsschalen und -deckel werden vorzugsweise vor der Verwendung durch auf dem Fachgebiet bekannte Sterilisierungsverfahren sterilisiert. Die Materialien, die zur Herstellung der Schale und des Deckels verwendet werden, bestimmen das Sterilisierungsverfahren, das angewendet werden kann. Um PTFE oder PETG zu sterilisieren, wird eine Gamma-Bestrahlung mit 2,5 oder 3,0 Megarad bevorzugt. Elektrische und chemische Sterilisierungsverfahren, die Fachleuten bekannt sind, können als Alternative eingesetzt werden.
Kultivierte Gewebeäquivalente weisen ein dermales Äquivalent eines hydrierten Collagen-Gitters auf, das durch einen Wirkstoff, vorzugsweise durch Fibroblasten, kontrahiert wird. In einer Ausführungsform wird eine mehrschichtige Schicht von Epidermalzellen auf der Oberfläche des dermalen Äquivalents kultiviert. In einer anderen Ausführungsform wird das hydrierte, kontrahierte Collagen-Gitter, das durch Keratocyten kontrahiert ist, auf einer Schicht kornealer Endothelzellen mit einer mehrschichtigen Schicht von kornealen Epithelzellen angeordnet, die auf der Oberfläche des Gitters kultiviert werden. Alternativ dazu können Epidermalzellen alleine kultiviert und dazu gebracht werden, sich mehrschichtig anzuordnen, um ein epidermales Blatt zu bilden. Das kultivierte Gewebeäquivalent wird entweder auf einer porösen Membran eines Trägers oder auf einem Collagen-Gel ausgebildet, das an eine poröse Membran der Bodenfläche eines Trägers geheftet wird. Zusätzlich können andere kultivierte Gewebeäquivalente gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung kältekonserviert werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, kultivierter epidermaler Blätter, kultivierter dermaler Äquivalente, kultivierter Hornhautäquivalente oder geernteter Säugetierhaut.
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Verwendung von Gewebeäquivalenten und die bevorzugte Verpackungsanordnung zur Erläuterung beschrieben. Fachleute werden verstehen, dass Änderungen an dem beschriebenen Verfahren durchgeführt werden können, die dann noch immer im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen.
Das Verfahren zum Durchdringen eines Gewebeäquivalenten mit einer Kälteschutzmittellösung besteht darin, das Gewebeäquivalent und den daran angebrachten Träger in ein Volumen von Kälteschutzmittellösung einzutauchen, das ausreichend ist, um die Probe einzutauchen, und darin, ein gleichmäßiges Volumen an Kälteschutzmittellösung oberhalb und unterhalb des Gewebeäquivalentes bereitzustellen. Einer 100-mm-Petrischale, die das Gewebeäquivalent und den Träger enthält, werden 25 mL von 2 M Glycerol in DMEM über einen Zeitraum hinweg zugegeben, der ausreicht, um die Probe vollständig zu durchdringen, vorzugsweise über einen Zeitraum zwischen einer und zwei Stunden, aber am bevorzugtesten über einen Zeitraum von ungefähr einer Stunde. Längere Zeiträume in der Kälteschutzmittellösung führen zu einer reduzierten Zelllebensfähigkeit im Gewebe, während zu kurze Zeiträume kein vollständiges Eindringen des Kälteschutzmittels in das Gewebe gewährleistet. Einschicht-Konstrukte werden typischer Weise weniger Zeit für die Perfusion benötigen, da sie weniger Zellschichten und eine reduzierte Barrierefunktion aufweisen. Während dieser Stunde wird das Eindringen der Kälteschutzmittellösung durch Schütteln der Probe und der Kälteschutzmittellösung verstärkt, typischerweise durch Schütteln der Petrischale auf einem Rotationsplattformschüttler (Bellco Orbitalschüttler) bei 70 Umdrehungen/Minute in einer 10% CO₂-begasten Kammer. Die 10% CO₂-Umgebung, dieselbe wie die Kulturumgebung, in der das Gewebeäquivalent hergestellt wurde, verhindert, dass die Medien entgasen, wodurch der pH-Wert des Grundmedienbestandteils des Kälteschutzmittels aufrecht erhalten wird. Das Schütteln ermöglicht ein schnelleres und vollständigeres Eindringen des Kälteschutzmittels in das Gewebeäquivalent und eine bessere Reproduzierbarkeit von Ergebnissen zwischen gefrorenen Gewebeäquivalenten. Es ist möglich, den Orbitalschüttler durch eine Vorrichtung zu ersetzen, welche eine Schüttelbewegung in anderen räumlichen Ebenen ausführt. Außerdem schließen andere Verfahren der mechanisch verstärkten Perfusion, ohne darauf beschränkt zu sein, das Schaukeln des Konstruktes mit dem Kälteschutzmittel in einem Gefäß auf einer Plattform oder das Zentrifugieren des Konstruktes mit dem Kälteschutzmittel und das Durchdringen von Kälteschutzmittel um das Konstrukt herum durch Verwendung einer Pumpe ein.
Der Träger und das angebrachte Gewebeäquivalent werden in die Schale platziert, und insgesamt ungefähr 16,0 ml Kälteschutzmittellösung werden hinzugefügt. Das Verpackungsdesign ermöglicht eine gleichmäßige Verteilung des Kälteschutzmittels. Ungefähr 8,0 ml unterhalb des Trägers und ungefähr 8,0 ml auf der Oberfläche des Gewebeäquivalenten. Der Deckel wird dann auf die Schale platziert und die zwei Teile werden hitzeversiegelt, vorzugsweise am Deckelmaterial.
Die verpackten Gewebeäquivalente werden daraufhin in eine programmierbare Gefriervorrichtung (Cryomed oder Planer) platziert, dessen Anfangstemperatur ungefähr auf Raumtemperatur eingestellt ist, vorzugsweise auf 20,0°C. Die Gefrierkammer, welche die verpackten Gewebeäquivalente enthält, wird mit –10,0°C/Minute auf den Fest-Flüssigphasen-Gleichgewichtstemperaturbereich für das Kälteschutzmittel abgekühlt, der typischerweise für 2,0 M Glycerol in DMEM zwischen ungefähr –5,3°C und –6,0°C liegt. Die Fest-Flüssigphasen-Gleichgewichtstemperatur ist die Temperatur, die erforderlich ist, um Eis in das Kälteschutzmittel zu impfen. Die Kammertemperatur wird eine Zeit lang gehalten, um die Innentemperatur der verpackten Gewebeäquivalente auf die Kammertemperatur anzugleichen. Die Kühlrate, die verwendet wird, um die Impftemperatur zu erreichen, ist nicht kritisch. Eine Haltezeit von ungefähr 40 Minuten ist ausreichend, um einen thermalen Ausgleich zu gewährleisten, aber diese Zeitspanne wird in Abhängigkeit von der Kammergröße, der Luftzirkulation innerhalb der Kammer und der Anzahl der einzufrierenden Verpackungen variieren. Während typischerweise mindestens 30 Minuten benötigt werden, kann eine Zeitspanne von bis zu einer Stunde für die Gewährleistung des Ausgleichs in Anspruch genommen werden. Nach der Haltezeit wird extrazelluläre Eisbildung durch Impfen initiiert.
Eisimpfen wird als ein Verfahren definiert, bei dem die Eisbildung in dem extrazellulären Kälteschutzmittel initiiert wird. Ein bevorzugtes Verfahren des Eisimpfens erfolgt dadurch, dass die Seite der Schale, welche das Gewebe enthält, mit einer gekühlten Sonde in Berührung gebracht wird, beispielsweise einem Flüssigstickstoff-gekühlten (–196°C) Stahlstab. Die Berührungsstelle des Stabes mit der Verpackung muss unterhalb der Ebene der Kälteschutzmittelgefriermedien innerhalb der Verpackung sein. Ein weiteres bevorzugtes Verfahren besteht darin, ein expandierendes Gas, wie Freon oder CO₂, direkt zur Außenseite der Verpackung freizusetzen. Die Eisbildung kann durch eine Kammernspitze initiiert werden, wo die Temperatur der Kammer innerhalb einer Bandbreite, die ausreicht, um einen Eiskristall zu bilden, gesenkt und erhöht wird. Andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren des Eisimpfens können ersatzweise verwendet werden.
Nachdem alle Gewebeäquivalente mit Eiskristallen geimpft sind, werden die Einheiten eine weitere Stunde gehalten, um einen thermodynamischen Ausgleich und eine Ausbreitung des Eisimpfkristalls durch das Kälteschutzmittel hindurch zu ermöglichen. Danach wird das Abkühlen wieder aufgenommen, und zwar mit einer Rate von vorzugsweise zwischen ungefähr –0,02°C/min bis ungefähr –0,3°C/min, bevorzugter mit einer Rate zwischen ungefähr –0,05 bis ungefähr –0,1°C/Minute und am bevorzugtesten mit einer Rate von ungefähr –0,07°C/Minute auf eine Endtemperatur, die vorzugsweise mindestens bei oder unter –70,0°C liegt, bevorzugter bei –120°C, noch bevorzugter bei –140°C oder am bevorzugtesten bei –196°C. Während die Gefriertemperatur sich der Glasübergangstemperatur von Wasser, –120°C, nähert, werden schädliche Temperaturschwankungen während der Transfers zu den endgültigen Lagerstätten immer unwahrscheinlicher.
Kältekonservierte Gewebeäquivalente werden bis zur Verwendung von der programmierbaren Gefriervorrichtung in einen Dampfphasenflüssigstickstoff-Lagerbehälter (Dewar) bei einer Temperatur zwischen ungefähr –120° bis –150°C oder in Flüssigstickstoff bei –196°C transferiert.
Für das Auftauen werden kältekonservierte Gewebeäquivalente aus der Dampfphasenflüssigstickstofflagerung entnommen und auf Trockeneis transferiert, um sich auf ungefähr –75°C zu erwärmen. Sobald sie auf –75°C ausgeglichen wurden, werden die kultivierten Gewebeäquivalente in eine Umgebung transferiert, vorzugsweise ein Wasserbad, das vorzugsweise auf 37°C eingestellt ist, oder bevorzugter auf 4°C oder am bevorzugtesten auf Raumtemperatur. Sobald ersichtlich ist, dass das gesamte Kälteschutzmittelmedium in Flüssigphase umgewandelt wurde, werden die Einheiten der kultivierten Gewebeäquivalentverpackung in einen biologisch sicheren Schrank überführt oder in einen anderen aseptischen Bereich und mit Ethanol keimfreigemacht. Der Deckel der Schalen wird durch Abziehen oder Schneiden des Deckelmaterials vom Boden der Einheit entfernt. Die Träger, welche die kultivierten Gewebeäquivalente enthalten, werden danach jeweils in Petrischalen überführt, während überschüssiges Kälteschutzmittel abgegossen wird. Um das kultivierte Gewebeäquivalent des restlichen Kälteschutzmittels zu spülen, werden 25 mL der Spüllösung, vorzugsweise DMEM bei Raumtemperatur, zur Petrischale, welche das kultivierte Gewebeäquivalent enthält, ungefähr 30 Minuten lang hinzugefügt. Andere ausreichende Spülmittel, vorzugsweise Lösungen mit physiologischer Stärke, wie Zellkulturmedien oder phosphatgepufferte Salzlösung, können vom Fachmann bestimmt werden. Die Spüllösung wird ein zweites Mal weitere 30 Minuten ausgetauscht. Die Spülzeiten können in Abhängigkeit von der Komplexität des Gewebes variieren.
Die Einheit des kultivierten Gewebeäquivalents kann dann zu ihrer ursprünglichen Kulturschale rückgeführt und in einem Kulturbewahrungsmedium bei 37°C/10% CO₂ rekultiviert werden. Alternativ dazu kann das Äquivalent auf einen Patienten angewendet oder im Hinblick auf eine Reaktion auf den Kontakt mit einer Substanz geprüft werden, wie in der US-Patentschrift 4,835,102 beschrieben.
Die folgenden Beispiele sind vorgesehen, um die Praxis der vorliegenden Erfindung näher zu erläutern und sollten keinesfalls als Einschränkung des Schutzumfanges der vorliegenden Erfindung ausgelegt werden. Fachleute werden erkennen, dass verschiedene Änderungen an den hierin beschriebenen Verfahren durchgeführt werden können, ohne vom Geist und Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
BEISPIELE
Beispiel 1 bis 3
Beispiele 1 bis 3 zeigen die Kältekonservierungs- und Auftautechniken der vorliegenden Erfindung mit der bevorzugten Verpackungsausbildung.
Beispiel 1: Kältekonservierung von Lebendhautäquivalent (LSE) mit der Verpackungsanordnung
Lebendhautäquivalent(LSE)-Konstrukte wurden gemäß EP-A-0448035 hergestellt. LSEs und 75-mm-Trägereinsätze (TRANSWELL^®, Costar, Cambridge) wurden 9 bis 10 Tage nach dem an die Luft heben in 100-mm-Petrischalen (Costar) platziert. LSE-Konstrukte wurden mit Kälteschutzmittel durchdrungen, indem die Konstrukte und die Transwell mit 25 mL kälteschützenden Medien, 2 M Glycerol in DMEM, in der 100-mm-Petrischale eine Stunde lang eingetaucht wurden. Während der Perfusion wurden die Konstrukte eine Stunde lang auf einem Rotationsschüttler (Bellco) bei 70 Umdrehungen/Minute in einer 10% CO₂-begasten Kammer geschüttelt. Das Schütteln ermöglicht eine vollständigere Perfusion und bessere Reproduzierbarkeit des Kältekonservierungsverfahrens. Nachdem die LSE durchdrungen waren, wurden die Petrischalen, welche das LSE enthielten, die Trägereinsätze und die extrazellulären Gefriermedien (2 M Glycerol und DMEM) in eine Kältekonservierungsverpackung gegeben und hitzeversiegelt.
Die Kammer einer programmierbaren Gefriervorrichtung (Planar) wurde mit der hierin beschriebenen Erfindung ausgestattet. Die Gefriervorrichtung wurde auf eine Anfangstemperatur von 20,0°C eingestellt. Die Rohrleitungen wurden mit Freon einen einzelnen Einsekunden-Intervall lang gereinigt, um jegliche Luft in den Leitungen zu entfernen. Die verpackten LSE-Einheiten wurden sicher in Gestelle platziert, welche jeweils acht LSE-Einheiten aufnahmen. Die Gestelle, geführt von Positionsstiften, wurden benachbart zu den Sprayschienen angeordnet. Die Kammertür der Gefriervorrichtung wurde geschlossen, um die Kammer von der Außenumgebung abzuschließen.
Die LSE-Einheiten wurden bei –10°C/Minute auf –6°C abgekühlt, und die Kammertemperatur wurde 40 Minuten lang bei –6°C gehalten, um das Kälteschutzmittel und die durchdrungenen Konstrukte an die Kammertemperatur anzugleichen. Nach dem 40 Minuten langen Halten wurde extrazelluläres Eis initiiert, indem Freon eine Sekunde lang in unmittelbarer Nähe zur Seite der Verpackung direkt freigesetzt wurde. Das Freon führte – während es von der Oberfläche der Verpackung verdampfte – dazu, dass die Kontaktfläche des Freons einen Temperaturabfall verzeichnete, der ausreichte, um die extrazelluläre Eisbildung zu initiieren.
Alle LSE-Einheiten wurden mit Eiskristallen geimpft, den Einheiten wurde ermöglicht, sich eine Stunde lang bei –6°C anzugleichen. Die Kammertemperatur wurde danach auf –0,07°C/Minute auf eine Endtemperatur von –20°C abgekühlt. Danach wurde die Kammer mit –0,5°C/Minute auf eine Endtemperatur von –70°C abgekühlt. Sobald die LSE-Einheiten kältekonserviert waren, wurden sie zu einem Dampfphasenlagerbehälter (Dewar) bei einer Temperatur von –120°C bis –150°C überführt.
Beispiel 2: Auftauen von kältekonserviertem LSE
Kältekonserviertes LSE wurde aus der Dampfphasenflüssigstickstofflagerung entnommen und auf Trockeneis überführt, um sich auf ungefähr –75°C zu erwärmen. Sobald die Äquivalente bei –75°C angeglichen sind, werden sie in ein Wasserbad überführt, das vorzugsweise auf 37°C eingestellt ist, bevorzugter auf 4°C oder am bevorzugtesten auf Raumtemperatur. Sobald ersichtlich ist, dass das gesamte Kälteschutzmittelmedium in Flüssigphase umgewandelt wurde, werden die Einheiten der kultivierten Gewebeäquivalentverpackung in einen biologisch sicheren Schrank überführt oder in einen anderen aseptischen Bereich und mit Ethanol keimfreigemacht. Der Deckel der Schalen wird durch Abziehen oder Schneiden des Deckelmaterials vom Boden der Einheit entfernt. Die Träger, welche die kultivierten Gewebeäquivalente enthalten, werden danach jeweils zu Petrischalen überführt, während überschüssiges Kälteschutzmittel abgegossen wird. Um das kultivierte Gewebeäquivalent des restlichen Kälteschutzmittels zu spülen, werden 25 mL der Spüllösung (bei Raumtemperatur), vorzugsweise DMEM, zur Petrischale, welche das kultivierte Gewebeäquivalent enthält, ungefähr 30 Minuten lang hinzugefügt. Andere ausreichende physiologische Spülmittel, beispielsweise andere Zellkulturmedien oder phosphatgepufferte Salzlösung, können vom Fachmann bestimmt werden. Die Spüllösung wird ein zweites Mal weitere 30 Minuten lang ausgetauscht.
Aufgetaute kältekonservierte Proben und Kontrollproben wurden durch histologische Verfahren verarbeitet und durch Lichtmikroskopie auf morphologische Organisation und Lebensfähigkeit hin überprüft und zeigten eine beinahe 100%-ige Lebensfähigkeit und waren fast nicht von der Kontrolle zu unterscheiden.
Beispiel 3: Bewertung des Kältekonservierungsverpackungs-Designs für Erwärmungsrate und thermale Gleichmäßigkeit
Eine Kältekonservierungsverpackung der vorliegenden Erfindung wurde im Hinblick auf gleichmäßige Wärmeübertragung bewertet. An einer Trägermembran, ohne kultiviertes Gewebeäquivalent, wurden fünf Thermoelemente angebracht, eines in der Mitte und vier im gleichen Abstand von 1,0 mm von der peripheren Wand des Trägers. Die Thermoelement-Leitungen traten aus der Verpackung von der Seite zwischen dem Deckel- und dem Schalenflansch zu einem Temperaturaufzeichner (Azonix Scanner Plus) aus. Die Verpackung wurde mit 17 mL Kälteschutzmittel gefüllt und hitzeversiegelt. Die Verpackung wurde auf –70°C äquilibriert und danach in ein auf 20°C eingestelltes Wasserbad transferiert. Der Temperaturaufzeichner zeichnete die Temperatur bei jedem Thermoelement alle 1 bis 2 Sekunden während der Erwärmung auf. Die Verpackung erwärmte sich anfangs mit einer Rate von 700°C/Minute und verlangsamte sich danach, je näher der Schmelzpunkt der Kühlmittelschutzlösung kam. Die thermale Gleichmäßigkeit lag zwischen 2°C und 6°C der durchschnittlichen Thermoelement-Temperatur während der schnellsten Erwärmungsraten und näherte sich 8°C bei Erreichen des Schmelzpunktes der Lösung.
Die Beispiele 4 bis 12 zeigen das Kältekonservierungsverfahren der vorliegenden Erfindung auf unterschiedlichen Geweben.
Beispiel 4: Kältekonservierung von epidermalen Blättern
Epidermale Blätter wurden aus reifen LSE 12 Tage nach dem an die Luft heben beschafft. Das Entfernen des epidermalen Blattes erfolgte durch Abziehen der dermalen Substratschicht von der epidermalen Schicht mit Hilfe von Pinzetten und Verwerfen der dermalen Schicht. Jedes Blatt wurde in drei gleiche Stücke geschnitten. Ein Stück von jedem Blatt wurde als Kontrolle fixiert. Die verbleibenden zwei Stücke von jedem Blatt wurden auf eine 75-mm-Polycarbonat-Transwell-Membran (Costar) in 100-mm-Kulturschalen (Costar) platziert. Jedes Stück wurde eine Stunde lang mit 25 mL DMEM und 2 Molar Glycerol durchdrungen. Die Schalen, welche die Konstrukte enthielten, wurden auf einem Rotationsschüttler (Bellco) bei 70 Umdrehungen/Minute eine Stunde lang in einer 10% CO₂-begasten Kammer angeordnet. Nachdem das epidermale Blatt durchdrungen war, wurden die Petrischale, welche das epidermale Blatt enthielt, Transwell und das extrazelluläre Gefriermedium (2 M Glycerol und DMEM) in einen Sack gegeben und vakuumversiegelt (Audiovox), mit einer Programmierung für ein 5-Sekunden-Vakuum und einer 3,9-Sekunden-Versiegelungszeit.
Verpackte epidermale Blätter wurden in die programmierbare Gefriervorrichtung (Planer) bei einer Anfangstemperatur von 20,0°C angeordnet. Die epidermalen Schichten wurden mit –10,0°C/Minute auf –6,0°C abgekühlt. Die Temperatur wurde 20 Minuten lang bei –6,0°C gehalten, um auf Kammertemperatur zu äquilibrieren. Nach dem 20 Minuten langen Halten wurde extrazelluläres Eis durch Kontakt der Außenseite des Sacks, unterhalb der Ebene des Gefriermediums, mit einer Flüssigstickstoff-gekühlten Sonde initiiert. Nachdem alle epidermalen Blätter mit Eiskristallen geimpft waren, wurde die Temperatur weitere fünf Minuten bei –6,0°C gehalten. Danach wurde die Kammer mit –1,0°C/Minute auf –8,0°C abgekühlt. Im Anschluss daran wurde die Temperatur 30 Minuten lang bei –8,0°C gehalten, um eine gleichmäßige Verteilung von Eis durch die Probe hindurch zu ermöglichen. Die Kammer wurde danach mit –0,1°C/Minute auf eine Endtemperatur von –70,0°C abgekühlt.
Kältekonservierte epidermale Schichten wurden aus der Gefriervorrichtung entfernt, und die Säcke wurden von den Petrischalen geschnitten und die Deckel entfernt. Zum Auftauen wurden 40 mL erwärmtes (37°C) DMEM aseptisch in jede Petrischale geschüttet. Nach 45 Sekunden wurde die gesamte Flüssigkeit von den Platten entfernt und weitere 40 mL Aliquots wurden jeder Schale zwei Minuten lang hinzugefügt. Nachdem das gesamte Eis geschmolzen war, wurden die epidermalen Blätter mit 25 mL DMEM 30 Minuten lang gespült. Das Medium wurde ein zweites Mal weitere 30 Minuten lang ausgetauscht. Danach wurden die epidermalen Blätter in Kulturbewahrungsmedium bei 37°C/10% CO₂ 24 Stunden lang vor der Analyse inkubiert. Die Inkubationszeit wurde für die Zeitverzögerung bereitgestellt, die typischerweise beobachtet wird, wenn gefrorene Zellen die Bedingungen des stationären Zustands wiederherstellen. Wiederum wurde die Inkubationszeit für die Zeitverzögerung bereitgestellt, die typischerweise beobachtet wird, wenn gefrorene Zellen die Bedingungen des stationären Zustands wiederherstellen.
Von den zwei verbleibenden Stücken jedes epidermalen Blattes wurde jeweils eines im Hinblick auf Histologie verarbeitet und ein Stück von jedem Blatt gemäß des MTT-Testprotokolls überprüft. Der Vergleich der Fotomikrographen eines nicht-kältekonservierten epidermalen Blattes mit jenen von kältekonserviertem epidermalem Blättern von Beispiel 4 zeigt, dass die drei grundlegenden Merkmale der Epidermis, die basale Schicht der Epidermis, die suprabasalen Schichten der Epidermis und das Stratum Corneum der Epidermis, alle durch dieses Verfahren konserviert wurden. Alle Schichten waren intakt, und die Gesamtmorphologie des kältekonservierten epidermalen Blattes war mit jener des nicht-kältekonservierten epidermalen Blattes identisch.
Beispiel 5: Kältekonservierung des dermalen Äquivalenten
Die dermalen Äquivalente, die in dieser Studie verwendet wurden, waren der nicht-epidermalisierte Bestandteil des LSE. Dermale Äquivalente wurden 8 Tage nach dem Guss gefroren. Die dermalen Äquivalente wurden mit Kälteschutzmittel durchdrungen, indem die dermalen Äquivalente, die am 75-mm-Transwell (Costar) angebracht sind, angeordnet in 100-mm-Petrischalen (Costar), in 25 mL DMEM und 2 Molar Glycerol eine Stunde lang eingetaucht wurden. Die Petrischalen wurden auf einem Rotationsschüttler (Bellco) bei 70 Umdrehungen/Minute eine Stunde lang in einer 10% CO₂-begasten Kammer platziert. Nachdem die dermalen Äquivalente durchdrungen waren, wurden die Petrischalen, die dermalen Äquivalente, Transwells und die extrazellulären Gefriermedien in die programmierbare Gefriervorrichtung (Planer) bei einer Anfangstemperatur von 20,0°C platziert. Danach wurde die Kammer mit –10,0°C/Minute auf –6,0°C abgekühlt. Die Temperatur wurde 20 Minuten lang gehalten, um auf Kammertemperatur zu äquilibrieren. Nach dem 20 Minuten langen Halten wurde extrazelluläres Eis durch den Kontakt der Außenseite der Schalen, unterhalb der Ebene der Gefriermedien, mit einer Flüssigstickstoff-gekühlten Sonde initiiert. Nachdem alle dermalen Äquivalente mit Eiskristallen geimpft worden waren, wurde die Temperatur weitere 5 Minuten lang bei –6,0°C gehalten. Danach wurde die Kammer mit –1,0°C/Minute auf –8,0°C abgekühlt. Die Kammertemperatur wurde wieder 30 Minuten lang bei –8,0°C gehalten, um eine gleichmäßige Verteilung von Eis durch die Probe hindurch zu ermöglichen. Die Einheiten der dermalen Äquivalente wurden dann bei –0,1°C/Minute auf eine Endtemperatur von –70,0°C abgekühlt.
Die kältekonservierten dermalen Äquivalente wurden danach aus der Gefriervorrichtung entnommen und der Deckel der Schale entfernt. Zum Auftauen wurden 40 mL von erwärmtem (37°C) DMEM aseptisch in jede Petrischale gegossen. Nach 45 Sekunden wurde die gesamte Flüssigkeit aus den Schalen entfernt und ein zusätzliches 40-mL-Aliquot zwei Minuten lang zu den Schalen hinzugefügt. Nachdem das gesamte Eis aufgetaut war, wurden die dermalen Äquivalente mit 25 mL DMEM 30 Minuten lang gespült. Das Medium wurde ein zweites Mal weitere 30 Minuten ausgetauscht. Die dermalen Äquivalente, die noch immer an den Transwells angebracht sind, wurden danach zu den Kulturschalen rückgeführt und in einem Kulturbewahrungsmedium 24 Stunden lang vor der Analyse bei 37°C/10% CO₂ inkubiert. Die Inkubationszeit wurde für die Zeitverzögerung bereitgestellt, die typischerweise beobachtet wird, wenn gefrorene Zellen die Bedingungen des stationären Zustands wiederherstellen. Die Proben wurden unter Verwendung des MTT-Testprotokolls geprüft.
Beispiel 6: Kältekonservierung von Hornhautäquivalenten
Hornhautäquivalente, die an 24-mm-Kulturtranswells (Costar) 9 Tage nach anheben an die feuchte Luft angebracht werden, wurden in sechs Vertiefungen-Cluster-Schalen (Costar) platziert. Das Verfahren zum Durchdringen von Hornhautäquivalenten mit Kälteschutzmittel bestand darin, jedes Hornhautäquivalent und jeden Transwell mit 4 mL extrazellulärem Gefriermedium (2 M Glycerol in DMEM) in den sechs Vertiefungen-Cluster-Schalen eine Stunde lang einzutauchen. Die sechs Vertiefungen-Cluster-Schalen, welche die Hornhautkonstrukte enthielten, wurden eine Stunde lang auf einem Rotationsschüttler (Bellco) bei 70 Umdrehungen/Minute in einer 10% CO₂-begasten Kammer geschüttelt. Nachdem die Hornhautäquivalente durchdrungen waren, wurden die Petrischalen, welche die Hornhautäquivalente enthielten, die Transwells und das extrazelluläre Gefriermedium in die programmierbare Gefriervorrichtung (Planer) bei einer Anfangstemperatur von 20,0°C platziert. Die Hornhautäquivalente wurden mit –10,0°C/Minute auf –6,0°C gekühlt. Die Temperatur wurde 20 Minuten lang gehalten, um an die Kammertemperatur anzugleichen. Nach dem 20 Minuten langen Halten wurde extrazelluläres Eis initiiert, und zwar durch Kontakt der Außenseite jeder Vertiefung in der Clusterplatte unterhalb der Ebene des Gefriermediums, mit einer Flüssigstickstoff-gekühlten Sonde. Nachdem alle Hornhautäquivalente mit Eiskristallen geimpft worden waren, wurde die Temperatur vor dem Abkühlen mit –1,0°C/Minute auf –8,0°C weitere 5 Minuten bei –6,0°C gehalten. Die Temperatur wurde wieder 30 Minuten lang bei –8,0°C gehalten, um eine gleichmäßige Verteilung von Eis durch die gesamte Probe hindurch zu ermöglichen. Die Einheiten der Hornhautäquivalente wurden mit –0,1°C/Minute auf eine Endtemperatur von –70,0°C abgekühlt.
Die kältekonservierten Hornhautäquivalente wurden aus der Gefriervorrichtung entnommen. Der Deckel der Schale wurde entfernt. Zum Auftauen wurden 6 mL von erwärmtem (37°C) DMEM aseptisch in jede Vertiefung der Cluster-Platte gegossen. Nach 45 Sekunden wurde die gesamte Flüssigkeit aus der Schale entfernt und ein weiteres 6-mL-Aliquot wurde zwei Minuten lang zur Schale hinzugefügt. Unter Verwendung von sterilen Pinzetten wurden die Hornhautäquivalente und die angebrachten Transwells zu einer neuen Cluster-Schale transferiert. Zum Spülen wurden 4 mL DMEM zu jeder Vertiefung 30 Minuten lang hinzugefügt. Das Medium wurde ein zweites Mal weitere 30 Minuten lang ausgetauscht. Die Hornhauteinheiten wurden danach zu der/derselben Kulturschale rückgeführt und in Hornhautbewahrungsmedium 24 Stunden lang vor der Analyse bei 37°C/10% CO₂ inkubiert. Die Inkubationszeit wurde für die Zeitverzögerung bereitgestellt, die typischerweise beobachtet wird, wenn gefrorene Zellen die Bedingungen des stationären Zustands wiederherstellen. Die Proben wurden unter Verwendung des MTT-Testprotokolls geprüft.
Beispiel 7: Kältekonservierung von geernteter Mäusehaut
Wildtypmäuse, Stamm B6CB6YF1, wurden durch eine Nembutal-Überdosis euthanisiert. Die Haut wurde aseptisch geerntet. Überschüssige Blutgefäße, Fett- und Bindegewebe wurden von der Dermis entfernt. Die Mäusehaut wurde auf ein rechteckiges Stück von 1 cm × 2 cm zugeschnitten. Die Mäusehautstücke wurden danach auf einem 75-mm-Transwell (Costar) in 100-mm-Petrischalen (Costar) platziert. Die Mäusehaut wurde durch Eintauchen in 24 mL von 2 M Glycerol in DMEM in den 100-mm-Petrischalen eine Stunde lang mit Kälteschutzmittel durchdrungen. Während der Perfusion wurden die Petrischalen, die jeweils die Mäusehaut enthielt, und der Transwell eine Stunde lang auf einem Rotationsschüttler (Bellco) bei 70 Umdrehungen/Minute in einer 10% CO₂-begasten Kammer geschüttelt. Nicht kältekonservierte Kontroll-Mäusehaut wurde in Nährstoffmedium bei 4°C für die Dauer der Kältekonservierung und des Auftauverfahrens (2 Tage) vor der Hautverpflanzung aufbewahrt.
Nachdem die Mäusehaut durchdrungen war, wurden die Petrischalen, welche die Mäusehaut enthielten, die Transwells und das extrazelluläre Gefriermedium in die programmierbaren Planer-Gefriervorrichtung bei einer Anfangstemperatur von 20,0°C platziert. Die Mäusehaut wurde mit –10,0°C/Minute auf –6,0°C abgekühlt und danach bei –6,0°C 20 Minuten lang gehalten, um an die Kammertemperatur anzugleichen. Nach dem 20 Minuten langen Halten wurde extrazelluläres Eis durch Kontakt der Außenseite der Schale mit einer Flüssigstickstoff-gekühlten Sonde initiiert. Die Kontaktstelle muss unterhalb der Ebene des Gefriermediums sein. Nachdem die gesamte Mäusehaut mit Eiskristallen geimpft worden war, wurde die Temperatur weitere 5 Minuten lang bei –6,0°C vor dem Abkühlen mit –1,0°C/Minute auf –8,0°C gehalten. Die Temperatur wurde wiederum 30 Minuten lang bei –8,0°C gehalten, um eine gleichmäßige Verteilung von Eis durch die gesamte Probe hindurch zu ermöglichen. Danach wurden die Einheiten mit –0,1°C/Minute auf eine Endtemperatur von –70,0°C abgekühlt.
Die kältekonservierte Mäusehaut wurde aus der Gefriervorrichtung entnommen und der Deckel der Schale entfernt. Zum Auftauen wurden 40 mL von erwärmtem (37°C) DMEM aseptisch in die Petrischalen geschüttet. Nach 45 Sekunden wurde die gesamte Flüssigkeit aus den Schalen entfernt, und ein zusätzliches 40-mL-Aliquot wurde zu den Schalen zwei Minuten lang hinzugefügt. Nachdem das gesamte Eis aufgetaut war, wurde die Mäusehaut in den Schalen 30 Minuten lang mit 25 mL DMEM gespült. Das Medium wurde ein zweites Mal weitere 30 Minuten ausgetauscht.
Die aufgetauten kältekonservierten Proben und die Kontrollproben wurden im Hinblick auf Histologie verarbeitet oder auf Mäuse verpflanzt. Die Fotomikrographen von nicht kältekonservierter Mäusehaut, die mit kältekonservierter Mäusehaut verglichen wurde, zeigten, dass die vier grundlegenden Merkmale der Mäusehaut, die Dermis mit Fibroblasten, die basale Schicht der Epidermis, die suprabasalen Schichten der Epidermis und das Stratum Corneum der Epidermis durch dieses Verfahren bewahrt wurden. Alle Schichten waren intakt und die Gesamtmorphologie der kältekonservierten Mäusehaut war mit jener von nicht kältekonservierter Mäusehaut identisch.
Beispiel 8: Kältekonservierung von ATS SKIN2^TM
SKIN2^TM, Modell ZK 1300 (Advanced Tissue Sciences, La Jolla, CA), wurde aus der Verpackung gemäß den Versandeinsätzen bei Ankunft entfernt und in Kulturschalen (Costar) platziert. Die Transwell-Einsätze wurden oberhalb von SKIN2^TM platziert, um das Hautkonstrukt eingetaucht zu belassen. SKIN2^TM wurde mit Kälteschutzmittel durchdrungen, indem SKIN2^TM in 2 M Glycerol in DMEM eine Stunde lang in den Kulturschalen eingetaucht wurde. Während der Perfusion wurden die Kulturschalen, welche das Konstrukt und den Transwell enthielten, eine Stunde lang auf einem Rotationsschüttler (Bellco) bei 70 Umdrehungen/Minute in einer 10 CO₂-begasten Kammer geschüttelt.
Nachdem SKIN2^TM durchdrungen war, wurden die Einheiten in die programmierbare Gefriervorrichtung (Planar) bei einer Anfangstemperatur von 20,0°C platziert. Die SKIN2^TM-Einheiten wurden mit –10,0°C/Minute auf –6,0°C abgekühlt und bei –6,0°C 20 Minuten lang gehalten, um an die Kammertemperatur anzugleichen. Nach dem 20 Minuten langen Halten wurde das extrazelluläre Eis durch Kontakt der Außenseite der Schalen unterhalb des Pegels des Gefriermediums mit einer Flüssigstickstoff-gekühlten Sonde initiiert. Nachdem alle SKIN2^TM-Einheiten mit Eiskristallen geimpft worden waren, wurde die Temperatur weitere 5 Minuten lang bei –6,0°C gehalten. Die Kammertemperatur wurde daraufhin mit –1,0°C/Minute auf –8,0°C abgekühlt. SKIN2^TM-Einheiten wurden 30 Minuten lang bei –8,0°C gehalten, um eine gleichmäßige Verteilung von Eis durch die gesamte Probe hindurch zu gewährleisten. SKIN2^TM-Einheiten wurden danach mit –0,1°C/Minute auf eine Endtemperatur von –70,0°C abgekühlt.
Kältekonservierte SKIN2^TM wurde aus der Gefriervorrichtung entnommen, die Deckel der Schalen wurden entfernt, und erwärmtes (37°C) DMEM wurde aseptisch in jede Kulturschale geschüttet. Nach 45 Sekunden wurde die gesamte Flüssigkeit aus den Schalen entfernt, und eine weitere Zugabe von DMEM wurde zwei Minuten lang jeder Schale hinzugefügt. Nach dem Auftauen wurden die SKIN2^TM-Einheit und der angebrachte Transwell unter Zuhilfenahme von sterilen Pinzetten zu einer neuen Kulturschale übertragen. Um SKIN2^TM vom Kühlschutzmittel zu spülen, wurde zu der Kulturschale, welche SKIN2^TM enthielt, 30 Minuten lang DMEM hinzugefügt. Das Medium wurde ein zweites Mal nochmals 30 Minuten lang ausgetauscht. Die SKIN2^TM-Einheit wurde danach zum selben Typ von Kulturschale rückgeführt und in einem Kulturbewahrungsmedium bei 37°C/10% CO₂ 24 Stunden lang vor der Analyse inkubiert. Wiederum gilt, dass die Inkubationszeit für die Zeitverzögerung bereitgestellt wurde, welche typischerweise beobachtet wird, wenn gefrorene Zellen die Bedingungen des stationären Zustandes wiederherstellen.
Kältekonservierte und Kontroll-Konstrukte wurden gemäß dem MTT-Testprotokoll für das SKIN2^TM-Modell ZK1300, das dem Produkt beigefügt ist, und darüber hinaus durch histologische Bewertung geprüft. Die Fotomikrographen von nicht kältekonservierter SKIN2^TM zeigten im Vergleich zu kältekonservierter SKIN2^TM, dass die vier grundlegenden Eigenschaften von SKIN2^TM, das Collagen-Gitter mit Fibroblasten, die basale Schicht der Epidermis, die suprabasalen Schichten der Epidermis und das Stratum Corneum der Epidermis alle durch dieses Verfahren bewahrt wurden. Alle Schichten waren intakt, und die Gesamtmorphologie von kältekonservierter SKIN2^TM war jener von nicht kältekonservierter SKIN2^TM ähnlich.
Beispiel 9: Test zur Messung der metabolischen mitochondrialen Aktivität (MTT)
Gefrorene und nicht gefrorene (Kontroll-)LSE, epidermales Blatt, dermale Äquivalente und Hornhautäquivalente wurden unter Anwendung des MTT-Tests überprüft. [SKIN2^TM-Konstrukte wurden gemäß „MTT Assay Protocol for use with Model ZK1300", das den Versandeinsätzen beigefügt ist, getestet.] Die Zelllebensfähigkeit der Konstrukte wurde unter Verwendung des MTT-Tests gemessen, eines kolorimetrischen MTT-Umwandlungstests, der entwickelt wurde, um das Zellwachstum und die Zelllebensfähigkeit zu messen. Dieser Test wird im Detail in Gay et al., „The Living Skin Equivalent as a Model in Vitro for Ranking the Toxic Potential of Dermal Irritants", Toxic. in Vitro, 6: 303–315 (1992), beschrieben. Die metabolische Reduktion des löslichen Tetrazoliumsalzes auf ein Blau-Formazan-Präzipitat hängt von der Gegenwart lebensfähiger Zellen mit intakter mitochondrialer Funktion ab. Dieser Test wird verwendet, um die Zytotoxizität in einer Reihe von Zelltypen zu quantifizieren, einschließlich der kultivierten humanen Keratinocyten.
Zu den Kulturschalen, welche LSE enthielten, wurde epidermales Blatt und dermales Äquivalent, 40 mL von Testmedium und zu den Vertiefungen, welche Hornhautäquivalente enthielten, 1,5 mL Testmedium hinzugefügt, welches 0,33 mg/mL MTT (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt. Die Gewebeäquivalente wurden 3 bis 4 Stunden lang in dem MTT-Testmedium inkubiert. Am Ende der Umwandlungsperiode wurde das Gewebeäquivalent unter Verwendung einer Hautbiopsiestanze mit einem Durchmesser von 8 mm biopsiert. Die Stanzbiopsien wurden danach 2 bis 3 Stunden lang bei Raumtemperatur in 0,3 mL Isopropanol extrahiert, das mit 0,04 N HCl angesäuert wurde. Am Ende der Extraktionsperiode wurden 0,2 mL jedes Extraktes zu einer Vertiefung einer 96-Vertiefungen-Platte übertragen. Das Aufnahmevermögen wurde auf einem Plattenleser (Dynatech) bei 570 nm gelesen, wobei das Isopropanol-Extraktionsmedium als Blindwert galt. Die MTT-Werte, die aus den aufgetauten kältekonservierten Proben erhalten worden waren, wurden mit entsprechenden Kontrollproben verglichen und in Prozent der Kontrolle (9) ausgedrückt.
Beispiel 10: Lactose-Dehydrogenase-Test (LDH)
LDH ist ein Enzym, das typischerweise in einer lebensfähigen Zelle vorkommt. Eine Beschädigung der Zelle führt zu einem Freisetzen des Enzyms und einer entsprechenden Abnahme der Enzymaktivität, die durch diesen Test erfasst wird.
Aufgetaute kältekonservierte und Kontroll-Proben von LSE wurden mit einer Hautbiopsiestanze, welche einen Durchmesser von 8 mm aufwies, gestanzt. Drei Proben wurden von jeder LSE-Einheit entnommen. Die Stanzproben wurden in ein 15-mm-Rohr mit 1 mL von 0,1 M Triethanolaminpuffer (auf Eis) platziert und mit einem elektrischen Gewebehomogenisator eine Minute lang homogenisiert. Danach wurden die Proben mit 1000 g bei 4,0°C zentrifugiert. Die Überstandsflüssigkeit wurde im Anschluss daran getestet. LDH-Cocktail-Reagens wurde hergestellt, indem Folgendes miteinander gemischt wurde: 3,00 mL Phosphatpuffer (0,1 Mol/l, pH-Wert von 7,0), 0,1 mL Pyruvat, Na-Salz (2,5 mg/mL) und 0,05 mL NADH, Na-Salz (10 mg/mL). 100 μl der Proben-Überstandsflüssigkeit wurden zu 900 μL der Reagenzien hinzugefügt, und es wurde ihr erlaubt, zwei Minuten lang zu reagieren. Die Veränderung der Aufnahmefähigkeit im Laufe der zwei Minuten wurde aufgezeichnet. Der Durchschnitt von drei Proben pro kältekonservierter LSE-Einheit wurde mit den nicht gefrorenen Kontrollen verglichen. Die Probenwerte wurden mit den entsprechenden Kontrollwerten verglichen und in Prozent der Kontrolle (9) ausgedrückt.
Beispiel 11: Bioäquivalenz von kältekonserviertem LSE zu nicht kältekonserviertem LSE
Um die Bioäquivalenz von kältekonserviertem und nicht kältekonserviertem LSE nachzuweisen, wurde eine Verpflanzungsstudie mit athymischen Mäusen durchgeführt.
LSE-Einheiten, die gemäß des in Beispiel 1 dargelegten Verfahrens kältekonserviert wurden, wurden einen Tag vor dem Verpflanzen aufgetaut und in einem Bewahrungsmedium 25 Stunden lang wiedergewonnen.
Es wurden vier Experimente durchgeführt, bei denen insgesamt 66 athymische Mäuse des Stamms B6CB6YF1/J-nu (Jackson Harbor Labs) entweder mit kältekonserviertem LSE (n = 43) oder nicht kältekonserviertem (Kontrolle) LSE (n = 23) verpflanzt wurden. Die Tiere wurden mit Nembutal anästhesiert. Ein Hautabschnitt von 2 × 2 cm mit voller Dicke wurde aus dem Rücken jeder Maus geschnitten, wobei das Panicculus Carnosus verschont blieb. LSE-Transplantate – entweder der Kontrolle oder kältekonservierte – wurden auf die Wunde aufgelegt und so zugeschnitten, dass sie passten. Alle Transplantate wurden mit einer Schicht von Petrolatum-imprägniertem Verbandsmull (Verkäufer) umwickelt und durch zwei Heftpflaster (Verkäufer) bedeckt. Die Verbände wurden 7 Tage nach der Verpflanzung entfernt.
14 Tage nach der Verpflanzung wurden alle Tiere euthanisiert und fotografiert. Die Verpflanzungsstelle wurde danach zum Zwecke einer histologischen Analyse und Bewertung ausgeschnitten. Die Grobfotografien und Mikrographen zeigten, dass es keinen Unterschied bei der Transplantatintegration zwischen dem Kontroll-LSE und dem aufgetauten, kältekonservierten LSE gab. Es wurden keine wesentlichen Unterschiede bei der Rate der Wundkontraktur zwischen den Kontroll-Transplantaten und den kältekonservierten Transplantaten festgestellt.
Beispiel 12: Syngenes Hautverpflanzen von kältekonservierter Mäusehaut und Kontroll-Mäusehaut
Um die Bioäquivalenz von kältekonservierter und nicht kältekonservierter Mäusehaut nachzuweisen, wurde eine syngene Hautverpflanzungsstudie durchgeführt.
Wildtypmaus, Stamm B6CB6YF1, wurden durch eine Nembutal-Überdosis euthanisiert. Die Haut wurde aseptisch geerntet. Überschüssige Blutgefäße, Fett- und Bindegewebe wurden aus der Dermis in Vorbereitung auf die Hautverpflanzung entfernt. Mäusehaut wurde kältekonserviert und gemäß dem Verfahren in Beispiel 7 aufgetaut. Nicht kältekonservierte Kontroll-Mäusehaut wurde in einem Nährstoffmedium bei 4°C für die Dauer des Kältekonservierungs- und Auftauverfahrens, insgesamt zwei Tage, vor der Hautverpflanzung aufbewahrt.
Sechs Mäuse desselben Stammes erhielten Hauttransplantate, zwei erhielten nicht kältekonservierte Kontroll-Mäusehaut und vier erhielten aufgetaute, kältekonservierte Mäusehaut. Die Mäuse wurden mit Nembutal anästhesiert. Ein Hautabschnitt von 2 × 2 cm mit voller Dicke wurde aus dem Rücken jeder Maus geschnitten, wobei das Paniculus Carnosus verschont blieb. Mäusehaut-Transplantate, entweder von der Kontrollgruppe oder kältekonservierte, wurden auf die Wunden platziert und so zugeschnitten, dass sie passten. Alle Transplantate wurden mit einer Schicht von Petrolatum-imprägniertem Verbandsmull umwickelt, bedeckt von zwei Heftpflastern. Diese Verbände wurden 7 Tage nach der Verpflanzung entfernt.
Dreißig Tage nach der Verpflanzung wurden alle Tiere euthanisiert und fotografiert. Die Verpflanzungsstelle wurde danach zum Zwecke einer histologischen Analyse und Bewertung ausgeschnitten. Die Grobfotografien und Mikrographen zeigten, dass es keinen Unterschied bei der Transplantatintegration zwischen der Kontroll-Mäusehaut und der aufgetauten, kältekonservierten Mäusehaut gab. Es wurden keine wesentlichen Unterschiede bei der Rate der Wundkontraktur zwischen den Kontroll-Transplantaten und den kältekonservierten Transplantaten festgestellt.
Obwohl die vorerwähnte Erfindung in einem gewissen Ausmaß detailliert mit Hilfe von Darstellungen und beispielhaft zu Zwecken des besseren Verständnisses beschrieben wurde, wird Fachleuten klar sein, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Schutzumfanges der beiliegenden Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

Verfahren zur Kältekonservierung eines geernteten Säugetiergewebes oder eines kultivierten Gewebsäquivalentes, die folgendes enthält: a. Eintauchen des vorerwähnten Gewebes in eine Kälteschutzmittellösung, Schütteln der vorerwähnten Kälteschutzmittellösung und des vorerwähnten eingetauchten Gewebes, um das wirksame Eindringen der Kälteschutzmittellösung in das vorerwähnte Gewebe zu erreichen und um ein durchdrungenes Gewebe zu erreichen. b. Impfen von extrazellulärem Eis in die vorerwähnte Kälteschutzmittellösung und das durchdrungene Gewebe. c. Kühlen des vorerwähnten durchdrungenen Gewebes von Schritt b. in einen kältekonservierten Zustand durch Gefrieren des vorerwähnten Gewebes mit einer niedrigen Gefrierrate auf eine Temperatur bei etwa oder tiefer als mindestens –70°C, um ein kältekonserviertes Gewebe zu erzeugen. d. Lagerung des vorerwähnten kältekonservierten Gewebes bei einer Temperatur von mindestens –70°C oder darunter.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das vorerwähnte Eintauchen in Schritt a. bei einer Anfangstemperatur von etwa 20°C ausgeführt wird und diese dann während der Perfusion mit einer Rate von etwa –10°C/Minute auf eine Temperatur von etwa –6°C abgekühlt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefrieren in Schritt c. mit einer Rate von –1°C/Minute auf eine Temperatur von etwa –8°C erfolgt und über einen Zeitraum aufrecht erhalten wird, der für einen physikalischen und biologischen Äquilibrierung der vorerwähnten Kälteschutzmittellösung im vorerwähnten Gewebe ausreicht.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur in Schritt c. über einen Zeitraum aufrecht erhalten wird, der für einen physikalischen und biologischen Äquilibrierung der vorerwähnten Kälteschutzmittellösung im vorerwähnten Gewebe ausreicht.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die vorerwähnte Kühlung mit einer Rate von etwa –0,3°C/Minute bis –0,02°C/Minute bis zu einer Temperatur von etwa –70°C oder weniger fortgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das vorerwähnte geerntete Säugetiergewebe geerntete Säugetierhaut ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das vorerwähnte kultivierte Gewebsäquivalent aus der Gruppe gewählt wird, die aus kultiviertem epidermalem Äquivalent, kultiviertem dermalem Äquivalent und kultiviertem Cornea-Äquivalent besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die vorerwähnte Temperatur des vorerwähnten kältekonservierten Zustands bei –120°C oder darunter bis zu –196°C oder darunter liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kälteschutzmittellösung 1,5 M bis 2,5 M Glycerin in einem Grundstoff aus Dulbeccos Modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiters das Auftauen des vorerwähnten kältekonservierten Gewebes enthält, wobei dieses Gewebe in etwa 1 bis etwa 2 Minuten aufgetaut wird.