SK284801B6

SK284801B6 - Spôsob kryokonzervácie tkanív cicavcov

Info

Publication number: SK284801B6
Application number: SK1033-97A
Authority: SK
Inventors: Stephen R. Watson; Mehmet Toner; Alexander G. Tschumakow
Original assignee: Organogenesis, Inc.
Priority date: 1995-01-30
Filing date: 1996-01-30
Publication date: 2005-11-03
Also published as: EP0807234A1; PL321089A1; RU2178865C2; BR9606864A; PT807234E; JP2006325598A; HUP9800411A2; CN1292651C; JP2014065736A; FI113694B; CZ241397A3; JP4361550B2; CZ294950B6; DE69637301D1; WO1996024018A1; ATE282805T1; JPH11501298A; HU223789B1; EP1516532B1; JP2007161723A

Abstract

Spôsob kryokonzervácie získaného tkaniva cicavcov alebo kultivovaného tkanivového ekvivalentu pripraveného in vitro, pri ktorom sa uvedené tkanivo alebo kultivovaný tkanivový ekvivalent ponorí do roztoku kryogénneho ochranného činidla a uvedený roztok kryogénneho ochranného činidla a ponorené tkanivo sa mieša na dosiahnutie účinného prieniku roztoku do tkaniva a potom sa tkanivo mrazí veľmi nízkou rýchlosťou. Počas mrazenia sa vyvolá tvorba mimobunkového ľadu nukleáciou. Kryokonzervované tkanivo sa môže skladovať pred použitím neobmedzenú dobu. Kultivovaným tkanivovým ekvivalentom je in vitro model ekvivalentu ľudského tkaniva, ako je koža alebo rohovka, ktorý sa môže po ukončení skladovania používať na transplantáciu alebo implantáciu in vivo alebo na testovanie zlúčenín in vitro.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka kryokonzervácie získaných tkanív a kultivovaných tkanivových ekvivalentov, ktoré sa pripravujú použitím technológie in vitro. V technológii sa používa súprava (zariadenie) na kryokonzerváciu získaných tkanív a kultivovaných tkanivových ekvivalentov. S použitím technológie kryokonzervácie je možné pred použitím uchovávať kryokonzervované získané tkanivá alebo kryokonzervované kultivované tkanivá počas neobmedzeného času. Kultivované tkanivo, ktoré je in vitro modelom ekvivalentov ľudského tkaniva, sa po ukončení skladovania môže použiť na transplantáciu alebo implantáciu in vivo alebo na testovanie látok in vitro.

Doterajší stav techniky

Technológiou in vitro boli vyvinuté ekvivalenty tkanív, ktoré sa používajú na testovanie in vitro alebo na transplantáciu tkaniva in vivo na poranenia. Spôsoby prípravy takýchto tkanivových ekvivalentov opisujú patenty USA č. 4,485 096, 4, 604 346, 4,835 102 a 5,374 515 a patentové prihlášky USA č. 08/193 809 a 08/337 830.

Skladovanie živých tkanív je obmedzené, a v dôsledku toho je čas ich použitia krátky a vzniká veľké množstvo odpadu. Na prepravu a uchovanie je nutné také tkanivo konzervovať na dlhšie časové úseky, až do času ich použitia. Vyvinutie kryokonzervačnej metódy a zariadenie na kryokonzerváciu a uchovanie umožňuje použitie týchto tkanív na neobmedzenú dobu, jednoduchú prepravu a uchovanie zásob tkanív. Žiaduca je takisto možnosť vytvoriť zásoby tkanív (tkanivových bánk) na oddeleniach popálenín a v nemocniciach. Ďalej je výhodné, že sa v rôznych fázach výrobného cyklu môžu odoberať vzorky na uchovanie na kontrolu kvality a môžu sa pripraviť veľké objemy kultúr, pretože sa môžu uchovávať v zmrazenom stave.

V súčasnosti sa čas skladovateľnosti bunkových biologických materiálov predlžuje schladením na „kryogénne“ teploty. Prechod z kvapalného stavu na pevný pomocou zníženej teploty systému prebieha buď ako kryštalizácia (vytváranie ľadu), pri ktorom dochádza k pravidelnému usporiadaniu molekúl vody, alebo ako vitrifikácia alebo amorfizácia (vytváranie skla), keď k takémuto pravidelnému usporiadaniu kryštalickej fázy nedochádza. Úlohou pre kryobiológov je ochladiť bunky na kryogénne teploty a potom ich priviesť späť do fyziologického stavu bez ich poškodenia.

Existujú dva základné postupy na kryokonzerváciu buniek a tkanív: metóda „zmrazenia a rozmrazenia“ a vitrifikácia (zosklovitenie). S použitím postupov „zmrazenia a rozmrazenia“ sa zmrazí extracelulámy roztok (do kryštalickej formy), ale uskutočňujú sa opatrenia na minimalizáciu tvorenia ľadu vnútri bunky. Pri vitrifikačných postupoch je snaha zabrániť tvorbe ľadu v celej vzorke. Postup uvedený ako prvý jc problematický v tom, že pokiaľ sa vytvoria kryštály vnútri buniek, narušujú životaschopnosť bunky po rozmrazení. Bunky však môžu prežiť cyklus zmrazenia a rozmrazenia, pokiaľ sa chladia riadenou rýchlosťou v prítomnosti kryogénnych ochranných činidiel (kryoprotektantov) v množstve, ktoré nie je toxické. Neskôr uvedený postup - vitrifikácia - sa snaží predísť potenciálnemu ničivému účinku intracelulámeho a extracelulámeho ľadu tým, že potláča tvorbu ľadu použitím veľmi vysokých koncentrácií rozpustených látok a/alebo polymérov. Ale k poškodeniu bunky môže prísť, ak je vystavená dlhodobému pô sobeniu toxických koncentrácií týchto aditív nutných na vitrifikáciu.

Kryogénne ochranné činidlá chránia živé bunky pred stresom, ktorý je spôsobený ich zmrazením. Jedným z mechanizmov chránenia buniek kryogénnymi ochrannými činidlami je nariedenie solí, ktorých koncentrácia v nezmrazenom roztoku sa zvyšuje, ako sa voda premieňa na ľad. Množstvo ľadu je dané teplotou a počiatočným zložením roztoku, kým množstvo nezmrazenej frakcie je len funkciou teploty. Kryogénne ochranné činidlá majú niekoľko ďalších funkcii. Jedna z dôležitých funkcií je, že obvykle znižujú teploty, pri ktorých dochádza ku tvorbe ľadu vnútri bunky. Ďalšou funkciou je stabilizácia membrán a proteínov.

Všetky roztoky sa podchladzujú pod ich teplotu tuhnutia až nájdu náhodné nukleačné jadro na vytvorenie kryštálu. V prípade, že prebieha kryokonzervácia spôsobom „zmrazenie a rozmrazenie“, tvorba ľadu v mimobunkovom prostredí sa zámerne začína nukleáciou (vytvorením nukleačných jadier) pri nízkych stupňoch podchladenia. Pokiaľ sa tvorba ľadu nevyvolá nukleáciou, ľad sa bude tvoriť spontánne, ak sa roztok ochladí dostatočne nízko pod jeho rovnovážnu teplotu tuhnutia. Pretože je tento postup v prírode náhodný, ľad sa bude tvoriť pri náhodných nepredvídateľných teplotách, v dôsledku toho bude miera prežitia pri opakovaných pokusoch veľmi rozdielna, aj keď postup mrazenia bude rovnaký. Okrem toho, extrémne rýchla kryštalizácia, ku ktorej dochádza pri tvorbe ľadu vo vysoko podchladenom roztoku, môže poškodiť bunky a tkanivá. Ďalej bolo zistené, že pokiaľ sa tvorba mimobunkového ľadu začne pri vysokých stupňoch podchladenia, je pravdepodobnosť tvorby ľadu vnútri bunky výrazne zvýšená. K tomuto javu dochádza, ak sa začiatok dehydratácie bunky vyvolanej mrazením oneskorí, čo vedie k zvýšenému zadržiavaniu vnútrobunkovej vody a tým k vyššej pravdebodobnosti tvorby ľadu v bunke.

Hneď, ako je naočkovaný mimobunkový ľad a vzorka je obklopená ľadom, je nutné ochladiť vzorku do kryokonzervovaného stavu. Tento stupeň chladenia je v postupe „zmrazenie a rozmrazenie“ najkľúčovejší. V dôsledku vytvorenia ľadu, čo je čistá voda, je čiastočne zmrazený mimobunkový roztok koncentrovanejší ako vnútrobunkový. V dôsledku toho sa bunka dehydratuje, preto stráca vodu v snahe vyrovnať termodynamickú rovnováhu. Ako sa systém chladí, tvorí sa viac mimobunkového ľadu a koncentrácia rozpustených látok sa zvyšuje, čo núti bunku ďalej dehydratovať. Existujú tri vlastnosti buniek, ktoré usmeňujú rýchlosť ich dehydratácie. Jednou je permeabilita bunkovej membrány pre vodu, čím je nižšia permeabilita pre vodu, tým dlhšie trvá dehydratácia buniek. Ďalšia je teplotná závislosť permeability bunkovej membrány pre vodu, permeabilita pre vodu sa pri všetkých bunkách znižuje so znižujúcou sa teplotou. Poslednou vlastnosťou je veľkosť bunky, dehydratácia väčších buniek trvá dlhšie ako dehydratácia menších buniek. Vzhľadom na to, že rôzne typy buniek majú výrazne rozdielne vlastnosti, môžu sa optimálne podmienky kryokonzervácie rôznych typov buniek rádovo líšiť.

Hoci presné mechanizmy poškodenia bunky počas kryokonzervácie nie sú ešte celkom známe, zdá sa, že charakteristické krivky prežitia získané meraním buniek, ktoré prežili, ako funkcie rýchlosti chladenia, sú kvalitatívne podobné pri všetkých typoch buniek a tvoria krivku tvaru obráteného U. Prežitie buniek je nízke, ak rýchlosti chladenia sú veľmi nízke alebo veľmi vysoké. Existuje stredná rýchlosť chladenia, ktorá úmožňuje optimálne prežitie. Hoci sa optimálna rýchlosť chladenia a šírka krivky pre rôzne typy buniek môže výrazne líšiť, zdá sa, že kvalitatívne správanie je všeobecne platné. Vyššie rýchlosti chladenia neposkytnú bunkám dostatok času na dehydratáciu a vnútri buniek sa tvorí ľad. Poškodenie buniek pri vysokých rýchlostiach chladenia sa pripisuje tvorbe vnútrobunkového ľadu. Pri nízkych rýchlostiach chladenia sa predpokladá, že sa bunky poškodia v dôsledku toho, že sú vystavené pôsobeniu vysoko koncentrovaných roztokov vnútro- a mimobunkovej soli a kryogénnych ochranných činidiel alebo v dôsledku mechanických interakcií medzi bunkami a mimobunkovým ľadom.

Je nutné dosiahnuť maximálnu dehydratáciu buniek skôr, ako prekročia krivku vnútrobunkovej ľadovej nukleácie. V tej chvíli prakticky všetka voda, ktorá zostáva v bunke, vytvára jadrá a mení sa na ľad. Nie je možné určiť presnú teplotu, pri ktorej k tomuto javu prichádza, ale je to približne -40 °C až -50 °C, ak sa bunky pomaly mrazia v prítomnosti kryogénnych ochranných činidiel v koncentrácii IM až 2M. Je dôležité poznamenať, že množstvo vody, ktoré sa v tejto chvíli vnútri bunky premení na ľad, môže byť po zmrazení neškodlivé, ale ak sa neroztopí dastatočne rýchlo, bude expandovať a pri rozmrazení bunku usmrti. (The Biophysics of Organ Cryopreservation, str. 117-140, vyd. Dávid E. Pegg a Armand M. Karow, Jr. NATO ASI Šerieš A: Life Sciences zväzok 147, 1987 Plénum Press, New York 233 Spring St., New York, NY 10013).

Skôr, ako boli vyvinuté komerčne využiteľné ekvivalenty kože, bola na tieto účely transplantácie používaná koža z mŕtvych darcov. Boli vyvinuté postupy kryokonzervácie, takže centrá popálenín a nemocnice môžu vytvárať tkanivové banky. Bolo vyvinuté množstvo rôznych spôsobov kryokonzervácie, ktoré využívajú odlišné kryogénne ochranné činidlá, rýchlosti chladenia, spôsoby zabalenia a podmienky uchovávania. Väčšina výskumných pracovníkov sa prikláňa k rýchlemu rozmrazeniu. Úspešnosť alebo neúspešnosť spôsobu kryokonzerácie je hodnotená buď z hľadiska prichytenia štepu na poranení alebo testom životaschopnosti buniek.

V patente USA č. 3,842 831 (Beisang) sa opisuje spôsob kryokonzervácie štepov kože z mŕtvych darcov. Tento spôsob zahŕňa priloženie kože mŕtveho darcu na riedku podkladovú tkaninu alebo iný vhodný podklad, ktorý je spolu so štepom pred zmrazením zrolovaný. Kryogénne ochranné činidlo sa nepoužíva, hoci vynálezcovia navrhujú použiť buď glycerín alebo dimetylsulfoxid (DMSO). Rýchlosť mrazenia je vysoká a nie je riadená (konštantná teplota). Tkanivo sa zmrazí na kryogénnu teplotu -70° C.

May SR a FA DeClement (Skin Banking Methodology, 17, 33-45 (1980) na dermatóme mŕtveho darcu zhodnotili geometriu balenia, rýchlosť chladenia a zohrievania. Výsledky naznačujú, že štep kože by mal byť skôr rovný ako zrolovaný a mala by sa použiť riadená pomalšia rýchlosť zmrazovania.

Patent USA č. 5,040 677 (Tubo) opisuje nepriedušne pre plyn uzatvárateľnú nádobu na jednotlivé štepy vrstiev epiteliálnych buniek. V prípade tejto nádoby sa vrstva epiteliálnych buniek musí prichytiť sponkami adhezívnou podkladovou vrstvou alebo podložku.

Patent USA č.5,145 770 (Tubo) opisuje spôsob kryokonzervácie vrstiev keratinocytov, pri ktorom sa používa kryogénne ochranné činidlo, ktoré nepreniká do bunky, ako je dextrán, a činidlo prenikajúce do bunky, ako je glycerol. Rýchlosť chladenia je približne -1 °C/min. Podobne európsky patent č.O 364 306 (Chao a kol.) opisuje spôsob kryokonzervácie vrstvy živých kultivovaných epiteliálnych buniek s použitím dimetylsulfoxidu (DMSO) a glycerolu ako kryogénnych ochranných činidiel, čím je rýchlosť mrazenia výhodne-1 °C/min.

Patent USA č.5,298 417 (Cancedda a kol.) opisuje spôsob kryokonzervácie vyvinutý pre jednovrstvové konštrukty, ako sú vrstvy epiteliálnych buniek, ktorých prípravu opisujú patenty USA č. 4,016 036, 4,304 866 a 4,456 687. Vrstvy epidermálnych buniek sa inkubujú s kryogénnym ochranným činidlom, ktorým je buď 8 až 15 % glycerol alebo dimetylsulfoxid (DMSO) a potom sa bunky kryokonzervujú s použitím postupu s riadenou rýchlosťou chladenia, kde rýchlosť chladenia je na začiatku pomalšia ako na konci postupu, a vyznačuje sa tým, že teplota vzrastie pred kulmináciou mrazenia.

Teasdale a kol., Bums, 19 (5) 406-410 (1993), skúmali spôsob kryokonzervácie dermálnych fibroblastov v kolagénovom géli. Teasdale stanovil, že optimálna životaschopnosť buniek sa môže dosiahnuť mrazením rýchlosťou -0,5 °C/min., s použitím dimetylsulfoxidu, ako je kryogénneho ochranného činidla.

Nanchahal a kol., „Cultured composite skin grafts: Biological skin equivalents permitting massive expansion, „The Lancet, 2 (8565), 191-193 (22. júla, 1989), rozoberajú spôsob uchovávania kompozitných štepov kultivovaného tkaniva, pri ktorom sa používa ako kryogénne ochranné činidlo 15 % glycerol a 10 % fetálne teľacie sérum (FCS) v médiu 199. Štepy a kryogénne ochranné činidlo sa inkubujú počas 2 hodín pri teplote 37 °C, mrazia sa rýchlosťou -1 °C/min. na teplotu -70 °C, a potom sa uchovávajú v kvapalnom dusíku. Životaschopnosť štepov po rýchlom rozmrazení bola určená dvojtýždňovou kultiváciou a transplantáciou štepov lysým myšiam. Konečné vyhodnotenie sa vykonalo po transplantácii štepov trom pacientom po odstránení tetovania.

Práce, ktoré publikovali Johnstone a kol., „Cryopreservation of Rabbit and Cat Comeas at -18 to -24 °C“, Comea, 11(3):211-220 (1992), sa venuje jednoduchému postupu kryokonzervácie králičích a mačacích rohoviek, pri ktorom sa namiesto kvapalného dusíka alebo mraziacich zariadení s veľmi nízkymi teplotami používa domáca mraznička. Prestúpenie kryogénneho ochranného činidla sa dosiahne postupným umiestňovaním rohoviek do roztoku 50 % fetálneho teľacieho séra a McCareyKaufmanovho média so zvyšujúcim sa obsahom glycerolu a glukózy.

Metódy známe z doterajšieho stavu techniky sa nemôžu použiť ku kryokonzervácii kultivovaných tkanivových ekvivalentov, sčasti preto, že sú relatívne hrubé a sú zložené z vrstiev heterogénnych buniek. Jednou z funkcií týchto tkanív in vivo je vytvoriť neprestupnú bariéru. Funkcie tkanív je potrebné brať do úvahy pri vývoji spôsobu kryokonzervácie.

Teraz bol zistený nový spôsob kryokonzervácie tkanív.

Podstata vynálezu

Vynález opisuje spôsob úspešnej kryokonzervácie kultivovaných tkanivových ekvivalentov pri veľmi nízkych teplotách, pri ktorom nedochádza k vytváraniu škodlivých ľadových kryštálov vnútri bunky, minimalizuje sa účinná koncentrácia potencionálne škodlivých chemikálií a umožňuje rýchle vnesenie a odstránenie kryogénnych ochranných činidiel pri vhodných teplotách, s použitím programovateľného mraziaceho zariadenia.

Bol vynájdený spôsob kryokonzervácie buniek kultivovaných tkanivových ekvivalentov pripravených postupom in vitro, pri ktorom si tkanivá uchovávajú svoju života schopnosť a použiteľnosť ako ekvivalenty ľudských tkanív. Vynález zahŕňa použitie miešania na zvýšenie penetrácie účinného množstva kryogénneho ochranného činidla. Tento spôsob je vhodný na kryokonzerváciu tak získaných tkanív, ako aj kultivovaných tkanivových ekvivalentov tak, že jc chránená štruktúrna integrita a životaschopnosť buniek.

Spôsob podľa vynálezu zahŕňa nasledujúce stupne:

1. získané tkanivo alebo kultivovaný tkanivový ekvivalent sa ponorí do roztoku kryogénneho ochranného činidla a roztok kryogénneho ochranného činidla a ponorené tkanivo sa mieša, aby sa dosiahla účinná penetrácie roztoku kryogénneho ochranného činidla do tkaniva (perfiizia tkaniva), a

2. po perfúzii roztoku kryogénneho ochranného činidla do tkaniva sa vykonáva chladenie na teplotný rozsah rovnováhy pevnej a kvapalnej fázy kryogénneho ochranného činidla, ďalej sa vykoná nukleácia mimobunkového ľadu a chladenia do kryokonzervovaného stavu mrazením tkaniva nízkou rýchlosťou na teplotu najmenej -70 °C alebo pod ňu, výhodnejšie na teplotu -120 °C alebo pod ňu, ešte výhodnejšie na teplotu -140 °C najvýhodnejšie na teplotu 196 °C.

Hneď, ako je kryokonzervované tkanivo zmrazené, môže sa uchovávať počas neobmedzenej doby pri teplotách medzi približne -120 °C až približne -196 °C, čo je teplota kvapalného dusíka.

Rozmrazenie kryokonzervovaného tkaniva sa vykonáva zohriatím zmrazeného tkaniva vysokou rýchlosťou, počas asi jednej až dvoch minút. Zmrazené tkanivo sa môže rozmraziť priamo pridaním ohriateho kultivačného média alebo fyziologického pufrovaného roztoku alebo iným spôsobom rýchleho zohriatia. Súprava umožňuje rozmrazenie tkaniva ponorením súpravy do vodného kúpeľa, hoci súprava zaisťuje tak vysokú rýchlosť zohriatia, ako riadenú rovnomernosť teploty pri zachovaní sterility počas kľúčového postupu rozmrazenia.

Pred použitím ako ekvivalent ľudského tkaniva, pre transplantáciu alebo na testovanie in vitro, sa rozmrazený kultivovaný tkanivový ekvivalent premyje na odstránenie roztoku kryogénneho ochranného činidla. Roztok kryogénneho ochranného činidla sa odstráni premytím napríklad izotonickým roztokom pufra pri fyziologickom pH. Kultivované tkanivové ekvivalenty sa môžu potom dočasne uchovávať v takomto roztoku pufra alebo sa pred použitím rekultivujú vo vhodnom médiu na kultiváciu buniek.

Tkanivové inžinierstvo je nová oblasť, ktorá využíva kultivované tkanivové bunky na vytvorenie tkanivových ekvivalentov použiteľných na testovanie reakcie na poškodenie chemickými činidlami alebo farmaceutický účinnými zlúčeninami. Kultivované tkanivo sa môže tiež použiť na vytvorenie transplantovateľného ľudského tkaniva.

Tkanivové ekvivalenty sú rozsiahle opísané v mnohých patentoch, napríklad v patentoch USA č. 4,485 096, 4,485 097, 4,539 716, 4,546 500, 4,604 346, 4,837 379 a 5, 374 515. Jedna úspešná aplikácia tkanivového ekvivalentu sa nazýva „živý ekvivalent kože“ (Living Skin Equivalent, LSE), ktorého morfológia je podobná morfológii skutočnej ľudskej kože. Živý ekvivalent kože (LSE) sa skladá z dvoch vrstiev: horná časť je tvorená diferencovanými a vrstvenými ľudskými epidermálnymi keratinocytmi, ktoré prekrývajú spodnú vrstvu ľudských dermálnych fibroblastov uložených v kolagénovej matrix. (Parenteau a kol., „Epidermis Generated In Vitro“ Practical Consideration and Applications,“ J. of Cellular Biochemistry, 45:245-251 (1991), Parenteau a kol., The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibrblasts to achieve form and function, „Cytotechnology, 9:163-171 (1992), a Beli a kol., „The Living Skin Equivalent: Its Manufacture, Its Organo typic Properties and Its Responses to Irritants“, Toxic in Vitro, 5:591-596 (1991)). Živý ekvivalent kože (LSE) použiteľný na transplantácie je v súčasnosti vo fáze klinických skúšok pre indikáciu týkajúcu sa poranení, keď je poškodená časť alebo celá hrúbka kože, ako je vyrezanie pri chirurgických operáciách, popáleniny, vredy kŕčových žíl, diabetické vredy, vredy z preležania a chronické zápalové vredy. Živý ekvivalent kože (LSE) je dvojvrstvové, takisto hrubé, in vitro vytvorené kožné tkanivo s plnou hrúbkou.

In vitro ekvivalent rohovky oka bol vyvinutý, ako je opísané v patente USA č. 5,374 515. Ekvivalent tkaniva rohovky má tri rozdielne bunkové vrstvy. Vonkajšiu vrstvu tvorí vrstvený epitel z plochých buniek, strednú vrstvu tvoria kolagénové vlákna a bunky stromatu, a vnútornú vrstvu tvorí jednoduchý epitel z plochých buniek, ktorý sa tiež nazýva rohovkový endotel. In vitro ekvivalent rohovky sa môže používať na testy toxicity in vitro, keď slúži ako presný, lacný nezvierací model na testovanie očného a kožného iritačného potenciálu mnohých typov výrobkov a surovín.

Cieľom kryokonzervácie je zachovať štruktúrnu integritu a životaschopnosť biologických materiálov počas neobmedzenej doby, čo umožňuje, aby tieto materiály mohli byť dostupné a použiteľné v okamihu potreby. V prípade zložitých tkanív s obmedzenou dĺžkou života je kryokonzervácia nutná na rozšírenie doby použiteľnosti produktu. História kryokonzervácie biologického materiálu však svedčí o tom, že optimalizácia postupu kryokonzervácie na určitú bunku nevyhnutne nevedie k dobrým výsledkom, ak sa tento postup použije pre iný typ bunky alebo pre iné bunky v tkanive. Je nutné vyvinúť špecializovanejšie spôsoby kryokonzervácie v dôsledku rozdielov v hustote buniek, v obsahu vody a v štruktúrnej organizácii tkanivových ekvivalentov s plnou hrúbkou. Spôsob kryokonzervácie podľa vynálezu je prekvapivo použiteľný v prípadoch samotných jednovrstvových epidermálnych a dermálnych vrstiev, dvojvrstvových tkanivových ekvivalentov, trojvrstvových ekvivalentov rohovky a získanej kože cicavcov. Vývoj súpravy umožňuje využiť kryokonzerváciu týchto tkanív vo výrobných postupoch.

Termín „kultivované tkanivové ekvivalenty“, ako je tu používaný, označuje tkanivové ekvivalenty cicavcov, ktoré sa pripravujú spôsobmi in vitro a patria medzi ne jednovrstvové ekvivalenty kože, ako je buď dermálny ekvivalent alebo epidermálna vrstva, dvojvrstvové ekvivalenty kože, hlavne živý ekvivalent kože (LSE), trojvrstvové ekvivalenty rohovky a ekvivalenty kože. Morfológia kultivovaných tkanivových ekvivalentov je podobná orgánom cicavcov, typicky ľudským orgánom in vivo. Na ilustráciu možno uviesť, že morfológia živého ekvivalentu kože (LSE) vykazuje veľa podobností s ľudskou kožou. Metabolický a mitoticky aktívne ľudské dermálne fibroblasty (HDF) sa nachádzajú v celej dermálnej vrstve konštruktu a bolo zistené, že do siete vylučujú kolagén a ďalšie komponenty matrix. Epidermis sa skladá z bazálnej vrstvy, o ktorej sa zistilo, že sa delí mitotickou rýchlosťou podobnou mitotickej rýchlosti ľudskej kože. Suprabazálny epidermis má rovnaké vrstvy ako koža in vivo, s dobre definovanými tŕňovými a granulovými vrstvami, ktoré obsahujú keratohyalín a lameláme granuly, ktoré prekrýva zrohovatelá vrstva. Imunohistochemicky sa zistí prítomnosť zložiek mimobunkovej matrix, ktoré sa bežne nachádzajú na dcrmoepidermálnom spojení normálnej ľudskej kože, ako je laminín, kolagén typu IV a kalanín (GB3).

Kultivované tkanivové ekvivalenty získané kultivačnými spôsobmi typickými pre jednotlivé orgány, ako je živý ekvivalent kože (LSE), používajú nosič ako kostru, na ktorej sa tvoria ekvivalenty. Kultivované tkanivové ekvivalenty sa pripravujú na nosiči, ktorý umožňuje manipuláciu s konštruktom počas prípravy, jeho prepravu a konečné použitie bez priameho kontaktu s konštruktom. Spôsob prípravy kultivovaných tkanivových ekvivalentov sa opisuje v patente USA č. 5,374 515 a v patentových prihláškach USA č.08/193 809 a 08/337 830.

Medzi kultivované tkanivové ekvivalenty patria dermálny ekvivalent hydratovanej kolagénovej siete zmrštenej určitým činidlom, výhodne ide o fibroblasty. Podľa jedného uskutočnenia sa na povrchu dermálneho ekvivalentu kultivuje vrstvená vrstva epidermálnych buniek. Podľa iného uskutočnenia sa hydratovaná zmrštená kolagénová sieť, zmrštená pôsobením keratocytov, umiestni na vrstvu endoteliálnych buniek rohovky s vrstvenou vrstvou epiteliálnych buniek rohovky kultivovaných na povrchu siete. Alternatívne sa môžu kultivovať samotné epidermálne bunky a vyvolať ich zvrstvenie na vytvorenie epidermálnej vrstvy. Kultivovaný tkanivový ekvivalent sa tvorí buď na poréznej membráne nosiča alebo na kolagénnom géli, ktorý prilípa k poréznej membráne na povrchu dna nosiča. Okrem toho sa môžu spôsobom podľa vynálezu kryokonzervovať tkanivové ekvivalenty, medzi ktoré patria ľuboboľné kultivované epidermálne vrstvy, kultivované dermálne ekvivalenty, kultivované ekvivalenty rohovky alebo získaná koža cicavcov, pričom však nejde o obmedzujúci zoznam.

Vynález bude ďalej opísaný s použitím tkanivových ekvivalentov. Odborníkovi je jasné, že môže vykonať modifikáciu opísaného spôsobu a pritom zostať v rámci rozsahu vynálezu.

Perfúzia tkanivového ekvivalentu roztokom kryogénneho ochranného činidla sa vykonáva ponorením tkanivového ekvivalentu s pripojeným nosičom do roztoku kryogénncho ochranného činidla v objeme, ktorý je dostaotčný na ponorenie vzorky, pri udržaní rovnakého objemu roztoku kryogénneho ochranného činidla nad tkanivovým ekvivalentom a pod tkanivovým ekvivalentom. Do Petriho misky s priemerom 100 mm, ktorá obsahuje tkanivový ekvivalent a nosič, sa pridá 25 ml 2M glycerolu v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) na čas dostatočný na úplnú perfúziu vzorky, výhodne na jednu až dve hodiny, ale najvýhodnejšie na približne jednu hodinu. Dlhší čas pôsobenia roztoku kryogénneho ochranného činidla vedie k zníženiu životaschopnosti buniek v tkanive, kým príliš krátky čas pôsobenia nezaisťuje úplné preniknutie kryogénneho ochranného činidla do tkaniva. V prípade jednovrstvových konštruktov je typicky nutný kratší čas perfúzie, hoci majú menej vrstiev buniek a zníženú bariérovú funkciu. Počas tejto hodiny sa prenikanie roztoku kryogénneho ochranného činidla zvýši miešaním vzorky a roztoku kryogénneho ochranného činidla, čo sa typicky uskutočňuje trepaním Petriho misky na trepačke s kruhovým pohybom (Bellco orbital shaker) pri 70 otáčkach za minútu v prostredí 10 % oxidu uhličitého. Prostredie 10 % oxidu uhličitého, ktoré je rovnaké ako kultivačné prostredie, v ktorom sa tkanivový ekvivalent pripravuje, bráni uvoľneniu plynu z média a tak udržiava pH základnej zložky média kryogénneho ochranného činidla. Miešanie umožňuje rýchlejšiu a dokonalejšiu perfúziu kryogénneho ochranného činidla do tkanivového ekvivalentu a lepšiu reprodukovateľnosť výsledkov pri jednotlivých zmrazených tkanivových ekvivalentoch. Trepačka s kruhovým pohybom sa môže nahradiť zariadením, ktoré vykonáva pohyb v iných priestorových rovinách. Medzi ďalšie spôsoby na mechanické zvýšenie perfúzie je zahrnuté, pričom však nejde o obmedzujúci výpočet, kývanie konštruktu s kryogénnym ochranným činidlom v nádobe na plošine alebo centrifugácia konštruktu s kryogénnym ochranným činidlom a perfúzie kryogénneho ochranného činidla okolo konštruktu s použitím pumpy.

Nosič a prichytený tkanivový ekvivalent sa umiestni do misky a pridá sa celkom okolo 16,0 ml roztoku kryogénneho ochranného činidla. Súprava umožňuje rovnomerné rozdelenie kryogénneho ochranného činidla: približne 8,0 ml sa dostane pod nosič a približne 8,0 ml sa dostane nad povrch tkanivového ekvivalentu. Na misku sa potom umiestni veko a obe časti sa spoja a uzavrú teplom.

Takto zabalené tkanivové ekvivalenty sa umiestnia do programovateľnej mraziacej komory (Cryomed alebo Planer) pri počiatočnej teplote zodpovedajúcej teplote miestnosti, výhodne 20,0 °C. Mraziaca komora obsahujúca uvedené v súprave uzavreté tkanivové ekvivalenty sa chladí rýchlosťou -10,0 °C/min. na teplotný rozsah rovnováhy pevnej a kvapalnej fázy pre kryogenne ochranné činidlo, ktorého hodnota sa v prípade 2M glycerolu obsiahnutého v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) pohybuje medzi približne -5,3 °C až -6,0 °C. Teplota rovnováhy pevnej a kvapalnej fázy je teplota nutná na vytvorenie jadier (nukleácie) ľadu v kryogénnom ochranom činidle. Teplota v komore sa udržiava počas určitej doby na vyrovnanie vnútornej teploty tkanivových ekvivalentov na teplotu komory. Rýchlosť chladenia použitá na dosiahnutie teploty na tvorbu jadier ľadu nie je rozhodujúca. Na dosiahnutie tepelnej rovnováhy je postačujúci čas 40 minút, ale tento čas bude kolísať v závislosti od veľkosti komory, cirkulácie vzduchu v komore a počtu úprav, ktoré sa mrazia. Typicky je nutný čas aspoň 30 minút, ale na zaistenie dosiahnutia rovnováhy môže byť tento čas až 1 hodina. Po tomto čase sa iniciuje tvorba mimobunkového ľadu nukleáciou.

Nukleácia ľadu (tvorba jadier ľadu) sa definuje ako spôsob vyvolania tvorby ľadu v mimobunkovom kryogénnom ochrannom činidle. Jedným výhodným spôsobom tvorby jadier ľadu je priloženie schladenej sondy ku stene misky obsahujúcej tkanivo, ako je oceľová tyčka chladená kvapalným dusíkom (-196 °C). Miesto dotyku tyčky so súpravou musí byť pod hladinou kryogénneho ochranného mraziaceho média. Ďalším výhodným spôsobom je priame uvoľnenie expandujúcich plynov, ako je freón alebo oxid uhličitý, do priestoru vnútra súpravy. Tvorba ľadu sa môže vyvolať dutým klincom, kde sa teplota znižuje a zvyšuje v rozsahu, ktorý je dostatočný na tvorbu kryštálov ľadu. Tvorba ľadu sa môže vyvolať aj ďalšími spôsobmi, ktoré sú známe v odbore.

Akonáhle pri všetkých tkanivových ekvivalentoch prebehlo vytvorenie jadier kryštálov ľadu, súpravy sa uchovajú pri uvedenej teplote ďalšiu hodinu, čo umožní dosiahnuť termodynamickú rovnováhu a rozšírenie zárodočných kryštálov ľadu do celého objemu kryogénneho ochranného činidla. Chladenie potom pokračuje rýchlosťou približne 0,02 až približne -0,3 °C/min., výhodnejšie medzi približne -0,05 až -0,1 °C/min. a najvýhodnejšie -0,07 °C/min., na konečnú teplotu najmenej -70,0 °C alebo menej, výhodnejšie na teplotu -120 ⁰C, ešte výhodnejšie na teplotu -140 °C a najvýhodnejšie na teplotu -196°C. Ak sa konečná teplota mrazenia blíži k teplote skleného prechodu vody, teda teplote -120° C, znižuje sa pravdepodobnosť škodlivého kolísania teploty počas prenosu do konečného miesta uchovávania.

Kryokonzervované tkanivové ekvivalenty sa prenesú z programovateľnej mrazničky do skladovacej nádoby s kvapalným dusíkom, kde prebieha skladovanie v plynnej fáze (Dewar) pri teplote medzi -120 °C a -150 °C, alebo do kvapalného dusíka, kde prebieha skladovanie pri teplote -196 °C, ku skladovaniu do času použitia.

Na rozmrazenie sa kryokonzervované tkanivové ekvivalenty vyberú zo skladovacej nádoby s kvapalným dusíkom, kde prebieha skladovanie v plynnej fáze a prenesú sa na suchý ľad, na zvýšenie teploty na približne -75 °C. Po dosiahnutí teploty -75 °C sa kultivované tkanivové ekvivalenty prenesú do prostredia, výhodne vodného kúpeľa s teplotou výhodne 37 C, výhodnejšie 4 C alebo najvýhodnejšie s teplotou miestnosti. Akonáhle vidno, že všetko kryogénne ochranné médium prešlo do kvapalnej fázy, výhodne sa súprava s kultivovaným tkanivovým ekvivalentom prenesie do sterilnej nádoby alebo do iného aseptického prostredia a sterilizuje sa etanolom. Veko sa odstráni odtrhnutím alebo odrezaním od dna jednotky. Každý nosič obsahujúci kultivované tkanivové ekvivalenty sa potom prenesie do Petriho misky, pričom sa vyleje nadbytok kryogénneho ochranného činidla. Na odstránenie zvyšku kryogénneho ochranného činidla z kultivovaného tkanivového ekvivalentu sa potom do Petriho misky obsahujúcej kultivovaný tkanivový ekvivalent na čas asi 30 minút pridá 25 ml premývacieho roztoku, výhodne Dulbeccovho modifikovaného Eaglovho média (DMEM) pri teplote miestnosti. Odborník môže určiť iné vhodné premývacie roztoky, výhodne roztoky s fyziologickou koncentráciou, ako je médium na kultiváciu buniek alebo fosfátom pufrovaný fyziologický roztok. Premývací roztok sa vymení a kultivovaný tkanivový ekvivalent sa premýva počas ďalších 30 minút. Čas premývania sa môže odlišovať v závislosti od zložitosti tkaniva.

Kultivovaný tkanivový ekvivalent sa môže preniesť späť do jeho pôvodnej kultivačnej nádoby a rekultivovať v médiu na udržiavanie kultúr pri teplote 37 °C v prostredí 10 % oxidu uhličitého. Alternatívne možno ekvivalent aplikovať pacientovi alebo sa môže použiť na testovanie odozvy na kontakt s určitou látkou, ako je opísané v patente USA č. 4,835 102.

Na lepšiu ilustráciu vynálezu sú uvedené nasledujúce príklady, ktorými sa však rozsah vynálezu v žiadnom smere neobmedzuje. Odborníkovi je jasné, že tu opísané spôsoby sa môžu rôzne modifikovať, pričom sa neodchýli od podstaty a rozsahu vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklady 1 a 2 opisujú kryokonzerváciu a rozmrazovanie podľa vynálezu.

Príklad 1

Kryokonzcrvácia živcho ekvivalentu kože (LSE)

Konštrukty živého ekvivalentu kože (LSE) sa pripravia podľa patentovej prihlášky USA č. 08/193 809. Živé ekvivalenty kože (LSE) a 75 mm veľké nosičové inzerty (TRANSWELL, Costar, Cambridge), 9 až 10 dní po spracovaní vzduchom (air-liftu), sa umiestnia do Petriho misiek (Costar) s priemerom 100 mm. Konštrukty živých ekvivalentov kože (LSE) sa perfundujú kryogénnym ochranným činidlom tak, že sa tieto konštrukty s nosičom TRANSWELL ponoria v Petriho miske s priemerom 100 mm na jednu hodinu do 25 ml kryogénneho ochranného média, čo je 2M glycerol v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM). V priebehu perfúzie sa konštrukty miešajú počas 1 hodiny na trepačke s kruhovým pohybom (Bellco) pri 70 otáčkach za minútu v prostredí 10 % oxidu uhličitého. Miešanie umožňuje dokonalejšiu perfúziu a lepšiu reprodukovateľnosť spôsobu kryokonzervá cie. Po ukončení perfúzie živého ekvivalentu kože (LSE) sa Petriho misky obsahujúce živý ekvivalent kože (LSE), nosičové inzerty a mimobunkové mraziace médium (2M glycerol v DMEM) umiestnia so kryokonzervačnej súpravy, ktorá sa uzavrie teplom. Vhodná súprava je opísaná v patentovej prihláške 5008-2004 s rovnakou prioritou ako má táto patentová prihláška.

Komora programovateľnej mrazničky (Planer) sa vybaví tu opísaným spôsobom podľa vynálezu. V mrazničke sa nadstaví počiatočná teplota na 20,0 °C. Potrubie sa prefúkne freónom za jednu sekundu na odstránenie vzduchu v potrubí. Súpravy so živým ekvivalentom kože (LSE) sa opatme uniestnia do stojanov, z ktorých každý pojme osem súprav. Stojany sa umiestnia na miesto určené čapmi vedľa kropiacich koľajníc. Dvere komory mrazničky sa uzavrú, aby sa komora izolovala od vonkajšieho prostredia.

Jednotky so živými ekvivalentmi kože sa chladia rýchlosťou -10 °C/min. na teplotu -6 °C a teplota -6 °C sa v mraziacej komore udržiava počas 40 minút, aby sa dosiahlo vyrovnanie teploty kryogénneho ochranného činidla a perfundovaných konštruktov na teplotu komory. Po týchto 40 minútach sa vyvolá tvorba mimobunkového ľadu priamym zavedením freónu počas 1 sekundy do bezprostrednej blízkosti steny súpravy. Freón sa odparuje z povrchu súpravy, čo spôsobuje na plochách súpravy, ktoré prišli do kontaktu s freónom, pokles teploty, ktorý je dostatočný na vyvolanie tvorby mimobunkovéhop ľadu.

Potom, čo sa vo všetkých jednotkách so živým ekvivalentom kože vytvoria jadrá kryštálov ľadu, teplota sa udržiava na hodnote -6 °C počas jednej hodiny. Teplota mraziacej komory sa potom zníži rýchlosťou 0,07 °C/min. na končnú teplotu -20 °C. Komora sa potom chladí rýchlosťou -0,5 °C/min. na konečnú teplotu -70 °C. Po kryokonzervácii živého ekvivalentu kože sa jednotky premiestnia do skladovacej nádoby, kde skladovanie prebieha v plynnej fáze (Dewar), kde je teplota -120°Caž-150°C.

Príklad 2

Rozmrazenie kryokonzervovaného živého ekvivalentu kože (LSE)

Kryokonzervovaný živý ekvivalent kože (LSE) sa vyberie zo skladovacej nádoby s kvapalným dusíkom, kde prebieha skladovanie v plynnej fáze, a prenesie sa na suchý ľad, aby sa ohrial na teplotu okolo -75 °C. Akonáhle sa teplota ustáli na -75 °C, kultivovaný tkanivový ekvivalent sa prenesie do vodného kúpeľa, ktorého teplota je výhodne 37 °C, výhodnejšie 4 °C a najvýhodnejšie teplota miestnosti. Keď vidno, že všetko kryogénne ochranné médium prešlo do kvapalnej fázy, výhodne sa súpravy s kultivovanými tkanivovými ekvivalentmi prenesú do sterilnej nádoby alebo do iného aseptického prostredia a sterilizujú sa etanolom. Veko sa odstráni odtrhnutím alebo odrezaním od dna jednotky. Každý nosič obsahujúci kultivované tkanivové ekvivalenty sa potom prenesie do Petriho misky, pričom sa vyleje nadbytok kryogénneho ochranného činidla. Na odstránenie zvyšku kryogénneho ochranného činidla z kultivovaného tkanivového ekvivalentu sa potom do Petriho misky obsahujúcej kultivovaný tkanivový ekvivalent pridá na čas asi 30 minút 25 ml premývacieho roztoku, výhodne Dulbeccovho modifikovaného Eaglovho média (DMEM), s teplotou miestnosti. Odborník môže určiť iné vhodné premývacie roztoky, ako je iné médium na kultiváciu buniek alebo fosfátom pufrovaný fyziologický roztok. Premývací roztok sa vymení a kultivovaný tkanivový ekvivalent sa premýva počas ďalších 30 minút.

SK 284801 Β6

Rozmrazené kryokonzervované a kontrolné vzorky sa spracujú histologickými metódami a pomocou svetelného mikroskopu sa hodnotí ich morfológia a životaschopnosť. Životaschopnosť rozmrazených kryokonzervovaných vzoriek sa blíži k 100 % a sú takmer neodlíšiteľné od kontrolných vzoriek.

Príklady 3 až 11 opisujú spôsob kryokonzervácie rôznych druhov tkanív podľa vynálezu.

Príklad 3

Kryokonzervácia epidermálnych vrstiev

Epidermálna vrstva sa vytvorí z maturovaného živého ekvivalentu kože (LSE) 12 dní po spracovaní vzduchom (air-liftu). Odobratie epidermálnej vrstvy sa vykonáva odtrhnutím dermálnej substrátovej vrstvy od epidermálnej vrstvy pinzetou a odstránením dermálnej vrstvy. Každá vrstva sa nareže na tri rovnaké kusy. Jeden kus z každej sa uchová ako kontrola. Zostávajúce dva kusy každej vrstvy sa umiestnia na 75 mm veľkú polykarbonátovú membránu TRANSWELL (Costar) do kultivačných misiek s priemerom 100 mm (Costar). Vykonáva sa perfúzia každého kusa vrstvy 25 ml DMEM a 2M glycerolom počas jednej hodiny. Misky obsahujúce konštrukty sa miešajú na trepačke s kruhovým pohybom (Bellco) pri 70 otáčkach za minútu počas 1 hodiny v prostredí 10 % oxidu uhličitého. Po perfúzii epidermálnej vrstvy sa Petriho miska obsahujúca epidermálnu vestvu, nosič TRANSWELL a mimobunkové mraziace médium (2M glycerol a DMEM) umiestni do vrecka a vákuovo sa uzavrie pomocou zariadenia Audiovox naprogramovaného na 5 sekúnd tvorby vákua a 3,9 sekúnd utesňovania.

Takto uzavreté epidermálne vrstvy sa umiestnia do programovateľnej mrazničky (Planer) s počiatočnou teplotou 20,0 °C. Epidermálne vrstvy sa chladia rýchlosťou -10,0 °C/min. na teplotu -6,0 °C. Teplota sa drží na hodnote -6,0 °C počas ďalších 20 minút na vyrovnanie teploty tkaniva na teplotu komory. Po uplynutí týchto 20 minút sa iniciuje vytváranie mimobunkového ľadu tak, že sa z vonkajšej strany vrecka pod hladinu mraziaceho média priloží sonda chladená kvapalným dusíkom. Potom, čo vo všetkých epidermálnych vrstvách sa vytvoria jadrá kryštálov ľadu, sa teplota udržiava počas ďalších 5 minút na hodnote -6,0 °C. Komora sa potom chladí rýchlosťou -1,0 °C/min. na teplotu -8,0 °C. Teplota sa potom udržiava počas 30 minút na hodnote -8,0 “C na umožnenie rovnomerného rozmiestnenia ľadu vo vzorke. Komora sa potom chladí rýchlosťou -0,1 °C/min. na konečnú teplotu -70,0 °C.

Kryokonzervované epidermálne vrstvy sa vyberú z mrazničky, vrecká sa rozstrihnú a z Petriho misiek sa odstráni veko. Na rozmrazenie sa do každej Petriho misky asepticky naleje 40 ml Dulbeccovho modifikovaného Eaglovho média (DMEM) zohriateho na teplotu 37 °C. Po 45 sekundách sa z misiek odstráni všetka kvapalina a do každej misky sa pridá ďalších 40 ml média na 2 minúty. Po roztopení všetkého ľadu sa epidermálne vrstvy premývajú počas 30 minút 25 ml média DMEM. Médium sa vymení a vzorka sa opäť premýva počas 30 minút. Epidermálne vrstvy sa potom inkubujú v médiu na uchovanie kultúr pri teplote 37 °C v prostredí 10 % oxidu uhličitého počas 24 hodín pred analýzou. Inkubačná doba je dlhá ako interval, ktorý typicky potrebujú zmrznuté bunky na spätné ustanovenie podmienok stabilného stavu.

Jedna z dvoch častí každej epidermálnej bunky sa skúma histologický, a druhá časť sa testuje MTT-testom. Porovnanie fotomikrografu epidermálnej vrstvy, ktorá nebola kryokonzervovaná a kryokonzervovanej epidermálnej vrstvy z príkladu 4 ukazuje, že všetky tri základné vrstvy epi dermis, čo je bazálna vrstva epidermis, suprabazálna vrstva epidermis a zrohovatelá vrstva epidermis, sa uvedeným spôsobom konzervujú. Všetky vrstvy sú neporušené a celková morfológia kryokonzervovanej epidermálnej vrstvy je rovnaká ako morfológia epidermálnych vrstiev, ktoré neboli kryokonzervované.

Príklad 4

Kryokonzervácia dermálnych ekvivalentov

Dermálnymi ekvivalentmi použitými v tomto príklade sú neepidermalizované zložky živého ekvivalentu kože (LSE). Dermálne ekvivalenty sa zmrazia 8 dni po otlačení. Perfúzia dermálnych ekvivalentov kryogénnym ochranným činidlom sa vykoná ponorením dermálnych ekvivalentov prichytených na 75 mm veľkom nosiči TRANSWELL (Costar) umiestnených v Petriho miskách (Costar) s priemerom 100 mm 25 ml Dulbeccovho modifikovaného Eaglovho média (DMEM) s 2M glycerolom na 1 hodinu. Petriho misky sa miešajú na trepačke s kruhovým pohybom (Bellco) pri 70 otáčkach za minútu v prostredí 10 % oxidu uhličitého. Po perfúzii dermálnych ekvivalentov kože sa Petriho misky, dermálne ekvivalenty kože, nosiče a mimobunkové mraziace médium umiestnia do programovateľnej mrazničky (Planer) s počiatočnou teplotou 20,0 °C. Komora sa potom chladí rýchlosťou -10,0 °C/min. na teplotu -6,0 °C. Teplota sa udržiava na tejto hodnote počas 20 minút na vyrovnanie teploty tkaniva na teplotu komory. Po uplynutí týchto 20 minút sa iniciuje vytváranie mimobunkového ľadu tak, že sa z vonkajšej strany misiek pod hladinu mraziaceho média priloží sonda chladená kvapalným dusíkom. Potom, čo sa vo všetkých dermálnych ekvivalentoch vytvoria jadrá kryštálov ľadu, sa teplota udržiava počas ďalších 5 minút na hodntoe -6,0 °C. Komora sa potom chladí rýchlosťou -1,0 °C/min. na teplotu -8,0 ’C. Teplota sa opäť udržiava počas 30 minút na hodnote -8,0 °C, na umožnenie rovnomerného rozmiestnenia ľadu vo vzorke. Dermálne ekvivalenty sa potom chladia rýchlosťou -0,1 °C/min. na konečnú teplotu -70,0 °C.

Kryokonzervované dermálne ekvivalenty sa vyberú z mrazničky a z Petriho misiek sa odstráni veko. Na rozmrazenie sa do každej Petriho misky aseptický naleje 40 ml Dulbeccovho modifikovaného Eaglovho média (DMEM) zohriateho na teplotu 37 °C. Po 45 sekundách sa z misiek odstráni všetka kvapalina a do každej misky sa pridá ďalších 40 ml média na 2 minúty. Po roztopení všetkého ľadu sa dermálne ekvivalenty premývajú počas 30 minút 25 ml média DMEM. Médium sa vymení a vzorka sa opäť premýva počas 30 minút. Dermálne ekvivalenty, stále pripojené na nosič TRANSWELL, sa potom prenesú naspäť do kultivačných misiek a inkubujú sa v médiu na uchovávanie kultúr pri teplote 27° C v prostredí 10 % oxidu uhličitého počas 24 hodín pred analýzou. Inkubačná doba je dlhá ako interval, ktorý typicky potrebujú zmrznuté bunky na spätné ustanovenie podmienok stabilného stavu. Vzorky sa testujú MTT-testom.

Príklad 5

Kryokonzervácia ekvivalentov rohovky

Ekvivalenty rohovky prichytené na 24 mm veľkých nosičoch TRANSWELL (Costar) sa umiestnia 9 dní po spracovaní vlhkým vzduchom do misky so šiestimi jamkami (Costar). Perfúzia ekvivalentov rohovky kryogénnym ochranným činidlom sa vykoná ponorením každého ekvivalentu rohovky a nosiča do 4 ml mimobunkového mraziaceho média (2M glycerol v médiu DMEM) v miskách so šiestimi jamkami na 1 hodinu. Misky so šiestimi jamkami obsahujúcimi konštrukty rohovky sa trepú na trepačke s kruhovým pohybom (Bellco) pri 70 otáčkach za minútu v prostredí 10 % oxidu uhličitého. Po perfúzii ekvivalentov rohovky sa Petriho misky obsahujúce ekvivalenty rohovky, nosič a mimobunkové mraziace médium umiestnia do programovateľnej mrazničky (Planer) s počiatočnou teplotou 20,0 ⁰ C. Ekvivalenty rohovky sa potom chladia rýchlosťou -10,0 °C/min. na teplotu -5,0 °C. Teplota sa udržiava na tejto hodnote počas 20 minút na vyrovnanie teploty tkaniva na teplotu komory. Po uplynutí týchto 20 minút sa iniciuje vytváranie mimobunkového ľadu tak, že sa z vonkajšej strany každej jamky pod hladinu mraziaceho média priloží sonda chladená kvapalným dusíkom. Potom, čo sa vo všetkých ekvivalentoch rohovky vytvoria jadrá kryštálov ľadu, sa teplota udržiava počas ďalších 5 minút na hodnote -6,0 °C. Komora sa potom chladí rýchlosťou -1,0 ⁰ C/min. na teplotu -8,0 ° C. Teplota sa opäť udržiava počas 30 minút na hodnote -8,0 °C na umožnenie rovnomerného rozmiestnenia ľadu vo vzorke. Dermálne ekvivalenty kože sa potom chladia rýchlosťou -0,1 ⁰ C/min. na konečnú teplotu-70,0 ° C.

Kryokonzervované ekvivalenty rohovky sa vyberú z mrazničky a z misiek sa odstráni veko. Po rozmrazení sa do každej jamky misky aseptický naleje 6 ml Dulbeccovho modifikovaného Eaglovho média (DMEM) zohriateho na teplotu 37°C. Po 45 sekundách sa z misiek odstráni všetka kvapalina a do každej misky sa pridá ďalších 6 ml média na 2 minúty. S použitím sterilných lekárskych klieští sa ekvivalenty rohovky a naviazané nosiče TRANSWELL prenesú do novej misky. Po premytí sa do každej jamky vnesú 4 ml média DMEM na 30 minút. Médium sa vymení a vzorka sa opäť premýva počas 30 minút. Rohovky sa potom prenesú naspäť do rovnakých kultivačných misiek a inkubujú sa v médiu na uchovávanie rohovky pri teplote 37° C v prostredí 10 % oxidu uhličitého počas 24 hodín pred analýzou. Inkubačná doba je dlhá ako interval, ktorý typicky potrebujú zmrznuté bunky na spätné ustanovenie podmienok stabilného stavu. Vzorky sa testujú MTT-testom.

Príklad 6

Kryokonzervácia získanej myšej kože

Myši divého typu, kmeň B6CB6YF1, sa usmrtia predávkovaním Nembutalom. Koža sa odoberie aseptickým spôsobom. Nadbytočné krvné cievy, tuk a spojivové tkanivo sa z dermy odstránia. Myšia koža sa upravila na pravouhlý kúsok s rozmermi 1 x 2 cm. Kúsky myšej kože sa potom umiestnia na 75 mm veľký nosič TRANSWELL (Costar) do Petriho misky s priemerom 100 mm. Perfúzia myšej kože kryogénnym ochranným činidlom sa vykoná ponorením do 25 ml 2M glycerolu v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) v Petriho miskách s priemerom 100 mm na 1 hodinu. Počas perfúzie sa Petriho misky obsahujúce myšiu kožu a nosič trepú počas 1 hodiny na trepačke s kruhovým pohybom (Bellco) pri 70 otáčkach za minútu v prostredí 10 % oxidu uhličitého. Kontrolné myšie kože, pri ktorých sa nevykonáva kryokonzervácia, sa uchováva v živnom médiu pri teplote 4°C počas trvania kryokonzervácie a rozmrazovania (2 dni) pred transplantáciou kože.

Po perfúzii myšej kože sa Petriho misky obsahujúce kožu, nosiče TRANSWELL a mimobunkové mraziace médium umiestni do programovateľnej mrazničky (Planer) s počiatočnou teplotou 20,0 ’C. Myšia koža sa potom chladí rýchlosťou -10,0 °C/min. na teplotu -6,0 °C. Teplota sa udržiava na tejto hodnote počas 20 minút na vyrovnanie teploty tkaniva na teplotu komory. Po uplynutí týchto 20 minút sa iniciuje vytváranie mimobunkového ľadu tak, že sa z vonkajšej strany misiek priloží sonda chladená kvapalným dusíkom. Miesto priloženia musí byť pod hladinou mraziaceho média. Potom, čo sa vo všetkých vzorkách myšej kože vytvoria jadrá kryštálov ľadu, sa teplota udržiava počas ďalších 5 minút na hodnote -6,0 °C. Komora sa potom chladí rýchlosťou -1,0 °C/min. na teplotu -8,0 °C. Teplota sa opäť udržiava počas 30 minút na hodnote -8,0 ’C na umožnenie rovnomerného rozmiestnenia ľadu vo vzorke. Vzorky sa potom chladia rýchlosťou -0,1 ° C/min. na konečnú teplotu -70,0 °C.

Kryokonzervovaná myšia koža sa vyberie z mrazničky a z misky sa odstráni veko. Po rozmrazení sa do každej Petriho misky aseptický naleje 40 ml Dulbeccovho modifikovaného Eaglovho média (DMEM) zohriateho na teplotu 37° C. Po 45 minútach sa z misiek odstráni všetka kvapalina a do každej misky sa pridá ďalších 40 ml média na 2 minúty. Po roztopení všetkého ľadu sa myšia koža premýva v miskách počas 30 minút 25 ml média DMEM. Médium sa vymení a vzorka sa znovu premýva počas 30 minút.

Rozmrazené kryokonzervované a kontrolné vzorky sa histologický vyhodnotia alebo sa transplantujú myšiam. Porovnanie fotomikrografu myšej kože, ktorá nebola kryokonzervovaná, a kryokonzervovanej myšej kože svedčia o tom, že štyri základné vrstvy myšej kože, čo je dermis s fibroblastmi, bazálna vrstva epidermis, suprabazálna vrstva epidermis a zrohovatelá vrstva epidermis, sa uvedeným spôsobom konzervujú. Všetky vrstvy kože sú neporušené a morfológia kryokonzervovanej myšej kože je rovnaká ako morfológia myšej kože, ktorá nebola kryokonzervovaná.

Príklad 7

Kryokonzervácia kože ATS SKIN2

SKIN2, model ZK 1300 (Advanced Tissue Sciences, La Jolla, Kalifornia, USA) sa vyberie po doručení z balíčka podľa priloženého návodu a umiestni sa do kultivačných misiek (Costar). Inzerty nosiča TRANSWELL sa umiestnia nad SKIN2, aby sa kožný konštrukt udržoval ponorený. Perfúzia kože SKIN2 kryogénnym ochranným činidlom sa uskutočňuje ponorením počas 1 hodiny do 2M glycerolu v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) v kultivačnej miske. Počas perfúzie sa kultivačné misky obsahujúce konštrukt a nosič trepú počas jednej hodiny na miešačke s kruhovým pohybom (Bellco) pri 70 otáčkach za minútu v prostredí 10 % oxidu uhličitého.

Po perfúzii kože SKIN2 sa vzorky umiestnia do programovateľnej mrazničky (Planer) s počiatočnou teplotou 20,0 °C. SKIN2 sa potom chladí rýchlosťou -10,0 °C/min. na teplotu -6,0 °C a udržujú sa pri teplote -6,0 °C počas 20 minút na vyrovnanie teploty tkaniva na teplotu komory. Po uplynutí týchto 20 minút sa iniciuje vytváranie mimobunkového ľadu tak, že sa z vonkajšej strany misiek priloží pod hladinou mraziaceho média sonda chladená kvapalným dusíkom. Potom, čo sa vo všetkých vzorkách SKIN2 vytvoria jadrá kryštálov ľadu, sa teplota udržiava počas 5 minút na hodnote -6,0 °C. Komora sa potom chladí rýchlosťou -1,0 °C/min. na teplote -8,0 ’C. Teplota sa potom udržiava počas 30 minút na hodnote -8,0 °C, aby sa umožnilo rovnomerné rozmiestnenie ľadu vo vzorke. SKIN2 sa potom chladí rýchlosťou -0,1 ⁰ C/min. na konečnú teplotu -70,0 C

Kryokonzervovaná SKIN2 sa vyberie z mrazničky, z misiek sa odstránia veká a do každej kultivačnej misky sa aseptický naleje Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM) zohriate na teplotu 37°C. Po 45 sekundách sa z misiek odstráni všetka kvapalina a do každej misky sa pridá DMEM na 2 minúty. Po rozmrazení sa SKIN2 a naviazaný nosič prenesú s použitím sterilných lekárskych klieští do nových kultivačných misiek. Na vymytie kryogénneho ochranného činidla zo SK.IN2 sa do každej kultivačnej misky obsahujúcej SKIN2 pridá na 30 minút DMEM. Médium sa vymení a vzorka sa opäť premýva počas 30 minút. SKIN2 sa potom prenesie späť do rovnakého typu kultivačných misiek a inkubujú sa v médiu na uchovávanie kultúr pri teplote 37 °C v prostredí 10 % oxidu uhličitého počas 24 hodín pred analýzou. Inkubačná doba je opäť dlhá ako interval, ktorý typicky potrebujú zmrznuté bunky na spätné ustanovenie podmienok stabilného stavu.

Kryokonzervované a kontrolné konštrukty sa podrobia MTT-testu postupom pripojeným k produktu SKIN2 model ZK 1300 a vyhodnotia sa takisto histologický. Porovnanie fotomikrografov SKIN2, ktorá nebola kryokonzervovaná, a kryokonzervovanej SKIN2, svedčí o tom, že 4 základné vrstvy SKIN2, čo je kolagénová sieť s fibroblastmi, bazálna vrstva epidermis, suprabazálne vrstvy epidermis a zrohovatelá vrstva epidermis, sa uvedeným spôsobom konzervujú. Všetky vrstvy sú neporušené a celková morfológia kryokonzervovanej SKIN2 je podobná ako morfológia SKIN2, ktorá nebola kryokonzervovaná.

Príklad 8

Test metabolickej mitochondriálnej aktivity (MTT-test)

Zmrazený a nezmrazený (kontrola) živý ekvivalent kože (LSE), epidermálna vrstva, dermálne ekvivalenty a ekvivalenty rohovky sa testujú MTT-testom. (Konštrukty SKIN2 sa testujú podľa protokolu, ktorý sa prikladá k výrobku: „MTT Assay Protocol for use with Model ZK 1300“). Životaschopnosť buniek konštruktov sa meria MTT-testom, čo je kolorimetrický test konverzie MTT (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazolium-bromidu), ktorý sa vyvinul na meranie bunkového rastu a životaschopnosti. Tento rast detailne opisujú Gay a kol., v práci „The Living Skin Equivalent as a Model In Vitro for Ranking the Toxic Potential of Dermal Irritants“ Toxic. In Vitro, 6:303-315 (1992). Metabolická redukcia rozpustenej tetrazóliovej soli na vyzrážaný modrý formazan závisí od prítomnosti mitochondriálnych funkcií. Tento test sa používa na kvantifikáciu cytotoxicity pri rôznych typoch buniek vrátane kultivovaných ľudských keratinocytov.

Do kultivačných misiek obsahujúcich živý ekvivalent kože (LSE), epidermálnu vrstvu alebo dermálny ekvivalent sa pridá 40 ml testovacieho média a do jamiek obsahujúceho ekvivalenty rohovky sa pridá 1,5 ml testovacieho média, ktoré obsahuje 0,33 mg/ml MTT (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazólium-bromid, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Tkanivové ekvivalenty sa inkubujú v tomto médiu počas 3 až 4 hodín. Na konci doby konzervácie sa vykoná biopsia tkanivového ekvivalentu s použitím 8 mm hrubej ihly určenej na biopsiu kože. Bioptické vzorky sa potom extrahujú počas 2 až 3 hodín pri teplote miestnosti v 0,3 ml izopropanolu okysleného 0,04 N kyselinou chlorovodíkovou. Na konci extrakcie sa 0,2 ml každého extraktu prenesie do jamky dosky s 96 jamkami. Zmeria sa absorbancia na prístroji na meranie absorbancie dosiek (Dynatech) pri vlnovej dĺžke 570 nm, pričom sa ako slepá vzorka používa izopropanolové extrakčné médium. Hodnoty MTT-testu získané pre rozmrazené kryokonzervované vzorky sa porovnajú so zodpovedajúcimi kontrolnými vzorkami a vyjadria sa ako percento kontroly - pozri pripojený obrázok, na ktorom je vyobrazený graf životaschopnosti kryokonzervovaných kultivovaných tkanív v porovnaní s kultivovanými tkanivami, ktoré neboli kryokonzervované. V grafe je znázornená životaschopnosť kry okonzervovaných kultivovaných tkanív meraná pomocou MTT-testu (test metabolickej mitochondriálnej aktivity). Živý ekvivalent kože (Living Skin Equivalent, LSE) bol ďalej meraný LDH-testom (test na dehydrogenázu laktózy). Všetky kultivované tkanivá sa porovnávajú s takisto starými kontrolami, ktoré neboli kryokonzervované a výsledky sa v grafe vynášajú na os y ako percento kontroly. Na osi x sú jednotlivé kultivované tkanivá. V stĺpci 1 sú výsledky pre štep kože pri meraní MTT-testom (n = 9), v stĺpci 2 sú výsledky pre štep kože pri meraní LDH-testom (n = 9), v stĺpci 3 sú výsledky pre kožu ATS pri meraní MTT-testom (n = 2), v stĺpci 4 sú výsledky pre dermálny ekvivalent pri meraní MTT-testom (n = 2), v stĺpci 5 sú výsledky pre epidermis pri meraní MTT-testom (n = 2) a v stĺpci 6 sú výsledky pre ekvivalent rohovky pri meraní MTT-testom (n = 2).

Príklad 9

Test na dehydrogenázu laktózy (LDH-test)

Dehydrogenáza laktózy (LDH) je enzým, ktorý sa bežne vyskytuje vnútri životaschopnej bunky. Poškodenie bunky spôsobuje uvoľnenie enzýmu a zodpovedajúce zníženie enzymatickej aktivity, ktorá sa deteguje týmto testom.

Z kontrolných a rozmrazených kryokonzervovaných vzoriek a kontrolných vzoriek živého ekvivalentu kože (LSE) sa odoberie ihlou s priemerom 8 mm bioptická vzorka. Z každej jednotky živého ekvivalentu kože (LSE) sa odoberú tri vzorky. Tieto vzorky sa umiestnia do 15 mm dlhých skúmaviek s 1 ml 0,1 M trietanolaminového pufra (chladia sa ľadom) a homogenizujú sa elektrickým tkanivovým homogenizérom počas 1 minúty. Vzorky sa potom centrifugujú pri 1 000 g a teplote 4 °C. Supematant sa potom podrobí testu. Reakčné činidlo pre LDH-test sa pripraví zmiešaním 3,00 ml fosfátového pufra (0,1 mol/1, pH 7,0), 0,1 ml sodnej soli pyruvátu (2,5 mg/ml) a 0,05 ml sodnej soli NADH (10 mg/ml). 100 μΐ vzorky sa pridá ku 900 μΐ uvedeného činidla a nechá sa reagovať počas 2 minút. V priebehu týchto 2 minút sa zaznamenávajú zmeny v absorbancii. Priemerná hodnota vypočítaná z troch vzoriek z každej kryokonzervovanej jednotke živého ekvivalentu kože (LSE) sa porovná s nezmrazenými kontrolami. Hodnoty získané pre dané vzorky sa porovnajú zo zodpovedajúcimi kontrolnými hodnotami a vyjadria sa ako percento kontroly (pozri pripojený obrázok).

Príklad 10

Bioekvivalencia kryokonzervovaného živého ekvivalentu kože (LSE) a živého ekvivalentu kože (LSE), ktorý nebol kryokonzervovaný

Na preukázanie bioekvivalencie kryokonzervovaného živého ekvivlentu kože (LSE) a LSE, ktorý nebol kryokonzervovaný sa vykoná transplantačný test na athymických myšiach.

Živé ekvivalenty kože (LSE) kryokonzervované spôsobom uvedeným v príklade 1 sa rozmrazia jeden deň pred transplantáciou a udržujú sa v médiu na uchovanie tkaniva počas 24 hodín.

Vykonajú sa 4 pokusy, v ktorých sa celkom 66 athymickým myšiam kmeňa B6CB6YFl/J-nu (Jakson Harbor Labs) transplantuje buď kryokonzervovaný živý ekvivalent kože (LSE) (celkom 43 myšiam) alebo živý ekvivalent kože, ktorý nebol kryokonzervovaný (kontrola) (celkom 23 myšiam). Zvieratá sa anestetizujú Nembutalom. Z chrbta každej myši sa vyreže kus kože s plnou hrúbkou s veľkosťou 2 x 2 cm tak, aby sa nepoškodil panicculus camosus. Štepy živého ekvivalentu kože, či ide o kontrolu alebo o kryokonzervované tkanivo, sa umiestnia na ranu a upravia sa, aby pasovali. Všetky štepy sa prekryjú jednou vrstvou vazelínou impregnovanej gázy a na ňu sa priložia dve vrstvy adhezívneho obväzu. Gáza a obväz sa odstránia 7 dní po transplantácii.

Štrnásť dní po transplantácii sa všetky zvieratá usmrtia a vyfotografujú. Miesto obsahujúce transplantát sa potom vyreže na histologickú analýzu a hodnotenie. Fotografie a mikrografy neukazujú žiadne rozdiely v prichytení štepov medzi kontrolným a kryokonzervovaným živým ekvivalentom kože. Medzi kontrolnými a kryokonzervovanými štepmi nie sú pozorované žiadne podstatné rozdiely v rýchlosti kontrakcie rany.

Príklad 11

Syngénna transplantácia kože kryokonzervovanej a kontrolnej myšej kože

Na preukázanie bioekvivalencie kryokonzervovanej myšej kože a myšej kože, ktorá nebola kryokonzervovaná, sa vykoná štúdia syngénnej transplantácie kože.

Myši divokého typu kmeňa B6CB6YF1 sa usmrtia predávkovaním Nembutalom. Aseptický sa odoberie koža. Pri príprave kože na transplantáciu sa z dermu odstránia krvné cievy, tuk a spojivové tkanivo. Myšia koža sa kryokonzervuje a rozmrazí spôsobom opísaným v príklade 7. Kontrolná myšia koža, ktorá nebola kryokonzervovaná, sa pred transplantáciou udržiava v živnom médiu pri teplote 4°C počas celého priebehu kryokonzervácie a rozmrazovania, teda celkom počas 2 dní.

Pri šiestich myšiach rovnakého kmeňa sa vykoná transplantácia kožných štepov, pričom dvom myšiam sa transplantuje kontrolná nezmrazená myšia koža a štyrom sa transplantuje rozmrazená kryokonzervovaná myšia koža. Myši sa anestetizujú Nembutalom. Z chrbta každej myši sa vyreže kus kože s plnou hrúbkou s veľkosťou 2 x 2 cm tak, aby sa nepoškodil panicculus camosus. Štepy myšej kože, či ide o kontrolu alebo o kryokonzervované tkanivo, sa umiestnia na ranu a upravia sa, aby pasovali. Všetky štepy sa prekryjú jednou vrstvou vazelínou impregnovanej gázy a na ňu sa priložia dve vrstvy adhezívneho obväzu. Gáza a obväz sa odstránia 7 dní po transplantácii.

Tridsať dní po transplantácii sa všetky zvieratá usmrtia a vyfotografujú sa. Miesto obsahujúce transplantát sa potom vyreže na histologickú analýzu a hodnotenie. Fotografie a mikrografy neukazujú žiadne rozdiely v prichytení štepov medzi kontrolnou a rozmrazenou kryokonzervovanou myšou kožou. Medzi kontrolnými a kryokonzervovanými štepmi nie sú pozorované žiadne rozdiely v rýchlosti kontrakcie rany.

Hoci bol vynález podrobne opísaný na ilustráciu a ako príklad kvôli jasnejšiemu pochopeniu vynálezu, odborníkovi je jasné, že v rámci patentových nárokov možno vykonať určité zmeny a modifikácie.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob kryokonzervácie získaného tkaniva cicavcov alebo kultivovaného tkanivového ekvivalentu, vyznačujúci sa tým, že sa:

a) uvedené tkanivo ponorí do roztoku kryogénneho ochranného činidla a uvedený roztok kryogénneho ochranného činidla a uvedené ponorené tkanivo sa mieša na dosiahnutie účinného prieniku roztoku kryogénneho ochranného činidla do uvedeného tkaniva a na dosiahnutie perfúzie tkaniva,

b) v uvedenom roztoku kryogénneho ochranného činidla a v uvedenom perfundovanom tkanive sa vytvoria jadrá mimobunkového ľadu,

c) uvedené perfundované tkanivo zo stupňa b) sa chladí do kryokonzervovaného stavu mrazením uvedeného tkaniva nízkou mraziacou rýchlosťou na teplotu najmenej asi -70 ⁰ C alebo nižšiu na získanie kryokonzervovaného tkaniva, a

d) uvedené kryokonzervované tkanivo sa uchováva pri teplote najmenej asi -70 ”C alebo nižšej.
2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že sa ponorenie uvedené v stupni a) uskutočňuje pri počiatočnej teplote asi 20 °C a potom počas perfúzie sa uskutočňuje chladenie rýchlosťou asi -10 °C/min. na teplotu asi -6 °C.
3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa mrazenie v stupni c) vykonáva rýchlosťou -1 °C/min na teplotu asi -8 °C a táto teplota sa udržiava počas doby, ktorá postačuje na umožnenie vytvorenia fyzikálnej a biologickej rovnováhy medzi uvedeným roztokom kryogénneho ochranného činidla a uvedeným tkanivom.
4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa v stupni c) teplota udržiava konštantná počas doby dostatočnej na umožnenie vytvorenia fyzikálnej a biologickej rovnováhy medzi uvedeným roztokom kryogénneho ochranného činidla a uvedeným tkanivom.
5. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa t ý m , že sa v chladení pokračuje rýchlosťou asi -0,3 °C až -0,02 °C za minútu na teplotu asi -70 °C alebo nižšiu.
6. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že sa ako uvedené získané tkanivo cicavcov použije získaná koža cicavcov.
7. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že sa ako uvedený kultivovaný tkanivový ekvivalent použije ekvivalent vybraný zo skupiny zahrnujúcej epidermálny ekvivalent, kultivovaný dermálny ekvivalent a kultivovaný ekvivalent rohovky.
8. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že sa ako teplota uvedeného kryokonzervovaného stavu použije teplota v rozsahu -120 °C alebo menej až -196 °C alebo menej.
9. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že sa ako uvedený roztok kryogénneho ochranného činidla použije 1,5 M až 2,5 M glycerol v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM).
10. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa uvedené vitrifikované tkanivo ďalej rozmrazí, pričom sa uvedené tkanivo rozmrazí počas asi jednej až asi dvoch minút.