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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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1. Gebiet
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Kältekonservierung sowohl von
geerntetem Gewebe als auch kultivierten Gewebeäquivalenten, die unter Anwendung
von In-Vitro-Technologie
erzeugt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Kältekonservierungs-Verpackungsanordnung
sowohl für
geerntetes Gewebe als auch kultivierte Gewebeäquivalente, das sowohl eine
kosteneffiziente als auch leicht zu handhabende Verpackungsanordnung
ist, welche eine maximale Lebensfähigkeit des Gewebes oder des
Gewebeäquivalenten
ermöglicht,
die kältekonserviert
werden sollen. Mit Hilfe der Kältekonservierungstechnologie
können
entweder kältekonserviertes
geerntetes Gewebe oder kältekonserviertes
kultiviertes Gewebe über
unbestimmte Zeiträume
vor ihrer Verwendung gelagert werden. Das kultivierte Gewebe ist
ein In-Vitro-Modell des äquivalenten menschlichen
Gewebes, welches, wenn es aus dem Lager entnommen wird, für Transplantation
oder Implantation, in vivo, oder für Screening-Verbindungen in vitro verwendet werden
kann.
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2. Kurze Beschreibung
des Hintergrunds der Erfindung
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Mit
der In-Vitro-Technologie wurden Gewebeäquivalente zum Zwecke des In-Vitro-Testens oder der
In-Vivo-Verpflanzung zur Wundversorgung entwickelt. Verfahren zur
Herstellung dieser Gewebeäquivalente
sind in den US-Patentschriften Nr. 4,485,096, 4,604,346, 4,835,102
und 5,374,515 und in EP-A-0418035 und WO 94/10940 offenbart.
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Die
Haltbarkeit von Lebendgeweben ist beschränkt, und infolgedessen ist
ihr Verwendungsfenster kurz, was zu einer großen Menge an Abfall führt. Es
besteht ein Bedarf daran, solche Gewebe über längere Zeiträume, beispielsweise für Zeiträume während des
Versendens und Lagerns, zu konservieren, bevor diese Gewebe verwendet
werden. Sowohl die Entwicklung eines Kältekonservierungsverfahrens
als auch einer Verpackung zur Kältekonservierung
und Lagerung würden
das Verwendungsfenster unbegrenzt verlängern, den Versand erleichtern
und die Führung
eines Inventars ermöglichen. Die
Ermöglichung
eines Gewebeinventars in Zentren zur Behandlung von Verbrennungsopfern
und Krankenhäusern
ist ebenso wünschenswert.
Andere Vorteile liegen darin, dass Proben aus verschiedenen Phasen
des Herstellungszyklus für
Qualitätskontrollarchive
einbehalten und größere Produktionschargen
hergestellt werden können,
da sich diese in einem gefrorenen Zustand aufbewahren lassen.
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Zum
gegenwärtigen
Zeitpunkt wird die Lagerzeit von zellulären biologischen Materialien durch
Abkühlen
auf „kältekonservierende" Temperaturen verlängert. Der Übergang
vom Flüssigzustand in
den Festzustand durch Herabsenken der Temperatur des Systems kann
entweder als Kristallisierung (Eis), wobei eine ordnungsmäßige Anordnung
von Wassermolekülen
durchgeführt
wird, oder als Vitrifikation oder Amorphisierung (Glasbildung) in
Abwesenheit einer solchen ordnungsmäßigen Anordnung von kristalliner
Phase erfolgen. Die Herausforderung für einen Kryobiologen besteht
darin, Zellen auf kältekonservierende
Temperaturen zu bringen und diese dann auf physiologische Bedingungen
zurückzuführen, ohne
sie zu beschädigen.
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Es
gibt zwei grundsätzliche
Ansätze
in Bezug auf die Kältekonservierung
von Zellen und Geweben: Gefrierauftauen und Vitrifikation. Bei den
Gefrierauftautechniken wird die extrazelluläre Lösung gefroren (z. B. in kristalliner
Form), wobei jedoch Maßnahmen
ergriffen werden, um die intrazelluläre Eisbildung zu minimieren.
Bei Vitrifikationsverfahren wird versucht, die Eisbildung während der
gesamten Probe hindurch zu verhindern. Der frühere Ansatz ist insofern problematisch,
als für
den Fall, dass Eiskristalle innerhalb der Zellen gebildet werden,
sich diese beim Auftauen nachteilig auf die Zelllebensfähigkeit auswirken.
Dennoch könnten
Zellen einen Gefrier-Auftau-Zyklus überleben, wenn sie mit kontrollierten
Raten in der Gegenwart von nicht-toxischen Gehalten an Kälteschutzmitteln
abgekühlt
werden. Letzterer Ansatz bei der Vitrifikation versucht, die potentiell
schädlichen
Auswirkungen von intra- und extrazellulärem Eis durch Vermindern der
Eisbildung unter Verwendung von sehr hohen Konzentrationen an gelösten Stoffen
und/oder Polymeren zu vermeiden. Bei langem Ausgesetztsein gegenüber toxischen
Gehalten dieser Zusatzstoffe, die für die Vitrifikation erforderlich
sind, kann es jedoch zu einer Zellschädigung kommen.
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Kälteschutzmittel
schützen
Lebendzellen vor den Belastungen, die sich im Rahmen des Gefrierverfahrens
ergeben. Eine Art, in der Kälteschutzmittel
Zellen schützen,
besteht darin, dass das Salz verdünnt wird, das in der ungefrorenen
Lösung
immer konzentrierter wird, während
Wasser zu Eis umgewandelt wird. Die Menge an Eis wird durch die
Temperatur und die anfängliche
Zusammensetzung der Lösung
bestimmt, während
die Menge an ungefrorenem Anteil nur eine Funktion der Temperatur
ist. Kälteschutzmittel
weisen mehrere andere Funktionen auf. Eine wichtige Funktion besteht
darin, dass sie für gewöhnlich die
Temperaturen der intrazellulären
Eisbildung reduzieren. Eine weitere Funktion besteht darin, dass
sie Membranen und Proteine stabilisieren.
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Alle
Lösungen
werden unter ihren Gefrierpunkt supergekühlt, bis sie eine zufällige Keimbildungsstelle
für die
Kristallbildung gefunden haben. Bei einer Kältekonservierung durch ein
Gefrier-Auftau-Verfahren sollte die Eisbildung in dem extrazellulären Medium
bewusst durch Impfen bei niedrigen Graden des Superkühlens initiiert
werden. Wenn die Eisbildung nicht durch Impfen herbeigeführt wird, wird
sich das Eis spontan bilden, wenn die Lösung ausreichend weit unter
ihrem Gleichgewichtsgefrierpunkt abgekühlt wird. Da dieses Verfahren
von Natur aus zufällig
ist, erfolgt die Eisbildung bei zufälligen, unvorhersehbaren Temperaturen;
infolgedessen unterliegen die Überlebensraten
zwischen wiederholten Versuchen mit demselben Gefrierprotokoll starken Schwankungen.
Ferner kann die extrem schnelle Kristallisierung, zu der es kommt,
wenn sich Eis in einer stark supergekühlten Lösung bildet, bei den Zellen
und Geweben Schäden
anrichten. Darüber
hinaus wurde gezeigt, dass – wenn
extrazelluläre
Eisbildung bei hohen Graden des Superkühlens initiiert wird – die Wahrscheinlichkeit
von intrazellulärer
Eisbildung drastisch zunimmt. Dieses Phänomen ergibt sich aus dem verzögerten Beginn
der gefrierinduzierten Zelldehydrierung, was zu vermehrter Rückhaltung
von intrazellulären
Wasser und somit zu einer höheren
Wahrscheinlichkeit der Eisbildung in der Zelle führt.
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Sobald
das extrazelluläre
Eis geimpft ist und die Probe von der Eisphase umgeben ist, ist
es notwendig, die Probe auf einen kältegefrorenen Zustand abzukühlen. Der
Kühlschritt
ist einer der kritischsten Schritte in einem Gefrier-Auftau-Protokoll.
Aufgrund der Bildung von Eis, d. h. reinem Wasser, ist die teilweise
gefrorene extrazelluläre
Lösung
konzentrierter als das intrazelluläre Kompartiment. Infolgedessen wird
die Zelle dehydrieren, indem sie Wasser verliert, in dem Versuch,
das thermodynamische Gleichgewicht wiederherzustellen. Während das
System abkühlt,
wird mehr extrazelluläres
Eis erzeugt und die Konzentration an gelösten Stoffen steigt und zwingt die
Zellen, weiter zu dehydrieren. Es gibt drei Eigenschaften der Zellen,
welche ihre Dehydrierungsrate regeln. Eine ist die Zellmembran-Wasserdurchlässigkeit;
je geringer die Wasserdurchlässigkeit,
desto länger
brauchen die Zellen, um zu dehydrieren. Eine weitere Eigenschaft
ist die Temperaturabhängigkeit von
der Zellmembran-Wasserdurchlässigkeit;
alle Zellen verringern ihre Wasserdurchlässigkeit mit abnehmenden Temperaturen.
Die letzte Eigenschaft ist die Zellgröße; größere Zellen brauchen länger, um
zu dehydrieren als kleinere. Angesichts des Umstandes, dass jeder
Zelltyp deutlich unterschiedliche Eigenschaften aufweisen kann,
können
die optimalen Kältekonservierungsbedingungen
um Größenordnungen
für verschiedene
Zelltypen variieren.
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Obwohl
die genauen Mechanismen der Zellschädigung während der Kältekonservierung noch nicht
vollständig
geklärt
wurden, scheinen charakteristische Überlebenssignaturen, die durch
Messen des Zellüberlebens
als eine Funktion der Kühlrate
erzeugt wurden, qualitativ für
alle Zelltypen ähnlich
zu sein und zeigen eine umgekehrte U-förmige Kurve. Das Zellüberleben
ist bei sehr langsamen und sehr schnellen Kühlraten gering, und es gibt
eine dazwischen liegende Kühlrate,
die optimales Überleben
erzielt. Obwohl die optimale Kühlrate
und die Breite der Kurve drastisch für verschiedene Zelltypen variieren können, scheint
das qualitative Verhalten universell zu sein. Schnellere Kühlraten
geben den Zellen nicht genügend
Zeit, um zu dehydrieren, und Zellen bilden Eis intern. Die Zellverletzung
bei schnellen Kühlraten wird
intrazellulärer
Eisbildung zugeschrieben. Bei langsamen Kühlraten nimmt man an, dass
die Zellverletzung auf die Auswirkungen des Ausgesetztseins gegenüber hoch
konzentrierten intra- und
extrazellulären
Salz- und Kälteschutzmittellösungen oder
auf die mechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen und dem extrazellulären Eis
zurückzuführen ist.
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Es
ist notwendig, die Zellen so weit wie möglich zu dehydrieren, bevor
sie die intrazelluläre
Eiskeimbildungskurve kreuzen. Es ist an diesem Punkt, wo praktisch
das gesamte Wasser, das in den Zellen verbleibt, keimbildend wirkt
und Eis bildet. Es ist nicht praktikabel, die genaue Temperatur
zu bestimmen, bei der dies geschieht, aber sie liegt bei ungefähr –40°C bis –50°C, wenn die
Zellen langsam in Gegenwart von 1 M bis 2 M Konzentrationen von
Kälteschutzmitteln
gefroren werden. Es ist wichtig, festzuhalten, dass die Menge an
Wasser, die innerhalb einer Zelle an diesem Punkt zu Eis wird, nicht
schädlich ist,
wenn sie gefroren ist, aber wenn sie schnell genug aufgetaut wird,
wird sie sich ausbreiten und die Zelle beim Auftauen töten (The
Biophysics of Organ Cryopreservation. Seite 117–140, herausgegeben von David
E. Pegg und Armand M. Karow, Nr., NATO ASI Series A: Life Sciences,
Band 147, 1987 Plenum Press, New York, 233 Spring St., New York,
NY 10013).
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Vor
der Entwicklung von kommerziell nutzbarem Hautäquivalent wurde Leichenhaut
für die
Zwecke der Verpflanzung verwendet. Kältekonservierungsprotokolle
wurden entwickelt, so dass Zentren zur Behandlung von Verbrennungsopfern
und Krankenhäuser
Hautbanken führen
konnten. Eine Reihe von unterschiedlichen Protokollen wurden unter
Verwendung verschiedener Kälteschutzmittel,
Gefrierraten, Verpackungsformate und Lagerbedingungen entwickelt.
Die meisten Forscher einigten sich auf ein schnelles Auftauprotokoll.
Der Erfolg oder das Scheitern des Protokolls wurde entweder durch
eine Transplantatannahme bei einem Wundbett oder durch einen Zell-Lebensfähigkeitstest
gemessen.
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In
der US-Patentschrift 3,842,831 an Beisang wird ein Verfahren zur
Kältekonservierung
von Leichen-Hautteilen offenbart. Dieses Verfahren schließt das Anbringen
der Leichenhaut an einem lose gewobenen Mull oder Trägergewebe
ein, wobei die Hautteile und der Mull gemeinsam vor dem Gefrieren
gewalzt werden. Es wird kein Kälteschutzmittel
verwendet, obwohl die Erfinder die Verwendung von Glycerin oder
DMSO vorschlagen. Das Gefrierprotokoll verwendet ein Protokoll mit
schneller unkontrollierter (mit feststehender Temperatur) Gefrierrate
bei einer kältekonservierenden
Temperatur von –70°C.
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May
SR und FA DeClement (Skin Banking Methodology, 17, 33–45 (1980))
haben eine Bewertung der Verpackungsgeometrie und der Kühl- und Erwärmungsraten
unter Verwendung von dermatomer Leichenhaut durchgeführt. Die
Ergebnisse ließen
den Schluss zu, dass Leichenhaut flach, anstatt gerollt, sein und
dass eine geringe kontrollierte Gefrierrate verwendet werden sollte.
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Die
Patentschrift U.S. 5,040,677 an Tubo offenbart einen gasdichten
versiegelbaren Behälter
für einzelne
Transplantate von Epithelzellblättern.
Der Behälter
erfordert, dass das Epithelzellblatt an einer haftenden Substratschicht
oder einem Trägergewebe durch
Verwendung von Klemmen befestigt wird.
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Die
US-Patentschrift 5,145,770 an Tubo offenbart ein Kältekonservierungsverfahren
für Keratinocytenblättern, welches
ein Kälteschutzmittel
eines nicht zellendurchdringenden Mittels, wie Dextran, und eines
zelldurchdringenden Reagens, wie Glycerol, verwendet, mit einer
Kühlrate
von ungefähr –1°C/Minute. Ähnlich offenbart
EP 0 364 306 an Chao et
al. ein Verfahren zum Kältekonservieren
eines Blattes von lebenden, kultivierten Epithelzellen, aber unter
Verwendung von DMSO und Glycerol als Kälteschutzmittel und eines Gefrierprotokolls
von vorzugsweise –1°C/Minute.
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Die
US-Patentschrift 5,298,417 an Cancedda et al. offenbart ein Kältekonservierungsprotokoll, das
für einschichtige
Konstrukte, wie Epithelblätter, entwickelt
wurde, die wie in
US 4,016,036 ,
4,304,866 und
4,456,687 beschrieben
hergestellt werden. Epidermale Blätter wurden mit einem Kälteschutzmittel von
entweder 8 bis 15% Glycerol oder DMSO inkubiert und durch Verwendung
eines Protokolls mit kontrollierter Rate kältekonserviert, wobei die Kühlrate am
Beginn langsamer als am Ende des Protokolls und durch einen Temperaturanstieg
vor dem Höhepunkt
des Gefrierverfahrens gekennzeichnet ist.
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Ein
Verfahren zur Kältekonservierung
von dermalen Fibroblasten in einem Collagen-Gel wurde von Teasdale
et al., Burns, 19 (5) 406–410
(1993) untersucht. Teasdale bestimmte, dass die optimale Zelllebensfähigkeit
durch Gefrieren bei –0,5°C/Minute bei
Verwendung von DMSO als Kälteschutzmittel
erzielt werden konnte.
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Nanchahal
et al., „Cultured
composite skin grafts: Biological skin equivalents permitting massive expansion", The Lancet, 2 (8565),
191–193
(22. Juli 1989), bespricht eine Technik zur Lagerung von kultivierten
Verbundgewebetransplantaten unter Verwendung eines Kälteschutzmittels
aus 15% Glycerol und 10% FCS in Medium 199. Die Transplantate und
das Kälteschutzmittel
wurden zwei Stunden lang bei 37°C
inkubiert und danach bei –1°C pro Minute
auf –70°C gefroren
und im Anschluss daran in Flüssigstickstoff
gelagert. Nach einem Schnellauftauen der Transplantate wurde ihre
Lebensfähigkeit
durch zweiwöchiges
Kultivieren und durch Verpflanzen auf haarlose Mäuse bestimmt. Eine endgültige Bewertung
erfolgte durch Verpflanzung auf drei Patienten, die sich der Entfernung
von Tätowierungen
unterzogen hatten.
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Johnstone
et al. „Cryopreservation
of Rabbit and Cat Corneas at –18
to –24°C", Cornea, 11(3): 211–220 (1992),
behandelt ein einfaches Verfahren zur Kältekonservierung von Kaninchen-
und Katzenhornhaut, bei dem ein Haushaltsgefriergerät anstatt Flüssigstickstoff
oder Gefriergeräte
mit sehr niedrigen Temperaturen verwendet werden. Die Perfusion des
Kältekonservierungsmittels
wird erhalten, indem die Hornhäute
in aufeinander folgenden Lösungen von
50% fötalem
Kalbsserum und McCarey-Kaufman-Medium mit zunehmendem Glycerol-
und Glucose-Gehalt angeordnet werden.
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US 5,131,850 offenbart ein
Verfahren zur Kältekonservierung
von Skelettmuskulaturgeweben durch Anordnen solchen Gewebes in Kontakt
mit einer Zusammensetzung, die ein Kältekonservierungsmittel enthält, das
einen zelldurchdringenden organischen gelösten Stoff aufweist, der vorzugsweise
Dimethylsulfoxid ist, und ein Glycosaminoglycan, das vorzugsweise
Chondroitinsulfat ist, in einer Menge, die ausreichend ist, um eine
Kältekonservierung
des Skelettmuskelgewebes durchzuführen. Die Zugabe von Glycosaminoglycan
zu einem kältekonservierenden
Mittel, das einen zelldurchdringenden organischen gelösten Stoff
aufweist, ermöglicht
die Verwendung einer großen
Bandbreite an Kühlraten.
Die Kältekonservierung
wird vorzugsweise innerhalb von 20 bis 60 Minuten nach der Zugabe
des kältekonservierenden
Mittels initiiert. Der Wechsel von Wasser zu Eisphase wird bei –2°C bis –6°C durch ein
Bersten von Flüssigstickstoff,
sterilem Eiskristall oder durch Vibration initiiert. Ferner werden
ein Gefrierplan, der so gestaltet ist, dass er die Aufrechterhaltung
von Zellgewebelebensfähigkeit
und von biomechanischen Eigenschaften während des und nach dem Gefrierverfahren
maximiert, und ein Auftauplan offenbart, der die Zelllebensfähigkeit
maximiert.
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US 5,298,417 beschreibt
ein Verfahren zum Konservieren von kultivierten epidermalen Blättern durch
Inkubieren der Blätter
bei Raumtemperatur in Medien mit einem Glycerol- oder Dimethylsulfoxid-Kältekonservierungsmittel über einen
vorbestimmten Zeitraum und anschließendes Gefrieren der kultivierten
Blätter.
Der Kühlgradient
ist durch eine geringe Anfangskühlrate,
gefolgt von einer höheren
Kühlrate,
gekennzeichnet. Das Beispiel beschreibt Taschen, die Gewebestücke enthalten,
die thermisch versiegelt sind und bei Raumtemperatur zwischen 5
bis 7 Minuten inkubiert werden. Die Taschen werden in einen geeigneten
Behälter gegeben und
in eine programmierbare Gefriervorrichtung transferiert. Die Gewebestücke werden
danach unter Verwendung eines Gefrierprogramms gefroren. Die Taschen,
welche die gefrorenen Epithelblätter
enthalten, werden bei einer Temperatur von –80°C gelagert.
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Unter
Verwendung von Verfahren des bekannten Stands der Technik ist es
nicht möglich,
eine Kältekonservierung
von kultivierten Gewebeäquivalenten
durchzuführen,
teilweise weil sie relativ dick sind und heterogene Zellschichten
aufweisen. Eine der Funktionen dieser Gewebe in vivo besteht darin, eine
Durchlässigkeitsbarriere
bereitzustellen. Gewebefunktionen müssen bei der Entwicklung eines
Kältekonservierungsprotokolls
berücksichtigt
werden.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ein Verfahren zur Kältekonservierung,
und insbesondere eine Verpackungsanordnung, entdeckt, das auf eine
Reihe von kultivierten Gewebeäquivalenten und
auf Säugetierhaut
anwendbar ist, eines, das eine überraschend
effektive und kommerziell praktische Verpackung für die Kältekonservierung
von kultivierten Gewebeäquivalenten
ist.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur erfolgreichen Kältekonservierung
von kultivierten Gewebeäquivalenten
bei sehr niedrigen Temperaturen bereit, welches die Bildung von
schädlichen
intrazellulären
Eiskristallen verhindert, eine effektive Konzentration an potentiell
schädlichen
Chemikalien minimiert und das schnelle Einführen und Entfernen von Kälteschutzmitteln
bei machbaren Temperaturen unter Verwendung einer programmierbaren
Gefrierausrüstung
ermöglicht.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner eine neue Verpackungsanordnung
bereit, die für
die Kältekonservierung,
die Lagerung und Verteilung von kultivierten Gewebeäquivalenten
entwickelt wurde. Die neue Anordnung bietet im Vergleich zu bestehenden
Verpackungsanordnungen sehr viele Vorteile. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt
gibt es keine im Handel erhältlichen
kältekonservierten
kultivierten Gewebeäquivalente,
daher sind keine serienmäßigen Verpackungsanordnungen
verfügbar.
Das Design der neuen Verpackung ermöglicht eine bessere Temperaturverfolgung
des Verpackungsinneren mit der Außentemperatur der Gefrierkammer
aufgrund einer effizienteren Wärmeübertragung.
Eine verbesserte Wärmeübertragungsrate
ermöglicht
einen kontrollierteren Prozess, somit einheitliche Kühl- und
Erwärmungsraten
des kultivierten Gewebeäquivalents,
wodurch die Schwankung bei der Zelllebensfähigkeit reduziert wird.
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Die
Erfinder haben ein Verfahren zur Kältekonservierung von kultivierten
Gewebeäquivalenten hergestellt
aus In-Vitro-Techniken entdeckt, so dass die Gewebe ihre Lebensfähigkeit
und Nützlichkeit
als Äquivalente
von menschlichen Geweben beibehalten. Die Erfindung schließt die Anwendung
von Schütteln
ein, um das Durchdringen einer effektiven Menge von Kälteschutzmittel
zu verstärken.
Das vorliegende Verfahren stellt die Kältekonservierung von geerntetem
Gewebe und kultivierten Gewebeäquivalenten
in einer Weise bereit, welche die strukturelle Integrität und die
zelluläre
Lebensfähigkeit
schützt.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung schließt folgende Schritte ein:
- 1) Das geerntete Gewebe oder das kultivierte
Gewebeäquivalent
werden in eine Kälteschutzmittellösung eingetaucht,
und die Kälteschutzmittellösung und
das eingetauchte Gewebe werden geschüttelt, um ein effektives Eindringen
der Kälteschutzmittellösung in
das Gewebe (Perfusion des Gewebes) zu erreichen, und
- 2) nach der Perfusion der Kälteschutzmittellösung in
das Gewebe, Abkühlen
auf einen Fest-Flüssigphasen-Gleichgewichtstemperaturbereich
für das Kälteschutzmittel,
Impfen von extrazellulärem
Eis und Abkühlen
auf einen kältekonservierten
Zustand durch Gefrieren des Gewebes mit einer niedrigen Gefrierrate
auf eine Temperatur bei etwa oder tiefer als mindestens –70°C, bevorzugter
bei oder tiefer als –120°C, noch bevorzugter bei –140°C und am
bevorzugtesten bei –196°C.
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Sobald
es gefroren ist, kann das kältekonservierte
Gewebe über
unbestimmte Zeiträume
hinweg zwischen Temperaturen von ungefähr –120°C bis ungefähr –196°C, der Temperatur von Flüssigstickstoff gelagert
werden.
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Das
Auftauen des kältekonservierten
Gewebes erfolgt durch Wärmen
des gefrorenen Gewebes mit einer hohen Rate, was in ungefähr 1 bis
2 Minuten erfolgt. Das gefrorene Gewebe kann durch direktes Ausbringen
von erwärmtem
Kulturmedium oder durch eine physiologisch gepufferte Lösung oder durch
ein anderes schnelles Erhitzungsverfahren aufgetaut werden. Die
Verpackungsanordnung ermöglicht
ein Auftauen des Gewebes durch Eintauchen der Verpackung in ein
Wasserbad, da die Verpackungsanordnung sowohl eine schnelle Erwärmungsrate
als auch eine kontrollierte thermale Gleichmäßigkeit gewährleistet, während im
Laufe des kritischen Auftauverfahrens die Sterilität aufrecht erhalten
wird.
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Vor
der Verwendung als Äquivalent
für menschliches
Gewebe, für
eine Verpflanzung oder für
In-Vitro-Testen, wird das aufgetaute kultivierte Gewebeäquivalent
gespült,
um die Kälteschutzmittellösung zu
entfernen. Die Kälteschutzmittellösung kann durch
Spülen
mit – zum
Beispiel – einer
isotonen Pufferlösung
mit physiologischem pH-Wert entfernt werden. Die kultivierten Gewebeäquivalente
können
danach vorübergehend
in einer solchen Pufferlösung gelagert
oder vor Verwendung in einem geeigneten Zellmedium rekultiviert
werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
FIGUREN
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1A und 1B zeigen
Ansichten des Deckels.
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2 zeigt
eine Draufsicht der Dichtung.
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3A und 3B zeigen
Ansichten der auf dem Deckel befestigten Dichtung.
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4A und 4B zeigen
Ansichten des Trägers.
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5A und 5B zeigen
Ansichten der Schale.
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6A und 6B zeigen
Seitenansichten des Zusammenbaus, auseinandergezogen und fertiggestellt.
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7 zeigt
eine Nahansicht des Zusammenbaus.
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8 zeigt
eine Draufsicht des fertiggestellten Zusammenbaus.
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9 zeigt
ein Diagramm der Lebensfähigkeit
von kältekonservierten
kultivierten Geweben im Vergleich zur Lebensfähigkeit von nicht-kältekonservierten
kultivierten Geweben. Die Lebensfähigkeit von kältekonservierten
kultivierten Geweben, gemessen durch MTT, wird dargestellt. LSE
wurde zusätzlich
durch einen LDH-Test gemessen. Alle kultivierten Gewebe werden mit
altersmäßig abgestimmten nicht-kältekonservierten
Kontrollen verglichen und als Prozentsatz der Kontrolle ausgedrückt.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Gewebe-Konstruieren
ist ein im Aufbau begriffenes Gebiet, das kultivierte Gewebezellen
verwendet, um Gewebeäquivalente
zu konstruieren, die verwendet werden können, um die Reaktion auf Verletzung
durch chemische Wirkstoffe oder pharmazeutische Verbindungen zu überprüfen. Das
kultivierte Gewebe kann auch verwendet werden, um verpflanzbares
menschliches Gewebe zu bilden.
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Gewebeäquivalente
wurden ausführlich
in vielen Patentschriften beschrieben, einschließlich in den US-Patentschriften
Nr. 4,485,096; 4,485,097; 4,539,716; 4,546,500; 4,604,346; 4,837,37
und 5,374,515, von denen alle hiermit durch Bezugnahme aufgenommen
werden. Eine erfolgreiche Anwendung des Gewebeäquivalents wird als das „Lebendhaut-Äquivalent" bezeichnet, welches eine Morphologie
aufweist, die jener echter menschlicher Haut ähnelt. Das Lebendhaut-Äquivalent
[Living Skin Equivalent] (LSE) besteht aus zwei Schichten: Der obere Abschnitt
wird aus differenzierten und mehrschichtigen humanen epidermalen
Keratinocyten hergestellt, die eine untere Schicht von humanen dermalen
Fibroblasten in einer Collagen-Matrix bedecken. Parentau, et al., „Epidermis
Generated in Vitro: Practical Considerations and Applications", J. of Cellular
Biochemistry, 45: 245: 251 (1991); Parentau, et al., „The organotypic
culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form
and function", Cytotechnology,
9: 163–171
(1992), und Bell et al., „The
Living Skin Equivalent: Its Manufacture, Its Organotypic Properties
and Its Responses to Irritants",
Toxic. in Vitro, 5: 591–596
(1991). LSE für
Verpflanzungen wird im Rahmen von klinischen Versuchen auf Indikationen
in Bezug auf Hautwunden mit teilweiser und voller Dicke geprüft: Exzisionschirurgie,
Verbrennungen, Venostase-Geschwüre,
Diabetesgeschwüre, Dekubitus-Geschwüre und chronische
entzündliche Geschwüre. Das
LSE ist ein zweischichtiges in vitro hergestelltes Hautgewebe mit
voller Dicke.
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Ein
In-Vitro-Organäquivalent
der Hornhaut des Auges wurde, wie in der US-Patentschrift Nr. 5,374,515
beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird, entwickelt.
Das Hornhautgewebeäquivalent
weist drei ausgeprägte
Zellschichten auf, die Außenschicht,
ein mehrschichtiges Plattenepithel, die Mittelschicht aus Collagenfasern
und Stromazellen; und eine Innenschicht, einschichtiges Plattenepithel,
auch als Korneaendothel bezeichnet. Ein In-Vitro-Hornhautäquivalent kann für In-Vitro-Toxizitätstests
verwendet werden, um als genaues und kostengünstiges nicht-tierisches prädiktives
Modell von in vivo okularem und dermalem Irritationspotential für viele
Arten von Produkten und Rohmaterialien zu dienen.
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Das
Ziel der Kältekonservierung
besteht in der Bewahrung der strukturellen Integrität und Lebensfähigkeit
von biologischen Materialien für
einen unbestimmten Zeitraum, so dass diese Materialien verfügbar sind
und nach Bedarf verwendet werden können. Komplexe Gewebe mit endlicher
Lebensdauer erfordern eine Kältekonservierung,
um die Produktverfügbarkeit
und -nützlichkeit
zu verlängern.
Die Geschichte der Kältekonservierung
von biologischem Material hat jedoch gezeigt, dass die Optimierung
eines Kältekonservierungsprotokolls
für eine bestimmte
Zelle nicht unbedingt gute Ergebnisse hervorbringt, wenn sie mit
einem anderen Zelltyp oder mit anderen Zellen in einem Gewebe verwendet wird.
Die Entwicklung von spezielleren Verfahren war aufgrund der Unterschiede
in der Zelldichte, in Bezug auf den Wassergehalt und der Ebene der
strukturellen Organisation der Gewebeäquivalente mit voller Dicke
erforderlich. Die Kältekonservierungsprotokolle
der vorliegenden Erfindung sind überraschender Weise
auf die einschichtigen epidermalen und dermalen Schichten alleine,
Zweischicht-Gewebeäquivalente,
dreischichtige Hornhautäquivalente
und geerntete Säugetierhaut
anwendbar. Die Entwicklung einer Verpackungsanordnung macht die
Kältekonservierung
dieser Gewebe für
Verfahren im Produktionsumfang anwendbar.
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So
wie hierin verwendet, steht der Begriff „kultivierte Gewebeäquivalente" für Gewebeäquivalente
aus Säugetier-Geweben,
wobei die Gewebeäquivalente
durch In-Vitro-Techniken
hergestellt werden und einschichtige Hautäquivalente, entweder ein dermales Äquivalent
oder ein epidermales Blatt, Zweischicht-Hautäquivalent, insbesondere LSE,
und dreischichtige Hornhautäquivalente
und Hautäquivalente
einschließen.
Die Morphologie der kultivierten Gewebeäquivalente ist jener von In-Vivo-Säugetierorganen,
typischerweise einem menschlichen Organ, ähnlich. Zur Veranschaulichung
sei erwähnt,
dass die Morphologie von LSE viele Ähnlichkeiten mit menschlicher
Haut hat. Metabolisch und mitotisch aktive humane dermale Fibroblasten
(HDF) werden in der gesamten dermalen Schicht des Konstruktes gefunden,
wobei gezeigt wurde, dass sie Collagen und andere Matrixkomponenten
in das Gitter absondern. Die Epidermis besteht aus einer basalen Schicht,
von der gezeigt wurde, dass sie sich mit einer mitotischen Rate
teilt, die jener von menschlicher Haut ähnlich ist. Die suprabasale
Epidermis zeigt dieselben Strata wie Haut in vivo, mit gut definierten
stacheligen und granulären
Schichten, die Keratohyalin und lamellare Granula enthalten, die
durch ein Stratum Corneum bedeckt sind. Immunohistochemie zeigt
die Gegenwart von extrazellulären
Matrixkomponenten, die routinemäßig an der
dermo-epidermalen Verbindungsstelle in normaler menschlicher Haut gefunden
werden, wie Laminin, Typ-IV-Collagen und Kalanin (GB3).
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Kultivierte
Gewebeäquivalente,
die durch organotypische Kulturverfahren erhalten werden, wie das
Lebendhautäquivalent
(LSE), verwenden einen Träger
als Gerüst,
auf dem die Äquivalente
gebildet werden. Kultivierte Gewebeäquivalente werden auf einem
Träger
hergestellt, der die Handhabung des Konstruktes während der
Herstellung, des Versands und der Endnutzung ermöglicht, ohne das Konstrukt direkt
zu berühren.
Verfahren zur Herstellung von kultivierten Gewebeäquivalenten
auf einem Träger
werden in der US-Patentschrift Nr. 5,374,515 und in EP-A-0418035
und in WO 94/10940 offenbart.
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Ein
Träger
schließt
eine flache durchlässige Membran
ein, die an einem Ende einer im Wesentlichen rohrförmigen Stütze befestigt
ist. Das andere Ende der rohrförmigen
Stütze
schließt
einen sich nach außen
erstreckenden Flansch ein, der wiederum einen Rand trägt, der
am oberen Ende einer Vertiefung in einer Gewebekulturschale und
in der Verpackungsanordnung der vorliegenden Erfindung hängen kann.
Der Membran-Stütze-Bauteil
ist größenmäßig so gestaltet,
dass er mit einer Kulturschale verwendet wird, welche mindestens
eine Vertiefung einer spezifischen Größe aufweist, um über der
Stütze
den geeigneten Abstand bereitzustellen und in das obere Ende der
Vertiefung einzugreifen. Der Membran-Stütze-Bauteil kann in unterschiedlichen Größen ausgeführt werden,
um mit verschiedenen Größen von
Kulturschalen und Kältekonservierungs- und
Lagerverpackungen verwendet zu werden. Ein Beispiel für solche
Träger
ist ein TRANSWELL® (Costar),
wie in der US-Patentschrift Nr. 5,466,602 beschrieben. Änderungen
an der Verpackungsanordnung können
von einem Fachmann durchgeführt werden,
um ähnliche
Träger
unterzubringen, welche unterschiedliche Stützmittel und Eingreifmittel
in den Kulturgefäßen verwenden. Ähnliche
Träger
werden in den US-Patentschriften Nr. 5,358,871 und 5,366,893 bzw.
in der US-Patentschrift Nr. 4,871,674 beschrieben.
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Die
bevorzugte Verpackungsanordnung, die im Verfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, nimmt das Trägergerüst auf und definiert eine Umgebung
um das Gewebeäquivalent
herum, die auf vorbestimmte Spezifikationen hin geregelt werden
kann. Die vorliegende Erfindung verwendet Materialien, die vorzugsweise
von medizinischer Qualität
sind und einer großen
Bandbreite an Temperaturen widerstehen können. Diese Materialien werden geformt,
um eine Schale und einen Deckel zu bilden, die durch ein Dichtungsmittel
miteinander dicht verbunden werden können. Die neue Verpackung ist
so gestaltet, dass sie eine Trägerstütze aufnimmt,
auf der Gewebeäquivalente
gebildet werden.
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Die
neue Verpackungsanordnung weist eine Schale, einen Deckel und eine
feste Dichtung dazwischen auf. Die Schale und der Deckel sind so
gestaltet, dass sie zum bestehenden Träger passen, der die angebrachten
Gewebeäquivalente
enthält.
Der Träger,
an dem das Gewebeäquivalent
angebracht ist, wird in die Schale gegeben, und es wird eine Kälteschutzmittellösung hinzugefügt. Der
Deckel wird daraufhin auf die Schale gelegt, und die zwei Teile werden
miteinander dicht verschlossen, um eine feste Abdichtung zwischen
der inneren und der äußeren Umgebung
der Verpackung herzustellen.
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Die
Verpackungsanordnung ermöglicht
eine gleichmäßige Verteilung
von Kälteschutzmittel
unterhalb des Trägers
und oberhalb der Oberfläche
des Gewebeäquivalents,
während
der Kontakt des Kälteschutzmittels
mit dem Gewebeäquivalent
und der Schale sowie dem Deckel aufrechterhalten wird. Die Anordnung
der Verpackung beruht auf dem Konzept, dass kontrollierte Kühl- und
Gefrierraten mit einem gleichen Volumen an Kälteschutzmittel aufrechterhalten
werden können,
bei Anordnung mit ähnlicher Geometrie
ober- und unterhalb des kultivierten Gewebes, das kältekonserviert
werden soll. Diese Anordnung stellt eine gleichmäßige Entfernung bereit, gemessen
sowohl von der oberen als auch der unteren Fläche des kultivierten Gewebeäquivalentes
zur Außenwand
der Verpackung (vorausgesetzt, die Verpackung weist auch eine gleichmäßige Dicke
auf). Diese Gleichmäßigkeit
sollte beim Kühlen
einen gleichmäßigen Wärmeaustausch
vom Gewebeäquivalent
zur Gefrierkammer bereitstellen, und von der äußeren Umgebung zum Gewebeäquivalent
beim Auftauen.
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Die
Schale weist eine Bodenfläche
auf, die an eine Seitenwand und einen Flansch angrenzt. Der Flansch
stellt eine ebene Fläche
zum Abdichten der Schale mit dem Deckel bereit. Die Seitenwand der Schale
weist eine einzelne fortlaufende oder eine Mehrzahl von unterbrochenen
Stützen
auf, die sich nach innen von und einstöckig mit der Seitenwand erstrecken.
Die Oberkante des Trägers,
welcher das kultivierte Gewebeäquivalent
enthält,
wenn er sich in der Schale befindet, wird auf den Stützen aufgehängt, die
durch die Seitenwand der Schale bereitgestellt werden. Zwischen
dem aufgehängten
Träger und
der Bodenfläche
der Schale ist ein Raum abgegrenzt, der ungefähr 1,0 mm Dicke mit einer Fläche misst,
die ungefähr
der Größe des Gewebeäquivalentes
entspricht.
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Der
Deckel weist eine ebene Bodenfläche auf,
die an eine Seitenwand und einen Flansch grenzt. Der Durchmesser
des Deckelflansches ist etwas kleiner als der Durchmesser des Schalenflansches.
Der Deckelflansch ruht, wenn er auf die einen Träger enthaltende Schale platziert
wird, so auf dem Träger,
dass die oberen Flächen
des Schalenflansches und des Deckelflansches mit derselben oder annähernd derselben
Ebene ausgerichtet in Kontakt sind. Ein zweiter Raum wird durch
den Deckel und die Oberfläche
des kultivierten Gewebeäquivalents abgegrenzt,
wobei dieser Raum ebenfalls ungefähr 1,0 mm Dicke mißt mit einer
Fläche,
die ungefähr
die Größe des Gewebeäquivalents
aufweist.
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Die
Anordnung ermöglicht
insgesamt ungefähr
1 mm zwischen der Schale und dem Boden des Trägers, welcher das Gewebeäquivalent
enthält,
das darauf angeordnet ist, und ungefähr 1 mm zwischen dem Deckel
und dem Gewebeäquivalent,
wobei das Kälteschutzmittel
oberhalb und unterhalb des Gewebeäquivalentes sowohl mit dem
Deckel als auch der Schale in Kontakt ist. Wenn der Deckel in die
Schale platziert wird, welche das Medium enthält, verdrängt der Deckel jegliche Luft
in der Verpackung an den peripheren Raum, welcher die rohrförmige Stütze des Trägers enthält.
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Der
Deckel wird mit der Schale entlang der exponierten Ebene abgedichtet,
die durch die oberen Flächen
des Schalen- und des Deckelflansches gebildet ist. Das Abdichten
kann durch Hitze, Klebstoff oder andere auf dem Fachgebiet bekannte
Mittel erfolgen. Die Dichtung zwischen dem Deckel und der Schale
verhindert ein Austreten des Kühlschutzmittels
und bewahrt die Sterilität
des Inneren der Einheit. Vorzugsweise wird eine ringförmige Schicht
von hitzeversiegelbarem Deckelmaterial sowohl an den Schalenflansch
als auch den Deckelflansch hitzeversiegelt. Das Deckelmaterial weist
vorzugsweise eine Lasche zum abziehbaren Entfernen und somit zum Entsiegeln
des Deckels von der Schale auf, um Zugang zum Gewebeäquivalent
zu erhalten. In einer anderen Ausführungsform wird ein Deckel
mit einem Flansch von ungefähr
demselben Durchmesser wie der Schalenflansch auf einer Schale mit
einem darin angeordneten Träger
platziert, so dass die Bodenfläche
des Deckelflansches in engem Kontakt zur oberen Fläche des
Schalenflansches steht. Die Flansche werden danach durch ein versiegelbares
Mittel miteinander versiegelt.
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1A und 1B zeigen
den Deckel 10, den Deckelflansch 11, die Deckelseitenwand 12 und die
Bodenfläche 13.
Der Deckelflansch 11, die Deckelseitenwand 12 und
die Bodenfläche 13 bilden eine
zusammenhängende
Fläche.
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2 zeigt
die ringförmige
Dichtung 20 und das Abziehelement 21.
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3A und 3B zeigen
die Dichtung 20, den Deckel 10, den Deckelflansch 11.
Die Dichtung 20 wird vor der Verwendung auf dem Deckelflansch 11 des
Deckels 10 befestigt, um die Ausrichtung der Abdichtung
während
des Versiegelungsverfahrens zu erleichtern.
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4A und 4B zeigen
den Träger 30, den
Trägerrand 31,
die durchlässige
Membran 32 und die rohrförmige Stütze 33. Die durchlässige Membran 32 enthält ein Kulturgewebeäquivalent, das
darauf durch die rohrförmige
Stütze 33 gehalten angeordnet
ist. Der Träger 30 ermöglicht den
Transfer des Gewebeäquivalentes
ohne Kontakt oder Entfernung des Gewebeäquivalentes während des
gesamten Kältekonservierungsprozesses
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5A und 5B zeigen
die Schale 40, die Bodenfläche 41 der Schale,
die Schalenseitenwand 42, den Schalenflansch 43 und
die Trägerstützen 44.
Die Bodenfläche 41 der
Schale, die Schalenseitenwand 42, der Schalenflansch 43 und
die Trägerstütze 44 bilden
eine zusammenhängende
Fläche.
Die Trägerstützen 44 berühren und
stützen
den Träger
innerhalb der Schale.
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6A und 6B zeigen
die Dichtung 20, den Deckel 10, den Träger 30 und
die Schale 40. Der Träger 30,
welcher ein Gewebeäquivalent
enthält,
ist in der Schale 40 angeordnet und innerhalb der Schale
aufgehängt.
Der Deckel 10 mit der Dichtung 20 ist über dem
Träger 30 angeordnet
und über
dem Träger aufgehängt.
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7 zeigt
die Dichtung 20, den Deckelflansch 11, den Deckel 10,
den Träger 30,
den Trägerrand 31,
die Trägerstützen 44 und
die Schale 40. Der Träger 30,
der ein Gewebeäquivalent
enthält,
ist in der Schale 40 angeordnet und innerhalb der Schale
durch Kontakt der Bodenfläche
des Trägerrandes 31 mit
den oberen Flächen
der Trägerstützen 44 aufgehängt. Der
Deckel 10 mit der Dichtung 20 wird über dem
Träger 30 angeordnet
und über
dem Träger durch
Kontakt der Bodenfläche
des Deckelflansches 11 mit der oberen Fläche des
Trägerrandes 31 aufgehängt. Die
oberen Flächen
des Deckelflansches 11 und des Schalenflansches 43 bilden
eine ebene Fläche
für die
Dichtung 20.
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8 zeigt
eine Draufsicht des Zusammenbaus.
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Materialien,
aus denen die Schalen und die Deckel hergestellt werden können, sind
steife oder halbflexible thermoplastische Materialien, die – wenn sie
erhitzt sind – durch
ein Vakuum geformt oder durch Spritzguss geformt werden, beispielsweise
Polytetrafluorethylen (PTFE) oder Polyethylenterephthalatglycol
(PETG). Die Verpackungsschalen und -deckel werden vorzugsweise vor
der Verwendung durch auf dem Fachgebiet bekannte Sterilisierungsverfahren
sterilisiert. Die Materialien, die zur Herstellung der Schale und
des Deckels verwendet werden, bestimmen das Sterilisierungsverfahren,
das angewendet werden kann. Um PTFE oder PETG zu sterilisieren,
wird eine Gamma-Bestrahlung mit 2,5 oder 3,0 Megarad bevorzugt.
Elektrische und chemische Sterilisierungsverfahren, die Fachleuten
bekannt sind, können
als Alternative eingesetzt werden.
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Kultivierte
Gewebeäquivalente
weisen ein dermales Äquivalent
eines hydrierten Collagen-Gitters auf, das durch einen Wirkstoff,
vorzugsweise durch Fibroblasten, kontrahiert wird. In einer Ausführungsform
wird eine mehrschichtige Schicht von Epidermalzellen auf der Oberfläche des
dermalen Äquivalents
kultiviert. In einer anderen Ausführungsform wird das hydrierte,
kontrahierte Collagen-Gitter, das durch Keratocyten kontrahiert
ist, auf einer Schicht kornealer Endothelzellen mit einer mehrschichtigen Schicht
von kornealen Epithelzellen angeordnet, die auf der Oberfläche des
Gitters kultiviert werden. Alternativ dazu können Epidermalzellen alleine
kultiviert und dazu gebracht werden, sich mehrschichtig anzuordnen,
um ein epidermales Blatt zu bilden. Das kultivierte Gewebeäquivalent
wird entweder auf einer porösen
Membran eines Trägers
oder auf einem Collagen-Gel ausgebildet, das an eine poröse Membran der
Bodenfläche
eines Trägers
geheftet wird. Zusätzlich
können
andere kultivierte Gewebeäquivalente gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung kältekonserviert
werden, einschließlich,
ohne darauf beschränkt
zu sein, kultivierter epidermaler Blätter, kultivierter dermaler Äquivalente,
kultivierter Hornhautäquivalente
oder geernteter Säugetierhaut.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun unter Verwendung von Gewebeäquivalenten
und die bevorzugte Verpackungsanordnung zur Erläuterung beschrieben. Fachleute
werden verstehen, dass Änderungen
an dem beschriebenen Verfahren durchgeführt werden können, die
dann noch immer im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen.
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Das
Verfahren zum Durchdringen eines Gewebeäquivalenten mit einer Kälteschutzmittellösung besteht
darin, das Gewebeäquivalent
und den daran angebrachten Träger
in ein Volumen von Kälteschutzmittellösung einzutauchen,
das ausreichend ist, um die Probe einzutauchen, und darin, ein gleichmäßiges Volumen
an Kälteschutzmittellösung oberhalb
und unterhalb des Gewebeäquivalentes
bereitzustellen. Einer 100-mm-Petrischale, die das Gewebeäquivalent
und den Träger
enthält,
werden 25 mL von 2 M Glycerol in DMEM über einen Zeitraum hinweg zugegeben,
der ausreicht, um die Probe vollständig zu durchdringen, vorzugsweise über einen Zeitraum
zwischen einer und zwei Stunden, aber am bevorzugtesten über einen
Zeitraum von ungefähr
einer Stunde. Längere
Zeiträume
in der Kälteschutzmittellösung führen zu
einer reduzierten Zelllebensfähigkeit
im Gewebe, während
zu kurze Zeiträume
kein vollständiges
Eindringen des Kälteschutzmittels
in das Gewebe gewährleistet.
Einschicht-Konstrukte werden typischer Weise weniger Zeit für die Perfusion
benötigen,
da sie weniger Zellschichten und eine reduzierte Barrierefunktion
aufweisen. Während
dieser Stunde wird das Eindringen der Kälteschutzmittellösung durch
Schütteln
der Probe und der Kälteschutzmittellösung verstärkt, typischerweise
durch Schütteln
der Petrischale auf einem Rotationsplattformschüttler (Bellco Orbitalschüttler) bei
70 Umdrehungen/Minute in einer 10% CO2-begasten
Kammer. Die 10% CO2-Umgebung, dieselbe wie
die Kulturumgebung, in der das Gewebeäquivalent hergestellt wurde,
verhindert, dass die Medien entgasen, wodurch der pH-Wert des Grundmedienbestandteils des
Kälteschutzmittels
aufrecht erhalten wird. Das Schütteln
ermöglicht
ein schnelleres und vollständigeres
Eindringen des Kälteschutzmittels
in das Gewebeäquivalent
und eine bessere Reproduzierbarkeit von Ergebnissen zwischen gefrorenen
Gewebeäquivalenten.
Es ist möglich,
den Orbitalschüttler durch
eine Vorrichtung zu ersetzen, welche eine Schüttelbewegung in anderen räumlichen
Ebenen ausführt.
Außerdem
schließen
andere Verfahren der mechanisch verstärkten Perfusion, ohne darauf
beschränkt
zu sein, das Schaukeln des Konstruktes mit dem Kälteschutzmittel in einem Gefäß auf einer
Plattform oder das Zentrifugieren des Konstruktes mit dem Kälteschutzmittel
und das Durchdringen von Kälteschutzmittel
um das Konstrukt herum durch Verwendung einer Pumpe ein.
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Der
Träger
und das angebrachte Gewebeäquivalent
werden in die Schale platziert, und insgesamt ungefähr 16,0
ml Kälteschutzmittellösung werden
hinzugefügt.
Das Verpackungsdesign ermöglicht eine
gleichmäßige Verteilung
des Kälteschutzmittels. Ungefähr 8,0 ml
unterhalb des Trägers
und ungefähr 8,0
ml auf der Oberfläche
des Gewebeäquivalenten. Der
Deckel wird dann auf die Schale platziert und die zwei Teile werden
hitzeversiegelt, vorzugsweise am Deckelmaterial.
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Die
verpackten Gewebeäquivalente
werden daraufhin in eine programmierbare Gefriervorrichtung (Cryomed
oder Planer) platziert, dessen Anfangstemperatur ungefähr auf Raumtemperatur
eingestellt ist, vorzugsweise auf 20,0°C. Die Gefrierkammer, welche
die verpackten Gewebeäquivalente enthält, wird
mit –10,0°C/Minute
auf den Fest-Flüssigphasen-Gleichgewichtstemperaturbereich
für das Kälteschutzmittel
abgekühlt,
der typischerweise für 2,0
M Glycerol in DMEM zwischen ungefähr –5,3°C und –6,0°C liegt. Die Fest-Flüssigphasen-Gleichgewichtstemperatur
ist die Temperatur, die erforderlich ist, um Eis in das Kälteschutzmittel
zu impfen. Die Kammertemperatur wird eine Zeit lang gehalten, um die
Innentemperatur der verpackten Gewebeäquivalente auf die Kammertemperatur
anzugleichen. Die Kühlrate,
die verwendet wird, um die Impftemperatur zu erreichen, ist nicht
kritisch. Eine Haltezeit von ungefähr 40 Minuten ist ausreichend,
um einen thermalen Ausgleich zu gewährleisten, aber diese Zeitspanne
wird in Abhängigkeit
von der Kammergröße, der Luftzirkulation
innerhalb der Kammer und der Anzahl der einzufrierenden Verpackungen
variieren. Während
typischerweise mindestens 30 Minuten benötigt werden, kann eine Zeitspanne
von bis zu einer Stunde für
die Gewährleistung
des Ausgleichs in Anspruch genommen werden. Nach der Haltezeit wird extrazelluläre Eisbildung
durch Impfen initiiert.
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Eisimpfen
wird als ein Verfahren definiert, bei dem die Eisbildung in dem
extrazellulären
Kälteschutzmittel
initiiert wird. Ein bevorzugtes Verfahren des Eisimpfens erfolgt
dadurch, dass die Seite der Schale, welche das Gewebe enthält, mit
einer gekühlten
Sonde in Berührung
gebracht wird, beispielsweise einem Flüssigstickstoff-gekühlten (–196°C) Stahlstab.
Die Berührungsstelle
des Stabes mit der Verpackung muss unterhalb der Ebene der Kälteschutzmittelgefriermedien
innerhalb der Verpackung sein. Ein weiteres bevorzugtes Verfahren
besteht darin, ein expandierendes Gas, wie Freon oder CO2, direkt zur Außenseite der Verpackung freizusetzen. Die
Eisbildung kann durch eine Kammernspitze initiiert werden, wo die
Temperatur der Kammer innerhalb einer Bandbreite, die ausreicht,
um einen Eiskristall zu bilden, gesenkt und erhöht wird. Andere auf dem Fachgebiet
bekannte Verfahren des Eisimpfens können ersatzweise verwendet
werden.
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Nachdem
alle Gewebeäquivalente
mit Eiskristallen geimpft sind, werden die Einheiten eine weitere
Stunde gehalten, um einen thermodynamischen Ausgleich und eine Ausbreitung
des Eisimpfkristalls durch das Kälteschutzmittel
hindurch zu ermöglichen.
Danach wird das Abkühlen
wieder aufgenommen, und zwar mit einer Rate von vorzugsweise zwischen
ungefähr –0,02°C/min bis
ungefähr –0,3°C/min, bevorzugter
mit einer Rate zwischen ungefähr –0,05 bis
ungefähr –0,1°C/Minute
und am bevorzugtesten mit einer Rate von ungefähr –0,07°C/Minute auf eine Endtemperatur,
die vorzugsweise mindestens bei oder unter –70,0°C liegt, bevorzugter bei –120°C, noch bevorzugter
bei –140°C oder am
bevorzugtesten bei –196°C. Während die
Gefriertemperatur sich der Glasübergangstemperatur
von Wasser, –120°C, nähert, werden
schädliche
Temperaturschwankungen während
der Transfers zu den endgültigen
Lagerstätten
immer unwahrscheinlicher.
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Kältekonservierte
Gewebeäquivalente
werden bis zur Verwendung von der programmierbaren Gefriervorrichtung
in einen Dampfphasenflüssigstickstoff-Lagerbehälter (Dewar)
bei einer Temperatur zwischen ungefähr –120° bis –150°C oder in Flüssigstickstoff bei –196°C transferiert.
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Für das Auftauen
werden kältekonservierte Gewebeäquivalente
aus der Dampfphasenflüssigstickstofflagerung
entnommen und auf Trockeneis transferiert, um sich auf ungefähr –75°C zu erwärmen. Sobald
sie auf –75°C ausgeglichen
wurden, werden die kultivierten Gewebeäquivalente in eine Umgebung
transferiert, vorzugsweise ein Wasserbad, das vorzugsweise auf 37°C eingestellt
ist, oder bevorzugter auf 4°C
oder am bevorzugtesten auf Raumtemperatur. Sobald ersichtlich ist,
dass das gesamte Kälteschutzmittelmedium
in Flüssigphase
umgewandelt wurde, werden die Einheiten der kultivierten Gewebeäquivalentverpackung
in einen biologisch sicheren Schrank überführt oder in einen anderen aseptischen
Bereich und mit Ethanol keimfreigemacht. Der Deckel der Schalen
wird durch Abziehen oder Schneiden des Deckelmaterials vom Boden
der Einheit entfernt. Die Träger,
welche die kultivierten Gewebeäquivalente
enthalten, werden danach jeweils in Petrischalen überführt, während überschüssiges Kälteschutzmittel
abgegossen wird. Um das kultivierte Gewebeäquivalent des restlichen Kälteschutzmittels
zu spülen,
werden 25 mL der Spüllösung, vorzugsweise
DMEM bei Raumtemperatur, zur Petrischale, welche das kultivierte
Gewebeäquivalent
enthält,
ungefähr
30 Minuten lang hinzugefügt. Andere
ausreichende Spülmittel,
vorzugsweise Lösungen
mit physiologischer Stärke,
wie Zellkulturmedien oder phosphatgepufferte Salzlösung, können vom
Fachmann bestimmt werden. Die Spüllösung wird
ein zweites Mal weitere 30 Minuten ausgetauscht. Die Spülzeiten
können
in Abhängigkeit
von der Komplexität
des Gewebes variieren.
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Die
Einheit des kultivierten Gewebeäquivalents
kann dann zu ihrer ursprünglichen
Kulturschale rückgeführt und
in einem Kulturbewahrungsmedium bei 37°C/10% CO2 rekultiviert
werden. Alternativ dazu kann das Äquivalent auf einen Patienten
angewendet oder im Hinblick auf eine Reaktion auf den Kontakt mit
einer Substanz geprüft
werden, wie in der US-Patentschrift 4,835,102 beschrieben.
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Die
folgenden Beispiele sind vorgesehen, um die Praxis der vorliegenden
Erfindung näher
zu erläutern
und sollten keinesfalls als Einschränkung des Schutzumfanges der
vorliegenden Erfindung ausgelegt werden. Fachleute werden erkennen,
dass verschiedene Änderungen
an den hierin beschriebenen Verfahren durchgeführt werden können, ohne vom
Geist und Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
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BEISPIELE
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Beispiel 1 bis 3
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Beispiele
1 bis 3 zeigen die Kältekonservierungs-
und Auftautechniken der vorliegenden Erfindung mit der bevorzugten
Verpackungsausbildung.
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Beispiel 1: Kältekonservierung
von Lebendhautäquivalent
(LSE) mit der Verpackungsanordnung
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Lebendhautäquivalent(LSE)-Konstrukte wurden
gemäß EP-A-0448035
hergestellt. LSEs und 75-mm-Trägereinsätze (TRANSWELL®,
Costar, Cambridge) wurden 9 bis 10 Tage nach dem an die Luft heben
in 100-mm-Petrischalen (Costar) platziert. LSE-Konstrukte wurden
mit Kälteschutzmittel
durchdrungen, indem die Konstrukte und die Transwell mit 25 mL kälteschützenden
Medien, 2 M Glycerol in DMEM, in der 100-mm-Petrischale eine Stunde
lang eingetaucht wurden. Während
der Perfusion wurden die Konstrukte eine Stunde lang auf einem Rotationsschüttler (Bellco)
bei 70 Umdrehungen/Minute in einer 10% CO2-begasten
Kammer geschüttelt.
Das Schütteln
ermöglicht
eine vollständigere
Perfusion und bessere Reproduzierbarkeit des Kältekonservierungsverfahrens.
Nachdem die LSE durchdrungen waren, wurden die Petrischalen, welche
das LSE enthielten, die Trägereinsätze und
die extrazellulären Gefriermedien
(2 M Glycerol und DMEM) in eine Kältekonservierungsverpackung
gegeben und hitzeversiegelt.
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Die
Kammer einer programmierbaren Gefriervorrichtung (Planar) wurde
mit der hierin beschriebenen Erfindung ausgestattet. Die Gefriervorrichtung
wurde auf eine Anfangstemperatur von 20,0°C eingestellt. Die Rohrleitungen
wurden mit Freon einen einzelnen Einsekunden-Intervall lang gereinigt, um jegliche
Luft in den Leitungen zu entfernen. Die verpackten LSE-Einheiten wurden
sicher in Gestelle platziert, welche jeweils acht LSE-Einheiten aufnahmen.
Die Gestelle, geführt
von Positionsstiften, wurden benachbart zu den Sprayschienen angeordnet.
Die Kammertür
der Gefriervorrichtung wurde geschlossen, um die Kammer von der
Außenumgebung
abzuschließen.
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Die
LSE-Einheiten wurden bei –10°C/Minute auf –6°C abgekühlt, und
die Kammertemperatur wurde 40 Minuten lang bei –6°C gehalten, um das Kälteschutzmittel
und die durchdrungenen Konstrukte an die Kammertemperatur anzugleichen.
Nach dem 40 Minuten langen Halten wurde extrazelluläres Eis
initiiert, indem Freon eine Sekunde lang in unmittelbarer Nähe zur Seite
der Verpackung direkt freigesetzt wurde. Das Freon führte – während es
von der Oberfläche
der Verpackung verdampfte – dazu,
dass die Kontaktfläche
des Freons einen Temperaturabfall verzeichnete, der ausreichte,
um die extrazelluläre Eisbildung
zu initiieren.
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Alle
LSE-Einheiten wurden mit Eiskristallen geimpft, den Einheiten wurde
ermöglicht,
sich eine Stunde lang bei –6°C anzugleichen.
Die Kammertemperatur wurde danach auf –0,07°C/Minute auf eine Endtemperatur
von –20°C abgekühlt. Danach wurde
die Kammer mit –0,5°C/Minute
auf eine Endtemperatur von –70°C abgekühlt. Sobald
die LSE-Einheiten kältekonserviert
waren, wurden sie zu einem Dampfphasenlagerbehälter (Dewar) bei einer Temperatur
von –120°C bis –150°C überführt.
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Beispiel 2: Auftauen von
kältekonserviertem
LSE
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Kältekonserviertes
LSE wurde aus der Dampfphasenflüssigstickstofflagerung
entnommen und auf Trockeneis überführt, um
sich auf ungefähr –75°C zu erwärmen. Sobald
die Äquivalente
bei –75°C angeglichen
sind, werden sie in ein Wasserbad überführt, das vorzugsweise auf 37°C eingestellt ist,
bevorzugter auf 4°C
oder am bevorzugtesten auf Raumtemperatur. Sobald ersichtlich ist,
dass das gesamte Kälteschutzmittelmedium
in Flüssigphase
umgewandelt wurde, werden die Einheiten der kultivierten Gewebeäquivalentverpackung
in einen biologisch sicheren Schrank überführt oder in einen anderen aseptischen
Bereich und mit Ethanol keimfreigemacht. Der Deckel der Schalen
wird durch Abziehen oder Schneiden des Deckelmaterials vom Boden
der Einheit entfernt. Die Träger,
welche die kultivierten Gewebeäquivalente
enthalten, werden danach jeweils zu Petrischalen überführt, während überschüssiges Kälteschutzmittel
abgegossen wird. Um das kultivierte Gewebeäquivalent des restlichen Kälteschutzmittels
zu spülen,
werden 25 mL der Spüllösung (bei
Raumtemperatur), vorzugsweise DMEM, zur Petrischale, welche das
kultivierte Gewebeäquivalent
enthält,
ungefähr
30 Minuten lang hinzugefügt. Andere
ausreichende physiologische Spülmittel,
beispielsweise andere Zellkulturmedien oder phosphatgepufferte Salzlösung, können vom
Fachmann bestimmt werden. Die Spüllösung wird
ein zweites Mal weitere 30 Minuten lang ausgetauscht.
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Aufgetaute
kältekonservierte
Proben und Kontrollproben wurden durch histologische Verfahren verarbeitet
und durch Lichtmikroskopie auf morphologische Organisation und Lebensfähigkeit
hin überprüft und zeigten
eine beinahe 100%-ige Lebensfähigkeit
und waren fast nicht von der Kontrolle zu unterscheiden.
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Beispiel 3: Bewertung
des Kältekonservierungsverpackungs-Designs
für Erwärmungsrate
und thermale Gleichmäßigkeit
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Eine
Kältekonservierungsverpackung
der vorliegenden Erfindung wurde im Hinblick auf gleichmäßige Wärmeübertragung
bewertet. An einer Trägermembran,
ohne kultiviertes Gewebeäquivalent, wurden
fünf Thermoelemente
angebracht, eines in der Mitte und vier im gleichen Abstand von
1,0 mm von der peripheren Wand des Trägers. Die Thermoelement-Leitungen traten
aus der Verpackung von der Seite zwischen dem Deckel- und dem Schalenflansch
zu einem Temperaturaufzeichner (Azonix Scanner Plus) aus. Die Verpackung
wurde mit 17 mL Kälteschutzmittel
gefüllt
und hitzeversiegelt. Die Verpackung wurde auf –70°C äquilibriert und danach in ein
auf 20°C
eingestelltes Wasserbad transferiert. Der Temperaturaufzeichner
zeichnete die Temperatur bei jedem Thermoelement alle 1 bis 2 Sekunden während der
Erwärmung
auf. Die Verpackung erwärmte
sich anfangs mit einer Rate von 700°C/Minute und verlangsamte sich
danach, je näher
der Schmelzpunkt der Kühlmittelschutzlösung kam.
Die thermale Gleichmäßigkeit
lag zwischen 2°C
und 6°C der
durchschnittlichen Thermoelement-Temperatur während der schnellsten Erwärmungsraten
und näherte
sich 8°C
bei Erreichen des Schmelzpunktes der Lösung.
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Die
Beispiele 4 bis 12 zeigen das Kältekonservierungsverfahren
der vorliegenden Erfindung auf unterschiedlichen Geweben.
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Beispiel 4: Kältekonservierung
von epidermalen Blättern
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Epidermale
Blätter
wurden aus reifen LSE 12 Tage nach dem an die Luft heben beschafft.
Das Entfernen des epidermalen Blattes erfolgte durch Abziehen der
dermalen Substratschicht von der epidermalen Schicht mit Hilfe von
Pinzetten und Verwerfen der dermalen Schicht. Jedes Blatt wurde
in drei gleiche Stücke
geschnitten. Ein Stück
von jedem Blatt wurde als Kontrolle fixiert. Die verbleibenden zwei
Stücke von
jedem Blatt wurden auf eine 75-mm-Polycarbonat-Transwell-Membran
(Costar) in 100-mm-Kulturschalen (Costar) platziert. Jedes Stück wurde
eine Stunde lang mit 25 mL DMEM und 2 Molar Glycerol durchdrungen.
Die Schalen, welche die Konstrukte enthielten, wurden auf einem
Rotationsschüttler (Bellco)
bei 70 Umdrehungen/Minute eine Stunde lang in einer 10% CO2-begasten
Kammer angeordnet. Nachdem das epidermale Blatt durchdrungen war,
wurden die Petrischale, welche das epidermale Blatt enthielt, Transwell
und das extrazelluläre
Gefriermedium (2 M Glycerol und DMEM) in einen Sack gegeben und
vakuumversiegelt (Audiovox), mit einer Programmierung für ein 5-Sekunden-Vakuum
und einer 3,9-Sekunden-Versiegelungszeit.
-
Verpackte
epidermale Blätter
wurden in die programmierbare Gefriervorrichtung (Planer) bei einer
Anfangstemperatur von 20,0°C
angeordnet. Die epidermalen Schichten wurden mit –10,0°C/Minute auf –6,0°C abgekühlt. Die
Temperatur wurde 20 Minuten lang bei –6,0°C gehalten, um auf Kammertemperatur
zu äquilibrieren.
Nach dem 20 Minuten langen Halten wurde extrazelluläres Eis
durch Kontakt der Außenseite
des Sacks, unterhalb der Ebene des Gefriermediums, mit einer Flüssigstickstoff-gekühlten Sonde
initiiert. Nachdem alle epidermalen Blätter mit Eiskristallen geimpft
waren, wurde die Temperatur weitere fünf Minuten bei –6,0°C gehalten.
Danach wurde die Kammer mit –1,0°C/Minute
auf –8,0°C abgekühlt. Im
Anschluss daran wurde die Temperatur 30 Minuten lang bei –8,0°C gehalten,
um eine gleichmäßige Verteilung
von Eis durch die Probe hindurch zu ermöglichen. Die Kammer wurde danach
mit –0,1°C/Minute
auf eine Endtemperatur von –70,0°C abgekühlt.
-
Kältekonservierte
epidermale Schichten wurden aus der Gefriervorrichtung entfernt,
und die Säcke
wurden von den Petrischalen geschnitten und die Deckel entfernt.
Zum Auftauen wurden 40 mL erwärmtes
(37°C) DMEM
aseptisch in jede Petrischale geschüttet. Nach 45 Sekunden wurde
die gesamte Flüssigkeit
von den Platten entfernt und weitere 40 mL Aliquots wurden jeder
Schale zwei Minuten lang hinzugefügt. Nachdem das gesamte Eis
geschmolzen war, wurden die epidermalen Blätter mit 25 mL DMEM 30 Minuten
lang gespült.
Das Medium wurde ein zweites Mal weitere 30 Minuten lang ausgetauscht.
Danach wurden die epidermalen Blätter
in Kulturbewahrungsmedium bei 37°C/10%
CO2 24 Stunden lang vor der Analyse inkubiert.
Die Inkubationszeit wurde für
die Zeitverzögerung
bereitgestellt, die typischerweise beobachtet wird, wenn gefrorene Zellen
die Bedingungen des stationären
Zustands wiederherstellen. Wiederum wurde die Inkubationszeit für die Zeitverzögerung bereitgestellt,
die typischerweise beobachtet wird, wenn gefrorene Zellen die Bedingungen
des stationären
Zustands wiederherstellen.
-
Von
den zwei verbleibenden Stücken
jedes epidermalen Blattes wurde jeweils eines im Hinblick auf Histologie
verarbeitet und ein Stück
von jedem Blatt gemäß des MTT-Testprotokolls überprüft. Der Vergleich
der Fotomikrographen eines nicht-kältekonservierten epidermalen
Blattes mit jenen von kältekonserviertem
epidermalem Blättern
von Beispiel 4 zeigt, dass die drei grundlegenden Merkmale der Epidermis,
die basale Schicht der Epidermis, die suprabasalen Schichten der
Epidermis und das Stratum Corneum der Epidermis, alle durch dieses
Verfahren konserviert wurden. Alle Schichten waren intakt, und die
Gesamtmorphologie des kältekonservierten
epidermalen Blattes war mit jener des nicht-kältekonservierten epidermalen
Blattes identisch.
-
Beispiel 5: Kältekonservierung
des dermalen Äquivalenten
-
Die
dermalen Äquivalente,
die in dieser Studie verwendet wurden, waren der nicht-epidermalisierte
Bestandteil des LSE. Dermale Äquivalente wurden
8 Tage nach dem Guss gefroren. Die dermalen Äquivalente wurden mit Kälteschutzmittel
durchdrungen, indem die dermalen Äquivalente, die am 75-mm-Transwell
(Costar) angebracht sind, angeordnet in 100-mm-Petrischalen (Costar), in 25 mL DMEM
und 2 Molar Glycerol eine Stunde lang eingetaucht wurden. Die Petrischalen
wurden auf einem Rotationsschüttler
(Bellco) bei 70 Umdrehungen/Minute eine Stunde lang in einer 10%
CO2-begasten Kammer platziert. Nachdem die
dermalen Äquivalente
durchdrungen waren, wurden die Petrischalen, die dermalen Äquivalente,
Transwells und die extrazellulären
Gefriermedien in die programmierbare Gefriervorrichtung (Planer)
bei einer Anfangstemperatur von 20,0°C platziert. Danach wurde die
Kammer mit –10,0°C/Minute
auf –6,0°C abgekühlt. Die
Temperatur wurde 20 Minuten lang gehalten, um auf Kammertemperatur
zu äquilibrieren.
Nach dem 20 Minuten langen Halten wurde extrazelluläres Eis
durch den Kontakt der Außenseite
der Schalen, unterhalb der Ebene der Gefriermedien, mit einer Flüssigstickstoff-gekühlten Sonde
initiiert. Nachdem alle dermalen Äquivalente mit Eiskristallen
geimpft worden waren, wurde die Temperatur weitere 5 Minuten lang
bei –6,0°C gehalten.
Danach wurde die Kammer mit –1,0°C/Minute
auf –8,0°C abgekühlt. Die
Kammertemperatur wurde wieder 30 Minuten lang bei –8,0°C gehalten,
um eine gleichmäßige Verteilung
von Eis durch die Probe hindurch zu ermöglichen. Die Einheiten der
dermalen Äquivalente
wurden dann bei –0,1°C/Minute
auf eine Endtemperatur von –70,0°C abgekühlt.
-
Die
kältekonservierten
dermalen Äquivalente wurden
danach aus der Gefriervorrichtung entnommen und der Deckel der Schale
entfernt. Zum Auftauen wurden 40 mL von erwärmtem (37°C) DMEM aseptisch in jede Petrischale
gegossen. Nach 45 Sekunden wurde die gesamte Flüssigkeit aus den Schalen entfernt
und ein zusätzliches
40-mL-Aliquot zwei Minuten lang zu den Schalen hinzugefügt. Nachdem das
gesamte Eis aufgetaut war, wurden die dermalen Äquivalente mit 25 mL DMEM 30
Minuten lang gespült.
Das Medium wurde ein zweites Mal weitere 30 Minuten ausgetauscht.
Die dermalen Äquivalente, die
noch immer an den Transwells angebracht sind, wurden danach zu den
Kulturschalen rückgeführt und
in einem Kulturbewahrungsmedium 24 Stunden lang vor der Analyse
bei 37°C/10%
CO2 inkubiert. Die Inkubationszeit wurde
für die
Zeitverzögerung
bereitgestellt, die typischerweise beobachtet wird, wenn gefrorene
Zellen die Bedingungen des stationären Zustands wiederherstellen.
Die Proben wurden unter Verwendung des MTT-Testprotokolls geprüft.
-
Beispiel 6: Kältekonservierung
von Hornhautäquivalenten
-
Hornhautäquivalente,
die an 24-mm-Kulturtranswells (Costar) 9 Tage nach anheben an die feuchte
Luft angebracht werden, wurden in sechs Vertiefungen-Cluster-Schalen
(Costar) platziert. Das Verfahren zum Durchdringen von Hornhautäquivalenten
mit Kälteschutzmittel
bestand darin, jedes Hornhautäquivalent
und jeden Transwell mit 4 mL extrazellulärem Gefriermedium (2 M Glycerol
in DMEM) in den sechs Vertiefungen-Cluster-Schalen eine Stunde lang
einzutauchen. Die sechs Vertiefungen-Cluster-Schalen, welche die
Hornhautkonstrukte enthielten, wurden eine Stunde lang auf einem
Rotationsschüttler
(Bellco) bei 70 Umdrehungen/Minute in einer 10% CO2-begasten
Kammer geschüttelt.
Nachdem die Hornhautäquivalente
durchdrungen waren, wurden die Petrischalen, welche die Hornhautäquivalente
enthielten, die Transwells und das extrazelluläre Gefriermedium in die programmierbare
Gefriervorrichtung (Planer) bei einer Anfangstemperatur von 20,0°C platziert.
Die Hornhautäquivalente
wurden mit –10,0°C/Minute
auf –6,0°C gekühlt. Die
Temperatur wurde 20 Minuten lang gehalten, um an die Kammertemperatur
anzugleichen. Nach dem 20 Minuten langen Halten wurde extrazelluläres Eis
initiiert, und zwar durch Kontakt der Außenseite jeder Vertiefung in
der Clusterplatte unterhalb der Ebene des Gefriermediums, mit einer
Flüssigstickstoff-gekühlten Sonde.
Nachdem alle Hornhautäquivalente
mit Eiskristallen geimpft worden waren, wurde die Temperatur vor dem
Abkühlen
mit –1,0°C/Minute
auf –8,0°C weitere 5
Minuten bei –6,0°C gehalten.
Die Temperatur wurde wieder 30 Minuten lang bei –8,0°C gehalten, um eine gleichmäßige Verteilung
von Eis durch die gesamte Probe hindurch zu ermöglichen. Die Einheiten der
Hornhautäquivalente
wurden mit –0,1°C/Minute auf
eine Endtemperatur von –70,0°C abgekühlt.
-
Die
kältekonservierten
Hornhautäquivalente wurden
aus der Gefriervorrichtung entnommen. Der Deckel der Schale wurde
entfernt. Zum Auftauen wurden 6 mL von erwärmtem (37°C) DMEM aseptisch in jede Vertiefung
der Cluster-Platte gegossen. Nach 45 Sekunden wurde die gesamte
Flüssigkeit aus
der Schale entfernt und ein weiteres 6-mL-Aliquot wurde zwei Minuten
lang zur Schale hinzugefügt.
Unter Verwendung von sterilen Pinzetten wurden die Hornhautäquivalente
und die angebrachten Transwells zu einer neuen Cluster-Schale transferiert.
Zum Spülen
wurden 4 mL DMEM zu jeder Vertiefung 30 Minuten lang hinzugefügt. Das
Medium wurde ein zweites Mal weitere 30 Minuten lang ausgetauscht.
Die Hornhauteinheiten wurden danach zu der/derselben Kulturschale
rückgeführt und
in Hornhautbewahrungsmedium 24 Stunden lang vor der Analyse bei
37°C/10%
CO2 inkubiert. Die Inkubationszeit wurde
für die
Zeitverzögerung
bereitgestellt, die typischerweise beobachtet wird, wenn gefrorene Zellen
die Bedingungen des stationären
Zustands wiederherstellen. Die Proben wurden unter Verwendung des
MTT-Testprotokolls geprüft.
-
Beispiel 7: Kältekonservierung
von geernteter Mäusehaut
-
Wildtypmäuse, Stamm
B6CB6YF1, wurden durch eine Nembutal-Überdosis euthanisiert. Die Haut
wurde aseptisch geerntet. Überschüssige Blutgefäße, Fett-
und Bindegewebe wurden von der Dermis entfernt. Die Mäusehaut
wurde auf ein rechteckiges Stück
von 1 cm × 2
cm zugeschnitten. Die Mäusehautstücke wurden
danach auf einem 75-mm-Transwell (Costar) in 100-mm-Petrischalen (Costar)
platziert. Die Mäusehaut
wurde durch Eintauchen in 24 mL von 2 M Glycerol in DMEM in den 100-mm-Petrischalen
eine Stunde lang mit Kälteschutzmittel
durchdrungen. Während
der Perfusion wurden die Petrischalen, die jeweils die Mäusehaut enthielt,
und der Transwell eine Stunde lang auf einem Rotationsschüttler (Bellco)
bei 70 Umdrehungen/Minute in einer 10% CO2-begasten
Kammer geschüttelt.
Nicht kältekonservierte Kontroll-Mäusehaut wurde
in Nährstoffmedium
bei 4°C
für die
Dauer der Kältekonservierung
und des Auftauverfahrens (2 Tage) vor der Hautverpflanzung aufbewahrt.
-
Nachdem
die Mäusehaut
durchdrungen war, wurden die Petrischalen, welche die Mäusehaut
enthielten, die Transwells und das extrazelluläre Gefriermedium in die programmierbaren
Planer-Gefriervorrichtung bei einer Anfangstemperatur von 20,0°C platziert.
Die Mäusehaut
wurde mit –10,0°C/Minute auf –6,0°C abgekühlt und
danach bei –6,0°C 20 Minuten
lang gehalten, um an die Kammertemperatur anzugleichen. Nach dem
20 Minuten langen Halten wurde extrazelluläres Eis durch Kontakt der Außenseite
der Schale mit einer Flüssigstickstoff-gekühlten Sonde
initiiert. Die Kontaktstelle muss unterhalb der Ebene des Gefriermediums
sein. Nachdem die gesamte Mäusehaut
mit Eiskristallen geimpft worden war, wurde die Temperatur weitere
5 Minuten lang bei –6,0°C vor dem
Abkühlen
mit –1,0°C/Minute
auf –8,0°C gehalten.
Die Temperatur wurde wiederum 30 Minuten lang bei –8,0°C gehalten,
um eine gleichmäßige Verteilung
von Eis durch die gesamte Probe hindurch zu ermöglichen. Danach wurden die
Einheiten mit –0,1°C/Minute
auf eine Endtemperatur von –70,0°C abgekühlt.
-
Die
kältekonservierte
Mäusehaut
wurde aus der Gefriervorrichtung entnommen und der Deckel der Schale
entfernt. Zum Auftauen wurden 40 mL von erwärmtem (37°C) DMEM aseptisch in die Petrischalen
geschüttet.
Nach 45 Sekunden wurde die gesamte Flüssigkeit aus den Schalen entfernt,
und ein zusätzliches
40-mL-Aliquot wurde zu den Schalen zwei Minuten lang hinzugefügt. Nachdem
das gesamte Eis aufgetaut war, wurde die Mäusehaut in den Schalen 30 Minuten
lang mit 25 mL DMEM gespült.
Das Medium wurde ein zweites Mal weitere 30 Minuten ausgetauscht.
-
Die
aufgetauten kältekonservierten
Proben und die Kontrollproben wurden im Hinblick auf Histologie
verarbeitet oder auf Mäuse
verpflanzt. Die Fotomikrographen von nicht kältekonservierter Mäusehaut,
die mit kältekonservierter
Mäusehaut
verglichen wurde, zeigten, dass die vier grundlegenden Merkmale
der Mäusehaut,
die Dermis mit Fibroblasten, die basale Schicht der Epidermis, die
suprabasalen Schichten der Epidermis und das Stratum Corneum der
Epidermis durch dieses Verfahren bewahrt wurden. Alle Schichten
waren intakt und die Gesamtmorphologie der kältekonservierten Mäusehaut
war mit jener von nicht kältekonservierter
Mäusehaut identisch.
-
Beispiel 8: Kältekonservierung
von ATS SKIN2TM
-
SKIN2TM, Modell ZK 1300 (Advanced Tissue Sciences,
La Jolla, CA), wurde aus der Verpackung gemäß den Versandeinsätzen bei
Ankunft entfernt und in Kulturschalen (Costar) platziert. Die Transwell-Einsätze wurden
oberhalb von SKIN2TM platziert, um das Hautkonstrukt eingetaucht
zu belassen. SKIN2TM wurde mit Kälteschutzmittel
durchdrungen, indem SKIN2TM in 2 M Glycerol
in DMEM eine Stunde lang in den Kulturschalen eingetaucht wurde.
Während
der Perfusion wurden die Kulturschalen, welche das Konstrukt und
den Transwell enthielten, eine Stunde lang auf einem Rotationsschüttler (Bellco)
bei 70 Umdrehungen/Minute in einer 10 CO2-begasten Kammer
geschüttelt.
-
Nachdem
SKIN2TM durchdrungen war, wurden die Einheiten
in die programmierbare Gefriervorrichtung (Planar) bei einer Anfangstemperatur
von 20,0°C
platziert. Die SKIN2TM-Einheiten wurden mit –10,0°C/Minute
auf –6,0°C abgekühlt und
bei –6,0°C 20 Minuten
lang gehalten, um an die Kammertemperatur anzugleichen. Nach dem
20 Minuten langen Halten wurde das extrazelluläre Eis durch Kontakt der Außenseite
der Schalen unterhalb des Pegels des Gefriermediums mit einer Flüssigstickstoff-gekühlten Sonde
initiiert. Nachdem alle SKIN2TM-Einheiten mit Eiskristallen
geimpft worden waren, wurde die Temperatur weitere 5 Minuten lang
bei –6,0°C gehalten.
Die Kammertemperatur wurde daraufhin mit –1,0°C/Minute auf –8,0°C abgekühlt. SKIN2TM-Einheiten wurden 30 Minuten lang bei –8,0°C gehalten, um
eine gleichmäßige Verteilung
von Eis durch die gesamte Probe hindurch zu gewährleisten. SKIN2TM-Einheiten wurden
danach mit –0,1°C/Minute
auf eine Endtemperatur von –70,0°C abgekühlt.
-
Kältekonservierte
SKIN2TM wurde aus der Gefriervorrichtung
entnommen, die Deckel der Schalen wurden entfernt, und erwärmtes (37°C) DMEM wurde
aseptisch in jede Kulturschale geschüttet. Nach 45 Sekunden wurde
die gesamte Flüssigkeit aus
den Schalen entfernt, und eine weitere Zugabe von DMEM wurde zwei
Minuten lang jeder Schale hinzugefügt. Nach dem Auftauen wurden
die SKIN2TM-Einheit und der angebrachte
Transwell unter Zuhilfenahme von sterilen Pinzetten zu einer neuen
Kulturschale übertragen.
Um SKIN2TM vom Kühlschutzmittel zu spülen, wurde
zu der Kulturschale, welche SKIN2TM enthielt,
30 Minuten lang DMEM hinzugefügt.
Das Medium wurde ein zweites Mal nochmals 30 Minuten lang ausgetauscht.
Die SKIN2TM-Einheit wurde danach zum selben
Typ von Kulturschale rückgeführt und
in einem Kulturbewahrungsmedium bei 37°C/10% CO2 24
Stunden lang vor der Analyse inkubiert. Wiederum gilt, dass die
Inkubationszeit für
die Zeitverzögerung
bereitgestellt wurde, welche typischerweise beobachtet wird, wenn gefrorene
Zellen die Bedingungen des stationären Zustandes wiederherstellen.
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Kältekonservierte
und Kontroll-Konstrukte wurden gemäß dem MTT-Testprotokoll für das SKIN2TM-Modell ZK1300, das dem Produkt beigefügt ist,
und darüber
hinaus durch histologische Bewertung geprüft. Die Fotomikrographen von
nicht kältekonservierter
SKIN2TM zeigten im Vergleich zu kältekonservierter
SKIN2TM, dass die vier grundlegenden Eigenschaften
von SKIN2TM, das Collagen-Gitter mit Fibroblasten,
die basale Schicht der Epidermis, die suprabasalen Schichten der
Epidermis und das Stratum Corneum der Epidermis alle durch dieses
Verfahren bewahrt wurden. Alle Schichten waren intakt, und die Gesamtmorphologie
von kältekonservierter SKIN2TM war jener von nicht kältekonservierter SKIN2TM ähnlich.
-
Beispiel 9: Test zur Messung
der metabolischen mitochondrialen Aktivität (MTT)
-
Gefrorene
und nicht gefrorene (Kontroll-)LSE, epidermales Blatt, dermale Äquivalente und
Hornhautäquivalente
wurden unter Anwendung des MTT-Tests überprüft. [SKIN2TM-Konstrukte wurden
gemäß „MTT Assay
Protocol for use with Model ZK1300", das den Versandeinsätzen beigefügt ist, getestet.]
Die Zelllebensfähigkeit
der Konstrukte wurde unter Verwendung des MTT-Tests gemessen, eines
kolorimetrischen MTT-Umwandlungstests, der entwickelt wurde, um
das Zellwachstum und die Zelllebensfähigkeit zu messen. Dieser Test
wird im Detail in Gay et al., „The
Living Skin Equivalent as a Model in Vitro for Ranking the Toxic
Potential of Dermal Irritants",
Toxic. in Vitro, 6: 303–315
(1992), beschrieben. Die metabolische Reduktion des löslichen
Tetrazoliumsalzes auf ein Blau-Formazan-Präzipitat hängt von der Gegenwart lebensfähiger Zellen
mit intakter mitochondrialer Funktion ab. Dieser Test wird verwendet,
um die Zytotoxizität
in einer Reihe von Zelltypen zu quantifizieren, einschließlich der
kultivierten humanen Keratinocyten.
-
Zu
den Kulturschalen, welche LSE enthielten, wurde epidermales Blatt
und dermales Äquivalent,
40 mL von Testmedium und zu den Vertiefungen, welche Hornhautäquivalente
enthielten, 1,5 mL Testmedium hinzugefügt, welches 0,33 mg/mL MTT (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt. Die Gewebeäquivalente
wurden 3 bis 4 Stunden lang in dem MTT-Testmedium inkubiert. Am Ende der Umwandlungsperiode
wurde das Gewebeäquivalent
unter Verwendung einer Hautbiopsiestanze mit einem Durchmesser von
8 mm biopsiert. Die Stanzbiopsien wurden danach 2 bis 3 Stunden
lang bei Raumtemperatur in 0,3 mL Isopropanol extrahiert, das mit
0,04 N HCl angesäuert
wurde. Am Ende der Extraktionsperiode wurden 0,2 mL jedes Extraktes
zu einer Vertiefung einer 96-Vertiefungen-Platte übertragen.
Das Aufnahmevermögen
wurde auf einem Plattenleser (Dynatech) bei 570 nm gelesen, wobei
das Isopropanol-Extraktionsmedium als Blindwert galt. Die MTT-Werte,
die aus den aufgetauten kältekonservierten
Proben erhalten worden waren, wurden mit entsprechenden Kontrollproben
verglichen und in Prozent der Kontrolle (9) ausgedrückt.
-
Beispiel 10: Lactose-Dehydrogenase-Test
(LDH)
-
LDH
ist ein Enzym, das typischerweise in einer lebensfähigen Zelle
vorkommt. Eine Beschädigung
der Zelle führt
zu einem Freisetzen des Enzyms und einer entsprechenden Abnahme
der Enzymaktivität,
die durch diesen Test erfasst wird.
-
Aufgetaute
kältekonservierte
und Kontroll-Proben von LSE wurden mit einer Hautbiopsiestanze,
welche einen Durchmesser von 8 mm aufwies, gestanzt. Drei Proben
wurden von jeder LSE-Einheit entnommen. Die Stanzproben wurden in ein
15-mm-Rohr mit 1 mL von 0,1 M Triethanolaminpuffer (auf Eis) platziert
und mit einem elektrischen Gewebehomogenisator eine Minute lang
homogenisiert. Danach wurden die Proben mit 1000 g bei 4,0°C zentrifugiert.
Die Überstandsflüssigkeit
wurde im Anschluss daran getestet. LDH-Cocktail-Reagens wurde hergestellt,
indem Folgendes miteinander gemischt wurde: 3,00 mL Phosphatpuffer
(0,1 Mol/l, pH-Wert von 7,0), 0,1 mL Pyruvat, Na-Salz (2,5 mg/mL)
und 0,05 mL NADH, Na-Salz (10 mg/mL). 100 μl der Proben-Überstandsflüssigkeit
wurden zu 900 μL
der Reagenzien hinzugefügt,
und es wurde ihr erlaubt, zwei Minuten lang zu reagieren. Die Veränderung
der Aufnahmefähigkeit
im Laufe der zwei Minuten wurde aufgezeichnet. Der Durchschnitt
von drei Proben pro kältekonservierter
LSE-Einheit wurde mit den nicht gefrorenen Kontrollen verglichen. Die
Probenwerte wurden mit den entsprechenden Kontrollwerten verglichen
und in Prozent der Kontrolle (9) ausgedrückt.
-
Beispiel 11: Bioäquivalenz
von kältekonserviertem LSE
zu nicht kältekonserviertem
LSE
-
Um
die Bioäquivalenz
von kältekonserviertem
und nicht kältekonserviertem
LSE nachzuweisen, wurde eine Verpflanzungsstudie mit athymischen
Mäusen
durchgeführt.
-
LSE-Einheiten,
die gemäß des in
Beispiel 1 dargelegten Verfahrens kältekonserviert wurden, wurden
einen Tag vor dem Verpflanzen aufgetaut und in einem Bewahrungsmedium
25 Stunden lang wiedergewonnen.
-
Es
wurden vier Experimente durchgeführt, bei
denen insgesamt 66 athymische Mäuse
des Stamms B6CB6YF1/J-nu (Jackson Harbor Labs) entweder mit kältekonserviertem
LSE (n = 43) oder nicht kältekonserviertem
(Kontrolle) LSE (n = 23) verpflanzt wurden. Die Tiere wurden mit
Nembutal anästhesiert.
Ein Hautabschnitt von 2 × 2
cm mit voller Dicke wurde aus dem Rücken jeder Maus geschnitten, wobei
das Panicculus Carnosus verschont blieb. LSE-Transplantate – entweder
der Kontrolle oder kältekonservierte – wurden
auf die Wunde aufgelegt und so zugeschnitten, dass sie passten.
Alle Transplantate wurden mit einer Schicht von Petrolatum-imprägniertem
Verbandsmull (Verkäufer)
umwickelt und durch zwei Heftpflaster (Verkäufer) bedeckt. Die Verbände wurden
7 Tage nach der Verpflanzung entfernt.
-
14
Tage nach der Verpflanzung wurden alle Tiere euthanisiert und fotografiert.
Die Verpflanzungsstelle wurde danach zum Zwecke einer histologischen
Analyse und Bewertung ausgeschnitten. Die Grobfotografien und Mikrographen
zeigten, dass es keinen Unterschied bei der Transplantatintegration zwischen
dem Kontroll-LSE und dem aufgetauten, kältekonservierten LSE gab. Es
wurden keine wesentlichen Unterschiede bei der Rate der Wundkontraktur
zwischen den Kontroll-Transplantaten und den kältekonservierten Transplantaten
festgestellt.
-
Beispiel 12: Syngenes
Hautverpflanzen von kältekonservierter
Mäusehaut
und Kontroll-Mäusehaut
-
Um
die Bioäquivalenz
von kältekonservierter und
nicht kältekonservierter
Mäusehaut
nachzuweisen, wurde eine syngene Hautverpflanzungsstudie durchgeführt.
-
Wildtypmaus,
Stamm B6CB6YF1, wurden durch eine Nembutal-Überdosis euthanisiert. Die Haut
wurde aseptisch geerntet. Überschüssige Blutgefäße, Fett-
und Bindegewebe wurden aus der Dermis in Vorbereitung auf die Hautverpflanzung
entfernt. Mäusehaut
wurde kältekonserviert
und gemäß dem Verfahren
in Beispiel 7 aufgetaut. Nicht kältekonservierte
Kontroll-Mäusehaut
wurde in einem Nährstoffmedium
bei 4°C
für die
Dauer des Kältekonservierungs-
und Auftauverfahrens, insgesamt zwei Tage, vor der Hautverpflanzung
aufbewahrt.
-
Sechs
Mäuse desselben
Stammes erhielten Hauttransplantate, zwei erhielten nicht kältekonservierte
Kontroll-Mäusehaut
und vier erhielten aufgetaute, kältekonservierte
Mäusehaut.
Die Mäuse
wurden mit Nembutal anästhesiert.
Ein Hautabschnitt von 2 × 2
cm mit voller Dicke wurde aus dem Rücken jeder Maus geschnitten,
wobei das Paniculus Carnosus verschont blieb. Mäusehaut-Transplantate, entweder
von der Kontrollgruppe oder kältekonservierte, wurden
auf die Wunden platziert und so zugeschnitten, dass sie passten.
Alle Transplantate wurden mit einer Schicht von Petrolatum-imprägniertem
Verbandsmull umwickelt, bedeckt von zwei Heftpflastern. Diese Verbände wurden
7 Tage nach der Verpflanzung entfernt.
-
Dreißig Tage
nach der Verpflanzung wurden alle Tiere euthanisiert und fotografiert.
Die Verpflanzungsstelle wurde danach zum Zwecke einer histologischen
Analyse und Bewertung ausgeschnitten. Die Grobfotografien und Mikrographen
zeigten, dass es keinen Unterschied bei der Transplantatintegration zwischen
der Kontroll-Mäusehaut
und der aufgetauten, kältekonservierten
Mäusehaut
gab. Es wurden keine wesentlichen Unterschiede bei der Rate der Wundkontraktur
zwischen den Kontroll-Transplantaten und den kältekonservierten Transplantaten
festgestellt.
-
Obwohl
die vorerwähnte
Erfindung in einem gewissen Ausmaß detailliert mit Hilfe von
Darstellungen und beispielhaft zu Zwecken des besseren Verständnisses
beschrieben wurde, wird Fachleuten klar sein, dass bestimmte Änderungen
und Modifikationen innerhalb des Schutzumfanges der beiliegenden Ansprüche durchgeführt werden
können.