ES2231804T3 - Metodo y diseño de encapsulado para crioconservacion y almacenamiento de equivalentes de tejido cultivado. - Google Patents
Metodo y diseño de encapsulado para crioconservacion y almacenamiento de equivalentes de tejido cultivado.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN DISEÑO DE ENVASE DE CRIOCONSERVACION EFICIENTE DE TEJIDOS DE MAMIFERO RECOGIDOS Y EQUIVALENTES DE TEJIDOS CULTIVADOS VIVOS REALIZADO CON TECNOLOGIA IN VITRO. LA INVENCION CONSISTE EN SUMERGIR UN TEJIDO DE MAMIFERO O UN EQUIVALENTE DE TEJIDO CULTIVADO EN UNA SOLUCION CRIOPROTECTORA, AGITAR LA SOLUCION LA SOLUCION CRIOPROTECTORA Y EL TEJIDO SUMERGIDO PARA REALIZAR UNA PENETRACION EFECTIVA DE LA SOLUCION CRIOPROTECTORA DENTRO DEL TEJIDO, Y CONGELAR EL TEJIDO A UNA VELOCIDAD DE CONGELACION MUY LENTA. EN LA ETAPA DE LA CONGELACION SE INICIA UNA FORMACION DE HIELO EXTRACELULAR POR SIEMBRA. EL TEJIDO CRIOCONSERVADO PUEDE ALMACENARSE DURANTE PERIODOS INDEFINIDOS DE TIEMPO ANTES DE USARSE. EL EQUIVALENTE DE TEJIDO CULTIVADO ES UN MODELO IN VITRO DEL TEJIDO HUMANO EQUIVALENTE, COMO LA PIEL O LA CORNEA, QUE, CUANDO SE RECUPERA DE SU ALMACENAMIENTO SE PUEDE USAR PARA TRASPLANTE O IMPLANTE IN VITRO O PARA CRIBAR COMPUESTOS IN VITRO.
Description
Método y diseño de encapsulado para
crioconservación y almacenamiento de equivalentes de tejido
cultivado.
Esta invención está relacionada con la
crioconservación de tejido extraído y equivalentes de tejido
cultivado formados mediante la utilización de la tecnología in
vitro. Esta invención está relacionada también con un diseño
de empaquetado de crioconservación para el tejido extraído y
equivalentes de tejido cultivado que es un diseño de empaquetado
efectivo y fácil de manipular, que permite la viabilidad máxima del
tejido o del equivalente del tejido para su crioconservación.
Mediante el uso de la tecnología de la crioconservación, el tejido
extraído crioconservado o el tejido cultivado crioconservado pueden
ser almacenados durante periodos indefinidos de tiempo con
antelación a su utilización. El tejido cultivado es un modelo in
Vitro del tejido humano equivalente, el cual al ser recuperado
del almacenamiento puede utilizarse para el transplante o
implantación in vivo o para compuestos de cribado in
vitro.
La tecnología in vitro ha desarrollado
equivalentes de tejido para los fines de pruebas in vitro o
injerto in vivo para la reparación de heridas. Los métodos
de producción de dichos equivalentes de tejido están expuestos en
las patente de los EE.UU. números 4485096, 4604346, 4835102 y
5374515, y EP-A-0418035 y
WO-94/10940.
La duración de almacenamiento de los tejidos
vivos es limitada, y subsiguientemente su ventana de utilización es
corta, dando lugar a muchos residuos desechables. Existe la
necesidad de preservar dichos tejidos duran periodos amplios de
tiempo, tal como para su envío y almacenamiento, hasta su
utilización final. Tanto el desarrollo de un método de
crioconservación y un encapsulado para la crioconservación y
almacenamiento ampliarían la ventana de utilización de forma
indefinida, así como la facilidad de su envío, y permitirían el
mantenimiento de un inventario. Sería deseable también la
posibilidad un inventario de tejidos en centros de atención de
quemados y hospitales. Otras ventajas son las muestras que puedan
retenerse a partir de diferentes etapas del ciclo de fabricación
para los archivos de control de calidad y de lotes de producción
más grandes que puedan realizarse conforme puedan mantenerse en un
estado de congelación.
En la actualidad el tiempo de almacenamiento de
los materiales biológicos celulares está ampliado mediante la
refrigeración a temperaturas "criogénicas". La transición de
líquido al estado sólido mediante el descenso de la temperatura del
sistema puede tener lugar bien como cristalización (hielo), que
incluye una configuración ordenada de las moléculas de agua, o como
la vitrificación o amorfización (formación de cristal), en la
ausencia de dicha configuración ordenada de la fase cristalina. El
desafío para un criobiólogo es llevar las células a temperaturas
criogénicas y hacer que retornen las mismas a los estados
fisiológicos sin dañarlas.
Existen dos soluciones básicas para la
crioconservación de células y tejidos:
congelación-descongelación y vitrificación. En las
técnicas de congelación-descongelación, la solución
extracelular se congela (es decir, en forma cristalina), pero se
toman unas etapas para minimizar la formación de hielo
intracelular. En los procedimientos de vitrificación, existe el
intento de impedir la formación de hielo a través de la muestra
completa. La primera solución es problemática porque si se forman
cristales de hielo dentro de las células, son perjudiciales para la
viabilidad de las células al descongelarse. No obstante, las
células podrían sobrevivir un ciclo de
congelación-descongelación si se enfriaran con
velocidades controladas en la presencia de niveles no tóxicos de
crioprotectores. La última solución de vitrificación busca evitar
los efectos potencialmente dañinos del hielo intracelular y
extracelular mediante la reducción de la formación de hielo
utilizando concentraciones muy altas de solutos y/o polímeros. No
obstante, puede tener lugar el daño celular a la exposición larga de
niveles tóxicos de estos aditivos necesarios para la
vitrificación.
Los crioprotectores protegen las células vivas de
las tensiones incluidas en el proceso de congelación. Una forma en
la que los crioprotectores protegen a las células es mediante la
disolución de la sal que llega a concentrarse en forma incremental
en la solución sin congelar conforme el agua se convierte en hielo.
La cantidad de hielo está dictada por la temperatura y por
composición inicial de la solución; mientras que la cantidad de
fracción no congelada es solo una función de la temperatura. Los
crioprotectores tienen otras funciones distintas. Una función
importante es que reducen usualmente las temperaturas de formación
de hielo intracelular. Otra función es que estabilizan las membranas
y las proteínas.
Todas las soluciones se superenfriarán por debajo
de sus punto de congelación hasta que encuentren un lugar de
nuclearización aleatoria para la formación de hielo. Cuando se
efectúa la crioconservación mediante un método de
congelación-descongelación, la formación de hielo en
el medio extracelular deberá ser iniciado de forma deliberada
mediante la siembra con un bajo grado de superenfriamiento. Si no se
induce la formación de hielo mediante la siembra, el hielo se
formará espontáneamente cuando la solución se enfríe suficientemente
más allá por debajo de su punto de congelación de equilibrio.
Debido a que este proceso es aleatorio por su naturaleza, la
formación de hielo tendrá lugar en forma aleatoria, con
temperaturas no predecibles; consecuentemente, las tasas de
supervivencia sean altamente variables entre las pruebas repetidas
con el mismo protocolo de congelación. Adicionalmente, la
cristalización extremadamente rápida que resulta cuando se forma el
hielo en una solución altamente superenfriada puede provocar daños
en las células y en los tejidos. Adicionalmente, se ha demostrado
que si la formación de hielo extracelular se inicia con altos
grados de superenfriamiento, se incrementará drásticamente la
probabilidad de la formación de hielo intracelular. Este fenómeno
tiene lugar a partir del inicio retardado de la deshidratación
celular inducida por la congelación, que da lugar a una retención
incrementada de agua intracelular, y por tanto a una probabilidad
más alta de formación de hielo en la célula.
Una vez que el hielo extracelular es sembrado y
la muestra está rodeada por la fase de hielo, es necesario enfriar
la muestra a un estado de crioconservación. La etapa de
enfriamiento es una de las etapas más críticas en un protocolo de
congelación-descongelación. Debido a la formación de
hielo, es decir, agua pura, la solución extracelular congelada
parcialmente se concentra más que el compartimento intracelular.
Como consecuencia de ello, la célula se deshidratará por la
pérdida de agua en un intento por restaurar el equilibrio
termodinámico. Conforme se enfría el sistema, se generará más hielo
extracelular y se elevará la concentración del soluto y forzando a
las células a que se deshidraten más. Existen tres características
de las células que controlan la velocidad de la deshidratación. Una
es la permeabilidad al agua de la membrana celular; cuanto más baja
sea la permeabilidad al agua, más tiempo tomará la deshidratación
de las células. Otra es la dependencia de la temperatura de la
permeabilidad al agua de la membrana celular; todas las células
reducen su permeabilidad al agua con el incremento de la
temperatura. La característica final es el tamaño de la célula;
las células más grandes toman más tiempo para deshidratarse que las
células pequeñas. Dado que cada tipo de célula puede tener
características drásticamente distintas, las condiciones de
crioconservación pueden variar en órdenes de magnitud para los
distintos tipos de células.
Aunque los mecanismos exactos de los daños
celulares durante la crioconservación no han sido todavía
elucidados completamente, las firmas de supervivencia
características generadas por la medida de la supervivencia celular
en función de la velocidad de enfriamiento, aparecerán como
cuantitativamente similares para todos los tipos de células,
representadas por una curva en forma de U invertida. La
supervivencia celular es baja con tasas de enfriamiento muy bajas y
muy rápidas, y existe una tasa de enfriamiento intermedia que genera
una supervivencia óptima. Incluso aunque la velocidad óptima de
enfriamiento y el ancho de la curva puedan variar drásticamente
para los distintos tipos de células, el comportamiento cualitativo
aparece como que es universal. Las tasas de enfriamiento más
rápidas no permiten a las células un tiempo suficiente para
deshidratarse y las células forman hielo internamente. El daño
celular para las tasas de enfriamiento rápido se atribuye a la
formación de hielo intracelular. Con tasas lentas de enfriamiento,
el daño celular está debido no obstante a los efectos de la
exposición a la sal altamente concentrada intra y extracelular, y a
las soluciones de crioconservación o a las interacciones mecánicas
entre las células y el hielo extracelular.
Es necesario deshidratar las células en todo lo
posible antes de que se cruce la curva de nucleación del hielo
intracelular. Es en este punto en donde prácticamente todo el agua
que resta en la célula se nucleará y formará hielo. No es práctico
determinar la temperatura exacta en que sucede lo anterior, pero es
aproximadamente a -40ºC a -50ºC en que las células se congelan
lentamente en la presencia de concentraciones de 1M a 2M de
crioprotectores. Es importante observar que la cantidad de agua que
se convierte en hielo dentro de una célula en este punto puede ser
inocua al congelarse, pero si no se descongela suficientemente
rápido, se expandirá y matará a la célula al descongelarse. (La
biofísica de la crioconservación de órganos, pág.
117-140, editada por David E. Pegg y Armand M.
Karow, Jr, NATO ASI Series A: Ciencias de la Vida, Vol. 147 1987
Plenum Press, Nueva Cork 233 Spring St., Nueva Cork, NY 10013).
Antes del desarrollo de una piel comercialmente
viable equivalente, se utilizó piel de cadáveres para los fines de
injertos. Se desarrollaron protocolos de crioconservación, de
forma que los centros y hospitales de quemados pudieran mantener
bancos de pieles. Se desarrollaron varios protocolos distintos
utilizando distintos crioprotectores, tasas de congelación, formatos
de encapsulación, y condiciones de almacenamiento. La mayoría de
los investigadores acordaron un protocolo de descongelación rápido.
El éxito o el fracaso del protocolo se midieron bien mediante un
parche de injerto en un lecho de herida o mediante un ensayo de
viabilidad celular.
En el documento U.S. 3842831 de Beisang se
expone un método para la crioconservación de parches de piel de
cadáveres. El método incluye la fijación de la piel del cadáver a
un tejido entrelazado holgado o soporte, y conjuntamente los
parches de piel y el tejido se enrollan antes de la congelación.
No se utilizan ningún crioprotector, aunque los inventores sugieren
el uso de glicerina o DMSO. El protocolo de congelación utiliza un
protocolo de tasa de congelación rápida no controlada (a temperatura
fijada) para una temperatura criogénica de -70ºC.
May SR y FA DeClement (Metodología de Bancos de
Piel, 17, 33-45 (1890)) efectuaron una evaluación
de la geometría de encapsulamiento y enfriamiento y tasas de
precauciones con la utilización de piel de cadáver de dermatomo. Los
resultados sugieren que la piel del cadáver sea plana en lugar de
enrollada, y que se utilice una tasa controlada más lenta de
congelación.
El documento U.S. 5040677 de Tubo expone un
envase sellable herméticamente estanco a gases para los injertos
individuales de planchas celulares epiteliales. El envase requiere
que la plancha celular epitelial sea fijada a una plancha de
substrato adhesivo o respaldo mediante el uso de pinzas.
El documento U.S. 5145770 de Tubo expone un
método de crioconservación para planchas de queratinocitos que
utiliza un crioprotector de un agente que no penetra en las
células, tal como el dextrano, y un reactivo de penetración en las
células, tal como el glicerol, con una tasa de enfriamiento de
aproximadamente -1ºC/minuto. De forma similar, el documento
EP-0364306 de Chao y otros, expone un método de
crioconservación de una plancha de células epiteliales cultivadas
vivas, pero utilizando tanto el DMSO y el glicerol como
crioprotector y un protocolo de congelación de preferiblemente
-1ºC/minuto.
El documento U.S. 5298417 de Candedda y otros
expone un protocolo de crioconservación desarrollado para
construcciones de una sola capa tal como las planchas epiteliales
preparadas según lo expuesto en el documento US 4016036, 4304866 y
4456687. Las planchas epidérmicas fueron incubadas con un
crioconservador de 8-15% de glicerol o DMSO y fueron
crioconservadas mediante el empleo de un protocolo de tasa
controlada, en donde la velocidad de enfriamiento sea más lenta en
el inicio que al final del protocolo, y estando caracterizada por
un incremento en la temperatura antes de la culminación del
procedimiento de congelación.
Se investigó un método para la crioprotección de
fibroblastos dérmicos en gel de colágeno, por Teasdale y otros,
Quemados, 19 (5) 406-410 (1993). Teasdale
determinó que la viabilidad celular óptima podría obtenerse mediante
la congelación con una tasa de -0.5º/minuto con DMSO como
crioprotector.
El documento "Injertos de piel compuesta
cultivada: Equivalentes biológicos de piel que permiten una
expansión masiva", de Nanchahal y otros, The Lancet, 2 (8565),
191-193 (22 de Julio de 1989), expone una técnica de
almacenamiento de injertos de tejido cultivado compuesto que
utiliza un crioprotector del 15% de glicerol y el 10% de FCS en
Medio 199. Los injertos y el crioprotector fueron incubados a 37ºC
durante dos horas y congelados a -1ºC por minuto hasta -70ºC y
almacenados entonces en nitrógeno líquido. Después de la
descongelación rápida de los injertos, se determinó su viabilidad
mediante el cultivo durante dos semanas y mediante el injerto en
ratones sin pelos. Se efectuó una evaluación final mediante el
injerto en tres pacientes llevando a cabo una extirpación de un
tatuaje.
El documento "Crioconservación de córneas de
conejo y gato a -18 a -24ºC", Cornea, de Johnstone y
otros, 11(3): 211-220 (1992), está dirigido a
un procedimiento sencillo para la crioconservación de corneas de
conejo y gato que utiliza un congelador doméstico en lugar de
nitrógeno líquido o bien congeladores de temperaturas muy bajas.
Se obtuvo la perfusión del crioconservador mediante la colocación
de las córneas en sucesivas soluciones del 50% de suero de feto de
ternero y medio de McCarey-Kaufman con contenido
incrementado de glicerol y glucosa.
El documento US-5131850 expone un
método para la crioconservación de tejidos músculoesquelético
mediante la colocación de dicho tejido en contacto con una
composición conteniendo un agente crioconservador que comprende un
soluto orgánico de penetración en las células, el cual es
preferiblemente el dimetilsulfoxido, y un glicosaminoglicano, el
cual es preferiblemente el sulfato de condroitina, en una cantidad
suficiente para crioconservar el tejido musculoesquelético. La
adición de un glicosaminoglicano a un agente crioconservador que
comprende un soluto orgánico de penetración en las células permite
el poder utilizar una amplia gama de velocidades de enfriamiento.
La crioconservación se inicia preferiblemente al cabo de 20 a 60
minutos después de la adición del agente crioconservador. El cambio
de fase de agua a hielo se inicia a los -2ºC a -6ºC mediante una
dosis de nitrógeno líquido, cristal de hielo estéril o mediante una
vibración. Se expone también un programa de congelación diseñado
para maximizar la retención de la viabilidad celular del tejido y
de las propiedades biomecánicas durante y después del proceso de
congelación, y un programa de descongelación que maximiza la
viabilidad de las células.
El documento US-5298417 expone un
proceso para preservar las planchas epidérmicas cultivadas mediante
la incubación de las planchas a temperatura ambiente en medios con
glicerol o un crioconservador de dimetilsufoxido durante un periodo
predeterminado de tiempo, y congelando después las planchas
cultivadas. El gradiente de enfriamiento está caracterizado porque
tiene una velocidad inicial más lenta de enfriamiento, seguida por
una velocidad más alta de enfriamiento. El ejemplo describe unas
bolsas conteniendo piezas de tejido que se sellan y se incuban
térmicamente a la temperatura ambiente durante 5-7
minutos. Las bolsas se colocan en un envase adecuado y se
transfieren a un congelador programable. Las piezas de tejido se
congelan entonces utilizando un programa de congelación. Las bolsas
conteniendo las planchas epiteliales congeladas se almacenan a
una temperatura de -80ºC.
Utilizando los métodos del arte anterior, no es
posible crioconservar los equivalentes de tejido cultivado, en
parte porque son relativamente gruesos y compuestos por capas
celulares heterogéneas. Una de las funciones de estos tejidos in
vivo es proporcionar una barrera de permeabilidad. Las funciones
del tejido tienen que ser consideradas en el desarrollo de un
protocolo de crioconservación.
Los presentes inventores han descubierto un
método para la crioconservación y, en particular, un diseño de un
encapsulado, que es aplicable a varios equivalentes de tejidos
cultivados y a la piel de mamíferos, que es un encapsulado
sorprendentemente efectivo y práctico comercialmente para la
crioconservación de equivalentes de tejido cultivado.
La presente invención proporciona un método para
la crioconservación con éxito de equivalentes de tejido cultivado a
temperaturas muy bajas que evita la formación de cristales de hielo
intracelulares dañinos, minimizando la concentración efectiva de
productos químicos potencialmente dañinos, y que permite la rápida
introducción y extracción de crioprotectores a temperaturas
factibles utilizando un equipo de congelación programable.
La presente invención proporciona un diseño de
encapsulado nuevo desarrollado para la crioconservación,
almacenamiento y distribución de equivalentes de tejido cultivado.
El nuevo diseño ofrece muchas ventajas sobre los diseños existentes
de encapsulados. En el momento actual, no existen equivalentes de
tejidos cultivados crioconservados disponibles comercialmente, y
por tanto no existen disponibles los diseños de encapsulados. El
diseño de un nuevo encapsulado permite un mejor seguimiento de la
temperatura del interior del encapsulado con la temperatura
exterior de la cámara de congelación, debido a que tiene una
transferencia de calor más eficiente. La velocidad de trasferencia
térmica mejorada permite un proceso más controlado; así pues, se
consigue un enfriamiento uniforme y velocidades de calentamiento del
equivalente de tejido cultivado, reduciéndose por tanto la
variabilidad en la viabilidad celular.
Los inventores han descubierto un método para
crioconservar equivalentes de tejido cultivado obtenidos a partir
de técnicas in vitro, de forma que los tejidos puedan
mantener su viabilidad y utilidad como equivalentes de los tejidos
humanos. La invención incluye el uso de la agitación para realzar la
penetración de una cantidad efectiva del crioprotector. El método
presente proporciona la crioconservación del tejido extraído y de
los equivalentes de tejido cultivado de una forma que protege la
integridad estructural y la viabilidad celular.
El método de esta invención incluye las etapas
siguientes:
- 1)
- El tejido extraído o el equivalente de tejido cultivado se sumerge en una solución crioprotectora, y la solución criprotectora y el tejido sumergido se agitan para conseguir una penetración efectiva de la solución crioprotectora dentro del tejido (perfusión del tejido); y
- 2)
- Después de la perfusión de la solución crioprotectora dentro del tejido, se enfría hasta llegar al margen de la temperatura de equilibrio de la fase sólido-líquido del crioprotector; sembrando hielo extracelular y enfriando hasta un estado crioconservado mediante la congelación del tejido a una velocidad de enfriamiento lenta hasta al menos una temperatura o inferior a la misma de aproximadamente -70ºC, preferiblemente incluso a -140ºC, y más preferiblemente a -196ºC.
Una vez congelado, el tejido crioconservado puede
ser almacenado durante periodos de tiempo indefinidos entre las
temperaturas de aproximadamente -120ºC a -196ºC, a la temperatura
del nitrógeno líquido.
La descongelación del tejido crioconservado se
lleva a cabo mediante el calentamiento del tejido congelado a una
alta velocidad, lo que se efectúa en aproximadamente 1 a 2 minutos.
El tejido helado puede ser descongelado mediante la aplicación
directa de un medio de cultivo calentado o mediante una solución
tampón fisiológica o mediante otro método de calentamiento rápido.
El diseño del encapsulado permite la descongelación del tejido
mediante la inmersión del encapsulado en un baño de agua ya que el
encapsulado asegura tanto una velocidad rápida de calentamiento
como la uniformidad térmica controlada mientras que se mantiene la
esterilidad durante el procedimiento de descongelación crítico.
Con antelación al uso de un equivalente del
tejido humano, para injertos o para pruebas in vitro, el
equivalente de tejido cultivado descongelado se lava para eliminar
la solución de crioprotector. La solución crioprotectora puede ser
eliminada mediante el lavado, por ejemplo, con una solución tampón
isotónica con un pH fisiológico. Los equivalentes de tejido
cultivado pueden ser entonces almacenados en dicha solución tampón,
o bien recultivados en un medio celular apropiado antes de su
utilización.
Las figuras 1A y 1B muestras vistas de la
tapa.
La figura 2 muestra una vista superior de la
junta hermética.
Las figuras 3A y 3B muestran vistas de la junta
hermética montada en la tapa.
Las figuras 4A y 4B muestran vistas del
soporte.
Las figuras 5A y 5B muestran vistas de la
bandeja.
Las figuras 6A y 6B muestran vistas laterales del
conjunto, en forma despiezada y completado.
La figura 7 muestra una vista en primer plano del
conjunto.
La figura 8 muestra una vista superior del
conjunto completado.
La figura 9 muestra un gráfico de la viabilidad
de los tejidos cultivados crioconservados en comparación con los
tejidos cultivados no crioconservados. Se muestra la viabilidad de
los tejidos cultivados crioconservados según lo medido por MTT. Se
midió LSE adicionalmente por el ensayo LDH. Todos los tejidos
cultivados están comparados con los controles de comparación de
edades no crioconservados, y se encuentran expresados como un
porcentaje del control.
La ingeniería de los tejidos es un campo
emergente que utiliza células de tejidos cultivados para construir
equivalentes de tejidos que puedan ser utilizados para examinar la
respuesta a los daños por agentes químicos o por compuestos
farmacéuticos. El tejido cultivado puede ser utilizado también para
formar un tejido humano injertable.
Los equivalentes de tejido han sido descritos
extensamente en muchas patentes, incluyendo las patentes de los
EE.UU. números 4485096; 4485097; 4539716; 4546500; 4604346; 4837379
Y 5374515, todas las cuales se incorporan aquí como referencia. Una
aplicación con éxito del equivalente de tejido es la denominada
como "equivalente de tejido vivo", la cual tiene una morfología
similar a la piel humana real. El equivalente de piel vivo (LSE)
está compuesto por dos capas: la parte superior está hecha de
queratinocitos epidérmicos humanos estratificados que cubren una
capa inferior de los fibroblastos dérmicos humanos en una matriz de
colágenos.
Parenteau y otros, "Epidermis generada in
vitro: Consideraciones prácticas y Aplicaciones", J. De
Celullar Biochistry, 45:245-251 (1991);
Parenteay y otros, "Cultivo orgánico de queratinocitos y
fibroblastos de piel humana para obtener forma y función",
Cytotechnology, 9:163-171 (1992); y Bell y
otros, "Los equivalentes de la piel humana: Su fabricación, sus
propiedades organotípicas y sus respuestas a los irritantes",
Toxic. In vitro, 5:591-596 (1991), el LSE
para injertos se encuentra en investigación en pruebas clínicas
para las indicaciones relativas a las heridas de la piel de grosor
parcial y total: cirugía de extirpación, quemados, úlceras de
estasis venosa, ulceras diabéticas, ulceras de decubitus, y
úlceras inflamatorias crónicas. El LSE es un tejido de la piel
in vitro de grosor completo y bicapa.
Se ha desarrollado un órgano in vitro
equivalente de la córnea tal como se describe en la patente de los
EE.UU. número 5374515 incorporada aquí como referencia. El
equivalente de tejido de cornea tiene tres capas celulares
distintas, la capa externa, un epitelio escamoso estratificado; la
capa intermedia de fibras de colágeno y células de estroma; y una
capa interna, de un sencillo epitelio escamoso, denominada también
como endotelio corneal. El equivalente de cornea in vitro
puede ser utilizado para ensayos de toxicidad in vitro para
servir como modelos predictivos económicos de elementos no animales
oculares in vivo y de irritación potencial dérmica para
muchos tipos de productos y materiales sin tratamiento.
El objetivo de la crioconservación es preservar
la integridad estructural y la viabilidad de materiales biológicos
durante un periodo de tiempo indefinido de tiempo, de forma que
estos materiales puedan estar disponibles y utilizados según sea
necesario. Los tejidos complejos de una vida finita precisarán de
crioconservación para ampliar la disponibilidad del producto y su
utilidad. La historia de la crioconservación de material biológico,
no obstante, ha demostrado que la optimización de un protocolo de
crioconservación para una célula en particular no es necesario que
proporcione resultados excelentes al ser utilizado con otro tipo de
célula o con otras células en un tejido. Se precisó del desarrollo
de métodos más especializados debido a las diferencias en la
densidad celular, contenido de agua y nivel de organización
estructural de los equivalentes de tejido de grosor completo. Los
protocolos de crioservación de esta invención son sorprendentemente
aplicables a las capas epidérmicas y dérmicas de una capa,
equivalentes de tejido bicapa, equivalentes de cornea de tres
capas, y piel de mamíferos extraída. El desarrollo de un diseño del
encapsulado hace que la crioconservación de estos tejidos sea
práctica para los procesos a escala de producción.
Tal como se utiliza aquí, el término
"equivalentes de tejido cultivado" significa equivalentes de
tejido de tejidos de mamíferos, en donde los equivalentes de tejido
se producen mediante técnicas in vitro y significando que
incluyen equivalentes de piel monocapa, bien como equivalente
dérmico o como una plancha epidérmica; equivalentes de piel bicapa,
LSE en particular: equivalentes de cornea tricapa y equivalentes de
piel. La morfología de los equivalentes de tejido cultivado es
similar al órgano de mamíferos in vivo, típicamente el
órgano humano. Con fines ilustrativos, la morfología del LSR
incluye muchas similaridades con la piel humana. Metabólica y
mitoticamente los fibroblastos dérmicos humanos (HDF) se encuentran
en toda la capa dérmica de la construcción, y se ha demostrado que
segregan colágeno y otros componentes matriciales en la red. La
epidermis comprende una capa basal para dividir con una tasa miótica
similar a la piel humana. La epidermis suprabasal muestra los
mismos estratos que la piel in vivo, con capas espinosas y
granulares bien definidas que contienen queratonhialina y gránulos
laminares recubiertos por una cornea de estratos. La
inmunohistoquimica demuestra la presencia de componentes matriciales
extracelulares que se encuentran rutinariamente en la unión
dermo-epidérmica en la piel humana normal, tal como
la laminita, colágeno tipo IV y calanina (GB3).
Los equivalentes de tejido cultivado obtenidos
por métodos de cultivo organotípicos, tal como el equivalente de
piel viva (LSE), utilizan un soporte como bastidor de soporte sobre
el cual se forman los equivalentes. Los equivalentes de tejido
cultivado se fabrican sobre un soporte que permite la manipulación
de la construcción durante la fabricación y el envío y para el uso
final sin contactar directamente con la construcción. Los métodos de
producción de equivalentes de tejido cultivado en un soporte se
encuentran expuestos en la patente de los EE.UU. número 5374515 y
en las patentes EP-A-0418035 y
WO-94/10940.
El soporte incluye una membrana permeable plana,
la cual está fijada a un extremo de un soporte esencialmente
tubular. El otro extremo del soporte tubular incluye una brida que
se extiende hacia fuera, la cual a su vez soporta un reborde que
puede colgar del extremo superior de una hendidura en un disco de
cultivo de tejidos y en el diseño del encapsulado de la presente
invención. El conjunto de membrana-soporte está
dimensionado para ser utilizado con un disco de cultivo que tenga
al menos una hendidura de un tamaño específico con el fin de
proporcionar el espacio libre adecuado alrededor del soporte y
acoplándose al extremo superior de la hendidura. El conjunto de
membrana-soporte puede fabricarse con diferentes
tamaños con el fin de utilizarse con distintos tamaños de los discos
de cultivo y crioconservación y con los encapsulados de
almacenamiento. Los ejemplos del diseño de los encapsulados están
descritos en la patente de los EE.UU. número 5466602. Las
modificaciones del diseño del encapsulado pueden hacerse por
artesanos especializados para acomodar soportes similares que
utilicen distintos medios y acoplamientos en las vasijas de
cultivo. Soportes similares están descritos en las patentes de los
EE.UU. números 5358871 y 5366893 o bien los descritos en la patente
de los EE.UU. número 4871674.
El diseño del encapsulado preferido utilizado en
el método de esta invención incorpora el bastidor de soporte y
define un entorno alrededor del equivalente del tejido que es capaz
de ser controlado según especificaciones predeterminadas. La
presente invención utiliza materiales que son preferiblemente de
calidad de graduación médica y que son capaces de soportar una
amplia gama de temperaturas. Estos materiales están moldeados para
formar una bandeja y una tapa que sean capaces de ser selladas
herméticamente mediante medios de sellado hermético. El nuevo
encapsulado está diseñado para incorporar un soporte sobre el cual
se formen los equivalentes del tejido.
El nuevo diseño del encapsulado comprende una
bandeja, una tapa y una junta de sellado hermético entre las
mismas. La bandeja y la tapa están diseñadas para encajar en el
soporte existente que contiene el equivalente de tejido asociado.
El soporte con el equivalente de tejido asociado se colocan en la
bandeja y se añade la solución del crioprotector. Se coloca la tapa
entonces sobre la bandeja y las dos partes se sellan herméticamente
en forma conjunta para formar una junta hermética entre los
entornos del interior y del exterior del encapsulado.
El diseño del encapsulado permite una
distribución igual del crioprotector por debajo del soporte y por
encima de la superficie del equivalente del tejido, mientras que se
mantiene el contacto del crioprotector en el equivalente del tejido
y con la bandeja y la tapa. El diseño del encapsulado está basado en
el concepto de que las velocidades controladas de enfriamiento y
congelación pueden ser mantenidas con un volumen igual de
crioprotector, configuradas con una geometría similar por encima y
por debajo del tejido cultivado a crioconservar. Esta configuración
proporciona una distancia uniforme, medida desde las superficies
superior e inferior del equivalente de tejido cultivado hasta la
pared exterior del encapsulado (en el supuesto de que el embalaje
tenga también un grosor uniforme). Esta uniformidad deberá
proporcionar un intercambio de calor uniforme desde el equivalente
del tejido hasta la cámara de congelación al efectuar el
enfriamiento; y desde el entorno externo hasta el equivalente del
tejido, al efectuar la descongelación.
La bandeja comprende una superficie inferior que
es contigua con una pared lateral y una brida. La brida proporciona
una superficie plana para el sellado hermético de la bandeja a la
tapa. La pared lateral de la bandeja tiene un soporte continuo o
bien una pluralidad de soportes discontinuos hacia dentro que se
extienden y que son integrales con la pared lateral. El borde
superior del soporte que contiene el equivalente del tejido
cultivado, al posicionarse en la bandeja, está suspendido sobre los
soportes provistos por la pared lateral de la bandeja. Se encuentra
definido un espacio entre el soporte suspendido y la superficie
inferior de la bandeja que mide aproximadamente 1,0 mm de grosor,
con un área en torno al tamaño del equivalente del tejido.
La tapa comprende una superficie inferior plana
contigua con una pared lateral y una brida. El diámetro de la brida
de la tapa es ligeramente menor que el diámetro de la brida de la
bandeja. La brida de la tapa, al colocarla sobre la bandeja que
contiene un portador, descansa sobre el soporte de forma que las
superficies superior de tanto la brida de la bandeja como la brida
de la tapa se encuentran en contacto orientadas sobre el mismo
plano. Se encuentra definido un segundo espacio mediante la tapa y
la superficie del equivalente del tejido cultivado que mide también
1,0 mm de grosor, con un área en torno al tamaño del equivalente
del tejido.
El diseño permite un total de aproximadamente 1
mm entre la bandeja y el fondo del soporte que contiene el
equivalente del tejido dispuesto entre los mismos, y
aproximadamente 1 mm entre la tapa y el equivalente del tejido con
el crioprotector encima y por debajo del equivalente del tejido en
contacto tanto con la tapa como con la bandeja. Cuando la tapa se
coloca en la bandeja que contiene el medio, la tapa desplaza
cualquier aire existente en el embalaje hacia el espacio periférico
que contiene el soporte tubular del soporte.
La tapa se sella herméticamente en la bandeja a
lo largo del plano expuesto creado por las superficies superiores
de las bridas de la bandeja y de la tapa. El sellado hermético se
lleva a cabo por calor, adhesivo o bien otros medios conocidos en
el arte. La junta hermética entre la tapa y la bandeja impide las
fugas del crioprotector y mantiene la esterilidad del interior de la
unidad. Preferiblemente se sella una plancha anular de material de
la pata sellable por calor a ambas bridas de la bandeja y de la
tapa. El material de la tapa tiene preferiblemente una aleta para
ser eliminada al estirar de la misma, y para eliminar el sellado
hermético de la tapa de la bandeja, para tener acceso al
equivalente del tejido. En otra realización, la tapa con una brida
de aproximadamente el mismo diámetro que la brida de la bandeja se
coloca sobre una bandeja con un soporte dispuesto dentro, de forma
que la superficie inferior de la brida de la tapa entre en contacto
con la superficie superior de la brida de la bandeja. Las bridas
se sellan entonces conjuntamente medios sellables herméticos.
Las figuras 1A y 1B muestran la tapa 10; brida de
la tapa 11; pared lateral de la tapa 12; y la superficie inferior
13. La brida de la tapa 11, la pared lateral de la tapa 12 y la
superficie inferior 13, forman una superficie continua.
La figura 2 muestra la junta anular 20 y la aleta
de tracción 21.
Las figuras 3A y 3B muestran la junta 20; la tapa
10; brida de la tapa 11. La junta 20 está montada en la brida de la
tapa 11 de la tapa 10 con antelación al uso para facilitar el
alineamiento de la junta durante el proceso de sellado.
Las figuras 4A y 4B muestran el soporte 30; el
reborde del soporte 31; membrana permeable 32; y el soporte tubular
33. La membrana permeable 32 contiene un equivalente del tejido de
cultivo dispuesto y unido por el soporte tubular 33. El soporte 30
permite la transferencia del equivalente del tejido sin hacer
contacto o extraer el equivalente del tejido a través del proceso de
crioconservación.
Las figuras 5A y 5B muestran la bandeja 40;
superficie inferior de la bandeja 41; pared lateral de la bandeja
42; brida de la bandeja 43; y apoyos del soporte 44. La superficie
inferior de la bandeja 41, pared lateral de la bandeja 42, brida
de la bandeja 43, y apoyos del soporte 44, forman una superficie
contigua. Los apoyos del soporte 44 contactan y soportan el soporte
dentro de la bandeja.
Las figuras 6A y 6B muestran la junta 20; la tapa
10; soporte 30; y bandeja 40. El soporte 30 que contiene el
equivalente del tejido está dispuesto en una bandeja 40, y está
suspendido dentro de la bandeja. La tapa 10 con la junta hermética
20 está colocada sobre el soporte 30, y está suspendida sobre el
soporte.
La figura 7 muestra la junta hermética 20; brida
de tapa 11; tapa 10; soporte 30; reborde de soporte 31; apoyos de
soporte 44; y bandeja 40. El soporte 30 que contiene el equivalente
del tejido se encuentra dispuesto en la bandeja 40, y está
suspendido dentro de la bandeja haciendo contacto con la superficie
inferior del reborde del soporte 31, hasta las superficies
superiores de los apoyos del soporte 44. La tapa 10 con la junta
hermética 20 está colocada sobre el soporte 30, y está suspendida
sobre el soporte haciendo contacto con la superficie inferior de la
brida de la tapa 11 de la superficie superior del reborde del
soporte 31. Las superficies superiores de la brida de la tapa 11 y
la brida de la bandeja 43 forman una superficie plana para la junta
hermética 20.
La figura 8 muestra una vista superior del
conjunto.
Los materiales para la fabricación de las
bandejas y las tapas son materiales rígidos o semiflexibles
termoplásticos que al calentarse se moldean por vacío o inyección
moldeada, tal como el politetrafluoroetileno (PTFE) o glicol de
tereftalato de polietileno (PETG). Las bandejas y las tapas del
encapsulado están esterilizadas preferiblemente antes de la
utilización mediante métodos que son conocidos en el arte de la
esterilización. Los materiales utilizados para fabricar la bandeja
y la tapa determinarán el método de esterilización que pueda ser
utilizado. Para esterilizar el PTFE o PETG, es preferible la
radiación de rayos gamma de 2,5 a 3,0 megaradios. Los métodos
eléctricos y químicos de esterilización conocidos por los técnicos
especializados en el arte pueden ser utilizados
alternativamente.
Los equivalentes de tejido cultivado
comprenden
Los equivalentes de tejido cultivado comprenden
un equivalente dérmico de una red de colágeno hidratado establecido
por un agente, preferiblemente fibroblastos. En una realización se
cultiva una capa estratificada de células epidérmicas sobre la
superficie del equivalente dérmico. En otra realización, la red de
colágeno contraído hidratada, contraída por queratocitos, está
dispuesta sobre una capa de células endoteliales corneales con una
capa estratificada de células epiteliales corneales sobre la
superficie de la red. Alternativamente, pueden ser cultivadas solo
células epidérmicas e inducidas a estratificar para formar un
plancha epidérmica. El equivalente de tejido cultivado está formado
sobre una membrana porosa de un soporte o sobre un gel de colágeno
que está adherido a una membrana porosa de la superficie inferior
de un soporte. Adicionalmente, pueden ser crioconsevados otros
equivalentes de tejido cultivado de acuerdo con los métodos de esta
invención, incluyendo aunque sin limitación cualquier plancha
epidérmica cultivada, cualquier equivalente dérmico cultivado,
cualquier equivalente de córnea cultivado o piel de mamífero
extraída.
Se describirá a continuación la presente
invención utilizando equivalentes de tejidos y el diseño del
encapsulado preferido como ilustración. Se comprenderá por los
técnicos especializados en el arte que pueden hacerse modificaciones
en el método descrito y que se encuentren dentro del alcance de
esta invención.
El método de perfusión de un equivalente de
tejido con una solución crioprotectora es sumergir el equivalente
de tejido y su soporte asociado en un volumen dado de una solución
crioprotectora suficiente para sumergir la muestra y para tener un
volumen igual de solución crioprotectora por encima y por debajo del
equivalente del tejido. A una placa de Petri de 10 mm que contiene
el equivalente de tejido y el soporte se añaden 25 ml de glicerol 2M
en DMEM durante un periodo de tiempo suficiente para completar la
perfusión de la muestra, preferiblemente entre una y dos horas,
pero más preferiblemente durante aproximadamente una hora. Los
periodos ampliados de tiempo en la polución del crioprotector dan
por resultado la reducción de la viabilidad celular en el tejido,
mientras que un periodo de tiempo demasiado corto no asegura la
impregnación completa del crioprotector dentro del tejido. Las
construcciones de monocapa requerirán típicamente menos tiempo para
la perfusión, ya que tienen menos capas celulares y una función de
barrera reducida. Durante esta hora, la penetración de la solución
crioprotectora se realza mediante la agitación de la muestra y la
solución crioprotectora, típicamente mediante la agitación de la
placa Petri en un vibrador de plataforma orbital (vibrador orbital
Bellco) a 70 rpm en una cámara con gas CO_{2} al 10%. El entorno
de CO_{2} al 10%, que es el mismo que el entorno de cultivo en el
que se fabricó el equivalente del tejido, impide que el medio pierda
el gas, manteniendo así el pH de la componente del medio de base
del crioprotector. La agitación permite una perfusión más rápida y
completa del crioprotector en el equivalen del tejido y una mayor
reproducibilidad de los resultados entre los equivalentes de tejido
congelados. Se puede sustituir el agitador orbital con un aparato
que ejecute un movimiento de agitación en otros planos espaciales.
Adicionalmente, otros métodos de perfusión mejorada mecánicamente
incluyen aunque sin limitación el balanceo de la construcción con
crioprotector en una vasija en una plataforma o con la
centrifugación de la construcción con crioprotector y la perfusión
del crioprotector alrededor de la construcción utilizando una
bomba.
El soporte y el equivalente de tejido asociado se
colocan en la bandeja y se añade un total de aproximadamente 16,0
ml de solución de crioprotector. El diseño del encapsulado permita
la distribución uniforme del crioprotector: aproximadamente 8,0 ml
por debajo del soporte y aproximadamente 8,0 ml sobre la superficie
del equivalente del tejido. La tapa se coloca entonces sobre la
bandeja y las dos partes se sellan por calor, preferiblemente al
material de la tapa.
Los equivalentes de tejido encapsulados se
colocan entonces en un congelador programable (Cryomed o Planer)
configurado a una temperatura de inicio de aproximadamente la
temperatura ambiente, preferiblemente a 20,0ºC. La cámara del
congelador que contiene los equivalentes del tejido encapsulados
se enfría a -10,0ºC/minuto hasta el rango de la temperatura de
equilibrio de sólido-líquido del crioprotector, que
típicamente es típicamente para el glicerol 2.0M en DMEM, entre
aproximadamente -5,3ºC y -6,0ºC. La temperatura de equilibrio de
fase sólido-liquido es la temperatura necesaria para
el sembrado de hielo en el crioprotector. La temperatura de la
cámara se mantiene durante un tiempo con el fin de equilibrar la
temperatura interna de los equivalentes de tejido encapsulados con
la temperatura de la cámara. La velocidad de enfriamiento utilizada
para obtener la temperatura de sembrado no es crítica. Es
suficiente un tiempo de mantenimiento de aproximadamente 40 minutos
para asegurar el equilibrio térmico pero el tiempo variará
dependiendo del tamaño de la cámara, de la circulación del aire
dentro de la cámara, y del número de encapsulados a congelar.
Aunque se precisan al menos de 30 minutos típicamente, puede llevar
hasta una hora para poder alcanzar el equilibrio. Después del
tiempo de mantenimiento, se iniciará la formación de hielo
extracelular mediante el sembrado.
El sembrado de hielo se define como un método
para iniciar la formación de hielo en el crioprotector
extracelular. Un método preferido de sembrado de hielo es mediante
el contacto del lado de la bandeja que contenga el tejido con una
sonda fría, tal como una barra de acero congelada en nitrógeno
líquido (-196ºC). El lugar de contacto de la barra con el
encapsulado tiene que ser por debajo del nivel del medio de
congelación del crioprotector en el encapsulado. Otro método
preferido es liberar directamente unos gases que se expandan tal
como el freón o bien el CO_{2} hacia el exterior del encapsulado.
La formación de aire puede ser iniciada mediante una punta de la
cámara en donde la temperatura de la cámara descienda y se eleve
dentro de un rango suficiente para formar un cristal de hielo.
Pueden sustituirse con otros métodos de sembrado de hielo conocidos
en el arte.
Después de que todos los equivalentes de tejido
hayan sido sembrados con cristales de hielo, las unidades se
mantienen una hora adicional para permitir el equilibrio
termodinámico y la propagación del cristal de la siembra de hielo a
través de la totalidad del crioprotector. El enfriamiento se reanuda
después a una velocidad de preferiblemente de entre aproximadamente
-0,02º/minuto hasta -0,3º/minuto; más preferiblemente entre
aproximadamente -0,05 hasta -0,1º/minuto, y más preferiblemente a
aproximadamente -0,07ºC/minuto hasta una temperatura
preferiblemente al menos o por debajo de -70,0ºC; más
preferiblemente a -120ºC; incluso más preferiblemente a -140ºC; o
bien más preferiblemente a -196ºC. Conforme la temperatura de
congelación final se aproxime a la temperatura de transición del
cristal de agua, -120ºC, existirán menos probablemente
fluctuaciones perjudiciales durante las transferencias hasta los
lugares de almacenamiento finales.
Los equivalentes de tejido crioconservados son
transferidos desde el congelador programable hasta el
almacenamiento en un depósito de nitrógeno líquido en fase de vapor
(Deward) a una temperatura entre aproximadamente -120ºC a -150ºC, o
en nitrógeno líquido a -196ºC hasta su utilización.
Para la descongelación, los equivalentes de
tejido cultivado crioconservados se extraen del almacenamiento de
nitrógeno liquido en fase de vapor y se transfieren al hielo seco
para el calentamiento hasta aproximadamente -75ºC. Una vez
equilibrados a -75ºC, los equivalentes de tejido de cultivo son
transferidos a un entorno, preferiblemente un baño de agua,
preferiblemente configurado a 37ºC; o más preferiblemente a 4ºC; o
más preferiblemente ajustado a la temperatura ambiente. Una vez que
sea visible que todo el medio crioprotector haya pasado a la fase
líquida, las unidades de los encapsulados de equivalentes de tejido
cultivado son transferidas preferiblemente a un gabinete de
seguridad biológica, o bien un área aséptica y sanitizada con
etanol. La tapa de las placas son eliminadas mediante el
desprendimiento o el corte del material de la tapa desde el fondo
de la unidad. Los soportes que contienen los equivalentes del tejido
cultivado son transferidos a las placas de Petri mientras que se
vierte el crioprotector en exceso. Para enjuagar el equivalente del
tejido cultivado de crioprotector residual, se añaden 25 ml de
solución de lavado, preferiblemente DMEM a la temperatura ambiente,
a la placa de Petri que contenga el equivalente del tejido cultivado
durante aproximadamente 30 minutos. Pueden determinarse otros
agentes de enjuagado suficiente, preferiblemente soluciones de
resistencia fisiológicas, tal como medios de cultivo de células o
bien fosfato salino tampón, mediante el artesano especializado en
el arte. La solución de enjuagado se intercambia una segunda vez
durante 30 minutos adicionales. Los tiempos de enjuagado pueden
variar dependiendo de la complejidad del tejido.
La unidad del equivalente de tejido cultivado
puede ser transferida entonces de nuevo a su disco de cultivo
original, y recultivado en un medio de mantenimiento del cultivo a
37ºC/10%CO_{2}. Alternativamente, el equivalente puede ser
aplicado a un paciente o comprobado para una respuesta para
contactar con una sustancia según lo expuesto en la patente de los
EE.UU. número 4835102.
Los ejemplos siguientes se proporcionan para
aclarar mejor la práctica de la presente invención y no se
interpretarán de ninguna forma para limitar el alcance de la
presente invención. Los técnicos especializados en el arte
reconocerán que pueden efectuarse varias modificaciones en los
métodos aquí descritos, mientras que no se desvíen del espíritu y
alcance de la presente invención.
Ejemplos 1 a
3
Los ejemplos 1 a 3 muestran las técnicas de
crioconservación y de descongelación de esta invención con el
diseño de encapsulado preferido.
Las construcciones de equivalente de piel viva
(LSE) fueron preparadas de acuerdo con la patente
EP-A-0418035. Las construcciones LSE
y las inserciones de soportes de 75 mm (TRANSWELL®, Costar,
Cambridge), con 9 a 10 días después de la extracción, fueron
colocadas en discos de Petri de 100 mm (Costar). Las construcciones
LSE fueron prefundidas con crioprotector mediante la inmersión de
las construcciones y con 25 ml de medios crioprotectores, 2M
Glycerol en DMEM, en el disco de Petri de 100 mm durante una hora.
Durante la perfusión, las construcciones fueron agitadas durante
una hora en un agitador orbital (Bellco) a 70 rpm en una cámara con
gas CO_{2} al 10%). La agitación permite una perfusión más
completa y una mejor reproductividad del método de crioconservación.
Después de haber prefundido las construcciones LSE, las placas de
Petri conteniendo las LSE, inserciones de portadores y medios de
congelación extracelulares (2M Glicerol y DMEM), se colocaron en un
encapsulado de crioconservación y siendo sellado herméticamente por
calor.
La cámara de un congelador programable (Planar)
se equipó con la invención aquí descrita. El congelador fue
configurado a una temperatura de inicio de 20,0ºC. Las tuberías
fueron purgadas con freón durante un intervalo de un segundo para
eliminar el aire en las tuberías. Las unidades LSE encapsuladas
fueron colocadas con seguridad en bastidores para alojar en cada
uno ocho unidades LSE. Los bastidores, guiados por pasadores de
localización, se colocaron en forma adyacente a los raíles de
pulverización. La puerta de la cámara del congelador se cerró para
sellar la cámara con respecto al entorno exterior.
Las unidades LSE fueron enfriadas a
-10ºC/mi-
nuto hasta -6ºC y la temperatura de la cámara se mantuvo a -6ºC durante 40 minutos para equilibrar el crioprotector y las construcciones prefundidas con la temperatura de la cámara. Después del mantenimiento de 40 minutos, se inició el hielo extracelular mediante la descarga directa de freón durante un segundo en la proximidad del lado del encapsulado. El freón, conforme se evaporaba de la superficie del encapsulado, provocaba que el área de contacto del freón bajara la temperatura en forma suficiente para iniciar la formación de hielo extracelular.
nuto hasta -6ºC y la temperatura de la cámara se mantuvo a -6ºC durante 40 minutos para equilibrar el crioprotector y las construcciones prefundidas con la temperatura de la cámara. Después del mantenimiento de 40 minutos, se inició el hielo extracelular mediante la descarga directa de freón durante un segundo en la proximidad del lado del encapsulado. El freón, conforme se evaporaba de la superficie del encapsulado, provocaba que el área de contacto del freón bajara la temperatura en forma suficiente para iniciar la formación de hielo extracelular.
Después de que las unidades LSE fueron sembradas
con cristales de hielo, se permitió que las unidades se
equilibraran durante una hora a -6ºC. La temperatura de la cámara
se enfrió entonces a -0,07º/minuto hasta una temperatura final de
-20ºC. La cámara se enfrió entonces a -0,5ºC/minuto hasta una
temperatura final de -70ºC. Una vez que las unidades LSE fueran
crioconservadas, fueron transferidas a un depósito de almacenamiento
de fase de vapor (Deward) a una temperatura de -120º a -150ºC.
Las unidades LSE crioconservadas fueron extraídas
del almacenamiento de nitrógeno líquido en fase de vapor y
transferidas a hielos eco para calentarlas hasta aproximadamente
-75ºC. Una vez equilibrado a -75ºC, el equivalente de tejido
cultivado fue transferido a una bajo de agua preferiblemente
configurado a 37ºC; o más preferiblemente calibrado a 4ºC; o
calibrado más preferiblemente a la temperatura ambiente. Una vez
que sea visible que todo el medio crioprotector haya retornado a la
fase líquida, las unidades de los encapsulados de equivalente de
tejido cultivado son transferidas preferiblemente a un gabinete de
seguridad biológica, o bien otra área aséptica y esterilizada con
alcohol. La tapa de los discos se extraen mediante su
desprendimiento o mediante el corte del material de la tapa del
fondo de la unidad. Los soportes conteniendo los equivalentes de
tejido cultivado son entonces transferidos a placas Petri mientras
que se vierte el exceso de crioprotector. Para enjuagar el
equivalente de tejido cultivado de crioprotector residual, se
añaden entonces 25 ml de una solución de lavado (a la temperatura
ambiente), preferiblemente DMEM, al disco de Petri que contenga el
equivalente de tejido cultivado durante aproximadamente 30 minutos.
Pueden ser determinadas por artesanos especializados en el arte
otras soluciones de enjuagado fisiológico suficiente, tal como
otros medios de cultivo celular o un medio salino de fosfato
tampón. La solución de enjuagado se intercambia por una segunda vez
durante 30 minutos adicionales.
Las muestras descongeladas criopreservadas y de
control fueron procesadas mediante métodos histológicos y evaluadas
por microscopía óptica para comprobar la organización morfológica
y viabilidad y mostrando una viabilidad cercana al 100%, siendo
imposibles de distinguir en el control.
Se evaluó un encapsulado de crioconservación de
la presente invención para comprobar la transferencia de calor
uniforme. En una membrana de soporte, sin un equivalente de tejido
cultivado, se montaron cinco termopares, uno en el centro y cuatro
separados por igual a 1,0 mm de la pared periférica del soporte.
Los hilos del termopar salían del encapsulado desde el lado de
entre la tapa y las bridas de la bandeja hacia un grabador de
temperaturas (Azonix Scanner Plus). El encapsulado se rellenó con
17 ml de crioprotector y el encapsulado fue sellado herméticamente.
El encapsulado se equilibró a -70ºC y se transfirió a un baño de
agua calibrado a 20ºC. El grabador de temperaturas registró la
temperatura de cada termopar correspondiente a cada segundo o cada
dos segundos durante el calentamiento. El encapsulado se calentó a
una velocidad de 700ºC/minuto inicialmente y disminuyó conforme se
aproximaba al punto de fusión de la solución del crioprotector. La
uniformidad térmica se encontraba entre 2ºC y 6ºC de la temperatura
del termopar promedio durante las velocidades de calentamiento más
rápidas y acercándose a 8ºC conforme se aproximaba al punto de
fusión de la solución.
Los ejemplos 4 a 12 muestran el metido de
crioconservación de esta invención en diferentes tejidos.
Las planchas epidérmicas se obtuvieron a partir
de LSE maduras a 12 días después de la extracción. La extracción de
la plancha epidérmica se llevó a cabo mediante el desprendimiento
de la capa del substrato dérmico de la capa epidérmica con pinzas y
desechando la capa dérmica. Cada plancha fue cortada en tres piezas
equivalentes. Una pieza de cada plancha se fijó como control. Las
dos piezas restantes componentes de cada plancha se colocaron en la
parte superior de una membrana de policarbonato (Costar) en placas
de cultivo de 100 mm (Costar). Cada pieza fue prefundida con 25 ml
de DMEM y 2 Molar Glicerol durante una hora. Las placas conteniendo
las construcciones fueron colocadas en un agitador orbital (Bellco)
a 70 rpm durante una hora en una cámara con gas CO_{2} al 10%.
Después de haber prefundido la plancha epidérmica, el disco de
Petri conteniendo la plancha epidérmica, y los medios de congelación
extracelulares (2M Glicerol y DMEM) se colocaron en una bolsa y
sellada al vacío (Audiovox) programada para un vacío de 5 segundos
y un tiempo de sellado de 3,9 segundos.
Las planchas epidérmicas encapsuladas se
colocaron en un congelador programable (Planer) a una temperatura
de inicio de 20,0ºC. Las planchas epidérmicas se enfriaron a
-10,0º/minuto a -6,0ºC. Se dejó que la temperatura se mantuviera
durante 20 minutos a -6,0ºC para equilibrar la temperatura de la
cámara. Después de 20 minutos de mantenimiento, se hizo que el
hielo extracelular se pusiera en contacto con el exterior de la
bolsa, por debajo del nivel de los medios de congelación, con una
sonda congelada con nitrógeno líquido. Después de haber sembrado
con cristales de hielo las planchas epidermales, la temperatura se
mantuvo durante 5 minutos adicionales a -6,0ºC. La cámara se
enfrió a -1,0ºC/minuto hasta -8,0ºC. La temperatura se mantuvo
durante 30 minutos a -8,0ºC para permitir la distribución uniforme
de hielo en la totalidad de la muestra. La cámara se enfrió
entonces a -0,1ºC/minuto hasta una temperatura final de
-70,0ºC.
Las planchas epidérmicas crioconservadas se
extrajeron del congelador y las bolsas se cortaron en los discos de
Petri y se retiraron las tapas. Para descongelar, se calentaron 40
ml de DMEM (37ºC) que se vertieron asépticamente en cada disco de
Petri. Después de 45 segundos, se eliminó todo el líquido de las
placas y se añadieron 40 ml adicionales en cada disco durante dos
minutos. Después de descongelar todo el hielo, se enjuagaron las
planchas epidérmicas con 25 ml de DMEM durante 30 minutos. Los
medios se intercambiaron una segunda vez durante 30 minutos
adicionales. Las planchas epidérmicas fueron entonces incubadas en
un medio de mantenimiento de cultivo a 37ºC/10%CO_{2} durante 24
horas antes del análisis. El tiempo de incubación se dejó durante
el retraso observado típicamente de las células congeladas para
restablecer las condiciones del estado firme reestablecido. De
nuevo, se dejó un tiempo de incubación del retraso observado
típicamente para las células congeladas para reestablecer las
condiciones de un estado firme.
De las dos piezas restantes de cada plancha
epidérmica, cada una fue procesada para la histología, y una pieza
de cada fue ensayada siguiendo el protocolo de ensayos MTT.
Comparando las fotomicrografias de la plancha epidérmica
crioconservada y la plancha epidermal criconservada del Ejemplo 4,
se mostró que las tres características básicas de la epidermis: la
capa basal de la epidermis, las capas suprabasales de la epidermis
y el corneo estratum de la epidermis, fueron preservadas en
su totalidad mediante este método. Todas las capas estaban intactas
y la totalidad de morfología de la plancha epidermal crioconservada
era idéntica a la plancha epidermal no crioconservada.
Los equivalentes dérmicos utilizados en este
estudio fueron el componente no epidermalizado del LSE. Los
equivalentes dérmicos se congelaron durante 8 días posteriores.
Los equivalente dérmicos fueron prefundidos con crioprotector
mediante la inmersión de los equivalentes dermales fijados a placas
de 75 mm (Costar) situadas en placas de Petri de 100 mm (Costar) con
25 ml de DMEM y 2 Molar Glicerol durante una hora. Las placas de
Petri se colocaron en un agitador orbital (Bellco) a 70 rpm durante
una hora en una cámara de gas CO_{2} al 10%. Después de haber
prefundido los equivales dermales, las placas de Petri, equivalente
dermales, placas y medios de congelación extracelular se colocaron
en un congelador programable (Planer) a una temperatura de inicio
de 20,0ºC. La cámara se enfrió entonces a -10,0ºC/minuto hasta
-6,0ºC. La temperatura de mantuvo durante 20 minutos para equilibrar la temperatura de la cámara. Después de 20 minutos de mantenimiento, se inició el hielo extracelular mediante el contacto del exterior de los discos, por debajo del nivel del medio de congelación, con una sonda congelada de nitrógeno líquido. Después de haber sembrado todos los equivalentes dermales con cristales de hielo, la temperatura se mantuvo durante 5 minutos adicionales a -6,0ºC. La cámara se enfrió entonces a -1,0ºC/minuto hasta -8,0ºC. La temperatura de la cámara se mantuvo de nuevo durante 30 minutos a -8,0ºC para permitir una distribución uniforme del hielo en la totalidad de la muestra. Las unidades equivalentes dermales se enfriaron entonces a -0,1ºC/minuto hasta una temperatura final de -70,0ºC.
-6,0ºC. La temperatura de mantuvo durante 20 minutos para equilibrar la temperatura de la cámara. Después de 20 minutos de mantenimiento, se inició el hielo extracelular mediante el contacto del exterior de los discos, por debajo del nivel del medio de congelación, con una sonda congelada de nitrógeno líquido. Después de haber sembrado todos los equivalentes dermales con cristales de hielo, la temperatura se mantuvo durante 5 minutos adicionales a -6,0ºC. La cámara se enfrió entonces a -1,0ºC/minuto hasta -8,0ºC. La temperatura de la cámara se mantuvo de nuevo durante 30 minutos a -8,0ºC para permitir una distribución uniforme del hielo en la totalidad de la muestra. Las unidades equivalentes dermales se enfriaron entonces a -0,1ºC/minuto hasta una temperatura final de -70,0ºC.
Los equivalentes dermales crioconservados fueron
entonces extraídos del congelador, y se extrajo la tapa del disco.
Para descongelar, se vertieron 40 ml de DMEM caliente (37ºC)
asépticamente en cada disco de Petri. Después de 45 segundos, se
eliminó todo el líquido de los discos y se añadieron 40 ml
adicionales a los discos durante dos minutos. Después de haber
descongelado todo el hielo, los equivalentes dermales se enjuagaron
con 25 ml de DMEM durante 30 minutos. Los medios fueron
intercambiados una segunda vez durante 30 minutos adicionales. Los
equivalentes dermales, todavía fijados a las placas, fueron entonces
transferidos de nuevo a los discos de cultivo e incubados en un
medio de mantenimiento de cultivo a 37ºC/CO_{2}10% durante 24
horas antes del análisis. El tiempo de incubación se dejó para el
retraso típicamente observado de las células congeladas para
reestablecer las condiciones del estado firme. Las muestras fueron
comprobadas con el protocolo de ensayos MIT.
Los equivalentes de córnea, fijados a placas de
cultivo de 24 mm (Costar), con 9 días posteriores a la extracción
de la humedad, se colocaron en seis discos (Costar). El método de
perfusión de los equivalentes de cornea con crioprotector consistió
en la inmersión de cada equivalente de córnea y colocar en una
placa Transwell con medios de congelación extracelular (2M Glicerol
en DMEM) en los seis discos Transwell durante una hora. Los seis
discos Transwell que contienen las construcciones de córnea fueron
agitados durante una hora en un agitador orbital (Bellco) a 70 rpm
en una cámara con gas CO_{2} al 10%. Después de ello, los
equivalentes de córnea fueron prefundidos, los discos de Petri
conteniendo los equivalentes de córnea, placas Transwell y los
medios de congelación extracelulares fueron colocados en un
congelador programable (Planer) a una temperatura de inicio de
20,0ºC. Los equivalentes de córnea fueron enfriados a
-10,0º-C/minuto hasta -6,0ºC. La temperatura fue mantenida durante
20 minutos para equilibrar la temperatura de la cámara. Después de
los 20 minutos de mantenimiento, se inició el hielo extracelular
mediante el contacto del exterior de cada hendidura en la placa del
conjunto, por debajo del nivel de los medios de congelación, con
una sonda congelada de nitrógeno líquido. Después de haber
sembrado todos los equivalentes de córnea con cristales de hielo,
la temperatura se mantuvo durante 5 minutos adicionales a -6,0ºC
antes de enfriar a -1,0ºC/minuto hasta -8,0ºC. La temperatura se
mantuvo de nuevo durante 30 minutos a -8,0ºC para permitir la
distribución uniforme del hielo en la totalidad de la muestra. Las
unidades de equivalente de córnea se enfriaron a -0,1ºC/minuto
hasta una temperatura final de -70ºC.
Los equivalentes de córnea crioconservados fueron
extraídos del congelador. La tapa del disco fue extraída. Para
descongelar, se vertieron 6 ml de DMEM calentado (37ºC) en forma
aséptica en cada hendidura de la placa del conjunto. Después de 45
segundos, se eliminó todo el líquido del disco y se añadieron 6 ml
adicionales al disco durante dos minutos. Utilizando pinzas
estériles, se transfirieron los equivalentes de córnea y los discos
Transwell asociados a un nuevo disco de conjunto. Para enjuagar, se
añadieron 4 ml de DMEM en cada hendidura durante 30 minutos. Los
medios fueron intercambiados una segunda vez durante 30 minutos
adicionales. Las unidades de córnea fueron transferidas de nuevo al
mismo disco de cultivo y se incubaron en un medio de mantenimiento
de córnea a 37ºC durante 24 horas antes del análisis. Se dejó un
tiempo de incubación para el retardo observado para las células
congeladas para el restablecimiento de las condiciones de un estado
firme. Las muestras fueron ensayadas utilizando el protocolo de
ensayos MTT.
Ratones de tipo salvaje, tipo B6CB6YF1, fueron
sometidos a eutanasia con una sobredosis de Nembutal. La piel fue
extraída asépticamente. Los vasos de sangre en exceso, grasa y
tejido de conexión fueron eliminados de la dermis. La piel murina
fue procesada hasta conseguir una pieza de 1 cm x 2 cm. Las piezas
de piel murina se colocaron en una placa Transwell de 75 mm
(Costar) en placas de Petri de 100 mm (Costar). La piel murina fue
prefundida con crioprotector mediante la inmersión en 25 ml de 2M
Glicerol en DMEm en placas de Petri de 100 mm durante una hora.
Durante la perfusión, las placas de Petri conteniendo la piel
murina y las placas Transwell fueron agitadas durante una hora en un
agitador orbital (Bellco) a 70 rpm en una cámara de gas CO_{2} al
10%. Para controlar, la piel de ratón no crioconservada se mantuvo
en unos medios nutrientes a 4ºC durante la duración de la
crioconservación y el proceso de descongelación (2 días) antes del
injerto de piel.
Después de haber perfundido la piel murina, los
discos de Petri conteniendo la piel murina, los discos Transwell y
los medios de congelación extracelulares se colocan en un
congelador programable Planer a una temperatura de inicio de
20,0ºC. La piel murina fue enfriada a -10,0ºC/minuto hasta -6,0ºC y
dejando que se mantuviera a -6,0ºC durante 20 minutos para
equilibrar la temperatura de la cámara. Después de 20 minutos de
mantenimiento, se inició el hielo extracelular por contacto con el
exterior del disco con una sonda congelada de nitrógeno líquido. El
lugar de contacto tiene que ser por debajo del nivel de los medios
de congelación. Después de que toda la piel murina hubiera sido
sembrada con cristales de hielo, la temperatura se mantuvo durante 5
minutos adicionales a -6,0ºC con antelación al enfriamiento a
-1,0ºC/minuto hasta -8,0ºC. La temperatura se mantuvo de nuevo
durante 30 minutos a -8,0ºC para permitir una distribución
uniforme del hielo en la totalidad de la muestra. Las unidades
fueron enfriadas a 0,1ºC/minuto hasta una temperatura final de
-70,0ºC.
La piel murina crioconservada fue extraída del
congelador y se extrajo la tapa del disco. Para la descongelación,
se vertieron 40 ml de DMEM caliente (37ºC) en forma aséptica en las
placas de Petri. Después de 45 segundos, se eliminó todo el líquido
de los discos y se vertieron 40 ml adicionales en los discos durante
dos minutos. Después de descongelar todo el hielo, la piel murina
fue enjuagada en los discos con 25 ml de DMEM durante 30 minutos.
Los medios fueron intercambiados una segunda vez durante 30 minutos
adicionales.
Las muestras descongeladas crioconservadas y de
control fueron procesadas para la histología o bien fueron
injertadas en ratones. Las fotomicrografias de piel de ratón no
crioconservada en comparación con la piel de ratón crioconservada
demostraron que las cuatro características básicas de la piel de
ratón, la dermis con fibroblastos, la capa basal de la epidermis,
las capas suprabasales de la epidermis, y la cornea de estrato de
la epidermis, fueron conservadas mediante este método. Todas las
capas se mantenían intactas y la morfología general de la piel de
ratón crioconservada era idéntica a la piel de ratón no
crioconservada.
El tipo SKIN2^{TM} modelo ZK 1300 (Advanced
Tissue Sciences, La Jolla, CA) fue extraído del encapsulado de
acuerdo con las inserciones de transporte a la llegada y se colocó
en placas de cultivo (Costar). Las inserciones Transwell fueron
colocadas por encima del SKIN2^{TM} para mantener la construcción
de la piel sumergida. El tipo SKIN2^{TM} fue prefundido con
crioprotector mediante la inmersión del SKIN2^{TM} en 2M Glicerol
en DMEM en placas de cultivo durante una hora. Durante la
perfusión, los discos de cultivo conteniendo la construcción y las
placas Transwell fueron agitados durante una hora en un agitador
orbital (Bellco) a 70 rpm en una cámara de gas CO_{2} al 10%.
Después de haber prefundido el tipo SKIN2^{TM},
las unidades se colocaron en un congelador programable (Planar) con
una temperatura de inicio de 20,0ºC. Las unidades de SKIN2^{TM}
fueron enfriadas a -10,0ºC/minuto hasta -6,0ºC y se dejaron para
mantener -6,0ºC durante 20 minutos para equilibrar la temperatura
de la cámara. Después de un mantenimiento de 20 minutos, se inició
el hielo extracelular por el contacto del exterior de los discos por
debajo del nivel de los medios de congelación con una sonda
congelada de nitrógeno líquido. Después de toda la SKIN2^{TM}
haya sido sembrada con cristales de hielo, se mantuvo la
temperatura durante 5 minutos adicionales a -6,0ºC. La temperatura
de la cámara se enfrió entonces a -1,0º/minuto hasta -8,0ºC. Las
unidades de SKIN2^{TM} se dejaron que mantuvieran -8,0ºC durante
30 minutos para permitir la distribución uniforme del hielo en la
totalidad de la muestra. Las unidades de SKIN2^{TM} se enfriaron
entonces a 0,1ºC/minuto hasta una temperatura final de -70,0ºC.
Las unidades de SKIN2^{TM} fueron extraídas del
congelador, y se extrajeron las tapas de los discos y se vertió
DMEM calentado (37ºC) en forma aséptica en cada disco de cultivo.
Después de 45 segundos, se eliminó todo el líquido de los discos, y
se añadió más DMEM a cada disco durante dos minutos. Una vez
descongelada, la unidad de SKIN2^{TM} y las unidades Transwell
fueron transferidas a nuevos discos de cultivo, utilizando pinzas
estériles. Para enjuagar el SKIN2^{TM} de crioprotector, se
añadió DMEM a cada disco de cultivo conteniendo el SKIN2^{TM}
durante 30 minutos. Los medios fueron intercambiados una segunda vez
durante 30 minutos adicionales. La unidad de SKIN2^{TM} fue
transferida de nuevo al mismo tipo de disco de cultivo y se incubó
en un medio de mantenimiento de cultivo a 37ºC/CO_{2}10% durante
24 horas con antelación al análisis. De nuevo, se dejó un tiempo de
incubación del retraso típicamente observado para las células
congeladas para restablecer las condiciones de un estado firme.
Las construcciones crioconservadas y de control
fueron ensayadas a continuación del protocolo de ensayo MTT para el
SKIN2^{TM} modelo ZK1300, asociada con el producto, y también
para la evaluación histológica. Las fotomicrografías del
SKIN2^{TM} no crioconservado en comparación con el SKIN2^{TM}
crioconservado demostró que las cuatro características básicas del
SKIN2^{TM}, la red de colágenos con fribroplastos, la capa basal
de la epidermis, las capas suprabasales de la epidermis, y la
córnea de estrato de la epidermis fueron conservadas mediante este
método. Todas las capas estaban intactas y la morfología completa
del SKIN2^{TM} crioconservado era similar al SKIN2^{TM} no
crioconservado.
Se ensayaron LSE congelado y no congelado, una
plancha epidermal, equivalentes dermales y equivalentes corneales,
utilizando el ensayo MTT. [Las construcciones de SKIN2^{TM} se
ensayaron de acuerdo con el "Protocolo de ensayos MTT para su uso
con el modelo ZK1300", asociado con las inserciones de envío]. La
viabilidad celular de las construcciones fue medida utilizando el
ensayo MTT, un ensayo de conversión MTT colorimétrico desarrollado
para medir el crecimiento celular y la viabilidad celular. Este
ensayo está descrito con detalle en el documento de Gay y otros,
titulado "Equivalente de piel viva como modelo in vitro
para la calificación del potencial tóxico de irritantes
dérmicos", Toxic in vitro, 6:303-315
(1992). La reducción metabólica de la sal de tetrazolio soluble en
un precipitado de fromazan azul depende de la presencia de células
viables con una función mitocondrial intacta. Este ensayo se
utiliza para cuantificar la citotoxicidad en una variedad de tipos
de células, incluyendo los queratinocitos humanos cultivados.
En los discos de cultivo conteniendo LSE, plancha
epidérmica, y equivalente dérmico, se añadieron 40 ml de medio de
ensayos y las hendiduras conteniendo los equivalentes corneales, y
1,5 ml de medio de ensayo conteniendo 0,33 mg/ml de MTT (Sigma
Chemical Co. St, Louis, MO). Los equivalentes de tejidos fueron
incubados en el medio de ensayo MTT durante 3-4
horas. Al final del periodo de conversión, se hizo una biopsia en el
equivalente de tejido utilizando un punzón de biopsia de piel de un
diámetro de 8 mm. Las biopsias de punzón fueron extraídas durante
2-3 horas a la temperatura ambiente en 0,3 ml de
isopropanol, acidificado con 0,04 N HCl. Al final del periodo de
extracción, se transfirieron 0,2 ml de cada extracto a una hendidura
de una placa de 96 Transwell. Las absorbencias se leyeron en un
lector de placas (Dynatech) a 570 nm con el medio de extracción de
isopropanol como plantilla. Los valores MTT se obtuvieron a partir
de muestras crioconservadas descongeladas se compararon con las
muestras de control correspondientes y expresados en términos de
porcentajes de control (figura 9).
La LDH es una enzima encontrada típicamente en
una célula viable. El daño en la célula provoca una liberación de
la enzima y una disminución correspondiente en la actividad de la
enzima detectada por este ensayo.
Las muestras descongeladas crioconservadas de
control del LSW fueron punzonadas con un punzón de biopsia de piel
de un diámetro de 8 mm. Se tomaron tres muestras de cada unidad
LSE. Las muestras del punzón fueron colocadas en tubos de 15 mm
con 1 ml de 0,1 M trietanolamina tampón (en hielo) y homogeneizada
con un homogeneizador de tejidos eléctrico durante un minuto. Las
muestras fueron centrifugadas a 1000 g a 4,0ºC. Se ensayó el
material sobrenadante. El reactivo de cóctail LDH se preparó
mediante la mezcla conjunta de lo siguiente: 3,00 ml de fosfato
tampón (0,1 mol/1; pH 7,0), 0,1 ml pivurato, sal Na (2,5 mg/ml), y
0,05 ml, NADH, sal Na (10 mg/ml). Se añadieron 100 \mul del
sobrenadante de la muestra a 900 \mul de los reactivos y se dejó
reaccionar durante dos minutos. El cambio en la absorbancia a
través de los dos minutos fue registrado. La media de las tres
muestras por unidad LSE crioconservada se comparó con los controles
no congelados. Los valores de las muestras fueron comparados con los
valores de control correspondientes y expresados en términos de
porcentaje de control (figura 9).
Para demostrar la bioequivalencia de los LSE
crioconservado y no crioconservado, se llevó a cabo un estudio de
injertos en ratones atímicos.
Las unidades LSE, crioconservadas de acuerdo con
el método descrito en el Ejemplo 1, fueron descongeladas un día
antes del injerto, y recuperadas en unos medios de mantenimiento
durante veinticuatro horas.
Se llevaron a cabo cuatro experimentos en los que
un total de 66 ratones atímicos del tipo B6CB6YF1/J-un
(Laboratorios Jackson Harbor) fueron injertados con el LSE
crioconservado (n = 43) y el LSE no crioconservado (control) (n =
23). Los animales fueron anestesiados con Nembutal. Se extrajo una
sección de piel de grosor total a partir del dorso de cada ratón,
conservando la zona carnosa. Los injertos LSE, sea el de control o
el crioconservado, fueron colocados en la herida y procesados para
encajar. Todos los injertos fueron revestidos con una capa de gasa
con vaselina y recubiertos mediante dos vendas adhesivas. Los
revestimientos fueron extraídos al cabo de 7 días del injerto.
A los 14 días después del injerto, todos los
animales fueron sometidos a eutanasia y fotografiados. El
emplazamiento del injerto fue extraído para el análisis y
evaluación histológica. Las fotografías directas y las micrografías
mostraron la inexistencia de diferencias en la integración del
injerto entre el LSE de control y el LSE descongelado y
crioconservado. No se observaron diferencias significativas en las
tasas de la contractura de la herida entre los injertos de control
o crioconservado.
Para demostrar la bioequivalencia de piel de
ratón crioconservada y no crioconservada, se llevó a cabo un
estudio de injertos de piel singeneico.
Se sometieron a eutanasia ratones del tipo
salvaje, tipo B6CB6YF1 mediante una sobredosis de Nembutal. La piel
fue extraída asépticamente. Se eliminaron los vasos de sangre en
exceso, la grasa y el tejido de conexión de la dermis para la
preparación del injerto de piel. La piel del ratón fue criconservada
y descongelada siguiendo el método del Ejemplo 7. La piel del ratón
de control y no crioconservada se mantuvo en unos medios nutrientes
a 4ºC durante el periodo de tiempo de la crioconservación y el
proceso de descongelación, con un total de dos días, antes del
injerto de piel.
Seis ratones del mismo tipo recibieron injertos
de piel, dos ratones recibieron la piel de ratón de control no
crioconservada y cuatro ratones recibieron la piel de ratón
descongelada crioconservada. Los ratones fueron anestesiados con
Nembutal. Se extrajo una sección de piel de grosor completo de 2 x 2
cm a partir del dorso de cada ratón, conservando la zona carnosa.
Los injertos de piel del ratón, bien sea de control o
crioconservada se colocaron sobre las heridas y siendo procesados.
Todos los injertos fueron revestidos con una capa de gasa con
vaselina, recubiertos con dos bandas adhesivas. Los revestimientos
fueron eliminados al cabo de 7 días del injerto.
A los treinta días del injerto, todos los
animales fueron sometidos a eutanasia y fotografiados. El
emplazamiento del injerto fue entonces extraído para el análisis y
evaluación histológica. Las fotografías directas y las micrografías
demostraron que no existía diferencia en la integración del injerto
entre la piel del ratón de control o la piel descongelada
crioconservada del ratón. No se observó diferencia significativa en
las tasas de la contractura de la herida entre los injertos de
control o crioconservados.
Aunque la invención anteriormente expuesta ha
sido descrita con cierto detalle a modo de ilustración y de ejemplo
para los fines de aclarar su comprensión, será obvio para los
técnicos especializados en el arte que pueden practicarse ciertos
cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
Claims (10)
1. Un método para la crioconservación de tejido
extraído de mamífero o equivalente de tejido cultivado, que
comprende:
- (a)
- situar en inmersión el mencionado tejido en una solución crioprotectora, agitando la mencionada solución crioprotectora y el mencionado tejido inmerso para conseguir la penetración efectiva de la solución crioprotectora dentro del mencionado tejido y conseguir un tejido prefundido;
- (b)
- sembrado de hielo extracelular en la mencionada solución crioprotectora y tejido prefundido;
- (c)
- enfriar el mencionado tejido prefundido de la etapa (b) hasta un estado crioconservado mediante la congelación del mencionado tejido a una velocidad de congelación lenta hasta una temperatura al menos de aproximadamente -70ºC o inferior, para producir un tejido crioconservado, y
- (d)
- almacenar el mencionado tejido crioconservado a una temperatura de al menos aproximadamente -70ºC o inferior.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la mencionada inmersión en la etapa (a) se lleva a cabo con una
temperatura de inicio de aproximadamente 20ºC y después durante la
perfusión, se enfría a una velocidad de aproximadamente
-10ºC/minuto hasta una temperatura de aproximadamente -6ºC.
3. El método de la reivindicación 1, en el que la
congelación en la etapa (c) se lleva a cabo a una velocidad de
-1ºC/minuto hasta una temperatura de aproximadamente -8ºC y
manteniéndola un tiempo suficiente para permitir el equilibrado
físico y biológico de la mencionada solución crioprotectora en el
mencionado tejido.
4. El método de la reivindicación 1, en el que la
etapa (c) la temperatura se mantiene constante durante un tiempo
suficiente para permitir el equilibrado físico y biológico de la
mencionada solución crioprotectora en el mencionado tejido.
5. El método de la reivindicación 3, en el que
le mencionado enfriamiento es continuado a una velocidad de
-0,3º/minuto a -0,02ºC/minuto hasta una temperatura de
aproximadamente -70ºC o inferior.
6. El método de la reivindicación 1, en el que el
mencionado tejido extraído de mamíferos es piel extraída de
mamífero.
7. El método de la reivindicación 1 en el que el
mencionado equivalente de tejido cultivado se selecciona del grupo
que comprende equivalente epidermal cultivado, equivalente termal
cultivado, y equivalente corneal cultivado.
8. El método de la reivindicación 1, en el que la
mencionada temperatura del mencionado estado crioconservado se
encuentra a -120ºC o inferior hasta una temperatura de -196ºC o
inferior.
9. El método de la reivindicación 1, en el que la
mencionada solución crioprotectora es 1,5M a 2,5M glicerol en una
base de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM).
10. El método de la reivindicación 1, que
comprende además la descongelación del mencionado tejido
crioconservado, en el que le mencionado tejido es descongelado en
aproximadamente 1 a 2
minutos.
minutos.
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