PL181762B1 - Method of and design of a package for effecting cryogenic preservation and storage of artificially grown human tissue equivalents - Google Patents
Method of and design of a package for effecting cryogenic preservation and storage of artificially grown human tissue equivalentsInfo
- Publication number
- PL181762B1 PL181762B1 PL96321089A PL32108996A PL181762B1 PL 181762 B1 PL181762 B1 PL 181762B1 PL 96321089 A PL96321089 A PL 96321089A PL 32108996 A PL32108996 A PL 32108996A PL 181762 B1 PL181762 B1 PL 181762B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- tissue
- cryoprotectant
- temperature
- skin
- solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 119
- 238000003860 storage Methods 0.000 title claims description 13
- 238000004321 preservation Methods 0.000 title abstract description 16
- 238000013461 design Methods 0.000 title description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 99
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 72
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 33
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 31
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 26
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 17
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 13
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 10
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- -1 IDMEM Substances 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 claims description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 5
- 229940027278 hetastarch Drugs 0.000 claims description 3
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims description 3
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 2
- KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N chondroitin sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)O1 KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N 0.000 claims description 2
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 claims description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims 1
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 151
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 96
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 29
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 21
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 21
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 14
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 12
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 10
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 9
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 8
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 7
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 7
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 7
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 7
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 6
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 6
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 6
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 5
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 5
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000006910 ice nucleation Effects 0.000 description 4
- 229940105631 nembutal Drugs 0.000 description 4
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 4
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 4
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 3
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010062575 Muscle contracture Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 208000006111 contracture Diseases 0.000 description 2
- 210000000399 corneal endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 2
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000011012 sanitization Methods 0.000 description 2
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000003871 white petrolatum Substances 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010056340 Diabetic ulcer Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010015946 Eye irritation Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000001034 Frostbite Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 description 1
- 206010040880 Skin irritation Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000000558 Varicose Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005280 amorphization Methods 0.000 description 1
- 238000002266 amputation Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000007688 edging Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000000871 endothelium corneal Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 231100000013 eye irritation Toxicity 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000008458 response to injury Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000036556 skin irritation Effects 0.000 description 1
- 231100000475 skin irritation Toxicity 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004781 supercooling Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012815 thermoplastic material Substances 0.000 description 1
- 231100000721 toxic potential Toxicity 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0236—Mechanical aspects
- A01N1/0263—Non-refrigerated containers specially adapted for transporting or storing living parts whilst preserving, e.g. cool boxes, blood bags or "straws" for cryopreservation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0278—Physical preservation processes
- A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B65—CONVEYING; PACKING; STORING; HANDLING THIN OR FILAMENTARY MATERIAL
- B65D—CONTAINERS FOR STORAGE OR TRANSPORT OF ARTICLES OR MATERIALS, e.g. BAGS, BARRELS, BOTTLES, BOXES, CANS, CARTONS, CRATES, DRUMS, JARS, TANKS, HOPPERS, FORWARDING CONTAINERS; ACCESSORIES, CLOSURES, OR FITTINGS THEREFOR; PACKAGING ELEMENTS; PACKAGES
- B65D55/00—Accessories for container closures not otherwise provided for
- B65D55/02—Locking devices; Means for discouraging or indicating unauthorised opening or removal of closure
- B65D55/06—Deformable or tearable wires, strings, or strips; Use of seals, e.g. destructible locking pins
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B65—CONVEYING; PACKING; STORING; HANDLING THIN OR FILAMENTARY MATERIAL
- B65D—CONTAINERS FOR STORAGE OR TRANSPORT OF ARTICLES OR MATERIALS, e.g. BAGS, BARRELS, BOTTLES, BOXES, CANS, CARTONS, CRATES, DRUMS, JARS, TANKS, HOPPERS, FORWARDING CONTAINERS; ACCESSORIES, CLOSURES, OR FITTINGS THEREFOR; PACKAGING ELEMENTS; PACKAGES
- B65D77/00—Packages formed by enclosing articles or materials in preformed containers, e.g. boxes, cartons, sacks or bags
- B65D77/04—Articles or materials enclosed in two or more containers disposed one within another
- B65D77/048—Articles or materials enclosed in two or more containers disposed one within another the inner and outer containers being rigid and the outer container being of curved cross-section, e.g. cylindrical
- B65D77/0486—Articles or materials enclosed in two or more containers disposed one within another the inner and outer containers being rigid and the outer container being of curved cross-section, e.g. cylindrical the inner container being coaxially disposed within the outer container
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B65—CONVEYING; PACKING; STORING; HANDLING THIN OR FILAMENTARY MATERIAL
- B65D—CONTAINERS FOR STORAGE OR TRANSPORT OF ARTICLES OR MATERIALS, e.g. BAGS, BARRELS, BOTTLES, BOXES, CANS, CARTONS, CRATES, DRUMS, JARS, TANKS, HOPPERS, FORWARDING CONTAINERS; ACCESSORIES, CLOSURES, OR FITTINGS THEREFOR; PACKAGING ELEMENTS; PACKAGES
- B65D85/00—Containers, packaging elements or packages, specially adapted for particular articles or materials
- B65D85/50—Containers, packaging elements or packages, specially adapted for particular articles or materials for living organisms, articles or materials sensitive to changes of environment or atmospheric conditions, e.g. land animals, birds, fish, water plants, non-aquatic plants, flower bulbs, cut flowers or foliage
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Hematology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Packages (AREA)
- Packging For Living Organisms, Food Or Medicinal Products That Are Sensitive To Environmental Conditiond (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
Abstract
1 Sposób konserwacji kriogenicznej zebranej skóry ssaka, ho- dowanej skóry lub równowaznika rogówki, polegajacy na zanurza- n i u tkanki w roztworze konserwantu kriogenicznego oraz pobudzaniu roztworu konserwantu kriogenicznego i zanurzonej tkanki, zaszczepianiu lodu pozakomórkowego w roztworze konser- wantu kriogenicznego i w perfundowanej tkance, a nastepnie chlod- zeniu perfundowanej tkanki do stanu zakonserwowanego kriogenicznie i przechowywaniu tkanki konserwowanej kriogeni- cznie w temperaturze co najwyzej -70°C, znamienny tym, ze roz- twór konserwantu kriogenicznego i tkanki chlodzi sie z predkoscia co najwyzej -0,3°C na minute 33 Urzadzenie do konserwacji kriogenicznej zebranej skóry ssaka, hodowanej skóry lub równowaznika rogówki, znamienne tym, ze zawiera miske (40), majaca kolnierz (43) oraz powierzchnie denna(41) przechodzaca w scianke boczna(42), przy czym scianka boczna (42) ma podpory (44), odchodzace od scianki i skierowane do wewnatrz miski, przy czym te podpory sa integralne ze scianka boczna (42), oraz zawiera nosnik (30), majacy plaska przepusz- czalna membrane (32), przymocowana do jednego z konców ruro- wej podpory (33), oraz majacy obrzeze (31) na przeciwleglym koncu rurowej podpory (33), przy czym to obrzeze (31) jest wsparte przez skierowane do wewnatrz miski podpory (44), ponadto zawiera pokrywe (10), majaca kolnierz (11) oraz plaska powierzchnie denna (13) przechodzaca w scianke boczna (12), przy czym kolnierz (11) scisle przylega do kolnierza (43) miski (40), oraz zawiera uszczelke (20) pomiedzy miska (40) a pokrywa (10) FIG.6A PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób konserwacji kriogenicznej zebranej skóry ssaka, hodowanej skóry lub równoważnika rogówki oraz urządzenie do konserwacji kriogenicznej zebranej skóry ssaka, hodowanej skóry lub równoważnika rogówki, zapewniające maksymalną żywotność tkanek konserwowanych kriogeniczne.
Przez zastosowanie technologii konserwacji kriogenicznej zebrana tkanka, albo hodowana tkanka, może być przechowywana przez nieskończenie długi czas przed wykorzystaniem. Tkanka hodowana jest modelem in vitro równoważnej tkanki ludzkiej, która po wyprowadzeniu ze stanu przechowywania może być wykorzystana do transplantacji lub inplantacji in vivo lub do przesiewowych badań związków in vitro.
Dzięki technolog! in vitro zostały wytworzone równoważniki tkanek, stosowane w badaniach in vitro oraz do przeszczepiania in vivo, przy leczeniu zranień. Sposoby wytwarzania takich równoważników tkanek ujawniono w opisach US 4485096,4604346,4835102 i 5374515 oraz w zgłoszeniach US nr 08/193809 i 08/337830.
Zdolność żywych tkanek do przechowywania jest ograniczona, a ponadto czas, w którym tkanki mogą być wykorzystane, jest krótki, co powoduje znaczne straty. Istnieje zatem zapotrzebowanie na konserwowanie żywych tkanek przez dłuższy czas, wystarczający, przykładowo, do ich przewożenia i składania aż do momentu wykorzystania tkanek, tak aby możliwe było utrzymywanie zapasu tkanek. W szczególności, pożądane jest utrzymywanie zapasu tkanek w szpitalach (np. w ośrodkach leczenia poparzeń), przechowywanie próbek z różnych etapów cyklu wytwarzania tkanek (celem kontrolowania ich jakości) oraz wytwarzanie większych partii produkcyjnych.
Znane sposoby konserwacji komórkowych materiałów biologicznych polegają na chłodzeniu do bardzo niskich temperatur. Przejście ze stanu ciekłego do stanu stałego przez obniżenie temperatury układu może przebiegać albo jako krystalizacja (lód), związana z uporządkowanym układem cząsteczek wody, albo jako zeszklenie lub amorfizacja (tworzenie szkła) w braku takiego uporządkowania fazy krystalicznej. Dla kriobiologa korzystne jest doprowadzenie komórek do bardzo niskich temperatur i następnie przywrócenie ich do warunków fizjologicznych bez szkody dla nich.
Istnieją dwa podstawowe podejścia do kriogenicznej konserwacji komórek i tkanek: zamrażanie-odmrażanie i zeszklenie. W technice zamrażania-odmrażania zamrażany jest roztwór pozakomórkowy (to znaczy do postaci krystalicznej), ale podejmowane są kroki w celu zmniejszenia powstawania lodu wewnątrz komórek. W procedurach witryfikacyjnych usiłuje się uniemożliwić powstawanie lodu w całej próbce. Pierwsze podejście jest problematyczne, bo jeżeli wewnątrz komórek powstaną kryształki lodu, są one szkodliwe dla żywotności komórki po odmrożeniu. Jednakże komórki mogą przeżyć cykl zamrażania-odmrażania, jeżeli są chłodzone z kontrolowaną prędkością w obecności nietoksycznych ilości środków osłaniających przed powstawaniem lodu. Podejście witryfikacyjne próbuje uniknąć potencjalnych uszkadzających wpływów lodu wewnątrzkomórkowego i pozakomórkowego przez stłumienie powstawania lodu przy użyciu bardzo dużych stężeń substancji rozpuszczonych i/lub polimerów. Jednakże uszkodzenie komórki może nastąpić na skutek długotrwałego działania toksycznych ilości tych dodatków potrzebnych do witryfikacji.
Konserwanty kriogeniczne zabezpieczają żywe komórki przed naprężeniami powodowanymi przez proces zamarzania. Jedna droga ochrony komórek przez te środki zabezpieczające
181 762 przed powstawaniem lodu polega na rozcieńczaniu soli, która staje się coraz bardziej stężona w mezamrożonym roztworze, gdy woda przechodzi w lód. Ilość lodu jest wyznaczana przez temperaturę i początkowy skład roztworu, natomiast ilość frakcji niezamarzniętej jest funkcjątemperatury. Konserwanty kriogeniczne mają kilka innych zadań. Jednym ważnym zadaniem jest to, że zmniejszają one zwykle temperatury powstawania lodu wewnątrzkomórkowego. Inne zadanie polega na tym, że stabilizują one membrany i proteiny.
Wszystkie roztwory stają się przechłodzone poniżej swej temperatury zamarzania aż do znalezienia przypadkowego miejsca nukleacji dla powstania kryształu. Przy konserwacji kriogenicznej sposobem zamrażania-odmrażania powstawanie lodu w medium pozakomórkowym powinno być umyślnie inicjowane przez zaszczepianie przy niskich stopniach przechłodzenia. Jeżeli powstawanie lodu nie zostanie zapoczątkowane przez zaszczepienie, lód będzie powstawać spontanicznie, kiedy roztwór zostanie ochłodzony wystarczająco poniżej swej temperatury równowagi przy zamarzaniu. Ponieważ proces ten ma naturę przypadkową, powstawanie lodu będzie odbywać się w przypadkowych, nieprzewidywalnych temperaturach. W konsekwencji współczynnik przetrwania będzie silnie zmienny pomiędzy powtarzanymi próbkami przy takim samym protokóle zamrażania. Ponadto skrajnie szybka krystalizacja, która następuje wtedy, gdy lód powstaje w silnie przechłodzonym roztworze, może spowodować uszkodzenie komórek i tkanek. Ponadto okazało się, że jeżeli pozakomórkowe powstawanie lodu zostanie zainicjowane przy wysokich stopniach przechłodzenia, prawdopodobieństwo powstawania lodu wewnątrzkomórkowego jest drastycznie zwiększone. Zjawisko to wynika z opóźnionego pojawienia się odwodnienia komórki na skutek zamarzania, co w wyniku powoduje zwiększoną retencję wody wewnątrzkomórkowej, a zatem większe prawdopodobieństwo powstania lodu w komórce.
Po zaszczepieniu lodu pozakomórkowego i otoczeniu próbki przez fazę lodu konieczne jest schłodzenie próbki do stanu zakonserwowanego kriogenicznie. Ten etap chłodzenia jest jednym z najważniejszych etapów w protokole zamrażania - odmrażania. Na skutek powstawania lodu, tzn. czystej wody, częściowo zamrożony roztwór pozakomórkowy jest bardziej stężony niż wewnątrz komórki. W konsekwencji komórka będzie się odwadniać tracąc wodę w usiłowaniu przywrócenia równowagi termodynamicznej. W miarę chłodzenia układu powstaje coraz więcej lodu pozakomórkowego i stężenie roztworów wzrasta, zmuszając komórki do dalszego odwadniania się. Są trzy cechy charakterystyczne komórek, które sterują ich prędkością odwadniania. Jednąjest przenikalność błony komórkowej dla wody. Im mniejsza jest przenikalność dla wody, tym dłuższego czasu potrzeba na odwodnienie komórek. Drugim czynnikiem jest zależność przenikalności wody przez błonę komórkową od temperatury. We wszystkich komórkach przenikalność wody maleje wraz ze spadkiem temperatury. Ostatnim czynnikiem jest wielkość komórki. Większe komórki potrzebują dłuższego czasu na odwodnienie niż mniejsze komórki. Zakładając, że każdy typ komórki może mieć właściwości drastycznie różniące się, optymalne warunki konserwacji kriogenicznej mogąróżnić się o rzędy wielkości w przypadku różnych typów komórek.
Chociaż dokładne mechanizmy uszkodzenia komórek podczas konserwacji kriogenicznej me zostały jeszcze całkowicie wyjaśnione, charakterystyczne oznaki przeżycia powstające przy mierzeniu przeżywania komórek w funkcji prędkości chłodzenia wydają się być jakościowo podobne dla wszystkich typów komórek i przedstawiają krzywą w kształcie odwróconej litery U. Przeżywalność komórekjest mała przy bardzo małych i bardzo dużych prędkościach chłodzenia, a optymalną przeżywalność zapewnia średnia prędkość chłodzenia. Chociaż optymalna prędkość chłodzenia i szerokość krzywej może być drastycznie różna dla różnego typu komórek, jakościowe zachowanie się wydaje się być uniwersalne. Większe prędkości chłodzenia nie dają komórkom czasu wystarczającego na odwodnienie się i komórki wytwarzają lód wewnątrz siebie. Uszkodzenie komórek przy dużych prędkościach chłodzenia przypisywane jest powstawaniu lodu wewnątrzkomórkowego. Przy małych prędkościach chłodzenia uszkodzenie komórek następuje, jak się sądzi, na skutek działania silnie stężonych wewnątrzkomórkowych i pozakomórkowych roztworów soli i konserwantu kriogenicznego albo na skutek oddziaływań mechanicznych pomiędzy komórkami a lodem pozakomórkowym.
181 762
Konieczne jest możliwie silne odwodnienie komórek zanim przekroczą one krzywą zarodkowania lodu wewnątrzkomórkowego. Właśnie w tym punkcie praktycznie cała woda pozostała w komórce będzie zarodkowana i będzie tworzyć lód. Nie jest praktyczne określanie dokładnej temperatury, przy której to nastąpi, ale w przybliżeniu w zakresie od 40°C do -50°C komórki powoli zamarzają przy stężeniach konserwantów kriogenicznych wynoszących IM do 2M. Warto zauważyć, że ilość wody, która przemienia się w lód wewnątrz komórki w tym punkcie, może być nieszkodliwa przy zamrażaniu, ale jeżeli odmrożenie nie będzie wystarczająco szybkie, wówczas woda ta rozszerzy się i zabije komórkę przy odmrażaniu. (The Biophysics of Organ Cryopreservation, s. 117-140, wydane przez David E. Pegg i Armand M, Karów, jr, NATO ASI Senes A: Life Sciences, wol. 147,1987Plenum Press,New York233 Spring St., New York, NY 10013).
Przed opracowaniem przemysłowo żywotnego równoważnika skróty do przeszczepów stosowano skóry ze zwłok. Protokóły konserwacji kriogenicznej opracowano tak, aby ośrodki leczenia poparzeń i szpitale mogły utrzymywać banki skóry. Opracowano kilka różnych protokółów z wykorzystaniem różnych konserwantów kriogenicznych, prędkości zamrażania, formatów pakowania i warunków składowania. Większość badaczy wyraziła zgodę na protokół szybkiego zamrażania. Powodzenie lub brak powodzenia protokółu mierzono albo przez przeszczep wzięty na ranę lub przez badanie żywotności komórek.
W patencie USA nr 3.842.831 (Beisang) opisano sposób konserwacji kriogenicznej łat skórnych ze zwłok. Sposób ten polega na dołączaniu skóry ze zwłok do luźno tkanego płótna lub podłoża, po czym razem te łaty skórne i płótno są zwijane przed zamrożeniem. Nie stosuje się żadnego konserwantu kriogenicznego, chociaż wynalazcy sugerujązastosowanie albo gliceryny, albo DMSO. Protokół zamrażania wykorzystuje dużą niekontrolowaną prędkość zamrażania (stała temperatura) do temperatury kriogenicznej -70°C.
May SR i FA DeClement (Skin Banking Methodology, 17, 33-45 (1980)) przeprowadzili ocenę geometrii pakowania i prędkości chłodzenia oraz ogrzewania przy użyciu dermatomicznej skóry ze zwłok. Wyniki sugerowały, że skóra ze zwłok powinna być raczej płaska niż zwinięta, i że należy stosować mniejszą prędkość kontrolowanego zamrażania.
Patent USA 5.040.677 (Tubo) opisuje gazoszczelny pojemnik na oddzielne przeszczepy arkuszy komórek nabłonkowych. Pojemnik ten wymaga, aby arkusz komórek nabłonkowych był przymocowany do klejącego arkusza podłoża za pomocą zacisków.
Patent USA 5.145.770 (Tubo) opisuje sposób konserwacji kriogenicznej arkuszy keratynocytów, wykorzystujący konserwant kriogeniczny z czynnika nie przenikającego do komórek, takiego jak dekstran i z reagentu przenikającego do komórek, takiego jak gliceryna, z prędkością chłodzenia około -1 °C/min. Podobnie EP 0 364 306 (Chao i in), opisuje sposób konserwacji kriogenicznej arkusza żywych hodowanych komórek nabłonkowych przy wykorzystaniu zarówno DMSO jak i gliceryny w charakterze konserwantu kriogenicznego i z użyciem protokółu zamrażania korzystnie -l°Ć/min.
Patent USA nr 4.298.417 (Cancedda i in) opisuje protokół konserwacji kriogenicznej opracowany dla konstrukcji jednowarstwowych, takich jak arkusze nabłonkowe przygotowane według patentów USA nr 4.016.036,4.304.866 i 4.456.687. Arkusze naskórkowe były inkubowane z konserwantem kriogenicznym złożonym albo z 8-15% gliceryny, albo z DMSO i były konserwowane kriogenicznie przy zastosowaniu protokółu z kontrolowaną prędkością, gdzie prędkość chłodzenia jest mniejsza na początku niż przy końcu protokółu i charakteryzuje się wzrostem temperatury przed punktem kulminacyjnym procedury zamrażania.
Sposób kriogenicznej konserwacji fibroblastów skóry w żelu kolagenowym był badany przez Teasdale’a i in., Burns, 19 (5) 406-410 (1993). Teasdale opisuje, że optymalną żywotność komórek można uzyskać przez zamrażanie z prędkością -0,5°C/min z zastosowaniem w charakterze konserwantu kriogenicznego DMSO.
Nanchahal i in., „Cultured composite skin grafts: Biological skin equivalents permitting massive expansion”, The Lancet, 2 (8565), 191-193 (22 lipca 1989) omawia technikę przechowywania złożonych hodowanych przeszczepów tkanek z wykorzystaniem konserwantu kriogenicznego z 15% gliceryny i 10% FCS w medium 199. Przeszczepy i konserwant kriogeniczny
181 762 inkubowano przy temperaturze 37°C przez dwie godziny, a następnie zamrażano z prędkością -l°C/min do -70°C, po czym przechowywano w ciekłym azocie. Po szybkim odmrożeniu przeszczepów ich żywotność określano przez hodowanie przez 2 tygodnie i przeszczepienie myszom pozbawionym włosów. Końcową ocenę przeprowadzono przez przeszczepienie trzem pacjentom, którym usuwano tatuaż.
Publikacja „Cryopreservation of Rabbit and Cat Comeas at -18 to -24°C”, Johnstone i in., Comea, 11(3): 211-220 (1992) dotyczy prostej procedury konserwacji kriogenicznej rogówki królika i kota, zasadniczo za pomocądomowej zamrażarki. Perfuzję konserwantu kriogenicznego otrzymano przez umieszczenie rogówek w kolejnych roztworach 50% surowicy z płodów bydlęcych i medium McCarey-Kaufmana ze zwiększoną zawartością gliceryny i glukozy.
Za pomocą znanych sposobów nie jest możliwe konserwowanie kriogeniczne hodowanych równoważników tkanek, ponieważ są one stosunkowo grube i złożone z heterogenicznych warstw komórek. Jednym z zadań tych tkanek in vivo jest zapewnienie bariery tlenowej, a wiadomo, że zadania tkanek należy uwzględniać przy opracowywaniu sposobów konserwacji kriogenicznej tkanek.
Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie sposobu konserwacji kriogenicznej oraz urządzenia do konserwacji kriogenicznej i składowania, pozwalających na przedłużenie czasu wykorzystania tkanki.
W szczególności, celem wynalazku jest opracowanie sposobu do konserwacji kriogenicznej tkanek, pozwalającego na konserwację przy bardzo niskich temperaturach wielu hodowanych równoważników tkanek i skóry ssaków, tak aby zapobiec powstawaniu szkodliwych kryształów lodu wewnątrz komórek, zmniejszyć do minimum skuteczne stężenia potencjalnie szkodliwych związków chemicznych i umożliwić szybkie wprowadzanie i usuwanie konserwantów kriogenicznych, przy dopuszczalnych temperaturach, z wykorzystaniem programowanego sprzętu do zamrażania.
Celem wynalazku jest również opracowanie nowej konstrukcji urządzenia do konserwacji kriogenicznej, przechowywania i dystrybucji tkanek, nadającego się do konserwacji hodowanych równoważników tkanek, a ponadto umożliwiającego szybkie zmiany temperatury wewnątrz urządzenia, które są związane ze zmianą temperatury na zewnątrz komory zamrażania.
Według wynalazku sposób konserwacji kriogenicznej zebranej skóry ssaka, hodowanej skóry lub równoważnika rogówki, polegający na zanurzaniu tkanki w roztworze konserwantu kriogenicznego oraz pobudzaniu roztworu konserwantu kriogenicznego i zanurzonej tkanki, zaszczepianiu lodu pozakomórkowego w roztworze konserwantu kriogenicznego i w perfundowanej tkance, a następnie chłodzeniu perfundowanej tkanki do stanu zakonserwowanego kriogenicznie i przechowywaniu tkanki konserwowanej kriogenicznie w temperaturze co najwyżej -70°C, charakteryzuje się tym, że roztwór konserwantu kriogenicznego i tkanki chłodzi się z prędkością co najwyżej -0,3°C na minutę.
Korzystnie, zanurzanie tkanki w roztworze konserwantu kriogenicznego prowadzi się w środowisku gazowym, oraz inicjuje się zaszczepianie lodu pozakomórkowego przez kontakt z sondą chłodzoną ciekłym azotem.
Po zaszczepieniu lodu obniża się temperaturę z prędkością -1 °C na minutę do temperatury -8°C, przy czym obniżanie temperatury jest prowadzone przez czas wystarczający do umożliwienia uzyskania fizycznej i biologicznej równowagi roztworu konserwantu kriogenicznego w konserwowanej tkance, wcześniej ochłodzonej do stanu zakonserwowanego kriogenicznie.
Korzystnie, chłodzi się roztwór konserwantu kriogenicznego i tkanki, do stanu zakonserwowanego kriogenicznie, z prędkością co najwyżej -0,2°C na minutę, zwłaszcza co najwyżej -0,1 °C na minutę.
Temperatura stanu zakonserwowanego kriogenicznie wynosi co najwyżej -120°C, korzystnie co najwyżej -140°C, zwłaszcza co najwyżej -196°C.
Korzystnie, roztwór konserwantu kriogenicznego zawiera co najmniej jeden konserwant kriogeniczny wybrany z grupy składającej się z penetrującego komórkę konserwantu kriogenicznego i niepenetrującego komórki konserwantu kriogenicznego.
181 762
Niepenetrującym komórki konserwantem kriogenicznym jest kompleks węglowodanu o wysokim ciężarze cząsteczkowym, zawierający jeden lub więcej członów wybranych z grupy składającej się z siarczanu chondrotiny, poliwinylopirolidonu i glikolu polietylenowego. Jako niepenetrujący komórki konserwant kriogeniczny stosuje się zwłaszcza hetaskrobię, w szczególności hydroksyetyloskrobię. Penetrujący komórkę konserwant kriogeniczny jest wybrany z grupy zawierającej glicerynę, glikol propylenowy, glikol etylenowy i sulfotlenek dimetylowy. Jako środek penetrujący komórkę stosuje się korzystnie glicerynę.
Ponadto, konserwant kriogeniczny jest rozpuszczalny w środowisku wybranym z grupy zawierającej DMEM,IDMEM,MEM,M199,RPMI 1640,Ham’sF-12,Ham’sF-10,NCTC 109, NCTC 135, oraz wodny roztwór buforu fosforanowego.
Według wynalazku zanurza się tkankę w roztworze konserwantu kriogenicznego przy początkowej temperaturze 20°C, a następnie obniża się temperaturę do -6°C, przy czym obniżanie temperatury prowadzi się z prędkością -10°C na minutę.
Zaszczepianie lodu i zaszczepianie lodu pozakomórkowego w roztworze konserwantu prowadzi się korzystnie w temperaturze -6°C do -8°C.
Zakonserwowaną kriogenicznie tkankę korzystnie przechowuje się w temperaturze co najwyżej -70°C, zaś odmrażanie prowadzi się przez 1 do 3 minut.
Sposób konserwacji kriogenicznej zebranej skóry ssaka, hodowanej skóry lub równoważnika rogówki, polegający na zanurzaniu tkanki w roztworze konserwantu kriogenicznego oraz pobudzaniu roztworu konserwantu kriogenicznego i zanurzonej tkanki, zaszczepianiu lodu pozakomórkowego w roztworze konserwantu kriogenicznego i w perfundowanej tkance, a następnie chłodzeniu perfundowanej tkanki do stanu zakonserwowanego kriogenicznie i przechowywaniu tkanki konserwowanej kriogenicznie w temperaturze co najwyżej -70°C, według wynalazku charakteryzuje się również tym, że zaszczepia się lód pozakomórkowy w roztworze konserwantu kriogenicznego w temperaturze co najwyżej -6°C oraz chłodzi się roztwór konserwantu kriogenicznego i tkanki z prędkością co najwyżej -0,3 °C na minutę.
Korzystnie, zanurza się tkankę w roztworze konserwantu kriogenicznego przy początkowej temperaturze 20°C oraz obniża się temperaturę do -6°C, przy czym obniża się temperaturę z prędkością-10°C na minutę, zakonserwowanąkriogenicznie tkankę przechowuje się w temperaturze co najwyżej -70°C, zaś jej odmrażanie prowadzi się przez 1 do 3 minut.
W obydwóch sposobach według wynalazku hodowany równoważnik tkanki jest wybrany z grupy obejmującej hodowany równoważnik naskórka, hodowany równoważnik skóry, oraz hodowany równoważnik rogówki, a jako roztwór konserwantu kriogenicznego stosuje się 1,5 M - 2,5 M roztwór gliceryny w Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM).
Po zamrożeniu tkanka zakonserwowana kriogenicznie może być przechowywana przez nieskończenie długi czas w zakresie temperatur od -120°C do około -196°C, co jest temperaturą ciekłego azotu.
Odmrażanie tkanki zakonserwowanej kriogenicznie odbywa się przez ogrzanie zamrożonej tkanki z dużą prędkością co jest realizowane, zwłaszcza przez 1 -2-minuty. Zamrożona tkanka może być odmrażana przez bezpośrednie doprowadzenie ogrzanego medium hodowlanego lub przez buforowany roztwór fizjologiczny, albo innym sposobem szybkiego ogrzewania.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że sposób według wynalazku pozwala na konserwowanie zarówno tkanki zebranej jak i hodowanych równoważników tkanek, wytworzonych technikami in vitro, tak że tkanki te zachowują swą integralność strukturalną i żywotność komórek, co umożliwia ich wykorzystanie w charakterze równoważników tkanek ludzkich.
Według wynalazku urządzenie do konserwacji kriogenicznej zebranej tkanki ssaka lub hodowanego równoważnika tkanki, charakteryzuje się tym, że zawiera miskę, mającąkołnierz oraz powierzchnię denną przechodzącą w ściankę boczną przy czym ścianka boczna miski ma podpory, odchodzące od ścianki i skierowane do wewnątrz miski, przy czym te podpory są integralne ze ścianką boczną miski, oraz zawiera nośnik, mający płaską przepuszczalną membranę, przymocowaną do jednego z końców rurowej podpory, oraz mający obrzeże usytuowane na przeciwległym końcu tej rurowej podpory, przy czym to obrzeże jest wsparte przez wyżej wymienione
181 762 podpory i jest skierowane do wewnątrz miski podpory, ponadto zawiera pokrywę, mającą kołnierz i płaskąpowierzchnię denną przechodzącą w ściankę boczną, przy czym kołnierz pokrywy ściśle przylega do kołnierza miski, oraz zawiera uszczelkę pomiędzy miską a pokrywą.
Urządzenie według wynalazku, dzięki lepszemu współczynnikowi przenoszenia ciepła, umożliwia dokładniejsze kontrolowanie procesu konserwowania tkanek, co z kolei pozwala na równomierne chłodzenie i ogrzewanie hodowanego równoważnika tkanek, przez co zmniejsza się zmienność żywotności komórek.
Urządzenie według wynalazku pozwala również na odmrożenie tkanki poprzez zanurzenie urządzenia w kąpieli wodnej, ponieważ konstrukcja urządzenia umożliwia zarówno dużą prędkość grzania jak i kontrolowaną równomierność termicznąprzy równoczesnym zachowaniu sterylności podczas krytycznej procedury odmrażania.
Przed zastosowaniem w charakterze równoważnika tkanki ludzkiej, do przeszczepu lub do badań in vitro odmrożony hodowany równoważnik tkanki płucze się w celu usunięcia roztworu konserwantu kriogenicznego. Roztwór konserwantu kriogenicznego można usunąć przez płukanie, przykładowo, izotonicznym roztworem buforowym przy fizjologicznej wartości współczynnika pH. Hodowane równoważniki tkanek można następnie przechowywać tymczasowo w takim roztworze buforowym lub z powrotem hodować w odpowiednim medium hodowli komórek przez użyciem.
Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania jest odtworzony na rysunku, na którym fig. 1A przedstawia pokrywę (w widoku z góry), fig. IB przedstawia pokrywę (widok z boku), fig. 2 przedstawia uszczelkę (widok z góry), fig. 3A i fig. 3B przedstawiają uszczelkę zamontowanąna pokrywie (widok z góry i zboku), fig. 4A i fig. 4B przedstawiająnośnik (widok z góry i z boku), fig. 5 A i fig. 5B przedstawiająmiskę (widok z góry i z boku), fig. 6A przedstawia zespół, w rozłożeniu na części (widok z boku), fig. 6B przedstawia skompletowany zespół (widok z boku), fig. 7 przedstawia zamknięty zespół (widok z boku), fig. 8 przedstawia skompletowany zespół (widok z góry), zaś fig. 9 przedstawia wykres żywotności konserwowanych kriogenicznie tkanek hodowanych w porównaniu z tkankami hodowanymi nie konserwowanymi kriogenicznie.
Na wykresie pokazano żywotność hodowanych tkanek konserwowanych kriogenicznie zmierzoną według MTT. LSE mierzono dodatkowo przez badanie LDH. Wszystkie hodowane tkanki są porównane z dopasowanymi wiekowo próbkami kontrolnymi nie konserwowanymi kriogenicznie i są wyrażone w procentach wartości dla próbek kontrolnych.
Inżynieria tkanek jest powstającą dziedziną, która wykorzystuje wyhodowane komórki tkanek do budowania równoważników tkanek, które mogą być wykorzystywane do badania reakcji na uszkodzenie czynnikami chemicznymi lub związkami farmaceutycznymi. Tkanka wyhodowana może również być stosowania do utworzenia tkanki ludzkiej nadającej się do przeszczepu.
Równoważniki tkanek zostały opisane obszernie w wielu patentach, takich jak patenty USA nr 4.485.096, 4.485.097, 4.539.716, 4.546.500, 4.604.346, 4.837.379 oraz 5.374.515, na każdy z których niniej szy opis powołuje się. Jedno uwieńczone powodzeniem zastosowanie równoważnika tkanki nazywanej jest równoważnikiem żywej skóry, która ma morfologię podobną do rzeczywistej skóry człowieka. Równoważnik żywej skóry (LSE) złożony jest z dwóch warstw: część górna jest wykonana ze zróżnicowanych i stratyfikowanych naskórkowych keratynocytów ludzkich, które pokrywają dolną warstwę ludzkich fibroblastów skórnych w kolagenowej substancji międzykomórkowej. Parenteau i inni, „Epidermis Generated in Vitro: Practical Considerations and Applications”, J. of Cellular Biochemistry, 45:245-251 (1991); Parenteau i inni, „The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achive form and function”, Cytotechnology, 9:163-171 (1992) oraz Bell i inni, „The Living Skin Equivalent: Its Manufacture, Its Organotypic Properties and Its Responses to Irritants”, Toxic,. in Vitro, 5:591-596 (1991). Równoważnik żywej skóry do przeszczepów jest w trakcie badań klinicznych na oznaki dotyczące zranień na częściowej i pełnej grubości skóry: chirurgia amputacyjna, oparzenia, zastoinowe wrzody żylne, wrzody cukrzycowe, wrzody odleżynowe i wrzody spowodowane przez chroniczne stany zapalne. LSE jest dwuwarstwową, mającą pełną grubość tkanką skórną wytworzoną in vitro.
181 762
Równoważnik rogówki oka wytworzony in vitro opracowano jak opisano w patencie USA nr 5.374.515, na który przedmiotowy opis powołuje się. Równoważnik tkanki rogówki ma trzy oddzielne warstwy komórek: warstwę zewnętrzną uwarstwiony, łuskowaty nabłonek, warstwę środkową z włókien kolagenowych i komórek zrębowych; oraz warstwę wewnętrzną pojedynczy łuskowaty nabłonek, zwany również śródbłonkiem rogówki. Ten równoważnik in vitro rogówki można stosować do badań toksyczności in vitro, gdzie służy jako dokładne i tanie, nie wymagające uśmiercania zwierząt, modele in vivo możliwości podrażnienia oczu i skóry przez wiele rodzajów produktów i surowców.
Celem konserwacji kriogenicznej jest zachowanie integralności strukturalnej i żywotności materiałów biologicznych przez nieokreślony czas, tak że materiały te mogą być dostępne i wykorzystywane, gdy potrzeba. Złożone tkanki o skróconej żywotności będą wymagały konserwacji kriogenicznej w celu przedłużenia dostępności i użyteczności produktu. Historia konserwacji kriogenicznej materiału biologicznego wykazuje jednak, że optymalizacja protokółu konserwacji kriogenicznej dla konkretnej komórki niekoniecznie daje dobre wyniki przy zastosowaniu wobec innego typu komórek lub w przypadku innych komórek w tkance. Potrzebne było opracowanie bardziej wyspecjalizowanych sposobów ze względu na różnice gęstości komórek, zawartości wody i poziomu organizacji strukturalnej równoważników tkanek o pełnej grubości. Protokóły konserwacji kriogenicznej według tego wynalazku niespodziewanie nadają się do stosowania wobec jednowarstwowych równoważników naskórka i samych warstw skóry, dwuwarstwowych równoważników tkanek, trójwarstwowych równoważników rogówki i zbieranej skóry ssaków. Opracowanie konstrukcji pakietowej umożliwia praktyczne zastosowanie konserwacji kriogenicznej tych tkanek w procesach na skalę produkcyjną.
Użyte tu określenie hodowane równoważniki tkanek oznacza równoważniki tkanek ssaków, które są wytworzone sposobami in vitro, przy czym określenie to obejmuje jednowarstwowe równoważniki skóry, albo równoważnik skóry, albo arkusz naskórkowy; dwuwarstwowe równoważniki skóry, zwłaszcza LSE; oraz trójwarstwowe równoważniki rogówki i równoważniki skóry. Morfologia hodowanych równoważników tkanek jest podobna do organu ssaków in vivo, typowo do organu ludzkiego. Dla ilustracji, morfologia LSE ma wiele podobieństw do skóry człowieka. Metabolicznie i mitotycznie aktywne fibroblasty skóry człowieka (HDF) znajdowane sąw całej warstwie skórnej według tej konstrukcji i, jak stwierdzono, wydzielająkolagen i inne składniki substancji międzykomórkowej do struktury. Naskórek złożony jest z warstwy podstawowej, która jak wykazano dzieli się z prędkością mitotyczną podobną jak w przypadku skóry człowieka. Naskórek ponadpodstawowy ma takie same warstwy jak skóra in vivo z dobrze określonymi warstwami kolczystą i ziarnistą zawierającymi keratohialinę i ziarna płytkowe przykryte warstwą rogową. Histochemia immunologiczna wykazuje obecność pozakomórkowych składników substancji międzykomórkowej rutynowo znajdowanych w połączeniu skóranaskórek w normalnej skórze człowieka takich jak laminina, kolagen typu IV i kalanina (GB3).
Hodowane równoważniki tkanek otrzymane metodami hodowli organotypowej, takie jak równoważnik żywej skóry (LSE), wykorzystują nośnik jako konstrukcję wsporczą na której powstają równoważniki. Hodowane równoważniki tkanek są wytwarzane na nośniku, który umożliwia manipulowanie konstrukcją podczas wytwarzania, przewożenie i końcowe wykorzystanie bez bezpośredniego dotykania konstrukcji. Sposoby wytwarzania hodowanych równoważników tkanek na nośniku sąopisane w patencie USA nr 5.374.515 i w zgłoszeniu patentowym USA nr seryjny 08/193.809 oraz 08/337.830.
Nośnik stanowi płaska przepuszczalna membrana, która jest przymocowana do jednego końca zasadniczo rurowej podpory. Drugi koniec tej rurowej podpory zawiera wystający na zewnątrz kołnierz, który z kolei ma obrzeże, które może być zawieszone na górnym końcu zagłębienia w miseczce do hodowania tkanki i w konstrukcji pakietowej według przedmiotowego wynalazku. Zespół podpory membranowej ma wymiary umożliwiające wykorzystywanie go z miską hodowlaną posiadającą przynajmniej jedno zagłębienie o specyficznej wielkości, tak aby zapewnić właściwy odstęp wokół podpory i sprzężenie z górnym końcem zagłębienia. Zespół podpory membranowej może być wykonany o różnych wymiarach, tak aby był stosowany z
181 762 różnymi wymiarami zarówno misek hodowlanych jak i pakietów konserwacji kriogenicznej i przechowywania. Przykładami takich nośników jest membrana TRANSWELL® (Costar), jak opisano w patencie USA nr 5.466.602. Fachowiec może wprowadzić modyfikacje tej konstrukcji pakietowej, aby dostosować podobne nośniki, które wykorzystują inne środki podparcia i sprzężenia w pojemnikach hodowlanych Podobne nośniki są opisane w patentach USA nr 5.358.871 i 5.366.893, albo też w patencie USA nr 4.871.674.
Korzystna konstrukcja pakietu według przedmiotowego wynalazku zawiera konstrukcję nośnika i tworzy wokół równoważnika tkanki środowisko, które może być sterowane według określonych wymagań.
Przedmiotowy wynalazek wykorzystuje materiały, które sąkorzystnie jakości medycznej i są zdolne do wytrzymywania temperatur w szerokim zakresie. Z materiałów tych ukształtowana jest miska i pokrywa, które nadają się do szczelnego połączenia ze sobą za pomocą elementu uszczelniającego. Ten nowy pakiet jest skonstruowany tak, aby zawierał podporę nośnika, na którym tworzone są równoważniki tkanek.
Ta nowa konstrukcja pakietu zawiera miskę, pokrywę i element uszczelniający pomiędzy nimi. Miska i pokrywa są skonstruowane tak, aby pasowały do istniejącego nośnika zawierającego dołączony równoważnik tkanki. Nośnik ten z dołączonym równoważnikiem tkanki umieszczany jest w misce i dodawany jest roztwór konserwantu kriogenicznego. Następnie pokrywajest umieszczana na misce i obie części są szczelnie łączone ze sobą, aby zapewnić szczelność pomiędzy wnętrzem a zewnętrznym środowiskiem pakietu.
Konstrukcja pakietu umożliwia równomierne rozprowadzenie konserwantu kriogenicznego poniżej nośnika i powyżej powierzchni równoważnika tkanki przy równoczesnym utrzymaniu kontaktu konserwantu kriogenicznego z równoważnikiem tkanki oraz z miską i pokrywą. Konstrukcja pakietu oparta jest na koncepcji, że można utrzymywać kontrolowane prędkości chłodzenia i zamrażania przy jednakowej ilości konserwantu kriogenicznego rozmieszczonego w podobnym układzie geometrycznym powyżej i poniżej hodowanej tkanki, która ma być konserwowana kriogenicznie. Rozwiązanie takie zapewnia jednakowy odstęp mierzony zarówno od górnej jak i od dolnej powierzchni hodowanego równoważnika tkanki do zewnętrznej ścianki pakietu (pod warunkiem, że pakiet również ma równomierną grubość). Równomierność ta powinna zapewniać równomierną wymianę ciepła z równoważnika tkanki do komory zamrażającej po ochłodzeniu i ze środowiska zewnętrznego do równoważnika tkanki po rozmrożeniu.
Miska zawiera powierzchnię denną, która jest ciągła ze ścianką boczny i kołnierzem. Kołnierz ma płaską powierzchnię do uszczelnienia miski względem pokrywy. Ścianka boczna ma jedną ciągłąpodporę lub wiele nieciągłych podpór odchodzących do wewnątrz od ścianki bocznej i integralnych wraz z nią. Górna krawędź nośnika zawierającego hodowany równoważnik tkanki po umieszczeniu w misce jest zawieszona na podporach utworzonych przez ściankę boczną miski. Pomiędzy zawieszonym nośnikiem a denną powierzchnią miski utworzona jest komora o grubości 1,0 mm i o powierzchni w przybliżeniu odpowiadającej wielkości równoważnika tkanki.
Pokrywa zawiera płaskąpowierzchnię dna ciągłą ze ściankąbocznąi kołnierzem. Średnica kołnierza pokrywy jest nieco mniejsza niż średnica kołnierza miski. Kołnierz pokrywy po umieszczeniu na misce zawierającej nośnik spoczywa na nośniku, tak że górne powierzchnie zarówno kołnierza miski jak i kołnierza pokrywy są w styku na tej samej płaszczyźnie lub wokół tej samej płaszczyzny. Druga komora jest utworzona przez pokrywę i powierzchnię hodowanego równoważnika tkanki i ma również grubość około 1,0 mm oraz pole powierzchni w przybliżeniu odpowiadające wielkości równoważnika tkanki.
Konstrukcja ta umożliwia w sumie około 1 mm pomiędzy miską a spodem nośnika z umieszczonym na nim równoważnikiem tkanki i około 1 mm pomiędzy pokrywą a równoważnikiem tkanki, przy czym środek zabezpieczający przed powstawaniem lodu jest usytuowany powyżej i poniżej równoważnika tkanki w styku zarówno z pokrywą jak i z miską. Kiedy pokrywa jest umieszczona w misce zawierającej medium, wówczas pokrywa ta wypiera wszelkie powietrze zawarte w pakiecie do przestrzeni obwodowej zawierającej rurową podporę nośnika.
181 762
Pokrywa jest uszczelniona względem miski wzdłuż odsłoniętej płaszczyzny utworzonej przez górne powierzchnie kołnierzy miski i pokrywy. Uszczelnianie może być realizowane za pomocą ciepła, kleju lub innych znanych środków. Uszczelnienie pomiędzy pokrywą a miską chroni przed uchodzeniem konserwantu kriogenicznego i utrzymuje steryIność wnętrza zespołu. Korzystnie pierścieniowy arkusz materiału okrywowego uszczelnianego cieplnie jest uszczelniony cieplnie na kołnierzach miski i pokrywy. Ten materiał okrywowy ma korzystnie język do usuwania przez ściąganie, a zatem do likwidowania szczelności pokrywy względem miski w celu uzyskania dostępu do równoważnika tkanki. W innym przykładzie realizacji pokrywa z kołnierzem o w przybliżeniu takiej samej średnicy jak kołnierz miski jest umieszczona na misce, przy czym nośnik jest usytuowany wewnątrz tak, że dolna powierzchnia kołnierza pokrywy styka się ściśle z górną powierzchnią kołnierza miski. Następnie kołnierze są ze sobą uszczelnione za pomocą elementów uszczelniających.
Figury 1A i IB pokazują pokrywę 10; kołnierz pokrywy 11, ściankę boczną 12 pokrywy oraz dennąpowierzchnię 13. Kołnierz 11 pokrywy, ścianka boczna 12 pokrywy i denna powierzchnia 13 tworzą jedną ciągłą powierzchnię.
Figura 2 przedstawia pierścieniową uszczelkę 20 i język 21 do ściągania.
Figury 3A i 3B pokazuj ąuszczelkę 20, pokrywę 10, kołnierz 11 pokrywy. Uszczelka 20 jest zamontowana na kołnierzu 11 pokrywy 10 przed użyciem, aby ułatwić określenie usytuowania uszczelki podczas procesu uszczelniania.
Figury 4A i 4B pokazująnośnik 30, obrzeże 31 nośnika, przepuszczalną membranę 32 i rurowąpodporę 33. Przepuszczalna membrana 32 zawiera hodowany równoważnik tkanki umieszczony na niej z obramowaniem przez rurową podporę 33. Nośnik 30 umożliwia przenoszenie równoważnika tkanki bez kontaktu z równoważnikiem tkanki lub usuwania równoważnika tkanki w całym procesie konserwacji kriogenicznej.
Figury 5A i 5B pokazująmiskę 40, powierzchnię denną41 miski, ściankę boczną42 miski, kołnierz 43 miski i podpory 44 nośnika. Powierzchnia denna 41 miski, ścianka boczna 42 miski, kołnierz 43 miski i podpory 44 nośnik tworzą powierzchnię ciągłą. Podpory 44 nośnika stykają się z nośnikiem wewnątrz miski i wspierają go.
Figury 6A i 6B przedstawiająuszczelkę 20, pokrywę 10, nośnik 30 i miskę 40. Nośnik 30, zawierający na sobie równoważnik tkanki jest umieszczony w misce 30 i jest zawieszony wewnątrz tej miski. Pokrywa 10 z uszczelką 20 jest umieszczona nad nośnikiem 30 i jest zawieszona nad tym nośnikiem.
Figura 7 przedstawia uszczelkę 20, kołnierz 11 pokrywy, pokrywę 10, nośnik 30, obrzeże 31 nośnika, podpory 44 nośnika i miskę 40. Nośnik 30, zawierający na sobie równoważnik tkanki, jest umieszczony w misce i jest zawieszony wewnątrz miski przez styk dolnej powierzchni obrzeża 31 nośnika z górnymi powierzchniami podpór 44 nośnika. Pokrywa 10 z uszczelką20 jest umieszczona na nośniku 30 i jest zawieszona nad tym nośnikiem przez styk dolnej powierzchni kołnierza 11 pokrywy z górną powierzchnią obrzeża 31 nośnika. Górne powierzchnie zarówno kołnierza 11 pokrywy jak i kołnierza 43 miski tworzą płaską powierzchnię dla uszczelki 20.
Figura 8 przedstawia cały zespół w widoku z góry.
Materiały, z których mogą być wykonane miski i pokrywy, są sztywnymi lub półgiętkimi materiałami termoplastycznymi, które po ogrzaniu są kształtowane podciśnieniowo lub przez wtrysk, takimi jak policzterofluoroetylen (PTFE) lub polietylenoczteroftalanoglikol (PETG). Miski i pokrywy pakietów są korzystnie sterylizowane przed użyciem sposobami znanymi w technice sterylizacji. Materiały użyte do wytwarzania miski i pokrywy będą określać sposób sterylizacji, który można zastosować. Do sterylizacji PTFE lub PETG korzystne jest promieniowanie gamma 2,5-3,0 Mrd (25-30 kGy). Alternatywnie mogą być wykorzystywane elektryczne i chemiczne metody sterylizacji znane fachowcom.
Hodowane równoważniki tkanek obejmująrównoważnik skóry z uwodnionej siatki kolagenowej skurczonej przez pewien czynnik, korzystnie fibroblasty. W jednym przykładzie realizacji uwarstwiona warstwa komórek naskórka jest hodowana na powierzchni równoważnika skóry. W innym przykładzie realizacji uwodniony skurczony szkielet kolagenowy, skurczony
181 762 przez keratocyty, jest usytuowany na warstwie rogówkowych komórek śródbłonkowych z uwarstwioną warstwą rogówkowych komórek śródbłonkowych hodowaną na powierzchni tego szkieletu. Alternatywnie mogą być hodowane same komórki naskórka i zmuszane do rozwarstwienia w celu utworzenia arkusza naskórkowego. Hodowany równoważnik tkanki jest utworzony albo na porowatej membranie nośnika, albo na kolagenowym żelu, który jest przywarty do porowatej membrany dolnej powierzchni nośnika. Ponadto inne hodowane równoważniki tkanek mogąbyć konserwowane kriogenicznie sposobami według niniejszego wynalazku, łącznie, ale bez ograniczenia tylko do tego, z dowolnym hodowanym arkuszem naskórkowym, dowolnym hodowanym równoważnikiem skóry, dowolnym hodowanym równoważnikiem rogówki lub zbieraną skórą ssaka.
Przedmiotowy wynalazek zostanie teraz opisany z wykorzystaniem jako ilustracji równoważników tkanek i korzystniej konstrukcji pakietowej. Dla fachowców jest zrozumiałe, że w opisanym sposobie można wprowadzić modyfikacje, a jednak nadal będzie się on mieścić w zakresie przedmiotowego wynalazku.
Sposób perfuzji równoważnika tkanki roztworem zabezpieczającym przed powstawaniem lodu polega na zanurzeniu równoważnika tkanki wraz z przymocowanym do niego nośnikiem w ilości roztworu chroniącego przed powstawaniem lodu wystarczającej do zanurzenia próbki i do posiadania takiej samej ilości roztworu konserwantu kriogenicznego powyżej i poniżej równoważnika tkanki. Do płytki Petriego 100 mm, zawierającej równoważnik tkanki i nośnik, dodano 25 ml 2M gliceryny w DMEM na czas wystarczający dla całkowitej perfuzji próbki, korzystnie 1 -2 h, ale najkorzystniej około 1 h. Dłuższe czasy w roztworze konserwantu kriogenicznego powodują zmniejszenie żywotności komórek w tkance, natomiast zbyt krótki czas nie zapewnia pełnego przeniknięcia konserwantu kriogenicznego do wnętrza tkanki. Konstrukcje jednowarstwowe będą typowo wymagały mniej czasu na perfuzję, ponieważ mają one mniej warstw komórek i zmniejszone działanie barierowe. Podczas tej godziny penetracja roztworu konserwantu kriogenicznego jest polepszana przez pobudzanie próbki i roztworu konserwantu kriogenicznego, typowo przez wstrząsanie płytki Petriego na orbitalnej wytrząsarce pomostowej (wytrząsarka orbitalna Bellco) przy 70 obr/min w komorze gazowej 10% CO2. To środowisko 10% CO2, takie samo jak środowisko hodowli, w którym równoważnik tkanki był wytwarzany, zabezpiecza media przed odgazowaniem, przez co utrzymywany jest współczynnik pH podstawowego składnika mediów konserwantu kriogenicznego. Pobudzanie umożliwia szybszą i pełniejszą perfuzję konserwantu kriogenicznego do wnętrza równoważnika tkanki i lepszą powtarzalność wyników pomiędzy zamrożonymi równoważnikami tkanek. Możliwe jest zastąpienie wytrząsarki orbitalnej urządzeniem, które realizuje ruch pobudzający w innych płaszczyznach przestrzeni. Ponadto inne sposoby mechanicznego zwiększania perfuzji obejmują ale beż ograniczenia tylko do nich, przychylanie struktury konserwantu kriogenicznego i perfuzję tego konserwantu kriogenicznego wokół struktury przy użyciu pompy.
Nośnik i przymocowany równoważnika tkanki umieszcza się w misce i dodaje się około 16,0 ml roztworu chroniącego przed powstawaniem lodu. Konstrukcja pakietu umożliwia równomierne rozprowadzenie konserwantu kriogenicznego: około 8,0 ml poniżej nośnika i około 8,0 ml na powierzchni równoważnika tkanki. Następnie na misce umieszcza się pokrywę i obie części uszczelnia się cieplnie, korzystnie do materiału okrywowego.
Zapakowane równoważniki tkanek umieszcza się następnie w programowanej zamrażarce (Cryomed lub Planer) ustawionej na temperaturę początkową w przybliżeniu równą temperaturze pokojowej, korzystnie 20,0°C. Komora zamrażarki zawierająca zapokowane równoważniki tkanek jest chłodzona z prędkością -10,0°C/min do zakresu temperatur równowagi fazy stałej i ciekłej dla konserwantu kriogenicznego, którym jest typowo 2,0 M gliceryna w DMEM, pomiędzy około -5,3°C a -6,0°C. Temperatura równowagi fazy stałej i ciekłej jest temperaturą konieczną do zarodkowania lodu w konserwancie kriogenicznym. Temperatura w komorze jest utrzymywana przez pewien czas w celu zrównoważenia temperatury wewnętrznej zapakowanych równoważników tkanki z temperaturą w komorze. Prędkość chłodzenia zastosowana w celu uzyskania temperatury zarodkowania nie jest krytyczna. Czas przetrzymywania około 40 min
181 762 jest wystarczający do zapewnienia równowagi cieplnej, ale czas ten będzie się zmieniać w zależności od wielkości komory, cyrkulacji powietrza wewnątrz komory i liczby zamrażanych pakietów. Chociaż typowo potrzeba przynajmniej 30 minut, zapewnienie równowagi może zająć nawet 1 godzinę. Po czasie przetrzymywania inicjowane jest przez zarodkowanie powstawanie lodu pozakomórkowego.
Zarodkowanie lodu definiowane jest jako sposób inicjowania powstawania lodu w pozakomórkowym konserwancie kriogenicznym. Korzystny sposób zarodkowania lodu polega na kontaktowaniu strony miski zawierającej tkankę z chłodzona sondą, takąjak stalowy pręt schłodzony ciekłym azotem (-196°C). Miejsce styku tego pręta z pakietem musi być usytuowane poniżej poziomu mediów konserwantu kriogenicznego w pakiecie. Inny korzystny sposób polega na bezpośrednim uwalnianiu rozprężających się gazów, takich jak freon lub CO2, na zewnątrz pakietu. Powstawanie lodu może być inicjowane przez ostrze w komorze, gdzie temperatura komory jest obniżana i podwyższana w zakresie wystarczającym do tworzenia kryształu lodu. Można również zastosować inne znane sposoby zarodkowania lodu.
Po zaszczepieniu wszystkich równoważników tkanek kryształami lodu zespoły są trzymane przez dodatkową jedną godzinę, aby umożliwić osiągnięcie równowagi termodynamicznej i rozejście się zarodkowych kryształów lodu w całym konserwancie kriogenicznym. Następnie chłodzenie jest wznawiane z prędkościąkorzystnie w zakresie od -0,02 do około -0,3°C, korzystniej od -0,05 do -0,1 °C/min, a najkorzystniej w przybliżeniu -0,07°C/min do końcowej temperatury korzystnie przynajmniej -70,0°C lub poniżej, korzystnie -120°C, jeszcze korzystniej -140°C lub najkorzystniej -196°C. Gdy końcowa temperatura zamrażania zbliża się do temperatury przej ścia wody w stan szklisty, tzn. -120°C, mniej prawdopodobne będą szkodliwe wahania temperatury podczas przenoszenia do miejsc końcowego składowania.
Zakonserwowane kriogenicznie równoważniki tkanek są przenoszone z programowanej zamrażarki do przechowywania w zbiorniku z ciekłym azotem przechodzącym w fazę pary (termosie) w temperaturze od -120 do -150°C, lub w ciekłym azocie o temperaturze -196°C aż do wykorzystania ich.
W celu rozmrożenia zakonserwowane kriogenicznie hodowane równoważniki tkanek wyjmuje się z pojemnika z ciekłym azotem przechodzącym w fazę pary i przenosi się do suchego lodu, aby podgrzać je do temperatury około -75°C. Po osiągnięciu równowagi przy temperaturze -75°C hodowane równoważniki tkanek przenoszone są następnie do otoczenia, korzystnie do kąpieli wodnej, korzystnie ustawionej na temperaturę 37°C, korzystniej na 4°C, a najkorzystniej na temperaturę pokojową. Kiedy widać już, że całość medium konserwantu kriogenicznego przeszła w fazę cieczy, zespoły pakietów z hodowanymi równoważnikami tkanek korzystnie przenosi się do szafki bezpiecznej biologicznie lub do innego obszaru aseptycznego i odkażonego etanolem. Pokrywy misek zdejmuje się przez ściągnięcie lub odcięcie materiału okrywowego od dna zespołu. Następnie każdy z nośników zawierających hodowane równoważniki tkanek przenosi się na płytki Petriego, wylewając nadmiar konserwantu kriogenicznego. W celu wypłukania hodowanego równoważnika tkanki z resztek konserwantu kriogenicznego na płytkę Petriego zawierającąhodowany równoważnik tkanki na około 30 minut dodaje się 25 ml roztworu phiczącego, korzystnie DMEM o temperaturze pokojowej. Fachowiec może określić inne wystarczające środki phiczące, korzystnie roztwory o natężeniu fizjologicznym, takie jak media stosowane przy hodowaniu komórek lub roztwór soli buforowanej fosforanem. Roztwór płuczący zmienia się jeszcze raz na dodatkowe 30 minut. Liczba phikań może zmieniać się zależnie od stopnia skomplikowania tkanki.
Następnie zespół hodowanego równoważnika tkanki można przenieść z powrotem do oryginalnej miski hodowlanej i z powrotem hodować z medium utrzymywania hodowli przy 37°C/10% CO2- Alternatywnie równoważnik ten można podać pacjentowi lub sprawdzać na nim reakcję na kontakt z substancją, jak opisano w patencie USA nr 4.835.102.
Następujące przykłady podano w celu lepszego objaśnienia praktycznej realizacji przedmiotowego wynalazku i w żaden sposób nie należy traktować ich jako ograniczenia zakresu przedmio
181 762 towego wynalazku. Dla fachowców jest oczywiste, że w opisanych tu sposobach można wprowadzić różne modyfikacje nie odchodzące od ducha i zakresu przedmiotowego wynalazku.
PRZYKŁADY
Przykłady 1-3
Przykłady 1-3 przedstawiają techniki konserwacji kriogenicznej i odmrażania według przedmiotowego wynalazku z korzystną konstrukcją pakietu.
Przykład 1: Konserwacja kriogeniczna równoważnika żywej skóry (LSE) z konstrukcją pakietu
Konstrukcje równoważnika żywej skóry (LSE) przygotowano według zgłoszenia patentowego USA nr seryjny 08/193.809. Równoważniki żywej skóry i przymocowane wkładki nośnika 75 mm (TRANSWELL®, Costar, Cambridge) 9-10 dni od unoszenia pneumatycznego umieszczono na płytkach Petriego 100 mm (Constar). Konstrukcje LSE poddano perfuzji konserwantem kriogenicznym przez zanurzenie tych konstrukcji i wprowadzenie 25 ml konserwantów kriogenicznych, 2 M gliceryny w DMEM na płytkę Petriego 100 mm na jedną godzinę. Podczas perfuzji konstrukcje te pobudzano przez jedną godzinę na orbitalnej wytrząsarce (Bellco) przy 70 obr/min. w komorze gazowej z 10% CO2. Pobudzanie umożliwia pełniejszą perfuzję i lepszą powtarzalność sposobu konserwacji kriogenicznej. Po przeprowadzeniu perfuzji LSE płytki Petriego zawierające LSE, wkładki nośnika i mediapozakomórkowego zamrażania (2M gliceryna i DMEM) umieszczono w pakiecie konserwacji kriogenicznej i uszczelniono termicznie. Pakiety konserwacji kriogenicznej opisane są w równocześnie rozpatrywanym zgłoszeniu patentowym USA, złożonym tego samego dnia co niniejsze zgłoszenie.
Komora programowanej zamrażarki (Planer) była wyposażona zgodnie z opisanym tu wynalazkiem. Zamrażarka była ustawiona na temperaturę początkową 20,0°C. Przewody rurowe przepłukano freonem jednorazowo przez jedną sekundę, aby usunąć powietrze z tych przewodów. Zapakowane jednostki LSE umieszczono bezpiecznie w stojakach mieszczących każdy po 8 jednostek LSE. Stojaki te, prowadzone przez kołki ustalające położenie, umieszczono przy szynach rozpylania. Drzwi komory zamrażarki zamknięto, by oddzielić szczelnie komorę od środowiska zewnętrznego. Jednostki LSE chłodzono z prędkością-10°C/min do temperatury -6°C i utrzymywano temperaturę komory -6°C przez 40 minut, by osiągnąć stan równowagi konserwantu kriogenicznego i konstrukcji perfundowanych z temperaturąw komorze. Po przetrzymywaniu przez 40 minut zainicjowano lód pozakomórkowy przez bezpośrednie wypuszczanie freonu przez jedną sekundę w pobliżu boku pakietu. Freon, parując z powierzchni pakietu, powodował spadek temperatury obszaru kontaktu z freonem wystarczający do zainicjowania powstawania lodu pozakomórkowego.
Po zaszczepieniu wszystkich jednostek LSE kryształkami lodu pozostawiono te jednostki do osiągnięcia stanu równowagi na jedną godzinę w temperaturze -6°C. Następnie temperaturę komory obniżano z prędkością -0,07°C na minutę do końcowej temperatury -20°C. Następnie komorę ochładzano z prędkością -0,5°C /min do końcowej temperatury -70°C. Po kriogenicznym zakonserwowaniu jednostek LSE przeniesiono je do pojemnika magazynowego z fazą pary (termosu) o temperaturze od -120 do -150°C.
Przykład 2: Odmrażanie zakonserwowanych kriogenicznie LSE
Zakonserwowane kriogenicznie LSE wyjęto z magazynu z ciekłym azotem przechodzącym w fazę pary i przeniosiono do suchego lodu w celu ogrzania do temperatury około -75°C. Po osiągnięciu równowagi w temperaturze -75°C hodowane równoważniki tkanek przeniesiono do kąpieli wodnej korzystnie ustawionej na 37°C, jeszcze korzystniej na 4°C, albo najkorzystniej na temperaturę pokojową. Kiedy widać już, że całe medium konserwantu kriogenicznego przeszło w fazę ciekłą, pakiety w hodowanymi równoważnikami tkanek korzystnie przeniesiono do biologicznie bezpiecznej szafki lub innego obszaru aseptycznego i odkażonego etanolem. Pokrywy z misek usunięto przez ściągnięcie lub odcięcie materiału okrywowego od dna zespołu. Następnie każdy z nośników zawierających hodowany równoważnik tkanki przeniesiono na płytki Petriego, wylewając nadmiar konserwantu kriogenicznego. W celu wypłukania hodowanego równoważnika tkanki z resztek konserwantu kriogenicznego dodano następnie na płytkę Petriego
181 762 zawierającą hodowany równoważnik tkanki 25 ml roztworu phiczącego (temperatura pokojowa), korzystnie DMEM na około 30 minut. Inne wystarczające fizjologiczne roztwory płuczące, takie jak inne media hodowli komórek lub roztwór soli buforowanej fosforanem, mogą być określone przez fachowca. Roztwór phiczący jest jeszcze raz zmieniany na dodatkowe 30 minut.
Odmrożone próbki zakonserwowane kriogenicznie i próbki kontrolne obrabiano sposobami histologicznymi i oceniano za pomocą mikroskopu optycznego organizację morfologiczną oraz żywotność, przy czym badania wykazały żywotność bliską 100% i były prawie nie do odróżnienia od próbek kontrolnych.
Przykład 3: Ocena konstrukcji pakietu konserwacji kriogenicznej pod względem prędkości ogrzewania i jednorodności termicznej
Pakiet konserwacji kriogenicznej według przedmiotowego wynalazku oceniano pod względem równomierności przekazywania ciepła. Na membranie nośnika bez hodowanego równoważnika tkanki zamontowano pięć termopar: jedną w środku i cztery w jednakowych odstępach 1,0 mm od ścianki obwodowej nośnika. Przewody termopar wychodziły z pakietu z boku pomiędzy kołnierzami pokrywy i miski do rejestratora temperatury (Αζοηΐχ Scanner Plus). Pakiet ten napełniono 17 ml konserwantu kriogenicznego i uszczelniono cieplnie. Pakiet doprowadzono do stanu równowagi przy temperaturze -70°C, a następnie przeniesiono do kąpieli wodnej ustawionej na temperaturę 20°C. Rejestrator temperatury zapisywał podczas ogrzewania temperaturę każdej termopary co 1-2 s. Pakiet ogrzewano z prędkościąpoczątkowo 700°C/min i zmniejszono tę prędkość po zbliżeniu się do temperatury topnienia roztworu konserwantu kriogenicznego. Równomierność termiczna wynosiła 2-6°C średniej temperatury termopar przy największych prędkościach grzania i zbliżała się do 8°C przy osiągnięciu temperatury topnienia roztworu. Przykłady 4-12 przedstawiająsposób konserwacji kriogenicznej według przedmiotowego wynalazku w przypadku różnych tkanek.
Przykład 4: Konserwacja kriogeniczna arkuszy naskórkowych
Arkusze naskórka pochodziły w dojrzałego LSE przy 12 dniach od unoszenia pneumatycznego. Zdejmowanie arkusza naskórkowego odbywało się przez zdzieranie warstwy podłoża skórnego z warstwy naskórkowej pincetą z wyrzuceniem warstwy skórnej. Każdy arkusz cięto na trzy jednakowe kawałki. Jeden kawałek z każdego arkusza mocowano jako kontrolny. Pozostałe dwa kawałki każdego arkusza umieszczono na wierzchu poliwęglanowej membrany 75 mm (Costar) w płytkach hodowlanych 100 mm (Costar). Każdy kawałek perfundowano za pomocą 25 ml DMEM i 2M gliceryny przez jedną godzinę. Płytki zawierające takie konstrukcje umieszczono na orbitalnej wytrząsarce (Bellco) przy 70 obr/min na jedną godzinę w komorze gazowej 10% CO2. Po perfundowaniu arkusza naskórkowego płytkę Petriego zawierającą akrusz naskórkowy, membranę i pozakomórkowe media kriogeniczne (2M gliceryna i DMEM) umieszczono w woreczku i uszczelniono próżniowo (Audiovox) z zaprogramowaniem na 5 s próżni i 3,9 s czasu uszczelnienia.
Zapakowane arkusze naskórkowe umieszczono w programowanej zamrażarce (Planer) o temperaturze początkowej 20,0°C. Arkusze naskórkowe chłodzono z prędkością-10,0°C/min do temperatury -6,0°C. Temperaturę tę utrzymywano przez 20 minut w celu wyrównania temperatury w komorze. Po przetrzymywaniu przez 20 minut inicjowano powstawanie lodu pozakomórkowego przez kontakt zewnętrznej strony woreczka poniżej poziomu mediów kriogenicznych z sondą schłodzoną ciekłym azotem. Kiedy wszystkie arkusze naskórkowe zostały zaszczepione kryształkami lodu, temperaturę utrzymywano przez dodatkowe 5 minut na wartości -6,0°C. Następnie komorę chłodzono z prędkością-l,0°C/min do -8,0°C. Następnie temperaturę tę utrzymywano przez 30 minut na wartości -8,0°C, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie lodu w całej próbce, następnie komorę chłodzono z prędkością-0,1 °C/min do końcowej temperatury -70,0°C.
Zakonserwowane kriogenicznie arkusze naskórkowe wyjęto z zamrażarki i woreczki odcięto od płytek Petriego, a pokrywy usunięto. W celu rozmrożenia do każdej płytki Petriego wlano aseptycznie 40 ml DMEM podgrzanego do temperatury 37°C. Po 45 s całą ciecz usunięto z płytek i dodano dodatkowe 40 ml tego roztworu. Kiedy cały lód roztopił się, arkusze naskórkowe
181 762 płukano przez 30 minut za pomocą25 ml DMEM. Media zmieniono jeszcze raz na dodatkowe 30 minut. Następnie arkusze naskórkowe inkubowano w medium konserwacji kultury przy 37°C /10% CO2 przez 24 h przed analizą. Umożliwiono czas inkubowania typowo przewidywany dla zamrożonych komórek przy przywracaniu do stanu równowagi. Znowu umożliwiono czas inkubacji typowo przewidywany dla zamrożonych komórek przy przywracaniu stanu równowagi.
Z dwóch pozostałych kawałków każdego arkusza naskórkowego jeden był obrabiany histologicznie, a drugi poddano próbom według protokółu badań MTT. Porównanie mikrofotografii arkusza naskórkowego niekonserwowanego kriogenicznie i arkusza naskórkowego konserwowanego kriogenicznie według przykładu 4 wykazało, że wszystkie trzy podstawowe cechy naskórka: warstwa podstawna naskórka, warstwy ponadpodstawne naskórka i warstwa rogowa naskórka były zachowane przy stosowaniu tego sposobu. Wszystkie warstwy były nienaruszone, a cała morfologia arkusza naskórkowego zakonserwowanego kriogenicznie była identyczna jak w przypadku arkusza naskórkowego niezakonserwowanego kriogenicznie.
Przykład 5: Konserwacja kriogeniczna równoważnika skóry
Równoważniki skóry użyte w tym badaniu były składnikiem LSE bez warstwy naskórkowej. Równoważniki skóry zamrożono 8 dni od uformowania. Równoważniki skóry perfundowano konserwantem kriogenicznym przez zanurzenie równoważników skóry przymocowanych do membrany 75 mm (Costar) umieszczonej w płytkach Petriego 100 mm (Costar) za pomocą 25 ml DMEM i 2M gliceryny przez jedną godzinę. Płytki Petriego umieszczono na wytrząsarce orbitalnej (Bellco) przy 70 obr/min na jedną godzinę w komorze gazowej 10% CO2. Po przeprowadzeniu perfundowania równoważników skóry płytki Petriego, równoważniki skóry, membrany i media zamrażania pozakomórkowego umieszczono w programowanej zamrażarce (Planer) o temperaturze początkowej 20,0°C. Następnie komorę chłodzono z prędkością -10,0°C/min do -6,0°C. Temperaturę tę utrzymywano przez 20 minut, aby uzyskać zrównoważenie temperatury w komorze. Po przetrzymywaniu przez 20 minut inicjowano powstawanie lodu pozakórkowego przez kontakt zewnętrznej strony płytek, poniżej poziomu mediów zamrażania, z sondą schłodzoną ciekłym azotem. Po zaszczepieniu kryształkami lodu wszystkich równoważników skóry temperaturę utrzymywano przez dodatkowe 5 minut na wartości -6,0°C. Następnie komorę chłodzono z prędkością-l,0°C/min do -8,0°C. Temperaturę w komorze znowu utrzymywano przez 30 minut na wartości -8,0°C, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie lodu w całej próbce. Jednostki równoważników skóry chłodzono następnie z prędkością -0,l°C/min do końcowej temperatury -70,0°C.
Zakonserwowane kriogenicznie równoważniki skóry wyjęto następnie z zamrażarki i usunięto z miski pokrywę. W celu rozmrożenia do każdej płytki Petriego wlano aseptycznie 40 ml DMEM ogrzanego do temperatury 37°C. Po 45 s całą ciecz usunięto z płytek i dodano do płytek na dwie minuty dodatkowe 40 ml roztworu. Po rozmrożeniu całego lodu równoważniki skóry płukano za pomocą25 ml DMEM przez 30 minut. Media zmieniono jeszcze raź na dodatkowe 30 minut. Równoważniki skóry, nadal przymocowane do membran, przeniesiono następnie z powrotem do misek hodowlanych i inkubowano w medium utrzymywania kultury przy 37°C/10% CO2 przez 24 h przed analizą. Czas inkubacji ustawiono na wartość typowo przewidywanądla zamrożonych komórek przy przywracaniu warunków równowagi. Próbki badano według protokółu badań MTT.
Przykład 6: Konserwacja kriogeniczna równoważników rogówki
Równoważniki rogówki, przymocowane do membran hodowlanych 24 mm (Costar), 9 dni po unoszeniu w wilgotnym powietrzu umieszczono w płytkach z sześcioma zagłębieniami (Costar). Sposób perfundowania równoważników rogówki konserwantem kriogenicznym polegał na zanurzaniu każdego równoważnika rogówki i membrany w 4 ml pozakomórkowych mediów zamrażania (2M gliceryna z DMEM) w miskach z sześcioma zagłębieniami na jedną godzinę. Miski z sześcioma zagłębieniami, zawierające konstrukcje rogówkowe, potrząsano przez jedną godzinę na orbitalnej wytrząsarce (Bellco) przy 70 obr/min w komorze gazowej 10% CO2. Po przeprowadzeniu perfuzji równoważników rogówki płytki Petriego zawierające równoważniki rogówki, membrany i pozakomórkowe media zamrażania umieszczono w programowanej za
181 762 mrażarce (Planer) o temperaturze początkowej 20,0°C. Równoważniki rogówki chłodzono z prędkością -10,0°C/min do -6,0°C. Temperaturę utrzymywano przez 20 minut w celu wyrównania temperatury w komorze. Po przetrzymywaniu przez 20 minut zainicjowano powstawanie lodu pozakomórkowego przez kontakt zewnętrznej strony każdego zagłębienia w płytce grupowej poniżej poziomu mediów zamrażania z sondą schłodzoną ciekłym azotem. Po zaszczepieniu kryształkami lodu wszystkich równoważników rogówki przez dodatkowe 5 minut utrzymywano temperaturę -6,0°C przed chłodzeniem z prędkością-l,0°C/min do -8,0°C. Temperaturę znowu utrzymywano przez 30 minut na wartości -8,0°C, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie lodu w całej próbce. Jednostki równoważnika rogówki chłodzono z prędkością -0,l°C/min do końcowej temperatury -70,0°C.
Zakonserwowane kriogenicznie równoważniki rogówki wyjęto z zamrażarki. Z miski zdjęto pokrywę. W celu rozmrożenia do każdego zagłębienia płytki grupowej wlano aseptycznie 6 ml DMEM ogrzanego do temperatury 37°C. Po 45 s z płytki usunięto całą ciecz i na dwie minuty do płytki dodano dodatkowe 6 ml roztworu. Za pomocą sterylnej pincety równoważniki rogówki i przymocowane membrany przeniesiono na nową płytkę grupową. W celu przepłukania do każdego zagłębienia na 30 minut dodano 4 ml DMEM. Media te zmieniono jeszcze raz na dodaktowe 30 minut. Następnie jednostki rogówki przeniesiono z powrotem do tej samej miski hodowlanej i inkubowano w medium utrzymywania rogówki przy 37°C/10% CO2 przez 24 h przed przeprowadzeniem analizy. Czas inkubowania ustawiono na wartość typowo przewidywaną dla zamrożonych komórek przy przywracaniu stanu równowagi. Próbki badano zgodnie z protokółem badań MTT.
Przykład 7: Konserwacja kriogeniczna zbieranej skóry myszy
Dzikie myszy, szczep B6CB6YF1 uśmiercono przez przedawkowanie Nembutalu. Skórę zebrano septycznie. Ze skóry właściwej usunięto nadmiar naczyń krwionośnych, tłuszczu i tkanki łącznej. Skórę myszy okrojono do prostokątnego kawałka 1 cm x 2 cm. Następnie kawałki skóry myszy umieszczono na membranie 75 mm (Costar) w płytkach Petriego 100 mm (Costar). Skórę myszy perfundowano konserwantem kriogenicznym przez zanurzenie w 25 ml 2M gliceryny w DMEM w płytkach Petriego 100 mm na jedną godzinę. Podczas perfuzji każda z płytek Petriego zawierających skórę myszy i membranę była wstrząsana przez jedną godzinę na orbitalnej wytrząsarce (Bellco) przy 70 obr/min w komorze gazowej 10% CO2. Kontrolną skórę myszy nie poddanąkonserwacji kriogenicznej trzymano w mediach odżywczych przy temperaturze 4°C przez czas trwania konserwacji kriogenicznej i procesu odmrożenia (2 dni) przed przeprowadzeniem przeszczepu skóry.
Po perfundowaniu skóry myszy płytki Petriego zawierające skórę myszy, membrany i media zamrażania pozakomórkowego umieszczane są w programowanej zamrażarce (Planer) przy temperaturze początkowej 20,0°C. Skóra myszy była chłodzona z prędkością -10,0°C/min do -6,0°C, a następnie przetrzymywana w temperaturze -6,0°C przez 20 minut w celu wyrównania temperatury w komorze. Po przetrzymywaniu przez 20 minut zainicjowano powstawanie lodu pozakomórkowego przez kontakt zewnętrznej strony płytki z sondą schłodzoną ciekłym azotem. Miejsce styku musi być usytuowane poniżej poziomu mediów zamrażania. Kiedy cała skóra myszy jest już zaszczepiona kryształkami lodu, temperatura jest utrzymywana przez dodatkowe 5 minut na wartości -6,0°C przed chłodzeniem z prędkością -l,0°C/min do -8,0°C. Temperaturę utrzymywano znowu przez 30 minut na wartości -8,0°C, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie lodu w całej próbce. Następnie jednostki ochłodzono z prędkością-0,1 °/min do końcowej temperatury -70,0°C.
Zakonserwowaną kriogenicznie skórę myszy wyjęto z zamrażarki i zdjęto pokrywę z miski. W celu rozmrożenia do płytek Petriego wlano aseptycznie 40 ml ogrzanego (37°C) DMEM. Po 45 s całą ciecz usunięto z płytek i do płytek na dwie minuty dodano dodatkowe 40 ml roztworu. Po rozmrożeniu całego lodu skórę myszy płukano w płytkach za pomocą 2 5 ml DMEM przez 30 minut.
Media wymieniono jeszcze raz na dodatkowe 20 minut.
181 762
Rozmrożone próbki zakonserwowane kriogenicznie i próbki kontrolne przetwarzano histologicznie lub zaszczepiono myszom. Mikrofotografie skóry mysiej niezakonserwowanej kriogenicznie porównano ze skórą myszy zakonserwowaną kriogenicznie i porównanie to wykazało, że sposobem tym utrzymano cztery podstawowe cechy skóry myszy, tzn. skórę właściwą z fibroblastami, warstwę podstawną naskórka, warstwy ponadpodstawne naskórka oraz warstwę rogową naskórka. Wszystkie warstwy były nienaruszone, a cała morfologia zakonserwowanej kriogenicznie skóry myszy była identyczna jak w przypadku skóry myszy niezakonserwowanej kriogenicznie.
Przykład 8: Konserwacja kriogeniczna ATS SKIN2™
SKIN2™, model ZK 1300 (Advanced Tissure Sciences, La Jolla, Kanada), wyjęto z opakowania zgodnie z wkładkami przewozowymi po otrzymaniu i umieszczono w miskach hodowlanych (Costar). Nad SKIN2™ umieszczono wkładki membranowe, aby utrzymywać konstrukcję skóry w zanurzeniu. SKJN2™ perfiindowano konserwantem kriogenicznym przez zanurrzenie SKIN2™ w 2M gliceryny w DMEM w miskach hodowlanych na jedną godzinę. Podczas perfuzji miski hodowlane zawierające konstrukcję i membranę wstrząsano przez jedną godzinę na wytrząsarce orbitalnej (Bellco) przy 70 obr/min w komorze gazowej 10% CO2.
Po perfuzji SKIN2™ jednostki umieszczono w programowanej zamrażarce (Planer) o temperaturze początkowej 20°C. Jednostki SKIN2™ chłodzono z prędkością-10,0°C/min do -6,0°C i przechowywano w temperaturze -6,0°C przez 20 minut w celu wyrównania temperatury w komorze. Po przetrzymywaniu przez 20 minut zainicjowano powstawanie lodu pozakomórkowego przez kontakt zewnętrznej strony misek poniżej poziomu mediów zamrażania z sondą schłodzoną ciekłym azotem. Kiedy wszystkie jednostki SKIN2™ były zaszczepione kryształkami lodu, temperaturze utrzymywano przez dodatkowe 5 minut na wartości -6,0°C. Następnie temperaturę w komorze obniżano z prędkością -1,0°C/min do -8,0°C. Jednostki SKIN2™ przetrzymywano przez 30 minut w temperaturze -8,0°C, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie lodu w całej próbce. Jednostki SKIN2™ ochłodzono następnie z prędkością-0,l°C/min do końcowej temperatury -70,0°C.
Zakonserwowane kriogenicznie SKIN2™ wyjęto z zamrażarki, zdjęto pokrywy z misek i w każdąmiskę hodowlaną wlano aseptycznie ogrzany (37°C) DMEM. Po 45 s całą ciecz usunięto z misek i do każdej miski na 2 minuty dodano dodatkową ilość DMEM. Po rozmrożeniu jednostkę SKIN2™ i przymocowaną membranę przeniesiono do nowych misek hodowlanych za pomocą sterylnej pincety. W celu wypłukania konserwantu kriogenicznego z SKIN2™ do każdej miski hodowlanej zawierającej SKIN2™ dodano na 30 minut DMEM. Media te wymieniono jeszcze raz na dodatkowe 30 minut. Następnie jednostkę SKIN2™ przeniesiono z powrotem do tego samego typu jednostki hodowlanej i inkubowano w medium utrzymywania kultury przy 37°C/10% CO2 przez 24 h przed analizą. Znowu czas inkubacji ustawiono na wartość typowo przewidzianą dla zamrożonych komórek do przywracania stanu równowagi.
Konstrukcje konserwowane kriogenicznie i kontrolne badano zgodnie z protokółem badań MTT dla SKIN2™ model ZK1300, w zamknięciu z produktem, jak również przez ocenę histologiczną. Mikrofotografie niekonserwowanej kriogenicznie SKIN2™ w porównaniu ze SKIN2™ konserwowaną kriogenicznie wykazały, że sposobem tym zachowano cztery podstawowe cechy SKIN2™, tzn. szkielet kolagenowy z fibroblastami, warstwę podstawową naskórka, warstwy ponadpodstawne naskórka i warstwę rogową naskórka. Wszystkie warstwy były nienaruszone, a cała morfologia SKIN2™ konserwowanej kriogenicznie była podobna do morfologii SKIN2™ niekonserwowanej kriogenicznie.
Przykład 9: Badanie metabolicznej aktywności mitochondrialnej (MTT)
Zamrożoną i nie zamrożoną (kontrolną) LSE, arkusz naskórkowy, równoważniki skóry i równoważniki rogówki poddano badaniu MTT. (Konstrukcje SKIN2™ badano zgodnie z „protokółem badań MTT do stosowania w przypadku modelu ZK 1300”, załączonym z wkładkami przewozowymi.) Żywotność komórek konstrukcji mierzono zgodnie z badaniem MTT, przy czym w celu zmierzenia wzrostu komórek i ich żywotności przeprowadzono kolorymetryczne badanie konwersji MTT. Badanie to opisano szczegółowo w „The Living Skin Equivalent as a
181 762
Model In Vitro for Ranking the Toxic Potential of Dermal Irritants”, Gay i in., Toxic. in Vitro, 6:303-315(1992). Metaboliczna redukcja rozpuszczalnej soli tetrazolowej do niebieskiego osadu formazanu jest zależna od obecności żywotnych komórek z nienaruszonym działaniem mitochondnalnym. Badanie to służy do ilościowego określania cytotoksyczności w różnych typach komórek, łącznie z hodowanymi ludzkimi keratynocytami.
Do misek hodowlanych zawierających LSE, arkusz naskórkowy i równoważnik skóry, dodano 40 ml medium badawczego, a do zagłębień zawierających równoważniki rogówki dodano 1,5 ml medium badawczego zawierającego 0,33 mg/ml MTT (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Równoważniki tkanek inkubowano w medium badawczym MTT przez 3-4 h. Przy końcu okresu konwersji równoważnik tkanki poddawano biopsji przy użyciu wycinka do pobierania próbek skóry o średnicy 8 mm. Wycięte próbki ekstrahowano następnie przez 2-3 h w temperaturze pokojowej w 0,3 ml izopropanolu zakwaszonego za pomocą 0,04 N HC1. Przy końcu czasu ekstrakcji 0,2 ml każdego ekstraktu przeniesiono do zagłębienia płytki posiadającej 96 zagłębień. Wartości absorpcji odczytywano na czytniku płytkowym (Dynatech) przy 570 nm z zastosowaniem izopropanolowego medium ekstrakcji jako odniesienia. Wartości MTT otrzymane z odmrożonych próbek zakonserwowanych kriogenicznie porównano z analogicznymi próbkami kontrolnymi i wyrażono w procentach wartości dla próbek kontrolnych (fig. 4).
Przykład 10: Badanie dehydrogenazy laktozowej (LDH)
LDH jest enzymem typowo występującym w żywotnej komórce. Uszkodzenie komórki powoduje uwolnienie enzymu i odpowiednie zmniejszenie aktywności tego enzymu wykrywane przez to badanie.
Odmrożone próbki zakonserwowane kriogenicznie i próbki kontrolne LSE poddawano biopsji przez wycinanie próbek skóry o średnicy 8 mm za pomocą wycinaka. Z każdej jednostki LSE pobrano trzy próbki. Wycięte próbki umieszczono w 15 mm probówkach z 1 ml 0,1 M buforowego roztworu trójetanoloaminy (na lodzie) i homogenizowano za pomocą elektronicznego homogenizatora tkanek przez 1 minutę. Następnie próbki wirowano przy 1000 g w temperaturze 4,0°C. Następnie zbadano nadsącz. Reagent koktailu LDH przygotowano przez zmieszanie razem: 3,00 ml buforu fosforanowego (0,1 mol/1; pH 7,0), 0,1 ml pirogronianu, sól sodowa (2,5 mg/ml) oraz 0,05 ml NADH, sól sodowa (10 mg/ml). 100 ml próbki nadsącza dodano do 900 ml reagentów i pozwolono na reagowanie przez 2 minuty. Zapisano zmianę absorpcji po tych dwóch minutach. Średniąz trzech próbek z jednostki LSE poddanej konserwacji kriogenicznej porównano z próbkami kontrolnymi nie zamrożonymi. Wartości próbek porównano z odpowiednimi wartościami kontrolnymi i wyrażono w procentach wartości dla próbek kontrolnych (fig. 4).
Przykład 11: Równoważność biologiczna LSE konserwowanego kriogenicznie wobec LSE niekonserwowanego kriogenicznie
Aby zademonstrować równoważność biologiczną LSE konserwowanego kriogenicznie i niekonserwowanego kriogenicznie przeprowadzono badania przeszczepu myszom pozbawionym grasicy.
Jednostki LSE zakonserwowane kriogenicznie sposobem opisanym w przykładzie 1 zostały odmrożone na jeden dzień przed wszczepieniem i były odtwarzane w mediach podtrzymujących przez 24 godziny.
Przeprowadzono cztery doświadczenia, w których razem 66 myszom pozbawionym grasicy, pochodzącym ze szczepu B6CB6YF 1/J-nu (Jackson Harbor Labs), wszczepiono albo zakonserwowany kriogenicznie LSE (n=43), albo niezakonserwowany kriogenicznie (kontrolny) LSE (n=23). Zwierzęta były usypiane za pomocąNembutalu. Kawałek skóry o pełnej grubości, o wymiarach 2x2 cm, wycięto z grzebietu każdej myszy, oszczędzając panicculus camosus. Wszczepy LSE, kontrolne lub konserwowane kriogenicznie, umieszczono na ranie i przycięto w celu dopasowania. Wszystkie przeszczepy opatrzono jedną warstwą gazy nasyconej wazelinąbiałą (z automatu) i przykryto dwoma bandażami klejącymi (z automatu). Opatrunek zdjęto 7 dni po przeszczepie.
dni po przeszczepie wszystkie zwierzęta uśmiercono i sfotografowano. Miejsce przeszczepu wycięto następnie do analizy histologicznej i oceny. Większość fotografii i mikrofoto
181 762 grafii nie wykazała żadnej różnicy w integracji przeszczepu pomiędzy kontrolnym LSE a odmrożonym LSE konserwowanym kriogenicznie. Nie zaobserwowano żadnej istotnej różnicy pomiędzy przeszczepami kontrolnymi a przeszczepami po konserwacji kriogenicznej, jeśli chodzi o stopnie przykurczu rany.
Przykład 12: Izoprzeszczep skóry myszy konserwowanej kriogenicznie i kontrolnej Aby zademonstrować biologiczną równoważność skóry myszy konserwowanej kriogenicznie i niekonserwowanej kriogenicznie, przeprowadzono badania izoprzeszczepów skóry.
Dzikie myszy szczepu B6CB6YF1 uśmiercono przez przedawkowanie Nembutalu. Skórę zebrano aseptycznie. Ze skóry właściwej przy przygotowaniu do przeszczepu skóry usunięto nadmiar naczyń krwionośnych, tłuszczu i tkanki łącznej. Skórę myszy zakonserwowano kriogenicznie i odmrożono sposobem według przykładu 7. Kontrolną skórę myszy nie poddaną konserwacji kriogenicznej trzymano w mediach odżywczych przy temperaturze 4°C przez czas konserwacji kriogenicznej i odmrażania razem przez dwa dni przed przeszczepem skóry.
Sześć myszy z tego samego szczepu otrzymało przeszczepy skóry, przy czym dwie otrzymały kontrolną skórę myszy niekonserwowaną chemicznie, a cztery otrzymały odmrożoną skórę myszy konserwowaną kriogenicznie. Myszy te uśpiono za pomocąNembutalu. Kawałek skóry o pełnej grubości, o wymiarach 2x2 cm, wycięto z grzbietu każdej myszy, oszczędzając panicculus camosus. Przeszczepy skóry myszy, kontrolne lub konserwowane kriogenicznie, umieszczono na ranach i przycięto w celu dopasowania. Wszystkie przeszczepy opatrzono warstwą gazy nasyconej białą wazeliną i przykryto dwoma bandażami klejącymi. Opatrunki te usunięto po siedmiu dniach od przeszczepu.
Trzydzieści dni po przeszczepie wszystkie zwierzęta uśmiercono i sfotografowano. Miejsce przeszczepu wycięto następnie do analizy histologicznej i oceny. Większość fotografii i mikrofotografii nie wykazała żadnej różnicy w integracji przeszczepu pomiędzy kontrolną skórą myszy a odmrożoną skórą myszy konserwowaną kriogenicznie. Nie było widać żadnych znacznych różnic pomiędzy przeszczepami kontrolnymi a przeszczepami konserwowanymi kriogenicznie, jeśli chodzi o stopień przykurczu rany.
Chociaż powyższy wynalazek opisano szczegółowo na zasadzie ilustracji i przykładu dla ułatwienia zrozumienia, dla fachowca jest oczywiste, że w zakresie podanym przez załączone zastrzeżenia patentowe możliwe jest wprowadzenie pewnych zmian i modyfikacji.
181 762
FIG.3B
181 762
F1G.4B
181 762
FIG.5A
181 762
FIG.6B
FIG.8
181 762 % WARTOŚCI DLA PRÓBKI KONTROLNEJ
FIG. 9
181 762
FIG. ΙΑ
FIG. IB
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (33)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób konserwacji kriogenicznej zebranej skóry ssaka, hodowanej skóry lub równoważnika rogówki, polegający na zanurzaniu tkanki w roztworze konserwantu kriogenicznego oraz pobudzaniu roztworu konserwantu kriogenicznego i zanurzonej tkanki, zaszczepianiu lodu pozakomórkowego w roztworze konserwantu kriogenicznego i w perfundowanej tkance, a następnie chłodzeniu perfundowanej tkanki do stanu zakonserwowanego kriogenicznie i przechowywaniu tkanki konserwowanej kriogenicznie w temperaturze co najwyżej -70°C, znamienny tym, że roztwór konserwantu kriogenicznego i tkanki chłodzi się z prędkością co najwyżej -0,3 °C na minutę.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zanurzanie tkanki w roztworze konserwantu kriogenicznego prowadzi się w środowisku gazowym.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inicjuje się zaszczepianie lodu pozakomórkowego przez kontakt z sondą chłodzoną ciekłym azotem.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po zaszczepieniu lodu obniża się temperaturę z prędkością -1°C na minutę do temperatury -8°C.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że chłodzi się roztwór konserwantu kriogenicznego i tkanki, do stanu zakonserwowanego kriogeniczne, z prędkością co najwyżej -0,2°C na minutę.
- 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że chłodzi się tkankę z prędkością co najwyżej -0,1 °C na minutę.
- 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hodowany równoważnik skóry jest wybrany z grupy obejmującej hodowany równoważnik naskórka, hodowany równoważnik skóry, dwuwarstwowy równoważnik skóry lub trójwarstwowy równoważnik skóry.
- 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że temperatura stanu zakonserwowanego kriogenicznie wynosi co najwyżej -120°C.
- 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że temperatura stanu zakonserwowanego kriogenicznie wynosi co najwyżej -140°C.
- 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że temperatura stanu zakonserwowanego kriogenicznie wynosi co najwyżej -196°C.
- 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako roztwór konserwantu kriogenicznego stosuje się 1,5 M - 2,5 M roztwór gliceryny w podłożu z Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium.
- 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór konserwantu kriogenicznego zawiera co najmniej jeden konserwant kriogeniczny wybrany z grupy składającej się z penetrującego komórkę konserwantu kriogenicznego i niepenetrującego komórki konserwantu kriogenicznego.
- 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że niepenetrującym komórki konserwantem kriogenicznym jest kompleks węglowodanu o wysokim ciężarze cząsteczkowym, zawierający jeden lub więcej członów wybranych z grupy składającej się z siarczanu chondrotiny, poliwinylopirohdonu i glikolu polietylenowego.
- 14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jako niepenetrujący komórki konserwant kriogeniczny stosuje się hetaskrobię.
- 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że hetaskrobiąjest hydroksyetyloskrobia.181 762
- 16. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że penetrujący komórkę konserwant kriogeniczny jest wybrany z grupy zawierającej glicerynę, glikol propylenowy, glikol etylenowy i sulfotlenek dimetylowy.
- 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że jako środek penetrujący komórkę stosuje się glicerynę.
- 18. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że stosuje się konserwant kriogeniczny rozpuszczalny w środowisku wybranym z grupy zawierającej DMEM, IDMEM, MEM, Ml99, RPMI 1640, Ham’sF-12, Ham’s F-10, NCTC 109, NCTC 135, oraz wodny roztwór buforu fosforanowego.
- 19. Sposób według zastrz. 1 albo 11, znamienny tym, że jako roztwór konserwantu kriogenicznego stosuje się 2 M roztwór gliceryny w Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium.
- 20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zanurza się tkankę w roztworze konserwantu kriogenicznego, przy początkowej temperaturze 20°C, a następnie obniża się temperaturę do -6°C.
- 21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że obniża się temperaturę z prędkością -10°C na minutę.
- 22. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się zaszczepianie lodu i zaszczepianie lodu pozakomórkowego w roztworze konserwantu w temperaturze -6° do -8°C.
- 23. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przechowuje się zakonserwowaną kriogenicznie tkankę w temperaturze co najwyżej -70°C.
- 24. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zakonserwowaną kriogenicznie tkankę odmraża się przez 1 do 3 minut.
- 25. Sposób konserwacji kriogenicznej zebranej skóry ssaka, hodowanej skóry lub równoważnika rogówki, polegający na zanurzaniu tkanki w roztworze konserwantu kriogenicznego oraz pobudzaniu roztworu konserwantu kriogenicznego i zanurzonej tkanki, zaszczepianiu lodu pozakomórkowego w roztworze konserwantu kriogenicznego i w perfundowanej tkance, a następnie chłodzeniu perfundowanej tkanki do stanu zakonserwowanego kriogenicznie i przechowywaniu tkanki konserwowanej kriogenicznie w temperaturze co najwyżej -70°C, znamienny tym, że zaszczepia się lód pozakomórkowy w roztworze konserwantu kriogenicznego w temperaturze co najwyżej -6°C oraz chłodzi się roztwór konserwantu kriogenicznego i tkanki z prędkością co najwyżej -0,3°C na minutę.
- 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że przechowuje się zakonserwowaną kriogenicznie tkankę w temperaturze co najwyżej -70°C.
- 27. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że zanurza się tkankę w roztworze konserwantu kriogenicznego przy początkowej temperaturze 20°C.
- 28. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że w etapie zanurzania tkanki w roztworze konserwantu kriogenicznego obniża się temperaturę do -6°C.
- 29. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że w etapie zanurzania tkanki w roztworze konserwantu kriogenicznego obniża się temperaturę z prędkością -10°C na minutę.
- 30. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że hodowany równoważnik tkanki jest wybrany z grupy obejmującej hodowany równoważnik naskórka, hodowany równoważnik skóry, oraz hodowany równoważnik rogówki.
- 31. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że jako roztwór konserwantu kriogenicznego stosuje się 1,5 M - 2,5 M roztwór gliceryny w Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM).
- 32. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że zakonserwowaną kriogenicznie tkankę odmraża się przez 1 do 3 minut.
- 33. Urządzenie do konserwacji kriogenicznej zebranej skóry ssaka, hodowanej skóry lub równoważnika rogówki, znamienne tym, że zawiera miskę (40), mającą kołnierz (43) oraz powierzchnię denną (41) przechodzącą w ściankę boczną (42), przy czym ścianka boczna (42) ma podpory (44), odchodzące od ścianki i skierowane do wewnątrz miski, przy czym te podpory są integralne ze ściankąboczną(42), oraz zawiera nośnik (30), mający płaskąprzepuszczalnąmem181 762 branę (32), przymocowanądo jednego z końców rurowej podpory (33), oraz mający obrzeże (31) na przeciwległym końcu rurowej podpory (33), przy czym to obrzeże (31) jest wsparte przez skierowane do wewnątrz miski podpory (44), ponadto zawiera pokrywę (10), mającą kołnierz (11) oraz płaskąpowierzchnię denną(13) przechodzącąw ściankę boczną (12), przy czym kołnierz (11) ściśle przylega do kołnierza (43) miski (40), oraz zawiera uszczelkę (20) pomiędzy miską (40) a pokrywą (10).* * *
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/380,099 US5891617A (en) | 1993-09-15 | 1995-01-30 | Cryopreservation of harvested skin and cultured skin or cornea equivalents by slow freezing |
| PCT/US1996/001217 WO1996024018A1 (en) | 1995-01-30 | 1996-01-30 | Method and package design for cryopreservation and storage of cultured tisse equivalents |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL321089A1 PL321089A1 (en) | 1997-11-24 |
| PL181762B1 true PL181762B1 (en) | 2001-09-28 |
Family
ID=23499896
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96321089A PL181762B1 (en) | 1995-01-30 | 1996-01-30 | Method of and design of a package for effecting cryogenic preservation and storage of artificially grown human tissue equivalents |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5891617A (pl) |
| EP (2) | EP0807234B1 (pl) |
| JP (4) | JPH11501298A (pl) |
| KR (1) | KR100328742B1 (pl) |
| CN (2) | CN1119599C (pl) |
| AT (2) | ATE282805T1 (pl) |
| AU (1) | AU716869B2 (pl) |
| BR (1) | BR9606864A (pl) |
| CZ (1) | CZ294950B6 (pl) |
| DE (2) | DE69633854T2 (pl) |
| ES (1) | ES2231804T3 (pl) |
| FI (1) | FI113694B (pl) |
| HU (1) | HU223789B1 (pl) |
| NO (1) | NO310491B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ302913A (pl) |
| PL (1) | PL181762B1 (pl) |
| PT (1) | PT807234E (pl) |
| RU (1) | RU2178865C2 (pl) |
| SG (1) | SG106553A1 (pl) |
| SK (1) | SK284801B6 (pl) |
| WO (1) | WO1996024018A1 (pl) |
Families Citing this family (91)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5891617A (en) * | 1993-09-15 | 1999-04-06 | Organogenesis Inc. | Cryopreservation of harvested skin and cultured skin or cornea equivalents by slow freezing |
| US5689961A (en) | 1996-01-30 | 1997-11-25 | Organogenesis Inc. | Ice seeding apparatus for cryopreservation systems |
| GB2330516A (en) * | 1997-10-22 | 1999-04-28 | Elizabeth Acton | Cryopreservation of cell suspensions |
| US6291240B1 (en) * | 1998-01-29 | 2001-09-18 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Cells or tissues with increased protein factors and methods of making and using same |
| WO1999060849A1 (en) | 1998-05-26 | 1999-12-02 | Lifecell Corporation | Cryopreservation of human red blood cells |
| CN1333818A (zh) | 1998-11-19 | 2002-01-30 | 奥加诺吉尼西斯公司 | 生物工程化的组织构建物、其制备方法及其应用 |
| US20010036665A1 (en) * | 1999-03-18 | 2001-11-01 | Susan M. Young | Method of preparing cryogenically preserved adherent cell containing plate for tissue culture applications |
| US6576265B1 (en) | 1999-12-22 | 2003-06-10 | Acell, Inc. | Tissue regenerative composition, method of making, and method of use thereof |
| US6579538B1 (en) | 1999-12-22 | 2003-06-17 | Acell, Inc. | Tissue regenerative compositions for cardiac applications, method of making, and method of use thereof |
| US20040043006A1 (en) * | 2002-08-27 | 2004-03-04 | Badylak Stephen F. | Tissue regenerative composition |
| CA2403273A1 (en) * | 2000-03-14 | 2001-09-20 | Alnis Biosciences, Inc. | Cryoprotective system |
| JP4204784B2 (ja) * | 2000-03-24 | 2009-01-07 | 株式会社メニコン | 組織等価物の凍結保存方法および凍結保存された組織等価物 |
| US6521402B1 (en) | 2000-06-14 | 2003-02-18 | The Texas A&M University System | Cryopreservation of tissues for use in nuclear transfer |
| US20020069649A1 (en) * | 2000-12-08 | 2002-06-13 | Ardais Corporation | Container for cryopreserved material |
| DE10061968A1 (de) * | 2000-12-13 | 2002-06-20 | Friedrich Hoffmann | Verfahren und Vorrichtung zum Einfrieren von Hornhautgewebe |
| AU2002226094A1 (en) * | 2000-12-15 | 2002-06-24 | The Texas A And M University System | Cloning bovines by nuclear transplantation |
| WO2002058588A2 (en) * | 2000-12-27 | 2002-08-01 | Ortec International, Inc. | Processes for making cryopreserved composite living constructs and products resulting therefrom |
| RU2003124058A (ru) * | 2001-01-02 | 2005-01-10 | Сьюпачилл Текнолоджиз Пти. Лтд. (Au) | Способ и система приготовления образцов тканей для гистологического и патологического исследования |
| WO2003024496A1 (en) * | 2001-09-05 | 2003-03-27 | Hans Biomed Corporation | A process for preparing a biomaterial for tissue repair |
| WO2003024213A1 (en) * | 2001-09-17 | 2003-03-27 | Provincia Italiana Della Congregazione Dei Figli Dell'immacolata Concezione - Istituto Dermopatico Dell'immacolata | Case for the protection and the transportation of epidermis or skin grafts cultivated in vitro from a skin graft cut from a donor |
| US6656380B2 (en) | 2001-10-16 | 2003-12-02 | Supachill Technologies Pty. Ltd. | Super-coolable composition having long-duration phase change capability, process for preparation of same, process for super-cooling same and articles comprising same |
| DE10151296A1 (de) * | 2001-10-17 | 2003-04-30 | Boehringer Ingelheim Pharma | Keratinozyten verwendbar als biologisch aktive Substanz bei der Behandlung von Wunden |
| WO2003037082A1 (en) * | 2001-11-01 | 2003-05-08 | Integrated Biosystems, Inc. | Systems and methods for freezing, storing and thawing biopharmaceutical material |
| US6681581B2 (en) | 2001-11-20 | 2004-01-27 | Supachill Technologies Pty. Ltd. | Pre-conditioned solute for use in cryogenic processes |
| AU2003219830A1 (en) * | 2002-02-22 | 2003-09-09 | Ebi, L.P. | Methods and compositions for treating bone or cartilage defects |
| WO2004011616A2 (en) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | The General Hospital Corporation | Systems and methods for cell preservation |
| WO2004010780A2 (en) * | 2002-07-30 | 2004-02-05 | General Biotechnology, Llc | Innocuous intracellular ice |
| WO2004069156A2 (en) * | 2003-01-30 | 2004-08-19 | The Regents Of The University Of California | Inactivated probiotic bacteria and methods of use thereof |
| US20040176855A1 (en) * | 2003-03-07 | 2004-09-09 | Acell, Inc. | Decellularized liver for repair of tissue and treatment of organ deficiency |
| US20040175366A1 (en) * | 2003-03-07 | 2004-09-09 | Acell, Inc. | Scaffold for cell growth and differentiation |
| WO2005002601A1 (en) | 2003-06-25 | 2005-01-13 | Badylak Stephen F | Conditioned matrix compositions for tissue restoration |
| WO2005118785A1 (en) | 2004-06-02 | 2005-12-15 | Es Cell International Pte Ltd | Cell preservation method |
| CN100386061C (zh) * | 2005-05-17 | 2008-05-07 | 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 | 一种经冰冻处理的低抗原的异种角膜基质及制备方法 |
| WO2007038629A2 (en) | 2005-09-26 | 2007-04-05 | Lifecell Corporation | Dry platelet composition |
| BRPI0621107A2 (pt) * | 2005-12-22 | 2011-11-29 | Jane Ennis | método de recuperação de células viáveis do tecido de cordão umbilical, método de preservação da viabilidade de células presentes no tecido de cordão umbilical, tecido de cordão umbilical e método de recuperação de hucpvcs viáveis |
| KR101039758B1 (ko) | 2006-04-28 | 2011-06-09 | 젤티크 애스세틱스, 인코포레이티드. | 피하 지질 과다 세포의 개선된 냉각을 위한 치료 장치와함께 사용하기 위한 동결 방지제 |
| WO2008022651A1 (en) | 2006-08-21 | 2008-02-28 | Antoine Turzi | Process and device for the preparation of platelet rich plasma for extemporaneous use and combination thereof with skin and bone cells |
| US8192474B2 (en) | 2006-09-26 | 2012-06-05 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Tissue treatment methods |
| US20080077201A1 (en) | 2006-09-26 | 2008-03-27 | Juniper Medical, Inc. | Cooling devices with flexible sensors |
| US9132031B2 (en) | 2006-09-26 | 2015-09-15 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Cooling device having a plurality of controllable cooling elements to provide a predetermined cooling profile |
| US20080287839A1 (en) | 2007-05-18 | 2008-11-20 | Juniper Medical, Inc. | Method of enhanced removal of heat from subcutaneous lipid-rich cells and treatment apparatus having an actuator |
| US8523927B2 (en) | 2007-07-13 | 2013-09-03 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | System for treating lipid-rich regions |
| US8285390B2 (en) | 2007-08-21 | 2012-10-09 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Monitoring the cooling of subcutaneous lipid-rich cells, such as the cooling of adipose tissue |
| US8603073B2 (en) | 2008-12-17 | 2013-12-10 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Systems and methods with interrupt/resume capabilities for treating subcutaneous lipid-rich cells |
| EP2221362A1 (en) * | 2009-02-19 | 2010-08-25 | Naturin GmbH & Co | Method for the cryopreservation of cells, artificial cell constructs or three-dimensional complex tissues assemblies |
| EP2769703B1 (en) | 2009-04-30 | 2022-04-06 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Device for removing heat from subcutaneous lipid-rich cells |
| BR112012018521A2 (pt) | 2010-01-25 | 2019-09-24 | Zeltiq Aesthetics Inc | aplicadores para uso doméstico para remover de forma não invasiva calor de células subcutâneas ricas em lipídeos por meio de refrigerantes de mudança de fase, e dispositivos, sistemas e métodos associados |
| EP2536825B1 (en) | 2010-02-18 | 2024-03-27 | Osiris Therapeutics, Inc. | Immunocompatible amniotic membrane products |
| KR101089614B1 (ko) * | 2010-02-26 | 2011-12-05 | (주)시지바이오 | 무세포 진피 기질의 제조 방법 및 그로부터 제조된 무세포 진피 기질 |
| GB201004072D0 (en) | 2010-03-11 | 2010-04-28 | Turzi Antoine | Process, tube and device for the preparation of wound healant composition |
| CN103179852B (zh) * | 2010-05-28 | 2015-04-08 | 格尼亚有限公司 | 改良的显微操作和储存装置以及方法 |
| US8676338B2 (en) | 2010-07-20 | 2014-03-18 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Combined modality treatment systems, methods and apparatus for body contouring applications |
| EP2616025A4 (en) * | 2010-09-13 | 2015-02-18 | Singapore Health Serv Pte Ltd | METHOD FOR REALIZING A REVERSIBLE REFRACTION PROCEDURE |
| JP5915977B2 (ja) * | 2011-11-29 | 2016-05-11 | 学校法人明治大学 | 凍結細胞シートの製造方法 |
| EP2854824A1 (en) | 2012-05-25 | 2015-04-08 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Use of keratinocytes as a biologically active substance in the treatment of wounds, such as diabetic wounds, optionally in combination with a dpp-4 inhibitor |
| DE102012013267A1 (de) | 2012-07-04 | 2014-01-09 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Substrateinrichtung, Konservierungsgerät und Verfahren zur Kryokonservierung einer biologischen Probe |
| TW201422155A (zh) | 2012-07-06 | 2014-06-16 | Arigos Biomedical Inc | 以氣體灌注快速冷卻與升溫預防玻璃質化組織受熱-力破壞的方法與裝置 |
| ES2705043T3 (es) * | 2013-03-13 | 2019-03-21 | Stratatech Corp | Criopreservación de sustitutos de piel humana viables |
| US9844460B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-12-19 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Treatment systems with fluid mixing systems and fluid-cooled applicators and methods of using the same |
| US9545523B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-01-17 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Multi-modality treatment systems, methods and apparatus for altering subcutaneous lipid-rich tissue |
| US10575890B2 (en) | 2014-01-31 | 2020-03-03 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Treatment systems and methods for affecting glands and other targeted structures |
| US10675176B1 (en) | 2014-03-19 | 2020-06-09 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Treatment systems, devices, and methods for cooling targeted tissue |
| USD777338S1 (en) | 2014-03-20 | 2017-01-24 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Cryotherapy applicator for cooling tissue |
| US10952891B1 (en) | 2014-05-13 | 2021-03-23 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Treatment systems with adjustable gap applicators and methods for cooling tissue |
| US10568759B2 (en) | 2014-08-19 | 2020-02-25 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Treatment systems, small volume applicators, and methods for treating submental tissue |
| US10935174B2 (en) | 2014-08-19 | 2021-03-02 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Stress relief couplings for cryotherapy apparatuses |
| JP6130868B2 (ja) * | 2015-02-19 | 2017-05-17 | テルモ株式会社 | 単離されたシート状細胞培養物の製造方法 |
| ES2892598T3 (es) | 2015-10-19 | 2022-02-04 | Zeltiq Aesthetics Inc | Métodos de tratamiento vascular para enfriar estructuras vasculares |
| AU2017206118B2 (en) | 2016-01-07 | 2021-09-30 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Temperature-dependent adhesion between applicator and skin during cooling of tissue |
| US10765552B2 (en) | 2016-02-18 | 2020-09-08 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Cooling cup applicators with contoured heads and liner assemblies |
| US10682297B2 (en) | 2016-05-10 | 2020-06-16 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Liposomes, emulsions, and methods for cryotherapy |
| US11382790B2 (en) | 2016-05-10 | 2022-07-12 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Skin freezing systems for treating acne and skin conditions |
| US10555831B2 (en) | 2016-05-10 | 2020-02-11 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Hydrogel substances and methods of cryotherapy |
| MX2019003680A (es) | 2016-10-04 | 2019-09-26 | Membrane Protective Tech Inc | Sistemas y metodos para crioprotectores naturales para la preservacion de celulas. |
| CN110461149A (zh) | 2017-01-27 | 2019-11-15 | 斯特拉塔泰克公司 | 组织容器系统 |
| AU2018214954B2 (en) * | 2017-02-01 | 2023-07-13 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Devices for tissue cryopreservation and recovery |
| RU2650694C1 (ru) * | 2017-02-15 | 2018-04-17 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна" (ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России) | Способ эффективной и безопасной криоконсервации донорских сосудистых трансплантатов, обеспечивающий оптимизацию их дальнейшего процессинга - радиационной стерилизации и децеллюляризации |
| US11076879B2 (en) | 2017-04-26 | 2021-08-03 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Shallow surface cryotherapy applicators and related technology |
| WO2019124339A1 (ja) * | 2017-12-18 | 2019-06-27 | テルモ株式会社 | 保護機構を具備する脆弱物保持デバイス |
| WO2020028472A1 (en) | 2018-07-31 | 2020-02-06 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Methods, devices, and systems for improving skin characteristics |
| JP7398434B2 (ja) * | 2018-08-30 | 2023-12-14 | ザ キュレイターズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミズーリ | 試料と細胞外氷との直接接触を防ぐのに有効な凍結保存装置 |
| US11154052B2 (en) | 2018-09-14 | 2021-10-26 | University Of Miami | Dual-chamber vial for corneal graft preservation |
| WO2020061429A1 (en) | 2018-09-20 | 2020-03-26 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of tils from cryopreserved tumor samples |
| CA3127191A1 (en) | 2019-01-21 | 2020-07-30 | Eclipse Medcorp, Llc | Methods, systems and apparatus for separating components of a biological sample |
| US10610280B1 (en) | 2019-02-02 | 2020-04-07 | Ayad K. M. Agha | Surgical method and apparatus for destruction and removal of intraperitoneal, visceral, and subcutaneous fat |
| CA3159372A1 (en) | 2019-10-31 | 2021-05-06 | Eclipse Medcorp, Llc | Systems, methods and apparatus for separating components of a sample |
| RU2731287C1 (ru) * | 2019-11-21 | 2020-09-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СПбГПМУ Минздрава России) | Пробирка для криоконсервации ткани яичников |
| RU2731065C1 (ru) * | 2019-12-24 | 2020-08-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (ИБР РАН) | Состав криоконсерванта для длительного хранения первичных кератиноцитов |
| WO2022025240A1 (ja) * | 2020-07-31 | 2022-02-03 | 学校法人同志社 | 角膜内皮細胞を保存するための方法および容器 |
| WO2023196877A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies |
| WO2023220608A1 (en) | 2022-05-10 | 2023-11-16 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist |
Family Cites Families (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2348448A (en) * | 1942-02-16 | 1944-05-09 | Kimble Glass Co | Apparatus for the cultivation of anaerobic and microaerophilic organisms |
| US3842831A (en) * | 1972-10-27 | 1974-10-22 | Genetic Labor Inc | Cellular skin patch |
| FR2486915A1 (fr) * | 1980-07-21 | 1982-01-22 | Biomerieux Sa | Boite etanche a fermeture par joint |
| US4539716A (en) * | 1981-03-19 | 1985-09-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Fabrication of living blood vessels and glandular tissues |
| US4546500A (en) * | 1981-05-08 | 1985-10-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Fabrication of living blood vessels and glandular tissues |
| US4485096A (en) * | 1982-02-26 | 1984-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Tissue-equivalent and method for preparation thereof |
| US4485097A (en) * | 1982-05-26 | 1984-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Bone-equivalent and method for preparation thereof |
| FR2558337B1 (fr) * | 1984-01-19 | 1986-05-02 | Air Liquide | Dispositif de congelation de produits biologiques conditionnes en paillettes |
| US5084377A (en) * | 1984-09-19 | 1992-01-28 | Larry Rowan | Cryogenic suspension method |
| US4604346A (en) * | 1984-10-09 | 1986-08-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Skin-equivalent prepared by the use of punch biopsy |
| US5026649A (en) * | 1986-03-20 | 1991-06-25 | Costar Corporation | Apparatus for growing tissue cultures in vitro |
| US4890457A (en) * | 1987-01-02 | 1990-01-02 | Cryolife, Inc. | Method for cryopreserving heart valves |
| IT1207525B (it) * | 1987-06-23 | 1989-05-25 | Ist Naz Ric Sul Cancro | Metodo per la preservazione difogli trapiantabili di epitelio coltivato in vitro vitale. |
| US4978540A (en) * | 1988-01-20 | 1990-12-18 | Lee Tung Ching | Production of frozen foods and other products |
| US5194269A (en) * | 1988-01-20 | 1993-03-16 | Lee Tung Ching | Production of frozen foods and other products |
| US4837379A (en) * | 1988-06-02 | 1989-06-06 | Organogenesis Inc. | Fibrin-collagen tissue equivalents and methods for preparation thereof |
| CA1335723C (en) * | 1988-08-04 | 1995-05-30 | Thomas Glonek | Method and composition for cryopreservation of tissue |
| CA2000181A1 (en) * | 1988-10-14 | 1990-04-14 | Chung-Faye Chao | Process for producing cultured epidermal sheet, product and method of use |
| JPH0651601B2 (ja) * | 1988-10-27 | 1994-07-06 | 伊藤忠飼料株式会社 | 豚の凍結受精卵及び凍結保存方法 |
| JPH02300101A (ja) * | 1989-05-12 | 1990-12-12 | Tabai Espec Corp | 生物試料凍結保存装置における植氷方法および植氷装置 |
| US4988302A (en) * | 1989-06-08 | 1991-01-29 | Difco Laboratories Incorporated | Culture media package |
| US5131850A (en) * | 1989-11-03 | 1992-07-21 | Cryolife, Inc. | Method for cryopreserving musculoskeletal tissues |
| CA2068993A1 (en) * | 1989-11-20 | 1991-05-21 | George John Morris | Cooling process and apparatus |
| US5040677A (en) * | 1990-06-04 | 1991-08-20 | Biosurface Technology, Inc. | Container for storage and distribution of a skin wound dressing |
| US5145770A (en) * | 1990-06-04 | 1992-09-08 | Biosurface Technology, Inc. | Cryopreservation of cultured epithelial sheets |
| US5336616A (en) * | 1990-09-12 | 1994-08-09 | Lifecell Corporation | Method for processing and preserving collagen-based tissues for transplantation |
| JPH04365434A (ja) * | 1991-06-12 | 1992-12-17 | Oji Paper Co Ltd | 不定根および／または毛状根の凍結保存法 |
| JP3672201B2 (ja) * | 1991-12-26 | 2005-07-20 | 雪印乳業株式会社 | 哺乳動物胚移植用ストロー及びその製造法 |
| US5366893A (en) * | 1993-01-13 | 1994-11-22 | Becton, Dickinson And Company | Culture vessel |
| US5518878A (en) * | 1993-09-15 | 1996-05-21 | Organogenesis Inc. | Cryopreservation of cultured skin or cornea equivalents with agitation |
| US5891617A (en) * | 1993-09-15 | 1999-04-06 | Organogenesis Inc. | Cryopreservation of harvested skin and cultured skin or cornea equivalents by slow freezing |
| US5689961A (en) * | 1996-01-30 | 1997-11-25 | Organogenesis Inc. | Ice seeding apparatus for cryopreservation systems |
-
1995
- 1995-01-30 US US08/380,099 patent/US5891617A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-01-30 JP JP8523665A patent/JPH11501298A/ja not_active Withdrawn
- 1996-01-30 RU RU97116150/13A patent/RU2178865C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 PT PT96905275T patent/PT807234E/pt unknown
- 1996-01-30 CN CN96191673A patent/CN1119599C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-30 DE DE69633854T patent/DE69633854T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-30 SG SG9802806A patent/SG106553A1/en unknown
- 1996-01-30 AU AU49082/96A patent/AU716869B2/en not_active Ceased
- 1996-01-30 AT AT96905275T patent/ATE282805T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 WO PCT/US1996/001217 patent/WO1996024018A1/en active IP Right Grant
- 1996-01-30 DE DE69637301T patent/DE69637301T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-30 AT AT04077072T patent/ATE376356T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 PL PL96321089A patent/PL181762B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 NZ NZ302913A patent/NZ302913A/en unknown
- 1996-01-30 SK SK1033-97A patent/SK284801B6/sk unknown
- 1996-01-30 KR KR1019970705324A patent/KR100328742B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 CZ CZ19972413A patent/CZ294950B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 ES ES96905275T patent/ES2231804T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-30 EP EP96905275A patent/EP0807234B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-30 HU HU9800411A patent/HU223789B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 BR BR9606864A patent/BR9606864A/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 EP EP04077072A patent/EP1516532B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-30 CN CNB031457983A patent/CN1292651C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-06-16 FI FI972563A patent/FI113694B/fi active
- 1997-07-28 NO NO19973463A patent/NO310491B1/no unknown
-
2006
- 2006-07-10 JP JP2006188993A patent/JP4361550B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-01-04 JP JP2007000107A patent/JP2007161723A/ja not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-12-27 JP JP2013272171A patent/JP2014065736A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL181762B1 (en) | Method of and design of a package for effecting cryogenic preservation and storage of artificially grown human tissue equivalents | |
| US5964096A (en) | Method and package design for cryopreservation and storage of cultured tissue equivalents | |
| KR100361357B1 (ko) | 배양된 조직등가물의 동결보존법 | |
| JP2722134B2 (ja) | 培養上皮細胞シートの凍結保存 | |
| CA1310588C (en) | Method for cryopreserving heart valves | |
| CN112638157A (zh) | 一种防止样品和细胞外冰直接接触的有效低温保存装置 | |
| JP2004520828A (ja) | 凍結保存された複合生体構築物の製造方法および該方法から得られる製造物 | |
| CA2210532C (en) | Method and package design for cryopreservation and storage of cultured tissue equivalents | |
| JPH09110601A (ja) | 培養上皮細胞シートの凍結保存 | |
| JP2008092801A (ja) | 組織由来細胞の凍結保存方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20080130 |