ES2231804T3 - Metodo y diseño de encapsulado para crioconservacion y almacenamiento de equivalentes de tejido cultivado. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN DISEÑO DE ENVASE DE CRIOCONSERVACION EFICIENTE DE TEJIDOS DE MAMIFERO RECOGIDOS Y EQUIVALENTES DE TEJIDOS CULTIVADOS VIVOS REALIZADO CON TECNOLOGIA IN VITRO. LA INVENCION CONSISTE EN SUMERGIR UN TEJIDO DE MAMIFERO O UN EQUIVALENTE DE TEJIDO CULTIVADO EN UNA SOLUCION CRIOPROTECTORA, AGITAR LA SOLUCION LA SOLUCION CRIOPROTECTORA Y EL TEJIDO SUMERGIDO PARA REALIZAR UNA PENETRACION EFECTIVA DE LA SOLUCION CRIOPROTECTORA DENTRO DEL TEJIDO, Y CONGELAR EL TEJIDO A UNA VELOCIDAD DE CONGELACION MUY LENTA. EN LA ETAPA DE LA CONGELACION SE INICIA UNA FORMACION DE HIELO EXTRACELULAR POR SIEMBRA. EL TEJIDO CRIOCONSERVADO PUEDE ALMACENARSE DURANTE PERIODOS INDEFINIDOS DE TIEMPO ANTES DE USARSE. EL EQUIVALENTE DE TEJIDO CULTIVADO ES UN MODELO IN VITRO DEL TEJIDO HUMANO EQUIVALENTE, COMO LA PIEL O LA CORNEA, QUE, CUANDO SE RECUPERA DE SU ALMACENAMIENTO SE PUEDE USAR PARA TRASPLANTE O IMPLANTE IN VITRO O PARA CRIBAR COMPUESTOS IN VITRO.

Description

Método y diseño de encapsulado para crioconservación y almacenamiento de equivalentes de tejido cultivado.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

Esta invención está relacionada con la crioconservación de tejido extraído y equivalentes de tejido cultivado formados mediante la utilización de la tecnología in vitro. Esta invención está relacionada también con un diseño de empaquetado de crioconservación para el tejido extraído y equivalentes de tejido cultivado que es un diseño de empaquetado efectivo y fácil de manipular, que permite la viabilidad máxima del tejido o del equivalente del tejido para su crioconservación. Mediante el uso de la tecnología de la crioconservación, el tejido extraído crioconservado o el tejido cultivado crioconservado pueden ser almacenados durante periodos indefinidos de tiempo con antelación a su utilización. El tejido cultivado es un modelo in Vitro del tejido humano equivalente, el cual al ser recuperado del almacenamiento puede utilizarse para el transplante o implantación in vivo o para compuestos de cribado in vitro.

2. Breve descripción de los antecedentes de la invención

La tecnología in vitro ha desarrollado equivalentes de tejido para los fines de pruebas in vitro o injerto in vivo para la reparación de heridas. Los métodos de producción de dichos equivalentes de tejido están expuestos en las patente de los EE.UU. números 4485096, 4604346, 4835102 y 5374515, y EP-A-0418035 y WO-94/10940.

La duración de almacenamiento de los tejidos vivos es limitada, y subsiguientemente su ventana de utilización es corta, dando lugar a muchos residuos desechables. Existe la necesidad de preservar dichos tejidos duran periodos amplios de tiempo, tal como para su envío y almacenamiento, hasta su utilización final. Tanto el desarrollo de un método de crioconservación y un encapsulado para la crioconservación y almacenamiento ampliarían la ventana de utilización de forma indefinida, así como la facilidad de su envío, y permitirían el mantenimiento de un inventario. Sería deseable también la posibilidad un inventario de tejidos en centros de atención de quemados y hospitales. Otras ventajas son las muestras que puedan retenerse a partir de diferentes etapas del ciclo de fabricación para los archivos de control de calidad y de lotes de producción más grandes que puedan realizarse conforme puedan mantenerse en un estado de congelación.

En la actualidad el tiempo de almacenamiento de los materiales biológicos celulares está ampliado mediante la refrigeración a temperaturas "criogénicas". La transición de líquido al estado sólido mediante el descenso de la temperatura del sistema puede tener lugar bien como cristalización (hielo), que incluye una configuración ordenada de las moléculas de agua, o como la vitrificación o amorfización (formación de cristal), en la ausencia de dicha configuración ordenada de la fase cristalina. El desafío para un criobiólogo es llevar las células a temperaturas criogénicas y hacer que retornen las mismas a los estados fisiológicos sin dañarlas.

Existen dos soluciones básicas para la crioconservación de células y tejidos: congelación-descongelación y vitrificación. En las técnicas de congelación-descongelación, la solución extracelular se congela (es decir, en forma cristalina), pero se toman unas etapas para minimizar la formación de hielo intracelular. En los procedimientos de vitrificación, existe el intento de impedir la formación de hielo a través de la muestra completa. La primera solución es problemática porque si se forman cristales de hielo dentro de las células, son perjudiciales para la viabilidad de las células al descongelarse. No obstante, las células podrían sobrevivir un ciclo de congelación-descongelación si se enfriaran con velocidades controladas en la presencia de niveles no tóxicos de crioprotectores. La última solución de vitrificación busca evitar los efectos potencialmente dañinos del hielo intracelular y extracelular mediante la reducción de la formación de hielo utilizando concentraciones muy altas de solutos y/o polímeros. No obstante, puede tener lugar el daño celular a la exposición larga de niveles tóxicos de estos aditivos necesarios para la vitrificación.

Los crioprotectores protegen las células vivas de las tensiones incluidas en el proceso de congelación. Una forma en la que los crioprotectores protegen a las células es mediante la disolución de la sal que llega a concentrarse en forma incremental en la solución sin congelar conforme el agua se convierte en hielo. La cantidad de hielo está dictada por la temperatura y por composición inicial de la solución; mientras que la cantidad de fracción no congelada es solo una función de la temperatura. Los crioprotectores tienen otras funciones distintas. Una función importante es que reducen usualmente las temperaturas de formación de hielo intracelular. Otra función es que estabilizan las membranas y las proteínas.

Todas las soluciones se superenfriarán por debajo de sus punto de congelación hasta que encuentren un lugar de nuclearización aleatoria para la formación de hielo. Cuando se efectúa la crioconservación mediante un método de congelación-descongelación, la formación de hielo en el medio extracelular deberá ser iniciado de forma deliberada mediante la siembra con un bajo grado de superenfriamiento. Si no se induce la formación de hielo mediante la siembra, el hielo se formará espontáneamente cuando la solución se enfríe suficientemente más allá por debajo de su punto de congelación de equilibrio. Debido a que este proceso es aleatorio por su naturaleza, la formación de hielo tendrá lugar en forma aleatoria, con temperaturas no predecibles; consecuentemente, las tasas de supervivencia sean altamente variables entre las pruebas repetidas con el mismo protocolo de congelación. Adicionalmente, la cristalización extremadamente rápida que resulta cuando se forma el hielo en una solución altamente superenfriada puede provocar daños en las células y en los tejidos. Adicionalmente, se ha demostrado que si la formación de hielo extracelular se inicia con altos grados de superenfriamiento, se incrementará drásticamente la probabilidad de la formación de hielo intracelular. Este fenómeno tiene lugar a partir del inicio retardado de la deshidratación celular inducida por la congelación, que da lugar a una retención incrementada de agua intracelular, y por tanto a una probabilidad más alta de formación de hielo en la célula.

Una vez que el hielo extracelular es sembrado y la muestra está rodeada por la fase de hielo, es necesario enfriar la muestra a un estado de crioconservación. La etapa de enfriamiento es una de las etapas más críticas en un protocolo de congelación-descongelación. Debido a la formación de hielo, es decir, agua pura, la solución extracelular congelada parcialmente se concentra más que el compartimento intracelular. Como consecuencia de ello, la célula se deshidratará por la pérdida de agua en un intento por restaurar el equilibrio termodinámico. Conforme se enfría el sistema, se generará más hielo extracelular y se elevará la concentración del soluto y forzando a las células a que se deshidraten más. Existen tres características de las células que controlan la velocidad de la deshidratación. Una es la permeabilidad al agua de la membrana celular; cuanto más baja sea la permeabilidad al agua, más tiempo tomará la deshidratación de las células. Otra es la dependencia de la temperatura de la permeabilidad al agua de la membrana celular; todas las células reducen su permeabilidad al agua con el incremento de la temperatura. La característica final es el tamaño de la célula; las células más grandes toman más tiempo para deshidratarse que las células pequeñas. Dado que cada tipo de célula puede tener características drásticamente distintas, las condiciones de crioconservación pueden variar en órdenes de magnitud para los distintos tipos de células.

Aunque los mecanismos exactos de los daños celulares durante la crioconservación no han sido todavía elucidados completamente, las firmas de supervivencia características generadas por la medida de la supervivencia celular en función de la velocidad de enfriamiento, aparecerán como cuantitativamente similares para todos los tipos de células, representadas por una curva en forma de U invertida. La supervivencia celular es baja con tasas de enfriamiento muy bajas y muy rápidas, y existe una tasa de enfriamiento intermedia que genera una supervivencia óptima. Incluso aunque la velocidad óptima de enfriamiento y el ancho de la curva puedan variar drásticamente para los distintos tipos de células, el comportamiento cualitativo aparece como que es universal. Las tasas de enfriamiento más rápidas no permiten a las células un tiempo suficiente para deshidratarse y las células forman hielo internamente. El daño celular para las tasas de enfriamiento rápido se atribuye a la formación de hielo intracelular. Con tasas lentas de enfriamiento, el daño celular está debido no obstante a los efectos de la exposición a la sal altamente concentrada intra y extracelular, y a las soluciones de crioconservación o a las interacciones mecánicas entre las células y el hielo extracelular.

Es necesario deshidratar las células en todo lo posible antes de que se cruce la curva de nucleación del hielo intracelular. Es en este punto en donde prácticamente todo el agua que resta en la célula se nucleará y formará hielo. No es práctico determinar la temperatura exacta en que sucede lo anterior, pero es aproximadamente a -40ºC a -50ºC en que las células se congelan lentamente en la presencia de concentraciones de 1M a 2M de crioprotectores. Es importante observar que la cantidad de agua que se convierte en hielo dentro de una célula en este punto puede ser inocua al congelarse, pero si no se descongela suficientemente rápido, se expandirá y matará a la célula al descongelarse. (La biofísica de la crioconservación de órganos, pág. 117-140, editada por David E. Pegg y Armand M. Karow, Jr, NATO ASI Series A: Ciencias de la Vida, Vol. 147 1987 Plenum Press, Nueva Cork 233 Spring St., Nueva Cork, NY 10013).

Antes del desarrollo de una piel comercialmente viable equivalente, se utilizó piel de cadáveres para los fines de injertos. Se desarrollaron protocolos de crioconservación, de forma que los centros y hospitales de quemados pudieran mantener bancos de pieles. Se desarrollaron varios protocolos distintos utilizando distintos crioprotectores, tasas de congelación, formatos de encapsulación, y condiciones de almacenamiento. La mayoría de los investigadores acordaron un protocolo de descongelación rápido. El éxito o el fracaso del protocolo se midieron bien mediante un parche de injerto en un lecho de herida o mediante un ensayo de viabilidad celular.

En el documento U.S. 3842831 de Beisang se expone un método para la crioconservación de parches de piel de cadáveres. El método incluye la fijación de la piel del cadáver a un tejido entrelazado holgado o soporte, y conjuntamente los parches de piel y el tejido se enrollan antes de la congelación. No se utilizan ningún crioprotector, aunque los inventores sugieren el uso de glicerina o DMSO. El protocolo de congelación utiliza un protocolo de tasa de congelación rápida no controlada (a temperatura fijada) para una temperatura criogénica de -70ºC.

May SR y FA DeClement (Metodología de Bancos de Piel, 17, 33-45 (1890)) efectuaron una evaluación de la geometría de encapsulamiento y enfriamiento y tasas de precauciones con la utilización de piel de cadáver de dermatomo. Los resultados sugieren que la piel del cadáver sea plana en lugar de enrollada, y que se utilice una tasa controlada más lenta de congelación.

El documento U.S. 5040677 de Tubo expone un envase sellable herméticamente estanco a gases para los injertos individuales de planchas celulares epiteliales. El envase requiere que la plancha celular epitelial sea fijada a una plancha de substrato adhesivo o respaldo mediante el uso de pinzas.

El documento U.S. 5145770 de Tubo expone un método de crioconservación para planchas de queratinocitos que utiliza un crioprotector de un agente que no penetra en las células, tal como el dextrano, y un reactivo de penetración en las células, tal como el glicerol, con una tasa de enfriamiento de aproximadamente -1ºC/minuto. De forma similar, el documento EP-0364306 de Chao y otros, expone un método de crioconservación de una plancha de células epiteliales cultivadas vivas, pero utilizando tanto el DMSO y el glicerol como crioprotector y un protocolo de congelación de preferiblemente -1ºC/minuto.

El documento U.S. 5298417 de Candedda y otros expone un protocolo de crioconservación desarrollado para construcciones de una sola capa tal como las planchas epiteliales preparadas según lo expuesto en el documento US 4016036, 4304866 y 4456687. Las planchas epidérmicas fueron incubadas con un crioconservador de 8-15% de glicerol o DMSO y fueron crioconservadas mediante el empleo de un protocolo de tasa controlada, en donde la velocidad de enfriamiento sea más lenta en el inicio que al final del protocolo, y estando caracterizada por un incremento en la temperatura antes de la culminación del procedimiento de congelación.

Se investigó un método para la crioprotección de fibroblastos dérmicos en gel de colágeno, por Teasdale y otros, Quemados, 19 (5) 406-410 (1993). Teasdale determinó que la viabilidad celular óptima podría obtenerse mediante la congelación con una tasa de -0.5º/minuto con DMSO como crioprotector.

El documento "Injertos de piel compuesta cultivada: Equivalentes biológicos de piel que permiten una expansión masiva", de Nanchahal y otros, The Lancet, 2 (8565), 191-193 (22 de Julio de 1989), expone una técnica de almacenamiento de injertos de tejido cultivado compuesto que utiliza un crioprotector del 15% de glicerol y el 10% de FCS en Medio 199. Los injertos y el crioprotector fueron incubados a 37ºC durante dos horas y congelados a -1ºC por minuto hasta -70ºC y almacenados entonces en nitrógeno líquido. Después de la descongelación rápida de los injertos, se determinó su viabilidad mediante el cultivo durante dos semanas y mediante el injerto en ratones sin pelos. Se efectuó una evaluación final mediante el injerto en tres pacientes llevando a cabo una extirpación de un tatuaje.

El documento "Crioconservación de córneas de conejo y gato a -18 a -24ºC", Cornea, de Johnstone y otros, 11(3): 211-220 (1992), está dirigido a un procedimiento sencillo para la crioconservación de corneas de conejo y gato que utiliza un congelador doméstico en lugar de nitrógeno líquido o bien congeladores de temperaturas muy bajas. Se obtuvo la perfusión del crioconservador mediante la colocación de las córneas en sucesivas soluciones del 50% de suero de feto de ternero y medio de McCarey-Kaufman con contenido incrementado de glicerol y glucosa.

El documento US-5131850 expone un método para la crioconservación de tejidos músculoesquelético mediante la colocación de dicho tejido en contacto con una composición conteniendo un agente crioconservador que comprende un soluto orgánico de penetración en las células, el cual es preferiblemente el dimetilsulfoxido, y un glicosaminoglicano, el cual es preferiblemente el sulfato de condroitina, en una cantidad suficiente para crioconservar el tejido musculoesquelético. La adición de un glicosaminoglicano a un agente crioconservador que comprende un soluto orgánico de penetración en las células permite el poder utilizar una amplia gama de velocidades de enfriamiento. La crioconservación se inicia preferiblemente al cabo de 20 a 60 minutos después de la adición del agente crioconservador. El cambio de fase de agua a hielo se inicia a los -2ºC a -6ºC mediante una dosis de nitrógeno líquido, cristal de hielo estéril o mediante una vibración. Se expone también un programa de congelación diseñado para maximizar la retención de la viabilidad celular del tejido y de las propiedades biomecánicas durante y después del proceso de congelación, y un programa de descongelación que maximiza la viabilidad de las células.

El documento US-5298417 expone un proceso para preservar las planchas epidérmicas cultivadas mediante la incubación de las planchas a temperatura ambiente en medios con glicerol o un crioconservador de dimetilsufoxido durante un periodo predeterminado de tiempo, y congelando después las planchas cultivadas. El gradiente de enfriamiento está caracterizado porque tiene una velocidad inicial más lenta de enfriamiento, seguida por una velocidad más alta de enfriamiento. El ejemplo describe unas bolsas conteniendo piezas de tejido que se sellan y se incuban térmicamente a la temperatura ambiente durante 5-7 minutos. Las bolsas se colocan en un envase adecuado y se transfieren a un congelador programable. Las piezas de tejido se congelan entonces utilizando un programa de congelación. Las bolsas conteniendo las planchas epiteliales congeladas se almacenan a una temperatura de -80ºC.

Utilizando los métodos del arte anterior, no es posible crioconservar los equivalentes de tejido cultivado, en parte porque son relativamente gruesos y compuestos por capas celulares heterogéneas. Una de las funciones de estos tejidos in vivo es proporcionar una barrera de permeabilidad. Las funciones del tejido tienen que ser consideradas en el desarrollo de un protocolo de crioconservación.

Los presentes inventores han descubierto un método para la crioconservación y, en particular, un diseño de un encapsulado, que es aplicable a varios equivalentes de tejidos cultivados y a la piel de mamíferos, que es un encapsulado sorprendentemente efectivo y práctico comercialmente para la crioconservación de equivalentes de tejido cultivado.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para la crioconservación con éxito de equivalentes de tejido cultivado a temperaturas muy bajas que evita la formación de cristales de hielo intracelulares dañinos, minimizando la concentración efectiva de productos químicos potencialmente dañinos, y que permite la rápida introducción y extracción de crioprotectores a temperaturas factibles utilizando un equipo de congelación programable.

La presente invención proporciona un diseño de encapsulado nuevo desarrollado para la crioconservación, almacenamiento y distribución de equivalentes de tejido cultivado. El nuevo diseño ofrece muchas ventajas sobre los diseños existentes de encapsulados. En el momento actual, no existen equivalentes de tejidos cultivados crioconservados disponibles comercialmente, y por tanto no existen disponibles los diseños de encapsulados. El diseño de un nuevo encapsulado permite un mejor seguimiento de la temperatura del interior del encapsulado con la temperatura exterior de la cámara de congelación, debido a que tiene una transferencia de calor más eficiente. La velocidad de trasferencia térmica mejorada permite un proceso más controlado; así pues, se consigue un enfriamiento uniforme y velocidades de calentamiento del equivalente de tejido cultivado, reduciéndose por tanto la variabilidad en la viabilidad celular.

Los inventores han descubierto un método para crioconservar equivalentes de tejido cultivado obtenidos a partir de técnicas in vitro, de forma que los tejidos puedan mantener su viabilidad y utilidad como equivalentes de los tejidos humanos. La invención incluye el uso de la agitación para realzar la penetración de una cantidad efectiva del crioprotector. El método presente proporciona la crioconservación del tejido extraído y de los equivalentes de tejido cultivado de una forma que protege la integridad estructural y la viabilidad celular.

El método de esta invención incluye las etapas siguientes:

1)

El tejido extraído o el equivalente de tejido cultivado se sumerge en una solución crioprotectora, y la solución criprotectora y el tejido sumergido se agitan para conseguir una penetración efectiva de la solución crioprotectora dentro del tejido (perfusión del tejido); y

2)

Después de la perfusión de la solución crioprotectora dentro del tejido, se enfría hasta llegar al margen de la temperatura de equilibrio de la fase sólido-líquido del crioprotector; sembrando hielo extracelular y enfriando hasta un estado crioconservado mediante la congelación del tejido a una velocidad de enfriamiento lenta hasta al menos una temperatura o inferior a la misma de aproximadamente -70ºC, preferiblemente incluso a -140ºC, y más preferiblemente a -196ºC.

Una vez congelado, el tejido crioconservado puede ser almacenado durante periodos de tiempo indefinidos entre las temperaturas de aproximadamente -120ºC a -196ºC, a la temperatura del nitrógeno líquido.

La descongelación del tejido crioconservado se lleva a cabo mediante el calentamiento del tejido congelado a una alta velocidad, lo que se efectúa en aproximadamente 1 a 2 minutos. El tejido helado puede ser descongelado mediante la aplicación directa de un medio de cultivo calentado o mediante una solución tampón fisiológica o mediante otro método de calentamiento rápido. El diseño del encapsulado permite la descongelación del tejido mediante la inmersión del encapsulado en un baño de agua ya que el encapsulado asegura tanto una velocidad rápida de calentamiento como la uniformidad térmica controlada mientras que se mantiene la esterilidad durante el procedimiento de descongelación crítico.

Con antelación al uso de un equivalente del tejido humano, para injertos o para pruebas in vitro, el equivalente de tejido cultivado descongelado se lava para eliminar la solución de crioprotector. La solución crioprotectora puede ser eliminada mediante el lavado, por ejemplo, con una solución tampón isotónica con un pH fisiológico. Los equivalentes de tejido cultivado pueden ser entonces almacenados en dicha solución tampón, o bien recultivados en un medio celular apropiado antes de su utilización.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A y 1B muestras vistas de la tapa.

La figura 2 muestra una vista superior de la junta hermética.

Las figuras 3A y 3B muestran vistas de la junta hermética montada en la tapa.

Las figuras 4A y 4B muestran vistas del soporte.

Las figuras 5A y 5B muestran vistas de la bandeja.

Las figuras 6A y 6B muestran vistas laterales del conjunto, en forma despiezada y completado.

La figura 7 muestra una vista en primer plano del conjunto.

La figura 8 muestra una vista superior del conjunto completado.

La figura 9 muestra un gráfico de la viabilidad de los tejidos cultivados crioconservados en comparación con los tejidos cultivados no crioconservados. Se muestra la viabilidad de los tejidos cultivados crioconservados según lo medido por MTT. Se midió LSE adicionalmente por el ensayo LDH. Todos los tejidos cultivados están comparados con los controles de comparación de edades no crioconservados, y se encuentran expresados como un porcentaje del control.

Descripción detallada de la invención

La ingeniería de los tejidos es un campo emergente que utiliza células de tejidos cultivados para construir equivalentes de tejidos que puedan ser utilizados para examinar la respuesta a los daños por agentes químicos o por compuestos farmacéuticos. El tejido cultivado puede ser utilizado también para formar un tejido humano injertable.

Los equivalentes de tejido han sido descritos extensamente en muchas patentes, incluyendo las patentes de los EE.UU. números 4485096; 4485097; 4539716; 4546500; 4604346; 4837379 Y 5374515, todas las cuales se incorporan aquí como referencia. Una aplicación con éxito del equivalente de tejido es la denominada como "equivalente de tejido vivo", la cual tiene una morfología similar a la piel humana real. El equivalente de piel vivo (LSE) está compuesto por dos capas: la parte superior está hecha de queratinocitos epidérmicos humanos estratificados que cubren una capa inferior de los fibroblastos dérmicos humanos en una matriz de colágenos.

Parenteau y otros, "Epidermis generada in vitro: Consideraciones prácticas y Aplicaciones", J. De Celullar Biochistry, 45:245-251 (1991); Parenteay y otros, "Cultivo orgánico de queratinocitos y fibroblastos de piel humana para obtener forma y función", Cytotechnology, 9:163-171 (1992); y Bell y otros, "Los equivalentes de la piel humana: Su fabricación, sus propiedades organotípicas y sus respuestas a los irritantes", Toxic. In vitro, 5:591-596 (1991), el LSE para injertos se encuentra en investigación en pruebas clínicas para las indicaciones relativas a las heridas de la piel de grosor parcial y total: cirugía de extirpación, quemados, úlceras de estasis venosa, ulceras diabéticas, ulceras de decubitus, y úlceras inflamatorias crónicas. El LSE es un tejido de la piel in vitro de grosor completo y bicapa.

Se ha desarrollado un órgano in vitro equivalente de la córnea tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5374515 incorporada aquí como referencia. El equivalente de tejido de cornea tiene tres capas celulares distintas, la capa externa, un epitelio escamoso estratificado; la capa intermedia de fibras de colágeno y células de estroma; y una capa interna, de un sencillo epitelio escamoso, denominada también como endotelio corneal. El equivalente de cornea in vitro puede ser utilizado para ensayos de toxicidad in vitro para servir como modelos predictivos económicos de elementos no animales oculares in vivo y de irritación potencial dérmica para muchos tipos de productos y materiales sin tratamiento.

El objetivo de la crioconservación es preservar la integridad estructural y la viabilidad de materiales biológicos durante un periodo de tiempo indefinido de tiempo, de forma que estos materiales puedan estar disponibles y utilizados según sea necesario. Los tejidos complejos de una vida finita precisarán de crioconservación para ampliar la disponibilidad del producto y su utilidad. La historia de la crioconservación de material biológico, no obstante, ha demostrado que la optimización de un protocolo de crioconservación para una célula en particular no es necesario que proporcione resultados excelentes al ser utilizado con otro tipo de célula o con otras células en un tejido. Se precisó del desarrollo de métodos más especializados debido a las diferencias en la densidad celular, contenido de agua y nivel de organización estructural de los equivalentes de tejido de grosor completo. Los protocolos de crioservación de esta invención son sorprendentemente aplicables a las capas epidérmicas y dérmicas de una capa, equivalentes de tejido bicapa, equivalentes de cornea de tres capas, y piel de mamíferos extraída. El desarrollo de un diseño del encapsulado hace que la crioconservación de estos tejidos sea práctica para los procesos a escala de producción.

Tal como se utiliza aquí, el término "equivalentes de tejido cultivado" significa equivalentes de tejido de tejidos de mamíferos, en donde los equivalentes de tejido se producen mediante técnicas in vitro y significando que incluyen equivalentes de piel monocapa, bien como equivalente dérmico o como una plancha epidérmica; equivalentes de piel bicapa, LSE en particular: equivalentes de cornea tricapa y equivalentes de piel. La morfología de los equivalentes de tejido cultivado es similar al órgano de mamíferos in vivo, típicamente el órgano humano. Con fines ilustrativos, la morfología del LSR incluye muchas similaridades con la piel humana. Metabólica y mitoticamente los fibroblastos dérmicos humanos (HDF) se encuentran en toda la capa dérmica de la construcción, y se ha demostrado que segregan colágeno y otros componentes matriciales en la red. La epidermis comprende una capa basal para dividir con una tasa miótica similar a la piel humana. La epidermis suprabasal muestra los mismos estratos que la piel in vivo, con capas espinosas y granulares bien definidas que contienen queratonhialina y gránulos laminares recubiertos por una cornea de estratos. La inmunohistoquimica demuestra la presencia de componentes matriciales extracelulares que se encuentran rutinariamente en la unión dermo-epidérmica en la piel humana normal, tal como la laminita, colágeno tipo IV y calanina (GB3).

Los equivalentes de tejido cultivado obtenidos por métodos de cultivo organotípicos, tal como el equivalente de piel viva (LSE), utilizan un soporte como bastidor de soporte sobre el cual se forman los equivalentes. Los equivalentes de tejido cultivado se fabrican sobre un soporte que permite la manipulación de la construcción durante la fabricación y el envío y para el uso final sin contactar directamente con la construcción. Los métodos de producción de equivalentes de tejido cultivado en un soporte se encuentran expuestos en la patente de los EE.UU. número 5374515 y en las patentes EP-A-0418035 y WO-94/10940.

El soporte incluye una membrana permeable plana, la cual está fijada a un extremo de un soporte esencialmente tubular. El otro extremo del soporte tubular incluye una brida que se extiende hacia fuera, la cual a su vez soporta un reborde que puede colgar del extremo superior de una hendidura en un disco de cultivo de tejidos y en el diseño del encapsulado de la presente invención. El conjunto de membrana-soporte está dimensionado para ser utilizado con un disco de cultivo que tenga al menos una hendidura de un tamaño específico con el fin de proporcionar el espacio libre adecuado alrededor del soporte y acoplándose al extremo superior de la hendidura. El conjunto de membrana-soporte puede fabricarse con diferentes tamaños con el fin de utilizarse con distintos tamaños de los discos de cultivo y crioconservación y con los encapsulados de almacenamiento. Los ejemplos del diseño de los encapsulados están descritos en la patente de los EE.UU. número 5466602. Las modificaciones del diseño del encapsulado pueden hacerse por artesanos especializados para acomodar soportes similares que utilicen distintos medios y acoplamientos en las vasijas de cultivo. Soportes similares están descritos en las patentes de los EE.UU. números 5358871 y 5366893 o bien los descritos en la patente de los EE.UU. número 4871674.

El diseño del encapsulado preferido utilizado en el método de esta invención incorpora el bastidor de soporte y define un entorno alrededor del equivalente del tejido que es capaz de ser controlado según especificaciones predeterminadas. La presente invención utiliza materiales que son preferiblemente de calidad de graduación médica y que son capaces de soportar una amplia gama de temperaturas. Estos materiales están moldeados para formar una bandeja y una tapa que sean capaces de ser selladas herméticamente mediante medios de sellado hermético. El nuevo encapsulado está diseñado para incorporar un soporte sobre el cual se formen los equivalentes del tejido.

El nuevo diseño del encapsulado comprende una bandeja, una tapa y una junta de sellado hermético entre las mismas. La bandeja y la tapa están diseñadas para encajar en el soporte existente que contiene el equivalente de tejido asociado. El soporte con el equivalente de tejido asociado se colocan en la bandeja y se añade la solución del crioprotector. Se coloca la tapa entonces sobre la bandeja y las dos partes se sellan herméticamente en forma conjunta para formar una junta hermética entre los entornos del interior y del exterior del encapsulado.

El diseño del encapsulado permite una distribución igual del crioprotector por debajo del soporte y por encima de la superficie del equivalente del tejido, mientras que se mantiene el contacto del crioprotector en el equivalente del tejido y con la bandeja y la tapa. El diseño del encapsulado está basado en el concepto de que las velocidades controladas de enfriamiento y congelación pueden ser mantenidas con un volumen igual de crioprotector, configuradas con una geometría similar por encima y por debajo del tejido cultivado a crioconservar. Esta configuración proporciona una distancia uniforme, medida desde las superficies superior e inferior del equivalente de tejido cultivado hasta la pared exterior del encapsulado (en el supuesto de que el embalaje tenga también un grosor uniforme). Esta uniformidad deberá proporcionar un intercambio de calor uniforme desde el equivalente del tejido hasta la cámara de congelación al efectuar el enfriamiento; y desde el entorno externo hasta el equivalente del tejido, al efectuar la descongelación.

La bandeja comprende una superficie inferior que es contigua con una pared lateral y una brida. La brida proporciona una superficie plana para el sellado hermético de la bandeja a la tapa. La pared lateral de la bandeja tiene un soporte continuo o bien una pluralidad de soportes discontinuos hacia dentro que se extienden y que son integrales con la pared lateral. El borde superior del soporte que contiene el equivalente del tejido cultivado, al posicionarse en la bandeja, está suspendido sobre los soportes provistos por la pared lateral de la bandeja. Se encuentra definido un espacio entre el soporte suspendido y la superficie inferior de la bandeja que mide aproximadamente 1,0 mm de grosor, con un área en torno al tamaño del equivalente del tejido.

La tapa comprende una superficie inferior plana contigua con una pared lateral y una brida. El diámetro de la brida de la tapa es ligeramente menor que el diámetro de la brida de la bandeja. La brida de la tapa, al colocarla sobre la bandeja que contiene un portador, descansa sobre el soporte de forma que las superficies superior de tanto la brida de la bandeja como la brida de la tapa se encuentran en contacto orientadas sobre el mismo plano. Se encuentra definido un segundo espacio mediante la tapa y la superficie del equivalente del tejido cultivado que mide también 1,0 mm de grosor, con un área en torno al tamaño del equivalente del tejido.

El diseño permite un total de aproximadamente 1 mm entre la bandeja y el fondo del soporte que contiene el equivalente del tejido dispuesto entre los mismos, y aproximadamente 1 mm entre la tapa y el equivalente del tejido con el crioprotector encima y por debajo del equivalente del tejido en contacto tanto con la tapa como con la bandeja. Cuando la tapa se coloca en la bandeja que contiene el medio, la tapa desplaza cualquier aire existente en el embalaje hacia el espacio periférico que contiene el soporte tubular del soporte.

La tapa se sella herméticamente en la bandeja a lo largo del plano expuesto creado por las superficies superiores de las bridas de la bandeja y de la tapa. El sellado hermético se lleva a cabo por calor, adhesivo o bien otros medios conocidos en el arte. La junta hermética entre la tapa y la bandeja impide las fugas del crioprotector y mantiene la esterilidad del interior de la unidad. Preferiblemente se sella una plancha anular de material de la pata sellable por calor a ambas bridas de la bandeja y de la tapa. El material de la tapa tiene preferiblemente una aleta para ser eliminada al estirar de la misma, y para eliminar el sellado hermético de la tapa de la bandeja, para tener acceso al equivalente del tejido. En otra realización, la tapa con una brida de aproximadamente el mismo diámetro que la brida de la bandeja se coloca sobre una bandeja con un soporte dispuesto dentro, de forma que la superficie inferior de la brida de la tapa entre en contacto con la superficie superior de la brida de la bandeja. Las bridas se sellan entonces conjuntamente medios sellables herméticos.

Las figuras 1A y 1B muestran la tapa 10; brida de la tapa 11; pared lateral de la tapa 12; y la superficie inferior 13. La brida de la tapa 11, la pared lateral de la tapa 12 y la superficie inferior 13, forman una superficie continua.

La figura 2 muestra la junta anular 20 y la aleta de tracción 21.

Las figuras 3A y 3B muestran la junta 20; la tapa 10; brida de la tapa 11. La junta 20 está montada en la brida de la tapa 11 de la tapa 10 con antelación al uso para facilitar el alineamiento de la junta durante el proceso de sellado.

Las figuras 4A y 4B muestran el soporte 30; el reborde del soporte 31; membrana permeable 32; y el soporte tubular 33. La membrana permeable 32 contiene un equivalente del tejido de cultivo dispuesto y unido por el soporte tubular 33. El soporte 30 permite la transferencia del equivalente del tejido sin hacer contacto o extraer el equivalente del tejido a través del proceso de crioconservación.

Las figuras 5A y 5B muestran la bandeja 40; superficie inferior de la bandeja 41; pared lateral de la bandeja 42; brida de la bandeja 43; y apoyos del soporte 44. La superficie inferior de la bandeja 41, pared lateral de la bandeja 42, brida de la bandeja 43, y apoyos del soporte 44, forman una superficie contigua. Los apoyos del soporte 44 contactan y soportan el soporte dentro de la bandeja.

Las figuras 6A y 6B muestran la junta 20; la tapa 10; soporte 30; y bandeja 40. El soporte 30 que contiene el equivalente del tejido está dispuesto en una bandeja 40, y está suspendido dentro de la bandeja. La tapa 10 con la junta hermética 20 está colocada sobre el soporte 30, y está suspendida sobre el soporte.

La figura 7 muestra la junta hermética 20; brida de tapa 11; tapa 10; soporte 30; reborde de soporte 31; apoyos de soporte 44; y bandeja 40. El soporte 30 que contiene el equivalente del tejido se encuentra dispuesto en la bandeja 40, y está suspendido dentro de la bandeja haciendo contacto con la superficie inferior del reborde del soporte 31, hasta las superficies superiores de los apoyos del soporte 44. La tapa 10 con la junta hermética 20 está colocada sobre el soporte 30, y está suspendida sobre el soporte haciendo contacto con la superficie inferior de la brida de la tapa 11 de la superficie superior del reborde del soporte 31. Las superficies superiores de la brida de la tapa 11 y la brida de la bandeja 43 forman una superficie plana para la junta hermética 20.

La figura 8 muestra una vista superior del conjunto.

Los materiales para la fabricación de las bandejas y las tapas son materiales rígidos o semiflexibles termoplásticos que al calentarse se moldean por vacío o inyección moldeada, tal como el politetrafluoroetileno (PTFE) o glicol de tereftalato de polietileno (PETG). Las bandejas y las tapas del encapsulado están esterilizadas preferiblemente antes de la utilización mediante métodos que son conocidos en el arte de la esterilización. Los materiales utilizados para fabricar la bandeja y la tapa determinarán el método de esterilización que pueda ser utilizado. Para esterilizar el PTFE o PETG, es preferible la radiación de rayos gamma de 2,5 a 3,0 megaradios. Los métodos eléctricos y químicos de esterilización conocidos por los técnicos especializados en el arte pueden ser utilizados alternativamente.

Los equivalentes de tejido cultivado comprenden

Los equivalentes de tejido cultivado comprenden un equivalente dérmico de una red de colágeno hidratado establecido por un agente, preferiblemente fibroblastos. En una realización se cultiva una capa estratificada de células epidérmicas sobre la superficie del equivalente dérmico. En otra realización, la red de colágeno contraído hidratada, contraída por queratocitos, está dispuesta sobre una capa de células endoteliales corneales con una capa estratificada de células epiteliales corneales sobre la superficie de la red. Alternativamente, pueden ser cultivadas solo células epidérmicas e inducidas a estratificar para formar un plancha epidérmica. El equivalente de tejido cultivado está formado sobre una membrana porosa de un soporte o sobre un gel de colágeno que está adherido a una membrana porosa de la superficie inferior de un soporte. Adicionalmente, pueden ser crioconsevados otros equivalentes de tejido cultivado de acuerdo con los métodos de esta invención, incluyendo aunque sin limitación cualquier plancha epidérmica cultivada, cualquier equivalente dérmico cultivado, cualquier equivalente de córnea cultivado o piel de mamífero extraída.

Se describirá a continuación la presente invención utilizando equivalentes de tejidos y el diseño del encapsulado preferido como ilustración. Se comprenderá por los técnicos especializados en el arte que pueden hacerse modificaciones en el método descrito y que se encuentren dentro del alcance de esta invención.

El método de perfusión de un equivalente de tejido con una solución crioprotectora es sumergir el equivalente de tejido y su soporte asociado en un volumen dado de una solución crioprotectora suficiente para sumergir la muestra y para tener un volumen igual de solución crioprotectora por encima y por debajo del equivalente del tejido. A una placa de Petri de 10 mm que contiene el equivalente de tejido y el soporte se añaden 25 ml de glicerol 2M en DMEM durante un periodo de tiempo suficiente para completar la perfusión de la muestra, preferiblemente entre una y dos horas, pero más preferiblemente durante aproximadamente una hora. Los periodos ampliados de tiempo en la polución del crioprotector dan por resultado la reducción de la viabilidad celular en el tejido, mientras que un periodo de tiempo demasiado corto no asegura la impregnación completa del crioprotector dentro del tejido. Las construcciones de monocapa requerirán típicamente menos tiempo para la perfusión, ya que tienen menos capas celulares y una función de barrera reducida. Durante esta hora, la penetración de la solución crioprotectora se realza mediante la agitación de la muestra y la solución crioprotectora, típicamente mediante la agitación de la placa Petri en un vibrador de plataforma orbital (vibrador orbital Bellco) a 70 rpm en una cámara con gas CO_{2} al 10%. El entorno de CO_{2} al 10%, que es el mismo que el entorno de cultivo en el que se fabricó el equivalente del tejido, impide que el medio pierda el gas, manteniendo así el pH de la componente del medio de base del crioprotector. La agitación permite una perfusión más rápida y completa del crioprotector en el equivalen del tejido y una mayor reproducibilidad de los resultados entre los equivalentes de tejido congelados. Se puede sustituir el agitador orbital con un aparato que ejecute un movimiento de agitación en otros planos espaciales. Adicionalmente, otros métodos de perfusión mejorada mecánicamente incluyen aunque sin limitación el balanceo de la construcción con crioprotector en una vasija en una plataforma o con la centrifugación de la construcción con crioprotector y la perfusión del crioprotector alrededor de la construcción utilizando una bomba.

El soporte y el equivalente de tejido asociado se colocan en la bandeja y se añade un total de aproximadamente 16,0 ml de solución de crioprotector. El diseño del encapsulado permita la distribución uniforme del crioprotector: aproximadamente 8,0 ml por debajo del soporte y aproximadamente 8,0 ml sobre la superficie del equivalente del tejido. La tapa se coloca entonces sobre la bandeja y las dos partes se sellan por calor, preferiblemente al material de la tapa.

Los equivalentes de tejido encapsulados se colocan entonces en un congelador programable (Cryomed o Planer) configurado a una temperatura de inicio de aproximadamente la temperatura ambiente, preferiblemente a 20,0ºC. La cámara del congelador que contiene los equivalentes del tejido encapsulados se enfría a -10,0ºC/minuto hasta el rango de la temperatura de equilibrio de sólido-líquido del crioprotector, que típicamente es típicamente para el glicerol 2.0M en DMEM, entre aproximadamente -5,3ºC y -6,0ºC. La temperatura de equilibrio de fase sólido-liquido es la temperatura necesaria para el sembrado de hielo en el crioprotector. La temperatura de la cámara se mantiene durante un tiempo con el fin de equilibrar la temperatura interna de los equivalentes de tejido encapsulados con la temperatura de la cámara. La velocidad de enfriamiento utilizada para obtener la temperatura de sembrado no es crítica. Es suficiente un tiempo de mantenimiento de aproximadamente 40 minutos para asegurar el equilibrio térmico pero el tiempo variará dependiendo del tamaño de la cámara, de la circulación del aire dentro de la cámara, y del número de encapsulados a congelar. Aunque se precisan al menos de 30 minutos típicamente, puede llevar hasta una hora para poder alcanzar el equilibrio. Después del tiempo de mantenimiento, se iniciará la formación de hielo extracelular mediante el sembrado.

El sembrado de hielo se define como un método para iniciar la formación de hielo en el crioprotector extracelular. Un método preferido de sembrado de hielo es mediante el contacto del lado de la bandeja que contenga el tejido con una sonda fría, tal como una barra de acero congelada en nitrógeno líquido (-196ºC). El lugar de contacto de la barra con el encapsulado tiene que ser por debajo del nivel del medio de congelación del crioprotector en el encapsulado. Otro método preferido es liberar directamente unos gases que se expandan tal como el freón o bien el CO_{2} hacia el exterior del encapsulado. La formación de aire puede ser iniciada mediante una punta de la cámara en donde la temperatura de la cámara descienda y se eleve dentro de un rango suficiente para formar un cristal de hielo. Pueden sustituirse con otros métodos de sembrado de hielo conocidos en el arte.

Después de que todos los equivalentes de tejido hayan sido sembrados con cristales de hielo, las unidades se mantienen una hora adicional para permitir el equilibrio termodinámico y la propagación del cristal de la siembra de hielo a través de la totalidad del crioprotector. El enfriamiento se reanuda después a una velocidad de preferiblemente de entre aproximadamente -0,02º/minuto hasta -0,3º/minuto; más preferiblemente entre aproximadamente -0,05 hasta -0,1º/minuto, y más preferiblemente a aproximadamente -0,07ºC/minuto hasta una temperatura preferiblemente al menos o por debajo de -70,0ºC; más preferiblemente a -120ºC; incluso más preferiblemente a -140ºC; o bien más preferiblemente a -196ºC. Conforme la temperatura de congelación final se aproxime a la temperatura de transición del cristal de agua, -120ºC, existirán menos probablemente fluctuaciones perjudiciales durante las transferencias hasta los lugares de almacenamiento finales.

Los equivalentes de tejido crioconservados son transferidos desde el congelador programable hasta el almacenamiento en un depósito de nitrógeno líquido en fase de vapor (Deward) a una temperatura entre aproximadamente -120ºC a -150ºC, o en nitrógeno líquido a -196ºC hasta su utilización.

Para la descongelación, los equivalentes de tejido cultivado crioconservados se extraen del almacenamiento de nitrógeno liquido en fase de vapor y se transfieren al hielo seco para el calentamiento hasta aproximadamente -75ºC. Una vez equilibrados a -75ºC, los equivalentes de tejido de cultivo son transferidos a un entorno, preferiblemente un baño de agua, preferiblemente configurado a 37ºC; o más preferiblemente a 4ºC; o más preferiblemente ajustado a la temperatura ambiente. Una vez que sea visible que todo el medio crioprotector haya pasado a la fase líquida, las unidades de los encapsulados de equivalentes de tejido cultivado son transferidas preferiblemente a un gabinete de seguridad biológica, o bien un área aséptica y sanitizada con etanol. La tapa de las placas son eliminadas mediante el desprendimiento o el corte del material de la tapa desde el fondo de la unidad. Los soportes que contienen los equivalentes del tejido cultivado son transferidos a las placas de Petri mientras que se vierte el crioprotector en exceso. Para enjuagar el equivalente del tejido cultivado de crioprotector residual, se añaden 25 ml de solución de lavado, preferiblemente DMEM a la temperatura ambiente, a la placa de Petri que contenga el equivalente del tejido cultivado durante aproximadamente 30 minutos. Pueden determinarse otros agentes de enjuagado suficiente, preferiblemente soluciones de resistencia fisiológicas, tal como medios de cultivo de células o bien fosfato salino tampón, mediante el artesano especializado en el arte. La solución de enjuagado se intercambia una segunda vez durante 30 minutos adicionales. Los tiempos de enjuagado pueden variar dependiendo de la complejidad del tejido.

La unidad del equivalente de tejido cultivado puede ser transferida entonces de nuevo a su disco de cultivo original, y recultivado en un medio de mantenimiento del cultivo a 37ºC/10%CO_{2}. Alternativamente, el equivalente puede ser aplicado a un paciente o comprobado para una respuesta para contactar con una sustancia según lo expuesto en la patente de los EE.UU. número 4835102.

Los ejemplos siguientes se proporcionan para aclarar mejor la práctica de la presente invención y no se interpretarán de ninguna forma para limitar el alcance de la presente invención. Los técnicos especializados en el arte reconocerán que pueden efectuarse varias modificaciones en los métodos aquí descritos, mientras que no se desvíen del espíritu y alcance de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplos 1 a 3

Los ejemplos 1 a 3 muestran las técnicas de crioconservación y de descongelación de esta invención con el diseño de encapsulado preferido.

Ejemplo 1 Crioconservación de equivalente de piel viva (LSE) con el diseño del encapsulado

Las construcciones de equivalente de piel viva (LSE) fueron preparadas de acuerdo con la patente EP-A-0418035. Las construcciones LSE y las inserciones de soportes de 75 mm (TRANSWELL®, Costar, Cambridge), con 9 a 10 días después de la extracción, fueron colocadas en discos de Petri de 100 mm (Costar). Las construcciones LSE fueron prefundidas con crioprotector mediante la inmersión de las construcciones y con 25 ml de medios crioprotectores, 2M Glycerol en DMEM, en el disco de Petri de 100 mm durante una hora. Durante la perfusión, las construcciones fueron agitadas durante una hora en un agitador orbital (Bellco) a 70 rpm en una cámara con gas CO_{2} al 10%). La agitación permite una perfusión más completa y una mejor reproductividad del método de crioconservación. Después de haber prefundido las construcciones LSE, las placas de Petri conteniendo las LSE, inserciones de portadores y medios de congelación extracelulares (2M Glicerol y DMEM), se colocaron en un encapsulado de crioconservación y siendo sellado herméticamente por calor.

La cámara de un congelador programable (Planar) se equipó con la invención aquí descrita. El congelador fue configurado a una temperatura de inicio de 20,0ºC. Las tuberías fueron purgadas con freón durante un intervalo de un segundo para eliminar el aire en las tuberías. Las unidades LSE encapsuladas fueron colocadas con seguridad en bastidores para alojar en cada uno ocho unidades LSE. Los bastidores, guiados por pasadores de localización, se colocaron en forma adyacente a los raíles de pulverización. La puerta de la cámara del congelador se cerró para sellar la cámara con respecto al entorno exterior.

Las unidades LSE fueron enfriadas a -10ºC/mi-
nuto hasta -6ºC y la temperatura de la cámara se mantuvo a -6ºC durante 40 minutos para equilibrar el crioprotector y las construcciones prefundidas con la temperatura de la cámara. Después del mantenimiento de 40 minutos, se inició el hielo extracelular mediante la descarga directa de freón durante un segundo en la proximidad del lado del encapsulado. El freón, conforme se evaporaba de la superficie del encapsulado, provocaba que el área de contacto del freón bajara la temperatura en forma suficiente para iniciar la formación de hielo extracelular.

Después de que las unidades LSE fueron sembradas con cristales de hielo, se permitió que las unidades se equilibraran durante una hora a -6ºC. La temperatura de la cámara se enfrió entonces a -0,07º/minuto hasta una temperatura final de -20ºC. La cámara se enfrió entonces a -0,5ºC/minuto hasta una temperatura final de -70ºC. Una vez que las unidades LSE fueran crioconservadas, fueron transferidas a un depósito de almacenamiento de fase de vapor (Deward) a una temperatura de -120º a -150ºC.

Ejemplo 2 Descongelación de unidades LSE crioconservadas

Las unidades LSE crioconservadas fueron extraídas del almacenamiento de nitrógeno líquido en fase de vapor y transferidas a hielos eco para calentarlas hasta aproximadamente -75ºC. Una vez equilibrado a -75ºC, el equivalente de tejido cultivado fue transferido a una bajo de agua preferiblemente configurado a 37ºC; o más preferiblemente calibrado a 4ºC; o calibrado más preferiblemente a la temperatura ambiente. Una vez que sea visible que todo el medio crioprotector haya retornado a la fase líquida, las unidades de los encapsulados de equivalente de tejido cultivado son transferidas preferiblemente a un gabinete de seguridad biológica, o bien otra área aséptica y esterilizada con alcohol. La tapa de los discos se extraen mediante su desprendimiento o mediante el corte del material de la tapa del fondo de la unidad. Los soportes conteniendo los equivalentes de tejido cultivado son entonces transferidos a placas Petri mientras que se vierte el exceso de crioprotector. Para enjuagar el equivalente de tejido cultivado de crioprotector residual, se añaden entonces 25 ml de una solución de lavado (a la temperatura ambiente), preferiblemente DMEM, al disco de Petri que contenga el equivalente de tejido cultivado durante aproximadamente 30 minutos. Pueden ser determinadas por artesanos especializados en el arte otras soluciones de enjuagado fisiológico suficiente, tal como otros medios de cultivo celular o un medio salino de fosfato tampón. La solución de enjuagado se intercambia por una segunda vez durante 30 minutos adicionales.

Las muestras descongeladas criopreservadas y de control fueron procesadas mediante métodos histológicos y evaluadas por microscopía óptica para comprobar la organización morfológica y viabilidad y mostrando una viabilidad cercana al 100%, siendo imposibles de distinguir en el control.

Ejemplo 3 Evaluación del diseño del encapsulado de criopreservación para la velocidad de calentamiento y uniformidad térmica

Se evaluó un encapsulado de crioconservación de la presente invención para comprobar la transferencia de calor uniforme. En una membrana de soporte, sin un equivalente de tejido cultivado, se montaron cinco termopares, uno en el centro y cuatro separados por igual a 1,0 mm de la pared periférica del soporte. Los hilos del termopar salían del encapsulado desde el lado de entre la tapa y las bridas de la bandeja hacia un grabador de temperaturas (Azonix Scanner Plus). El encapsulado se rellenó con 17 ml de crioprotector y el encapsulado fue sellado herméticamente. El encapsulado se equilibró a -70ºC y se transfirió a un baño de agua calibrado a 20ºC. El grabador de temperaturas registró la temperatura de cada termopar correspondiente a cada segundo o cada dos segundos durante el calentamiento. El encapsulado se calentó a una velocidad de 700ºC/minuto inicialmente y disminuyó conforme se aproximaba al punto de fusión de la solución del crioprotector. La uniformidad térmica se encontraba entre 2ºC y 6ºC de la temperatura del termopar promedio durante las velocidades de calentamiento más rápidas y acercándose a 8ºC conforme se aproximaba al punto de fusión de la solución.

Los ejemplos 4 a 12 muestran el metido de crioconservación de esta invención en diferentes tejidos.

Ejemplo 4 Crioconservación de planchas epidérmicas

Las planchas epidérmicas se obtuvieron a partir de LSE maduras a 12 días después de la extracción. La extracción de la plancha epidérmica se llevó a cabo mediante el desprendimiento de la capa del substrato dérmico de la capa epidérmica con pinzas y desechando la capa dérmica. Cada plancha fue cortada en tres piezas equivalentes. Una pieza de cada plancha se fijó como control. Las dos piezas restantes componentes de cada plancha se colocaron en la parte superior de una membrana de policarbonato (Costar) en placas de cultivo de 100 mm (Costar). Cada pieza fue prefundida con 25 ml de DMEM y 2 Molar Glicerol durante una hora. Las placas conteniendo las construcciones fueron colocadas en un agitador orbital (Bellco) a 70 rpm durante una hora en una cámara con gas CO_{2} al 10%. Después de haber prefundido la plancha epidérmica, el disco de Petri conteniendo la plancha epidérmica, y los medios de congelación extracelulares (2M Glicerol y DMEM) se colocaron en una bolsa y sellada al vacío (Audiovox) programada para un vacío de 5 segundos y un tiempo de sellado de 3,9 segundos.

Las planchas epidérmicas encapsuladas se colocaron en un congelador programable (Planer) a una temperatura de inicio de 20,0ºC. Las planchas epidérmicas se enfriaron a -10,0º/minuto a -6,0ºC. Se dejó que la temperatura se mantuviera durante 20 minutos a -6,0ºC para equilibrar la temperatura de la cámara. Después de 20 minutos de mantenimiento, se hizo que el hielo extracelular se pusiera en contacto con el exterior de la bolsa, por debajo del nivel de los medios de congelación, con una sonda congelada con nitrógeno líquido. Después de haber sembrado con cristales de hielo las planchas epidermales, la temperatura se mantuvo durante 5 minutos adicionales a -6,0ºC. La cámara se enfrió a -1,0ºC/minuto hasta -8,0ºC. La temperatura se mantuvo durante 30 minutos a -8,0ºC para permitir la distribución uniforme de hielo en la totalidad de la muestra. La cámara se enfrió entonces a -0,1ºC/minuto hasta una temperatura final de -70,0ºC.

Las planchas epidérmicas crioconservadas se extrajeron del congelador y las bolsas se cortaron en los discos de Petri y se retiraron las tapas. Para descongelar, se calentaron 40 ml de DMEM (37ºC) que se vertieron asépticamente en cada disco de Petri. Después de 45 segundos, se eliminó todo el líquido de las placas y se añadieron 40 ml adicionales en cada disco durante dos minutos. Después de descongelar todo el hielo, se enjuagaron las planchas epidérmicas con 25 ml de DMEM durante 30 minutos. Los medios se intercambiaron una segunda vez durante 30 minutos adicionales. Las planchas epidérmicas fueron entonces incubadas en un medio de mantenimiento de cultivo a 37ºC/10%CO_{2} durante 24 horas antes del análisis. El tiempo de incubación se dejó durante el retraso observado típicamente de las células congeladas para restablecer las condiciones del estado firme reestablecido. De nuevo, se dejó un tiempo de incubación del retraso observado típicamente para las células congeladas para reestablecer las condiciones de un estado firme.

De las dos piezas restantes de cada plancha epidérmica, cada una fue procesada para la histología, y una pieza de cada fue ensayada siguiendo el protocolo de ensayos MTT. Comparando las fotomicrografias de la plancha epidérmica crioconservada y la plancha epidermal criconservada del Ejemplo 4, se mostró que las tres características básicas de la epidermis: la capa basal de la epidermis, las capas suprabasales de la epidermis y el corneo estratum de la epidermis, fueron preservadas en su totalidad mediante este método. Todas las capas estaban intactas y la totalidad de morfología de la plancha epidermal crioconservada era idéntica a la plancha epidermal no crioconservada.

Ejemplo 5 Crioconservación del equivalente dérmico

Los equivalentes dérmicos utilizados en este estudio fueron el componente no epidermalizado del LSE. Los equivalentes dérmicos se congelaron durante 8 días posteriores. Los equivalente dérmicos fueron prefundidos con crioprotector mediante la inmersión de los equivalentes dermales fijados a placas de 75 mm (Costar) situadas en placas de Petri de 100 mm (Costar) con 25 ml de DMEM y 2 Molar Glicerol durante una hora. Las placas de Petri se colocaron en un agitador orbital (Bellco) a 70 rpm durante una hora en una cámara de gas CO_{2} al 10%. Después de haber prefundido los equivales dermales, las placas de Petri, equivalente dermales, placas y medios de congelación extracelular se colocaron en un congelador programable (Planer) a una temperatura de inicio de 20,0ºC. La cámara se enfrió entonces a -10,0ºC/minuto hasta
-6,0ºC. La temperatura de mantuvo durante 20 minutos para equilibrar la temperatura de la cámara. Después de 20 minutos de mantenimiento, se inició el hielo extracelular mediante el contacto del exterior de los discos, por debajo del nivel del medio de congelación, con una sonda congelada de nitrógeno líquido. Después de haber sembrado todos los equivalentes dermales con cristales de hielo, la temperatura se mantuvo durante 5 minutos adicionales a -6,0ºC. La cámara se enfrió entonces a -1,0ºC/minuto hasta -8,0ºC. La temperatura de la cámara se mantuvo de nuevo durante 30 minutos a -8,0ºC para permitir una distribución uniforme del hielo en la totalidad de la muestra. Las unidades equivalentes dermales se enfriaron entonces a -0,1ºC/minuto hasta una temperatura final de -70,0ºC.

Los equivalentes dermales crioconservados fueron entonces extraídos del congelador, y se extrajo la tapa del disco. Para descongelar, se vertieron 40 ml de DMEM caliente (37ºC) asépticamente en cada disco de Petri. Después de 45 segundos, se eliminó todo el líquido de los discos y se añadieron 40 ml adicionales a los discos durante dos minutos. Después de haber descongelado todo el hielo, los equivalentes dermales se enjuagaron con 25 ml de DMEM durante 30 minutos. Los medios fueron intercambiados una segunda vez durante 30 minutos adicionales. Los equivalentes dermales, todavía fijados a las placas, fueron entonces transferidos de nuevo a los discos de cultivo e incubados en un medio de mantenimiento de cultivo a 37ºC/CO_{2}10% durante 24 horas antes del análisis. El tiempo de incubación se dejó para el retraso típicamente observado de las células congeladas para reestablecer las condiciones del estado firme. Las muestras fueron comprobadas con el protocolo de ensayos MIT.

Ejemplo 6 Crioconservación de equivalentes de córnea

Los equivalentes de córnea, fijados a placas de cultivo de 24 mm (Costar), con 9 días posteriores a la extracción de la humedad, se colocaron en seis discos (Costar). El método de perfusión de los equivalentes de cornea con crioprotector consistió en la inmersión de cada equivalente de córnea y colocar en una placa Transwell con medios de congelación extracelular (2M Glicerol en DMEM) en los seis discos Transwell durante una hora. Los seis discos Transwell que contienen las construcciones de córnea fueron agitados durante una hora en un agitador orbital (Bellco) a 70 rpm en una cámara con gas CO_{2} al 10%. Después de ello, los equivalentes de córnea fueron prefundidos, los discos de Petri conteniendo los equivalentes de córnea, placas Transwell y los medios de congelación extracelulares fueron colocados en un congelador programable (Planer) a una temperatura de inicio de 20,0ºC. Los equivalentes de córnea fueron enfriados a -10,0º-C/minuto hasta -6,0ºC. La temperatura fue mantenida durante 20 minutos para equilibrar la temperatura de la cámara. Después de los 20 minutos de mantenimiento, se inició el hielo extracelular mediante el contacto del exterior de cada hendidura en la placa del conjunto, por debajo del nivel de los medios de congelación, con una sonda congelada de nitrógeno líquido. Después de haber sembrado todos los equivalentes de córnea con cristales de hielo, la temperatura se mantuvo durante 5 minutos adicionales a -6,0ºC antes de enfriar a -1,0ºC/minuto hasta -8,0ºC. La temperatura se mantuvo de nuevo durante 30 minutos a -8,0ºC para permitir la distribución uniforme del hielo en la totalidad de la muestra. Las unidades de equivalente de córnea se enfriaron a -0,1ºC/minuto hasta una temperatura final de -70ºC.

Los equivalentes de córnea crioconservados fueron extraídos del congelador. La tapa del disco fue extraída. Para descongelar, se vertieron 6 ml de DMEM calentado (37ºC) en forma aséptica en cada hendidura de la placa del conjunto. Después de 45 segundos, se eliminó todo el líquido del disco y se añadieron 6 ml adicionales al disco durante dos minutos. Utilizando pinzas estériles, se transfirieron los equivalentes de córnea y los discos Transwell asociados a un nuevo disco de conjunto. Para enjuagar, se añadieron 4 ml de DMEM en cada hendidura durante 30 minutos. Los medios fueron intercambiados una segunda vez durante 30 minutos adicionales. Las unidades de córnea fueron transferidas de nuevo al mismo disco de cultivo y se incubaron en un medio de mantenimiento de córnea a 37ºC durante 24 horas antes del análisis. Se dejó un tiempo de incubación para el retardo observado para las células congeladas para el restablecimiento de las condiciones de un estado firme. Las muestras fueron ensayadas utilizando el protocolo de ensayos MTT.

Ejemplo 7 Crioconservación de piel murina extraída

Ratones de tipo salvaje, tipo B6CB6YF1, fueron sometidos a eutanasia con una sobredosis de Nembutal. La piel fue extraída asépticamente. Los vasos de sangre en exceso, grasa y tejido de conexión fueron eliminados de la dermis. La piel murina fue procesada hasta conseguir una pieza de 1 cm x 2 cm. Las piezas de piel murina se colocaron en una placa Transwell de 75 mm (Costar) en placas de Petri de 100 mm (Costar). La piel murina fue prefundida con crioprotector mediante la inmersión en 25 ml de 2M Glicerol en DMEm en placas de Petri de 100 mm durante una hora. Durante la perfusión, las placas de Petri conteniendo la piel murina y las placas Transwell fueron agitadas durante una hora en un agitador orbital (Bellco) a 70 rpm en una cámara de gas CO_{2} al 10%. Para controlar, la piel de ratón no crioconservada se mantuvo en unos medios nutrientes a 4ºC durante la duración de la crioconservación y el proceso de descongelación (2 días) antes del injerto de piel.

Después de haber perfundido la piel murina, los discos de Petri conteniendo la piel murina, los discos Transwell y los medios de congelación extracelulares se colocan en un congelador programable Planer a una temperatura de inicio de 20,0ºC. La piel murina fue enfriada a -10,0ºC/minuto hasta -6,0ºC y dejando que se mantuviera a -6,0ºC durante 20 minutos para equilibrar la temperatura de la cámara. Después de 20 minutos de mantenimiento, se inició el hielo extracelular por contacto con el exterior del disco con una sonda congelada de nitrógeno líquido. El lugar de contacto tiene que ser por debajo del nivel de los medios de congelación. Después de que toda la piel murina hubiera sido sembrada con cristales de hielo, la temperatura se mantuvo durante 5 minutos adicionales a -6,0ºC con antelación al enfriamiento a -1,0ºC/minuto hasta -8,0ºC. La temperatura se mantuvo de nuevo durante 30 minutos a -8,0ºC para permitir una distribución uniforme del hielo en la totalidad de la muestra. Las unidades fueron enfriadas a 0,1ºC/minuto hasta una temperatura final de -70,0ºC.

La piel murina crioconservada fue extraída del congelador y se extrajo la tapa del disco. Para la descongelación, se vertieron 40 ml de DMEM caliente (37ºC) en forma aséptica en las placas de Petri. Después de 45 segundos, se eliminó todo el líquido de los discos y se vertieron 40 ml adicionales en los discos durante dos minutos. Después de descongelar todo el hielo, la piel murina fue enjuagada en los discos con 25 ml de DMEM durante 30 minutos. Los medios fueron intercambiados una segunda vez durante 30 minutos adicionales.

Las muestras descongeladas crioconservadas y de control fueron procesadas para la histología o bien fueron injertadas en ratones. Las fotomicrografias de piel de ratón no crioconservada en comparación con la piel de ratón crioconservada demostraron que las cuatro características básicas de la piel de ratón, la dermis con fibroblastos, la capa basal de la epidermis, las capas suprabasales de la epidermis, y la cornea de estrato de la epidermis, fueron conservadas mediante este método. Todas las capas se mantenían intactas y la morfología general de la piel de ratón crioconservada era idéntica a la piel de ratón no crioconservada.

Ejemplo 8 Crioconservación de SKIN2^{TM} de ATS

El tipo SKIN2^{TM} modelo ZK 1300 (Advanced Tissue Sciences, La Jolla, CA) fue extraído del encapsulado de acuerdo con las inserciones de transporte a la llegada y se colocó en placas de cultivo (Costar). Las inserciones Transwell fueron colocadas por encima del SKIN2^{TM} para mantener la construcción de la piel sumergida. El tipo SKIN2^{TM} fue prefundido con crioprotector mediante la inmersión del SKIN2^{TM} en 2M Glicerol en DMEM en placas de cultivo durante una hora. Durante la perfusión, los discos de cultivo conteniendo la construcción y las placas Transwell fueron agitados durante una hora en un agitador orbital (Bellco) a 70 rpm en una cámara de gas CO_{2} al 10%.

Después de haber prefundido el tipo SKIN2^{TM}, las unidades se colocaron en un congelador programable (Planar) con una temperatura de inicio de 20,0ºC. Las unidades de SKIN2^{TM} fueron enfriadas a -10,0ºC/minuto hasta -6,0ºC y se dejaron para mantener -6,0ºC durante 20 minutos para equilibrar la temperatura de la cámara. Después de un mantenimiento de 20 minutos, se inició el hielo extracelular por el contacto del exterior de los discos por debajo del nivel de los medios de congelación con una sonda congelada de nitrógeno líquido. Después de toda la SKIN2^{TM} haya sido sembrada con cristales de hielo, se mantuvo la temperatura durante 5 minutos adicionales a -6,0ºC. La temperatura de la cámara se enfrió entonces a -1,0º/minuto hasta -8,0ºC. Las unidades de SKIN2^{TM} se dejaron que mantuvieran -8,0ºC durante 30 minutos para permitir la distribución uniforme del hielo en la totalidad de la muestra. Las unidades de SKIN2^{TM} se enfriaron entonces a 0,1ºC/minuto hasta una temperatura final de -70,0ºC.

Las unidades de SKIN2^{TM} fueron extraídas del congelador, y se extrajeron las tapas de los discos y se vertió DMEM calentado (37ºC) en forma aséptica en cada disco de cultivo. Después de 45 segundos, se eliminó todo el líquido de los discos, y se añadió más DMEM a cada disco durante dos minutos. Una vez descongelada, la unidad de SKIN2^{TM} y las unidades Transwell fueron transferidas a nuevos discos de cultivo, utilizando pinzas estériles. Para enjuagar el SKIN2^{TM} de crioprotector, se añadió DMEM a cada disco de cultivo conteniendo el SKIN2^{TM} durante 30 minutos. Los medios fueron intercambiados una segunda vez durante 30 minutos adicionales. La unidad de SKIN2^{TM} fue transferida de nuevo al mismo tipo de disco de cultivo y se incubó en un medio de mantenimiento de cultivo a 37ºC/CO_{2}10% durante 24 horas con antelación al análisis. De nuevo, se dejó un tiempo de incubación del retraso típicamente observado para las células congeladas para restablecer las condiciones de un estado firme.

Las construcciones crioconservadas y de control fueron ensayadas a continuación del protocolo de ensayo MTT para el SKIN2^{TM} modelo ZK1300, asociada con el producto, y también para la evaluación histológica. Las fotomicrografías del SKIN2^{TM} no crioconservado en comparación con el SKIN2^{TM} crioconservado demostró que las cuatro características básicas del SKIN2^{TM}, la red de colágenos con fribroplastos, la capa basal de la epidermis, las capas suprabasales de la epidermis, y la córnea de estrato de la epidermis fueron conservadas mediante este método. Todas las capas estaban intactas y la morfología completa del SKIN2^{TM} crioconservado era similar al SKIN2^{TM} no crioconservado.

Ejemplo 9 Ensayo de actividad mitocondrial metabólica (MIT)

Se ensayaron LSE congelado y no congelado, una plancha epidermal, equivalentes dermales y equivalentes corneales, utilizando el ensayo MTT. [Las construcciones de SKIN2^{TM} se ensayaron de acuerdo con el "Protocolo de ensayos MTT para su uso con el modelo ZK1300", asociado con las inserciones de envío]. La viabilidad celular de las construcciones fue medida utilizando el ensayo MTT, un ensayo de conversión MTT colorimétrico desarrollado para medir el crecimiento celular y la viabilidad celular. Este ensayo está descrito con detalle en el documento de Gay y otros, titulado "Equivalente de piel viva como modelo in vitro para la calificación del potencial tóxico de irritantes dérmicos", Toxic in vitro, 6:303-315 (1992). La reducción metabólica de la sal de tetrazolio soluble en un precipitado de fromazan azul depende de la presencia de células viables con una función mitocondrial intacta. Este ensayo se utiliza para cuantificar la citotoxicidad en una variedad de tipos de células, incluyendo los queratinocitos humanos cultivados.

En los discos de cultivo conteniendo LSE, plancha epidérmica, y equivalente dérmico, se añadieron 40 ml de medio de ensayos y las hendiduras conteniendo los equivalentes corneales, y 1,5 ml de medio de ensayo conteniendo 0,33 mg/ml de MTT (Sigma Chemical Co. St, Louis, MO). Los equivalentes de tejidos fueron incubados en el medio de ensayo MTT durante 3-4 horas. Al final del periodo de conversión, se hizo una biopsia en el equivalente de tejido utilizando un punzón de biopsia de piel de un diámetro de 8 mm. Las biopsias de punzón fueron extraídas durante 2-3 horas a la temperatura ambiente en 0,3 ml de isopropanol, acidificado con 0,04 N HCl. Al final del periodo de extracción, se transfirieron 0,2 ml de cada extracto a una hendidura de una placa de 96 Transwell. Las absorbencias se leyeron en un lector de placas (Dynatech) a 570 nm con el medio de extracción de isopropanol como plantilla. Los valores MTT se obtuvieron a partir de muestras crioconservadas descongeladas se compararon con las muestras de control correspondientes y expresados en términos de porcentajes de control (figura 9).

Ejemplo 10 Ensayo de deshidrogenasa de lactosa (LDH)

La LDH es una enzima encontrada típicamente en una célula viable. El daño en la célula provoca una liberación de la enzima y una disminución correspondiente en la actividad de la enzima detectada por este ensayo.

Las muestras descongeladas crioconservadas de control del LSW fueron punzonadas con un punzón de biopsia de piel de un diámetro de 8 mm. Se tomaron tres muestras de cada unidad LSE. Las muestras del punzón fueron colocadas en tubos de 15 mm con 1 ml de 0,1 M trietanolamina tampón (en hielo) y homogeneizada con un homogeneizador de tejidos eléctrico durante un minuto. Las muestras fueron centrifugadas a 1000 g a 4,0ºC. Se ensayó el material sobrenadante. El reactivo de cóctail LDH se preparó mediante la mezcla conjunta de lo siguiente: 3,00 ml de fosfato tampón (0,1 mol/1; pH 7,0), 0,1 ml pivurato, sal Na (2,5 mg/ml), y 0,05 ml, NADH, sal Na (10 mg/ml). Se añadieron 100 \mul del sobrenadante de la muestra a 900 \mul de los reactivos y se dejó reaccionar durante dos minutos. El cambio en la absorbancia a través de los dos minutos fue registrado. La media de las tres muestras por unidad LSE crioconservada se comparó con los controles no congelados. Los valores de las muestras fueron comparados con los valores de control correspondientes y expresados en términos de porcentaje de control (figura 9).

Ejemplo 11 Bioequievalencia del LSE crioconservado con el LSE no crioconservado

Para demostrar la bioequivalencia de los LSE crioconservado y no crioconservado, se llevó a cabo un estudio de injertos en ratones atímicos.

Las unidades LSE, crioconservadas de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1, fueron descongeladas un día antes del injerto, y recuperadas en unos medios de mantenimiento durante veinticuatro horas.

Se llevaron a cabo cuatro experimentos en los que un total de 66 ratones atímicos del tipo B6CB6YF1/J-un (Laboratorios Jackson Harbor) fueron injertados con el LSE crioconservado (n = 43) y el LSE no crioconservado (control) (n = 23). Los animales fueron anestesiados con Nembutal. Se extrajo una sección de piel de grosor total a partir del dorso de cada ratón, conservando la zona carnosa. Los injertos LSE, sea el de control o el crioconservado, fueron colocados en la herida y procesados para encajar. Todos los injertos fueron revestidos con una capa de gasa con vaselina y recubiertos mediante dos vendas adhesivas. Los revestimientos fueron extraídos al cabo de 7 días del injerto.

A los 14 días después del injerto, todos los animales fueron sometidos a eutanasia y fotografiados. El emplazamiento del injerto fue extraído para el análisis y evaluación histológica. Las fotografías directas y las micrografías mostraron la inexistencia de diferencias en la integración del injerto entre el LSE de control y el LSE descongelado y crioconservado. No se observaron diferencias significativas en las tasas de la contractura de la herida entre los injertos de control o crioconservado.

Ejemplo 12 Injerto de piel singeneico de piel de ratón crioconservada y de control

Para demostrar la bioequivalencia de piel de ratón crioconservada y no crioconservada, se llevó a cabo un estudio de injertos de piel singeneico.

Se sometieron a eutanasia ratones del tipo salvaje, tipo B6CB6YF1 mediante una sobredosis de Nembutal. La piel fue extraída asépticamente. Se eliminaron los vasos de sangre en exceso, la grasa y el tejido de conexión de la dermis para la preparación del injerto de piel. La piel del ratón fue criconservada y descongelada siguiendo el método del Ejemplo 7. La piel del ratón de control y no crioconservada se mantuvo en unos medios nutrientes a 4ºC durante el periodo de tiempo de la crioconservación y el proceso de descongelación, con un total de dos días, antes del injerto de piel.

Seis ratones del mismo tipo recibieron injertos de piel, dos ratones recibieron la piel de ratón de control no crioconservada y cuatro ratones recibieron la piel de ratón descongelada crioconservada. Los ratones fueron anestesiados con Nembutal. Se extrajo una sección de piel de grosor completo de 2 x 2 cm a partir del dorso de cada ratón, conservando la zona carnosa. Los injertos de piel del ratón, bien sea de control o crioconservada se colocaron sobre las heridas y siendo procesados. Todos los injertos fueron revestidos con una capa de gasa con vaselina, recubiertos con dos bandas adhesivas. Los revestimientos fueron eliminados al cabo de 7 días del injerto.

A los treinta días del injerto, todos los animales fueron sometidos a eutanasia y fotografiados. El emplazamiento del injerto fue entonces extraído para el análisis y evaluación histológica. Las fotografías directas y las micrografías demostraron que no existía diferencia en la integración del injerto entre la piel del ratón de control o la piel descongelada crioconservada del ratón. No se observó diferencia significativa en las tasas de la contractura de la herida entre los injertos de control o crioconservados.

Aunque la invención anteriormente expuesta ha sido descrita con cierto detalle a modo de ilustración y de ejemplo para los fines de aclarar su comprensión, será obvio para los técnicos especializados en el arte que pueden practicarse ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

1. Un método para la crioconservación de tejido extraído de mamífero o equivalente de tejido cultivado, que comprende:

(a)

situar en inmersión el mencionado tejido en una solución crioprotectora, agitando la mencionada solución crioprotectora y el mencionado tejido inmerso para conseguir la penetración efectiva de la solución crioprotectora dentro del mencionado tejido y conseguir un tejido prefundido;

(b)

sembrado de hielo extracelular en la mencionada solución crioprotectora y tejido prefundido;

(c)

enfriar el mencionado tejido prefundido de la etapa (b) hasta un estado crioconservado mediante la congelación del mencionado tejido a una velocidad de congelación lenta hasta una temperatura al menos de aproximadamente -70ºC o inferior, para producir un tejido crioconservado, y

(d)

almacenar el mencionado tejido crioconservado a una temperatura de al menos aproximadamente -70ºC o inferior.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la mencionada inmersión en la etapa (a) se lleva a cabo con una temperatura de inicio de aproximadamente 20ºC y después durante la perfusión, se enfría a una velocidad de aproximadamente -10ºC/minuto hasta una temperatura de aproximadamente -6ºC.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la congelación en la etapa (c) se lleva a cabo a una velocidad de -1ºC/minuto hasta una temperatura de aproximadamente -8ºC y manteniéndola un tiempo suficiente para permitir el equilibrado físico y biológico de la mencionada solución crioprotectora en el mencionado tejido.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (c) la temperatura se mantiene constante durante un tiempo suficiente para permitir el equilibrado físico y biológico de la mencionada solución crioprotectora en el mencionado tejido.

5. El método de la reivindicación 3, en el que le mencionado enfriamiento es continuado a una velocidad de -0,3º/minuto a -0,02ºC/minuto hasta una temperatura de aproximadamente -70ºC o inferior.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el mencionado tejido extraído de mamíferos es piel extraída de mamífero.

7. El método de la reivindicación 1 en el que el mencionado equivalente de tejido cultivado se selecciona del grupo que comprende equivalente epidermal cultivado, equivalente termal cultivado, y equivalente corneal cultivado.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la mencionada temperatura del mencionado estado crioconservado se encuentra a -120ºC o inferior hasta una temperatura de -196ºC o inferior.

9. El método de la reivindicación 1, en el que la mencionada solución crioprotectora es 1,5M a 2,5M glicerol en una base de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM).

10. El método de la reivindicación 1, que comprende además la descongelación del mencionado tejido crioconservado, en el que le mencionado tejido es descongelado en aproximadamente 1 a 2
minutos.