CN1119599C - 培养皮肤组织相同物的冷藏和贮存的方法以及设备 - Google Patents

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Abstract

本发明为获取的哺乳动物组织和体外技术制备的活培养组织相同物的一种有效的冷藏包装设计。本发明包括将哺乳动物组织或培养组织相同物浸入到冷藏液中，搅拌冷藏液和浸入的组织，使冷藏液有效地侵透组织，然后，以缓慢的冷冻速度冷冻组织。在冷冻步骤中，通过引入晶种引发胞外冰的形成，在使用前，冷藏组织可无限期贮存。培养组织相同物是相同人类组织，如皮肤或角膜，的体外标本，当从贮存处取回后，可用于体内移植或植入，或体外筛选化合物。

Description

培养皮肤组织相同物的冷藏 和贮存的方法以及设备
                        发明背景
1.发明领域
本发明涉及获取的组织及用体外技术得到的培养组织相同物的冷冻保藏。本发明还涉及获取的组织和培养组织相同物的冷藏包装设计，该设计成本低，易于处理，并使冷藏的组织或组织相同物具有最大的成活力，利用该冷藏技术，无论是冷藏的获取组织或冷藏的培养组织，在使用前可无限期的贮存，培养组织是相同的人类组织的体外标本，当从贮存处取回后，可用于体内移植或植入，或用于体外筛选化合物。
2.发明背景简述
体外技术已经发展了组织相同物(tissue equivalents)，用于体外检测或体内移植修复伤口。制备此类组织相同物的方法见US专利号4,485,096，4,604,346，4,835,102和5,374,515，和US专利申请序号08/193,809和08/337,830；所有的这些文献都列入本文作为参考文献。
活组织的贮存期是有限的，其次，其使用期也很短，因而造成极大的浪费。当运输和贮存，需将这些组织保存更长的时间，直至使用。用于冷藏和贮存的冷藏方法和包装技术的发展，将无限期地延长组织的使用寿命，使运输变得容易，并允许长时间库存。使组织能在烧伤康复中心和医院库存，也是希望的，其它的优点是从处于生产周期的不同阶段保留样品用于质量控制归档，和当样品维持在冷冻状态时，可进行大批量生产。
通常，冷却到“深冷”温度，可延长细胞生物材料的贮存期。当结晶(冰)时，涉及水分子的有序排列，或当玻璃化或非晶化(形成玻璃态)时，即不存在结晶相的有序排列，可通过降低系统的温度，使其从液相转变为固相。低温生物学家面临的挑战是将细胞带到深冷温度，再将其带回到生理条件下而不损伤它们。
有两种基本的方法用于冷藏细胞和组织：冻—融法和玻璃化法。运用冻融技术时，胞外溶液被冷冻(即结晶形式)，但采用步骤最大限度地减少胞内冰的形成。在玻璃化步骤中，则试图阻止整个样品形成冰。前一种方法存在些问题，如果冰晶在细胞内形成，则融化时，对细胞的成活力是不利的。然而，如果在无毒量的冷藏液存在下，以控制的速度冷却，经过一个冻融周期，细胞是能存活的。后一种玻璃化法通过采用高浓度的溶质和/或聚合物来抑制冰的形成，从而避免胞内和胞外冰的潜在危害。然而，细胞长期暴露于玻璃化法所需这些添加剂的有毒环境中，必会受到损伤。
冷藏液保护活细胞免受在冷冻过程中的损害，冷藏液保护细胞的一条途径是稀释盐浓度，因为随着水变成冰，在未结冰的溶液中，盐浓度急剧增加。冰的数量由温度和溶液起始组成来决定；而未结冰部分的数量仅是温度的函数，冷藏液还具有几种其它功能。一种重要的功能是它们通常能降低胞内冰形成的温度，另一种功能是它们能稳定膜和蛋白质。
所有的溶液都过冷到冰点之下，直至发现一随机的结晶形成的成核点。当用冻融法冷藏时，在低程度过冷下，引入晶种，可审慎地引发胞外基质中冰的形成。如果不用引入晶种诱导冰的形成，则当溶液冷至远远低于其平衡冰点时，冰将自发形成。由于此过程的随机性，因而冰的形成也将是随机的，不可预测温度；继之，在采用相同冷冻法的重复实验之间，其成活率是大不相同的。进一步，极其快速的结晶会导致如下结果：当冰在高度低冷的溶液中形成，会损伤细胞和组织。更进一步表明，如果胞外冰的形成是在高度过冷时引发的，则胞内冰的形成的可能性将急剧增加。这种现象的产生是因为延迟了冷冻诱导细胞脱水的开始，将导致保留的胞内水增加，细胞中冰形成的可能性增加。
一旦胞外冰被引入晶种，样品便由冰相包围。必需将样品冷却到冷藏状态。在冻融技术中，冷却是最重要的步骤之一。由于冰的形成，即纯水。部分冷冻的胞外溶液其浓度较胞内间隔中的更大。结果，在试图恢复热力学平衡时，通过失去水分使细胞脱水。随着系统的冷却，产生更多的胞外冰，溶质的浓度上升，迫使细胞进一步脱水，细胞的三种特性控制其脱水速率。一是细胞膜的透水性；其透水性越差，细胞脱水所需的时间越长。另一种是细胞膜透水性的温度依赖性；所有的细胞随着温度的降低其透水性降低。最后一种是细胞的大小；大细胞较小细胞需更长的时间脱水。已知每一种细胞类型可能具有完全不同的特性，因此最适冷藏条件依不同细胞类型的大小顺序而多化。
虽然在冷藏中细胞损伤的准确机理还不完全清楚，但是通过测定细胞成活产生的，作为冷却速度函数的特征成活符号似乎对所有的细胞类型在性质上都是相似的，并显示出逆转的U型曲线。在很慢和很快的冷却速度下，细胞成活都很低；存在一中间冷却速度，产生最佳的成活力，虽然对于不同的细胞类型，最适冷却速度和曲线的宽度会发生剧烈变化，但其定性特征似乎是通用的。快速冷却，使细胞不具备足够的时间脱水，于是细胞内部结冰。快速冷却时细胞受损，应归于胞内冰的形成。在慢速冷却时细胞受损，被认为是由于将其暴露到高浓度的胞内和胞外盐及冷藏液中，或由于细胞和胞外冰间的相互机械作用造成的。
在跨越胞内冰的成核曲线前，必需尽可能地使细胞脱水。实际上正是在此处，细胞内残留的所有水分将成核，结冰。要确定此处的准确温度是不实际的，但是，在1M到2M浓度的冷藏液存在下，当细胞慢慢冷冻时，它大约是-40℃到-50℃。在冷冻时，在此处细胞内转化成冰的水的数量是无害的，但是，在融化时，如果没有融化得足够快，它将膨胀，并杀死细胞，注意这点是很重要的。(器官冷藏的生物物理，Pg 117-140，edited by David E.Pegg和Armand M.Karow，Jr.NATOASI Series A：生命科学Vol.147 1987 Plenum Press，New York 233 SpringSt.，New York，NY 10013)。
在产业上活皮肤相同物开发之前，是用尸体的皮肤来进行皮肤移植。冷藏方法的发展使得烧伤中心和医院能拥有皮肤库。大量不同的冷藏方法发展起来，它们利用不同的冷藏液，不同的冷冻速度、包装格式和贮存条件。大多数研究者赞同快速融化法，这种方法的成败通过对损伤处的移植或检测细胞成活力来衡量。
在美国专利3,842,831中，Beisang发表了冷藏尸体皮肤块的方法。该方法包括将尸体皮肤附着到一稀松编织的麻布或支持物上，在冷冻前，将皮肤块和麻布卷在一起。没有加入冷藏液，虽然发明者建议可用甘油或DMSO。该冷冻法采用快速非控制(固定温度)冷冻速度直到-70℃低温。
May SR和FA DeClement( 皮肤库方法学，17，33-45(1980))评价了利用生皮节尸体皮肤的包装几何学和冷却与加温速度，结果表明尸体皮肤最好是平坦，而不是卷起来的，应采用慢些的控制的冷冻速度。
在美国专利5,040,677中，Tubo发表了一个不漏气的可密封的容器，可用于上皮细胞层的单独移植。该容器要求用夹子将上皮细胞层连到一片状粘性物质或支持物上。
在美国专利5,145,770中，Tubo发表了一种冷藏角质化细胞层的方法，该方法采用一种非细胞渗透液如葡聚糖和一种细胞渗透液如甘油做冷藏液，冷冻速度约为-1℃/分钟。与此类似，Chao等在EP 0364306中发表了一种冷藏活的培养上皮细胞层的方法，但利用了DMSO和甘油作为冷藏液，选择的冷冻方法是-1℃/分钟。
在美国专利5,298,417中，Cancedda等发表了一种冷藏单层构建物如上皮层的方法，其制备法见美国专利4,016,036，4,304,866和4,456,687。将上皮层同冷藏液，或是8-15％的甘油，或是DMSO，一起保温，用控制速度法进行冷藏，在此，冷冻速度在开始时慢于结束时，其特征是在冷冻步骤完成之前有一温度的增加。
Teasdale等研究了在胶原凝胶上冷藏真皮成纤维细胞的方法， 烧 伤，19(5)406-410(1993)。Teasdale确定，用DMSO作为冷藏液，以--0.5℃/分钟速度进行冷冻，可获得最佳细胞成活力。
Nanchahal等，“培养的合成皮肤移植物：生物皮肤相同物允许大规模的发展，”The Lancet，2(8565)，191-193(July 22，1989)，讨论了一种用于贮存合成培养组织移植物的技术，该技术利用在培养基199中的15％甘油和10％ FCS作为冷藏液。将移植物和冷藏液在37℃保温2小时，再以-1℃/分钟的速度冷冻至-70℃，然后贮存在液氮中。当将移植物快速融化后，通过培养2周和将其移植到无毛小鼠中来测定其成活力。最后，将其移植到三个切除纹身的病人身上，再做最后估价。
Johnstone等，“在-18到-24℃冷藏兔子和猫的角膜”，角膜，11(3)：211-220(1992)，提出了一个冷藏兔子和猫角膜的简单方法，该方法利用家用冷柜而不是在液氮中或低温冷柜中保藏。将角膜逐次放入具有递增的甘油和葡萄糖含量的一系列50％胎牛血清和McCarey-Kaufman培养基中，可使冷藏流充满样品。
用前述现有技术的方法不可能冷藏培养组织相同物，部分原因是这些相同物相对厚些，并且有异质细胞层。这些组织在体内的功能之一是提供一个渗透屏障。在发展冷藏方法时，必需考虑组织的功能。
本发明人发现了一种冷藏方法，特别是一种包装设计，适用于大量的培养组织相同物和哺乳动物皮肤。对于冷藏培养组织相同物，这种包装是令人惊异的有效和在产业上实用。
                  发明概述
本发明提供了一种在非常低的温度下成功冷藏培养组织相同物的方法，避免了有害的胞内冰晶的形成，最大限度地减少潜在有害化学物的有效浓度，并且利用可编程的冷冻仪器，在适宜的温度下允许冷藏液的迅速导入和除去。
本发明还提供了一种新的包装设计，用于培养组织相同物的冷藏、贮存和分配。与现有的包装设计相比，新的包装设计具有许多优点。现在，通过商业渠道买不到冷藏的培养组织相同物，因此，也得不到现货供应的包装设计，由于具有更有效的热传递，新的包装设计使包装内部的温度能更好地跟踪外部的冷室温度，一种改进的热传递速度可以供一个更能控制的过程之用；因此，有了培养组织相同物均匀的冷冻和加热速度，减少了细胞成活力的可变性。
发明人发现了一种冷藏由体外技术制备的培养组织相同物的方法，因而这些组织作为人类组织的相同物能维持其成活力和利用性。本发明包括利用搅拌增进有效数量冷藏液的渗透。本发明方法以保护结构完整性.和细胞成活力的方式对获得的组织和培养的组织相同物提供冷藏。
本发明的方法包括下列步骤：
1)将获得的组织或培养组织相同物浸入冷藏液中，搅拌，使冷藏液有效地浸透组织(充满组织)；和
2)在冷藏液浸透组织后，将其冷却到冷藏液的固-液相平衡温度；引入胞外冰晶种，然后以缓慢的速度将组织冷冻到至少等于或低于-70℃，更好是等于或低于-120℃，再如是-140℃，最好是-196℃，使之达到冷藏状态。
一旦冷冻了，冷藏组织便可在约-120℃到约-196℃，液氮的温度，这样的温度之间，被无限期的贮存。
快速加热冷冻的组织，通常在1到2分钟内，可融化冷藏的组织，通过直接施加加热的培养基或加入生理缓冲液或采用其它快速加热法，可将冷冻的组织融化，由于在其关键的融化过程中保持无菌的同时，该包装设计确保了一个极快的加热速度和控制的热均匀性，因而可将包装设计浸入水浴中而使组织融化。
在作为人类组织相同物用于移植或体外检测前，将融化的培养组织相同物进行清洗，以除去冷藏液。例如，用生理pH下的等渗缓冲液可清洗除去冷藏液。在使用前，培养组织相同物可暂时贮存在这种缓冲液中或在适当的细胞培养基中重新培养。
                    图示说明
图1A和1B为盖子的图示。
图2为密封垫的俯视图。
图3A和3B示出安装到盖子上的密封垫的视图。
图4A和4B示出载体的视图。
图5A和5B示出盘子的视图。
图6A和6B为组装物的侧视图，部件分解图和完成装配图。
图7为组装物的细部图。
图8为组装物完成装配的俯视图。
图9为冷藏培养组织与非冷藏培养组织的成活力的比较图表，图表中列出了由MTT测定的冷藏培养组织的成活力。LSE是附加地再由LDH法测定。所有的培养组织同年龄相当的非冷藏对照进行比较，结果以对照的百分比来表示。
                发明的详细描述
组织工程(tissue engineering)是一个新兴领域，它利用培养的组织细胞构建组织相同物，这些组织相同物可用于检查对化学试剂或药物损伤的反应，也可用于构成移植的人类组织。
组织相同物已在许多专利中广泛详尽地加以描述，包括美国专利号，4,485,906；4,485,097；4,539,716；4,546,500；4,604,346；4,837,379；和5,374,515，所有的这些专利都引入本文作为参考文献，组织相同物的一个成功的应用是“活皮肤相同物”，它与真正的人类皮肤在形态学上相似。活皮肤相同物(LSE)由两层组成：上层由分化和分层的人类表皮角质化细胞构成，它复盖在由位于胶原基质中的人类真皮成纤维细胞构成的下层上面。Parenteau，等“体外形成表皮：实际考虑和应用，”J·of Cellular Biochemistry，45：245-251(1991)；Parenteau，等，“人类皮肤角质化细胞和成纤维细胞的器官型培养以实现结构和功能”，Cytotechnology，9：163-171(1992)；和Bell等“活皮肤相同物：制造，器官性质和对刺激的反应，”Toxic.in Vitro，5：591-596(1991)。用于移植的LSE正在进行临床试验，以指出与部分和全厚度皮肤损伤的关系，这些损伤包括：切除手术，烧伤，静脉停滞溃疡，糖尿病溃疡，褥疮溃疡，和慢性炎症溃疡。LSE是全厚度，双层的体外工程皮肤组织。
眼角膜体外器官相同物也已被开发出来，见美国专利号5,374,515，并入本文作为参考文献。角膜组织相同物有三层性质截然不同的细胞层，最外层为分层的鳞状上皮，中层为胶原纤维和基质细胞，内层为简单的鳞状上皮，也叫角膜内皮。在体外毒性实验中，可使用体外角膜相同物充当体内的对于不同类型的产物和粗物质产生的眼和真皮刺激电位的精确便宜的非动物预测标本。
冷藏的目的在于能无限期的保存生物材料的结构完整性和成活力，使得在需要时能随时得到，加以运用。具有限生命周期的复杂组织需要冷藏来扩展其适应性和利用率。然而，生物材料冷藏的历史表明，适合于某种特定细胞的冷藏方法，当用于另一类细胞或同一组织的其它细胞时，并不一定给出好的结果。由于细胞密度不同，含水量不同，全厚度组织相同物的结构组成水平不同，因而需要发展专一性更强的方法。本发明的冷藏方法令人惊异地适用于单层的表皮层和单层的真皮层，双层的组织相同物，三层的角膜相同物，和获取的哺乳动物皮肤。包装设计的发展使得这些组织的冷藏适应于大规模生产。
在此所用的术语“培养的组织相同物(cultured tissueequivalents)”意思为哺乳动物组织的组织相同物，这里的相同物由体外技术制备，包括单层皮肤相同物，或是真皮相同物，或是表皮相同物；双层皮肤相同物，特别是LSE；三层角膜相同物和皮肤相同物。培养的组织相同物在形态学上与体内的哺乳动物器官，特别是人类器官相似。进一步阐明LSE在形态学上与人类皮肤的许多相似之处。具有代谢活性和有丝分裂活性的人类真皮成纤维细胞(HDF)遍布构建物的真皮层，并分泌胶原和其它基质成分到网格中去。表皮层由一基层组成，与人类皮肤相似，该基层由有丝分裂速率来划分。基层上的表皮层与体内的皮肤有相同的层次，即具有严格定义的含有角质透明蛋白和板状颗粒的多刺的颗粒状层次，其上复盖一层角质层。免疫组织化学证明；，在正常人类皮肤的真皮—表皮连接处，如laminin，胶原，IV型和kalanin(GB3)，常能发现胞外基质成分的存在。
培养的组织相同物通过器官型培养法得到，例如活皮肤相同物(LSE)，利用一个载体做骨架，在其上形成相同物。培养的组织相同物在一载体上制造，该载体允许在生产、船运和最终运用过程中，不必直接接触构建物，便可对构建物进行操作，在载体上制备培养的组织相同物的方法见美国专利号5,374,151和美国专利申请序号08/193,809和08/337,830。
载体包括一扁平的透性膜，该膜附在一基本为管状支持物的一端。管状支持物的另一端包括一向外伸出的法兰，它能依次运载悬挂在本发明的包装设计和组织培养皿中的小孔上端的边缘。膜-支持物组装物的大小应设计得适合于具有至少一个特定大小的小孔的培养皿，以便提供恰当的空隙给支持物以衔接小室的上端。可以组装不同大小的膜—支持物组装物，以适用于不同大小的培养皿和冷藏包装。这些载体的例子是TRANSWELL(Costar)，详见美国专利号5,466,602。本领域技术人员可对包装设计进行修改以适应那些用于不同支持物和衔接在培养器皿中的类似载体。有关类似载体的叙述见美国专利号5,358,871和5,366,893或见美国专利号4,871,674。
本发明优选的包装设计结合了载体骨架，限定了组织相同物周围的环境，使能被控制适合于预定的专一性。本发明所用的材料最好是医用级的，能耐受很广的温度范围。这些材料被铸造成一个盘子和一个盖子，用密封手段可将二者密封起来，设计的新包装结合有一载体支持物、组织相同物在其上形成。
新的包装设计包括一个盘子，一个盖子以及位于二者间的一个紧紧的密封垫。将盘子和盖子设计得适合于现存的附有组织相同物的载体。将载体及附于其上的组织相同物放入盘中，加入冷藏液，盖上盖子，然后将两部分密封，使得在包装的内外环境间形成紧密的密封。
当保持冷藏液与组织相同物及盘子，盖子接触时，该包装设计使得冷藏液在载体下面和在组织相同物表面的上面均匀分布。该包装的设计基于如下概念：控制的冷冻速率能用等体积的冷藏液维持，在被冷藏的培养组织的上下按相似的几何学排列。无论从培养组织相同物的上表面或者下表面到包装的外壁进行测量，这种排列都提供均匀的距离(该包装也具有均匀的厚度)。当冷冻时，这种均匀性将提供从组织相同物到冷冻室的均匀的热交换；当融化时，则提供从外环境到组织相同物的均匀的热交换。
盘子包括一与侧壁和法兰相连的底面。法兰为盘子和盖子的密封提供一个平面。盘子的侧壁具有单个连续的或许多不连续的向内伸出的支持物，并与侧壁形成一整体。当将包含有培养的组织相同物的载体放入盘中一定位置时，其上部边沿被悬在由盘子侧壁提供的支持物上。在悬挂的载体和盘子底面之间在一限定的空间，测定其厚度为1.0mm，面积大约相当于组织相同物的大小。
盖子包括一与侧壁和法兰相连的平底面。盖子法兰的直径稍小于盘子法兰的直径。当将盖子法兰放在含有载体的盘子上时，盖子法兰被搁在载体上，使得盘子法兰和盖子法兰的顶部表面定向接触在同一平面上。第二个空间被盖子和培养的组织相同物的表面所限定，测量其厚度为1.0mm，面积大约相当于组织相同物的大小。
该设计允许在盘子和其上放有组织相同物的载体的底部之间有约1mm的空间，在盖子和组织相同物之间有约1mm的空间，组织相同物的上下遍布的冷藏液与盖子和盘子均接触。当盖子放入含有培养基的盘子中时，盖子将包装中的空气置换到载体的管状支持物的外周空间去。
盖子沿着由盘子和盖子法兰的顶部表面产生的暴露平面与盘子密封。密封可通过加热，粘合或已知的其它手段来完成。盖子和盘子间的密封阻止了冷藏液的泄漏，保持了包装单元内部的无菌状态。最好将热密封盖柄的环形片加热密封到盘子法兰和其上的盖子法兰上。盖子柄最好具有一个拉手，以便将盖子打开；当开封时，将盖子从盘子上移走，使能接触到组织相同物。在另一实施方案中，将其法兰直径与盘子法兰直径相同的盖子放入一其中含载体的盘子里，使得盖子法兰的底面紧密地与盘子法兰的顶面接触，然后，用密封手段将二者的法兰密封起来。
图1A和1B示出盖子10；盖子法兰11；盖子侧壁12；和底面13。盖子法兰11，盖子侧壁12和底面13形成一个邻接的表面。
图2示出一环形的密封垫20和拉手21。
图3A和3B示出密封垫20；盖子10，盖子法兰11。密封垫20在使用前先安装到盖子10的法兰11上，以有利于在密封过程中使密封垫更易于调整。
图4A和4B示出载体30；载体边缘31；透性膜32；和管状支持物33。透性膜32包含一放在其上与管状支持物33邻接的培养组织相同物。在整个冷藏过程中，载体30使得组织相同物能够转移而不需接触或移动组织相同物。
图5A和5B示出盘子40；盘底面41；盘侧壁42；盘法兰43；和载体支持物44。盘底面41，盘侧壁42，盘法兰43，和载体支持物44构成一个邻接的表面，载体支持物44接触和支持位于盘中的载体。
图6A和6B示出密封垫20；盖子10；载体30；和盘子40。将载有组织相同物的载体30放置在盘子40中，并悬在盘子内。具密封垫20的盖子10放置在载体30上，并悬在载体上。
图7示出密封垫20；盖子法兰11；盖子10；载体30，载体边缘31；载体支持物44；和盘子40。将载有组织相同物的载体30放置在盘子40中，通过载体边缘31的底面与载体支持物44的顶面相接触，使载体悬在盘子内。具密封垫20的盖子10放置在载体30上，通过盖子法兰11的底面与载体边缘31的顶面相接触，使盖子悬在载体上。盖子法兰11和盘子法兰43的顶面形成一个平面用于密封20。
图8为组装物的俯视图。
用于制造盘子，盖子的材料应是刚性的或半柔性的热塑材料，当加热时，可通过真空或注塑法加以模塑成型，如聚四氟乙烯(PTFE)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETG)，包装盘子和盖子在使用前最好用常规的灭菌法进行灭菌处理。所采用的灭菌法将由制造盘子和盖子的材料来决定。若要灭菌PTFE或PETG，最好采用2.5到3.0兆拉德的Gamma射线。实验室中常用的电化学灭菌法也可以采用。
培养的组织相同物包括一由介子，最好是成纤维细胞收缩而成的水合胶原晶格的真皮相同物。在一种实施方案中，表皮细胞的层状层在真皮相同物的表面培养。在另一种实施方案中，由角质化细胞收缩而来的水合收缩胶原晶格被放置在一层角膜内皮细胞上，其角膜上皮细胞的层状层在晶格的表面培养。另外，单独的表皮细胞可培养，诱导分层以形成表皮层。培养的组织相同物或是在载体的多孔膜上形成，或是在附着于载体底面多孔膜上的胶原凝胶上形成。此外，根据本发明的方法，其它的培养组织相同物也可冷藏，包括，但不局限于此，任何培养的表皮层，任何培养的真皮相同物，任何培养的角膜相同物，或获得的哺乳动物皮肤。
现利用组织相同物和优选的包装设计对本发明进行详细叙述。本领域的技术人员应明白，即使对所述的方法进行修正，改造，仍包括在本
发明的范围内。
用冷藏液浸透组织相同物的方法是将组织相同物和连接的载体浸入大量的足以淹没样品的冷藏液中，并且在组织相同物的上下具有等体积的冷藏液。在包含有组织相同物和载体的100mm陪替氏培养皿中加入25ml 2M的甘油和DMEM，放置一段时间，使之完全浸透样品，时间可选在1到2小时之间，最好是1个小时左右。在冷藏液中放置时间过长，会减少组织中细胞的成活力；若时间太短，则不能保证冷藏液完全浸透组织，单层构建物由于其细胞层数少，防护功能降低，通常只需较短的时间就可浸透。在浸泡时间内，搅拌样品和冷藏液，可加强促进冷藏液的浸透，通常是将陪替氏培养皿放在轨道平台摇床(Bellco轨道摇床)的含10％ CO2的气室中以70rpm的转速摇动。10％ CO2的环境与组织相同物制造的环境相同，避免了培养基脱气，维持了冷藏液碱性基质成分的pH。搅拌使得冷藏液能更快，更完全地浸入组织相同物，并使冷藏组织相同物间的结果重复性更好。也能用一种在其它立体水平能进行搅拌运动的设备代替轨道摇床。另外，其它可增强浸透的机械方法包括，但不局限于此，摇动放在平台上容器中的构建物与冷藏液或离心构建物与冷藏液，再用泵使构建物浸透冷藏液。
将载体和连在其上的组织相同物放入盘子中，加入总共约16.0ml的冷藏液。包装设计使得冷藏液均匀分布：在载体下面约8.0ml，组织相同物上面约8.0ml。然后将盖子盖在盘子上，将两部分热封，最好是到盖子柄。
然后，将包装的组织相同物放入一起始温度设置在室温，最好是20.0℃的可编程冷柜(Cryomed式Planer)里，含包装组织相同物的冷室以-10.0℃/分钟的速度冷却到固—液相平衡温度，对于冷藏液，2.0M的甘油和DMEM，通常在约-5.3℃和-6.0℃之间。固—液相平衡温度是在冷藏液中加入冰晶种的必需温度。将冷室温度保持一段时间，以平衡包装组织相同物的内部温度至冷室温度。用于得到加晶种温度的冷却速度不是一个关键因素。保持约40分钟的时间足以保证热平衡。但时间可依据冷室的大小，室内空气的循环，冷藏包装数目的不同而变化。通常需要至少30分钟的时间，达到1小时的时间能确保平衡。保温一段时间后，加入晶种引发形成胞外冰。
加入冰晶种定义为在胞外冷藏液中引发冰晶形成的方法。一种优选的加入冰晶种的方法是用一冷冻探针如一液氮冷冻(-196℃)钢棒去接触装有组织的盘子的边沿。棒与包装的接触点必需低于包装中冷藏液冷冻基质的水平面。另一种优选方法是直接释放一种膨胀气体如氟利昂或CO2到包装的外面。冰晶的形成由一冷室钉针引发，在那里，冷室温度在一定范围内升降足以形成冰晶。也可采用本领域里已知的其它加入冰晶种的方法。
当所有的组织相同物被加入冰晶种后，将包装单元放置额外的1小时，以达到热力学平衡及传播冰晶种使遍布冷藏液。然后重新开始冷却，其速度选择在-0.02～-0.3℃/分钟之间；选择在-0.05～-0.1℃/分钟更好；选择在约-0.07℃/分钟最好，冷却至最终温度，至少应为-70.0℃，或低于-70.0℃；再好一点为-120℃；更好为-140℃，最好为-196℃。随着最终冷冻温度接近水的玻璃化温度，-120℃，在转移到最终贮存地期间，将不太可能产生不利的温度波动。
将冷藏的组织相同物从可编程的冷柜转移到温度约在-120℃到-150℃之间的汽相液氮贮存罐(Dewar)贮存，或直接贮存在-196℃的液氮里，直到使用。
为了融化冷藏的培养组织相同物，将其从汽相液氮贮存处取出，转移到干冰上，加热至约-75℃。一旦在-75℃达到平衡，将培养组织相同物转移到一环境中，最好是水浴，温度设置在37℃，设置在4℃更好，设置在室温最好。一旦看见所有的冷藏液基质都转为液相，则最好将培养的组织相同物包装单元转移到生物安全柜中，或其它无菌的地方，并用乙醇洗涤。将培养皿的盖子剥去或从包装单元的底部切去盖子的柄以除去盖子。然后，倒掉多余的冷藏液，将含有培养的组织相同物的载体转移到陪替氏培养皿中。将25ml清洗液，最好是DMEM在室温加到含有培养组织相同物的陪替氏培养皿中约30分钟，以洗掉培养组织相同物中残留的冷藏液。由技术人员来决定是否加入其它充足的清洗液。最好是生理补强液，如细胞培养基戊磷酸盐缓冲液。更换清洗液两次，再放置额外的30分钟。清洗时间的长短由组织的复杂性来确定。
可将培养的组织相同物转移到最初的培养皿中，在37℃/10％ CO2于维持培养基中重新培养。另外，这种相同物可用于病人，或用于检测与某种物质接触后的反应，详见美国专利号4,835,102。
下面的实例更详尽地阐述了本发明的应用，但无论如何，不应被看作是对本发明范围的限制。本领域的技术人员应认识到，在不背离本发明的精神和范围的原则下，可对在此叙述的方法进行各种修正。
                  实例
                例1至例3
例1至例3为本发明的具有最佳包装设计的冷藏和融化技术。
例1：具有包装设计的活皮肤
            相同物(LSE)的冷藏
根据美国专利申请序号08/193,809可制备活皮肤相同物(LSE)构建物。在空气升液后9到10天，LSEs和连接的载体插入物(TRANSWELL，Costar，Cambridge)，被放在100mm的陪替氏培养皿(Costar)中。将构建物和transwell浸入装在100mm的陪替氏培养皿内的25ml冷藏液，DMEM中的2M甘油1小时，可使LSE构建物充满冷藏液。在充液过程中，将构建物放在含10％ CO2的气室中于轨道摇床(Bellco)上以70rpm的转速摇1小时。摇动能使充液更完全，并使冷藏法具有更好的再现性。在LSE充满冷藏液后，将含有LSE，载体插入物，胞外冷藏液(2M的甘油和DMEM)的陪替氏培养皿放入一冷藏包装盒里，加热封口。在与本申请同时提交的一共同未决的专利申请中，美国专利申请序号--/---，---，也叙述了该冷藏包装盒的制备。
在本文叙述的本发明中配备了一个可编程的冷柜(Planar)的冷室。冷柜的起始温度设置在20℃管道线里每隔1秒用氟里昂清洁净化一次，以除去管道线里的任何空气。包装好的LSE单位被安全放置在能容纳8个LSE单位的架子上。这些架子在定位针指示下，安放在临近喷雾轨道处。关闭冷柜冷室的门，使冷室与外部环境隔绝。
LSE单元以-10℃/分的速度被冷却到-6℃。将冷室温度维持在-6℃ 40分钟，以平衡冷藏液和充满冷藏液的结构物至冷室温度。40分钟后，通过直接使紧靠包装边沿的氟里昂去电荷1秒钟，可引发胞外冰的形成，随着包装表面的氟里昂的蒸发，使得与氟里昂接触的地方温度下降，足以引发胞外冰的形成。
当所有的LSE单元加入冰晶种后，将它们在-6℃平衡1小时。然后，将冷室温度以-0.07℃/分的速度冷却到-20℃，再以-0.5℃/分的速度冷却到最终温度-70℃。一旦LSE单元被冷藏后，将其转移到一温度为-120℃到-150℃的汽相贮存罐(Dewar)里。
例2：融化冷藏的LSE
将冷藏的LSE从汽相的液氮贮存处取出，转移到干冰上加热至约-75℃。在-75℃平衡后，将培养的组织相同物转移到37℃水浴中；若是4℃水浴更好；放置在室温最好。一旦看见所有的冷藏液变为液相，则最好将培养的组织相同物包装单元转移到生物安全柜中，或其它无菌的地方，并用乙醇洗涤。将培养皿的盖子剥去或从包装单元的底部切去盖子的座以除去盖子，然后，倒掉多余的冷藏液，将含有培养的组织相同物的载体转移到陪替氏培养皿中。将25ml清洗液(室温)，最好是DMEM加到含有培养组织相同物的陪替氏培养皿中约30分钟，以洗掉培养组织相同物中残留的冷藏液。由技术人员来决定是否加入其它的充足的生理清洗液，如其它的培养基或磷酸盐缓冲液。更换清洗液两次，再放置额外的30分钟。
用组织学法处理融化的冷藏样品和对照样品，通过光学显微镜评价其形态组织和成活力，结果表明其成活力接近100％，与对照样品几乎无甚区别。
例3：由加热速度和热均匀性来评价冷藏包装设计
本发明的冷藏包装由均匀的热转移来评价。在未连接培养的组织相同物的载体膜上安装5个热电偶，一个在中心，另4个离载体的边沿壁均留出1.0mm的间隔。热电偶的导线从盖子到盘缘之间这边离开包装盒到温度记录仪(Azonix Scanner Plus)。包装盒里充满了17ml冷藏液，加热封口。将包装盒平衡到-70℃，再转移到20℃水浴中。在加热过程中，温度记录仪每隔1-2秒记录一次每个热电偶的温度。包装盒最初以700℃/分钟的速度被加热，当接近冷藏液的熔点时则放慢速度。在加热速度达到最大时，热均匀性为平均热电偶温度，在2℃到6℃之间。在为溶液的熔点时，则接近8℃。
例4到12为本发明的对不同组织的冷藏方法。
例4：表皮片的冷藏
在空气升液后12天，从成熟的LSE获取表皮片。用镊子从表皮层上剥去真皮层，将其丢掉，再取下表皮片。将每一片切成相同的三块。将每一片中的一块用作对照，另两块放在位于100mm培养皿(Costar)中的一块75mm多聚碳酸酯transwell膜(Costar)上面。每一块用25mlDMEM和2M甘油浸泡1小时。将装有构建物的培养皿放在一轨道摇床(Bellco)的含10％ CO2的气室中70rpm摇1小时。当表皮片浸透后，将装有表皮片，trasnswell和胞外冷冻基质(2M甘油和DMEM)的陪替氏培养皿放入一盒子中，真空封接，(Audiovox)编程抽真空5秒，封接3.9秒。
将包装的表皮片放入一起始温度为20.0℃的可编程的冷柜(Planer)里。表皮片以-10.0℃/分钟的速度被冷却至-6.0℃。将温度维持在-6.0℃ 20分钟使平衡到冷室温度。然后将一液氮冷冻探针伸到冷冻液下面，接触盒子的外边，引发胞外冰的形成。在所有的表皮片被加入冰晶种后，在-6.0℃再保持5分钟。然后，以-1.0℃/分钟的速度将冷室冷却至-8.0℃。在-8.0℃保持30分钟，使样品周围的冰块均匀分布。然后，以-0.1℃/分钟的速度将冷室冷至最终温度-70.0℃。
将冷藏的表皮片从冷柜中取出，将盒子与陪替氏培养皿分开，移去盖子。将加热的40ml DMEM(37℃)无菌倒入每个陪替氏培养皿中，进行融化。45秒后，将所有的液体从培养皿中除去，再加入40ml液体到每个培养皿中2分钟。当所有的冰都融化后，用25ml DMEM漂洗表皮片30分钟。更换漂洗液，再放置30分钟，在进行分析前，将表皮片放入维持培养基中37℃/10％ CO2保温24小时。保温时间允许滞后，通常看来是因为冷冻细胞需恢复稳态状况。再一次，保温时间允许滞后，通常看来是因为冷冻细胞需恢复稳态状况。
对于每一表皮片的剩余的两块，其中一块用于组织学处理，另一块用MTT检测法测定。比较实例4的非冷藏表皮片和冷藏表皮片的光学显微图片，发现表皮的三个基本特征：表皮基层，表皮上基层和表皮层状角质，均可由该方法保存。每一层都未受损，冷藏表皮片的全部形态学都与未冷藏的表皮片一致。
例5：真皮相同物的冷藏
本研究所用的真皮相同物为LSE的非表皮化成分。在剥下后8天，真皮相同物被冷冻。将放置在100mm陪替氏培养皿(Costar)中并连在75mm transwell(Costar)上的真皮相同物浸入25ml DMEM和2M甘油中1小时，使冷藏液充满真皮相同物。将陪替氏培养皿放在轨道摇床(Bellco)的含10％ CO2气室中于70rpm摇1小时。当真皮相同物浸透冷藏液后，将陪替氏培养皿，真皮相同物，trasnswells和胞外冷藏基质放入一起始温度为20.0℃的可编程冷柜(Planer)里。然后，以-10.0℃/分钟的速度将冷室冷至-6.0℃。维持该温度20分钟，使之平衡到冷室温度。平衡20分钟后，将一液氮冷冻探针插入到冷冻基质下面，接触培养皿的外壁，引发胞外冰的形成。当所有的真皮相同物都被播种冰晶后，于-6.0℃再保温5分钟。然后，以-1.0℃/分钟的速度将冷室冷至-8.0℃。将冷室温度在-8.0℃保持30分钟。使冰晶在整个样品中均匀分布。然后，以-0.1℃/分钟的速度将真皮相同物冷至终温度-70.0℃。
然后，将冷藏的真皮相同物从冷柜中取出，去掉培养皿的盖子。为了融化，将40ml温热的(37℃)DMEM无菌操作倒入每个陪替氏培养皿中。45秒钟后，倒掉皿中的所有液体，重新加入40ml DMEM液，放置2分钟。当所有的冰都融化后，加入25ml DMEM漂洗真皮相同物30分钟，更换溶液一次，再漂洗30分钟，在进行分析前，将仍然连在transwells上的真皮相同物转移回培养皿中，在维持培养基中37℃/10％ CO2保温24小时。保温时间允许滞后，通常是因为冷冻细胞需恢复稳态状况。用MTT试验检测样品。
例6：角膜相同物的冷藏
在湿空气升液后9天，将连在24mm培养transwells(Costar)上的角膜相同物放入6孔簇培养皿(six well cluster dishes)(Costar)中。在6孔簇培养皿中将每一个角膜相同物和transwell浸入4ml胞外冷冻基质(2M甘油和DMEM)中1小时，使冷藏液充满角膜。将包含角膜构建物的6孔簇培养皿放在轨道摇床(Bellco)上于10％ CO2气室中70·rpm摇1小时。当角膜相同物浸透冷藏液后，将包含角膜相同物，transwells和为胞外冷冻基质的6孔簇培养皿放入一起始温度为20.0℃的可编程的冷柜(Planer)里。以-10.0℃/分钟的速度将角膜相同物冷至-6.0℃保持此温度20分钟使平衡到冷室温度。平衡20分钟后，将一液氮冷冻探针插入到冷冻基质下面，接触簇板上每一个孔的外壁，引发胞外冰的形成。在所有的角膜相同物被播种冰晶后，在以-1.0℃/分钟的速度冷至-8.0℃之前。于-6.0C再保温5分钟，在-8.0℃保温30分钟，使冰晶在整个样品中均匀分布。以-0.1℃/分钟的速度将角膜相同物冷至终温度-70.0℃。
将冷藏的角膜相同物从冷柜中取出，将培养皿的盖子去掉。为了融化，在簇板的每个孔中无菌操作倒入6ml温热的(37℃)DMEM。45秒钟后，倒掉皿中的所有液体，重新加入6ml DMEM放置2分钟。用无菌镊子将角膜相同物和相连的transwells转移到一新的簇培养皿中，在每一个孔中加4mlDMEM漂洗30分钟，更换一次溶液，再漂洗30分钟。然后于分析前，将角膜单元转移回相同的培养皿中，在角膜维持培养基中于37℃/10％ CO2保温24小时。保温时间允许滞后，通常是因为冷冻细胞需恢复稳态状况。用MTT试验检测样品。
例7：获取的鼠皮肤的冷藏
野生型小鼠，种号B6CB6YF1，由过剂量Nembutal无痛致死。无菌操作取下皮肤。从真皮上去掉过量的血管，脂肪和连接的组织。将小鼠皮肤修剪成1cm×2cm的长方形块。将小鼠皮肤块放入75mmtranswell(Costar)上放入100mm陪替氏培养皿(Costar)中，在100mm陪替氏培养皿中将小鼠皮肤浸入25ml 2M甘油和DMEM中1小时，使小鼠皮肤充满冷藏液。在充满过程中，将包含有小鼠皮肤和tramswell的陪替氏培养皿放在轨道摇床(Bellco)上于10％ CO2气室中于70rpm摇1小时。在皮肤移植前的冷藏和融化过程期间(2天)，对照，未冷藏的小鼠皮肤于4℃下保存在营养培养基中。
当小鼠皮肤浸透冷藏液后，将装有鼠皮肤transwells和胞外冰藏基质的陪替氏培养皿放入一起始温度为20.0℃的可编程的Planer冷柜中。以-10.0℃/分钟的速度将小鼠皮肤冷至-6.0℃。于此温度上保持20分钟，使之平衡到冷室温度。平衡20分钟后，用一液氮冷冻探针接触培养皿的外壁，引发胞外冰的形成。接触位点必须低于冷冻基质水平面。当所有的小鼠皮肤被播种冰晶后，保持-6.0℃的温度5分钟。再以-1.0℃/分钟的速度冷至-8.0℃。在-8.0℃保持30分钟。使冰晶在整个样品中均匀分布。以-0.1℃/分钟的速度将包装单位冷至终温度-70.0℃。
将冷藏的小鼠皮肤从冷柜中取出，去掉培养皿的盖子。为了融化，将40ml温热的(37℃)DMEM无菌操作倒入陪替氏培养皿中。45秒钟后，将所有液体从皿中倒出，再加入40ml液体，放置2分钟。当所有的冰都融化后，在培养皿中将小鼠皮肤用25ml DMEM漂洗30分钟，更换一次DMEM，再漂洗30分钟。
将冻融的样品和对照样品进行组织学处理或移植到小鼠身上。比较非冷藏小鼠皮肤和冷藏小鼠皮肤的光学显微图片，发现小鼠皮肤的四个基本特征：具成纤维细胞的真皮，表皮基层，表皮上基层和表皮层状角质，均可由该方法保存。每一层都未受损，冷藏小鼠皮肤的全部形态学都与未冷藏的小鼠皮肤一致。
例8：冷藏ATS SKIN2TM
根据船运插入物的到达时间，将SKIN2TM，型号ZK 1300(组织科学进展，La Jolla，CA)从包装中取出，放入培养皿(Costar)中。将transwell插入物放在SKIN2TM的上面以使皮肤构建物浸入其中。在培养皿中将SKIN2TM浸入2M甘油和DMEM中1小时。使SKIN2TM中充满冷藏液。在充满过程中，将包含构建物和transwell的培养皿放在一轨道摇床(Bellco)上于10％ CO2的气室中70rpm摇1小时。
当SKIN2TM中充满冷藏液后，将包装单元放入一起始温度为20.0℃的可编程的冷柜(Planar)里。以-10.0℃/分钟的速度将SKIN2TM冷至-6.0℃。保持该温度20分钟，使之平衡到冷室温度。平衡20分钟后，用一液氮冷冻探针插入冷冻基质中，接触培养皿的外壁，引发胞外冰的形成，在所有的SKIN2TM单元都播种冰晶后，再将温度保持在-6.0℃ 5分钟。然后，以-1.0℃/分钟的速度将冷室温度冷至-8.0℃。将SKIN2TM单元在-8.0℃保持30分钟。使冰晶在整个样品中均匀分布。然后将SKIN2TM单元以-0.1℃/分钟的速度冷至终温度-70.0℃。
将冷藏的SKIN2TM从冷柜中取出，去掉培养皿的盖子。将温热的(37℃)DMEM无菌操作倒入每个培养皿中。45秒钟后，将所有的液体从皿中倒出，重新加入DMEM到每个培养皿中，放置2分钟。一旦融化了，用无菌镊子将SKIN2TM单元和连接的transwell转移到一个新的培养皿中。为了漂洗掉SKIN2TM中的冷藏液，在含SKIN2TM的每个培养皿中加入DMEM，30分钟更换一次DMEM，再漂洗额外的30分钟。在分析前，将SKIN2TM单元转移回同一类型的培养皿中，在维持培养基中于37℃/10％ CO2保温24小时，又，保温时间可以滞后，通常是因为冷冻细胞需恢复稳态状况。
用MTT试验测定SKIN2TM，型号ZK1300，附产物，的冷藏和对照构建物，同样也可由组织学来估价。比较非冷藏的SKIN2TM和冷藏的SKIN2TM的光学显微图片，表明SKIN2TM的4种基本构成，具成纤维细胞的胶原网格，表皮基层，表皮上基层和表皮层状角质，都可由该法保存。每一层都未受损，冷藏SKIN2TM的全部形态学都与未冷藏的SKIN2TM一致。
例9：代谢线粒体活性试验(MTT)
用MTT试验测定冷冻和非冷冻(对照)的LSE，表皮片，真皮相同物和角膜相同物。[SKIN2TM构建物的检测根据“用于型号ZK1300的MTT试验”，附船运插入物]用MTT试验测定构建物的细胞成活力，一种比色的MTT转化法用于测定细胞生长和成活力。Gay等对该法进行了详细叙述，“活皮肤相同物作为一种体外模式用于排列真皮刺激物的潜在毒性，” 体外毒物，6：303-315(1992)。将可溶性的四唑盐代谢还原成一种兰色的甲沉淀，依赖于具有完整线粒体功能的活细胞的存在。本试验用于定量各种细胞包括培养的人类角质化细胞的细胞毒素。
在包含LSE，表皮片和真皮相同物的培养皿中加入40ml试验培养基，在包含角膜相同物的小孔里加入含0.33mg/ml MTT(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)的试验培养基1.5ml。将组织相同物在MTT试验培养基中保温3-4小时。在转化末期，用一直径为8mm的皮肤活组织检查穿孔器对组织相同物进行活组织检查，然后，在室温将穿孔的活组织用由0.04N HCl酸化的0.3ml异丙醇抽提2-3小时，在抽提结束后，将每一种抽提液取0.2ml转移到-96孔板的孔中。用异丙醇抽提培养基作空白，在一板式读数器上(Dynatech)读570nm的吸收值。从冻融样品得到的MTT值与相应的对照样品的进行比较，以对照的百分数来表示。
例10：乳糖脱氢酶试验(LDH)
LDH为普遍存在于活细胞中的一种酶。对细胞的损伤会导致该酶的释放，用本试验进行检测，则相应的酶活力降低。
用一直径为8mm的皮肤活组织检查穿孔器对LSE的冻融样品和对照样品进行穿孔。从每一LSE单位中取出样品3份。将穿孔的样品放入装有1ml 0.1M三乙醇胺缓冲液(于冰上)的15mm试管中，用一电组织匀浆器匀浆1分钟，然后在4.0℃ 1000g下离心。测定上清液，装下列试剂混合可制得LDH混合试剂：3.0ml磷酸缓冲液(0.1mol/LpH7.0)，0.1ml丙酮酸Na盐(2.5mg/mt)，和0.05ml NADH Na盐(10mg/ml)。将100μl样品上清液加到900μl混合试剂中，反应2分钟，记录2分钟内吸收值的变化。将每一冷藏LSE单元的三份样品的平均值与非冷藏对照进行比较。样品值与相应的对照值进行比较，并以对照的百分数来表示(图4)。
例11：冷藏LSE和非冷藏LSE的生物相同性
为了证明冷藏的和非冷藏的LSE具有生物相同性，进行了athymic鼠的移植研究。
在移植前一天，将根据例1中所述方法冷藏的LSE单元融化，并在维持培养基中恢复24小时。
进行了4次实验，用冷藏的LSE(n＝43)或非冷藏的(对照)LSE(n＝23)对总共66只athymic鼠，种号B6CB6YF1/J-nu(JacksonHarbor Labs)，进行移植。用Nembutal对动物进行麻醉。从每只小鼠背部切下2×2cm的全厚度皮肤块，抽出肌膜(panicculus carnosus)。将LSE移植物，或是对照，或是冷藏样品，放在伤口处，修剪使其适合。在所有的移植物上包扎一层饱含凡士林的罗纱布(vendor)其外再缠两层胶口绷带(vendor)。在移植7天后将包扎取掉。
移植14天后，将所有动物无痛致死前照像将移植部位切下作组织学分析并评价。一般像片和显微像片表明，对于对照LSE或冻融LSE而言，在移植融合方面没有区别。在伤口挛缩速度方面，对照或冷藏移植物间也无明显区别。
例12：冷藏和非冷藏小鼠皮肤的同基因皮肤移植
为了证明冷藏的和非冷藏的小鼠皮肤的生物相同性，进行了同基因皮肤移植研究。
用过剂量的Nembutal使野生型小鼠，种号B6CB6YF1，无痛致死。无菌操作获取皮肤，从真皮除去多余的血管，脂肪和相连的组织，然后用真皮制备皮肤移植物。按照例7中的方法冷藏和融化小鼠皮肤。皮肤移植前，在共计2天的冻融过程中。将对照，非冷藏的小鼠皮肤于4℃保存在营养培养基中。
同种的6只小鼠接受皮肤移植，两只接受对照，非冷藏小鼠皮肤，4只接受冻融小鼠皮肤。用Nembutal将小鼠麻醉。从每只小鼠的背部切下2×2cm的全厚度皮肤块，抽出肌膜(Panicculus carnosas)。将小鼠皮肤移植物，或是对照，或是冷藏样，放在伤口处，修剪使其适合，在所有的移植物上包扎一层饱含凡士林的罗纱布，其外再缠两层胶口绷带。移植后7天，可将包扎去掉。
移植后30天，将所有动物无痛致死并照像。切下移植部位用于组织学分析和评价。一般像片和显微像片表明，在对照小鼠皮肤或冻融小鼠皮肤之间，在移植物整合方面没有区别。在对照或冷藏移植物之间，伤口挛缩速度也无明显区别。
虽然对前述的发明已经做了描述，为了便于理解，对于某些细节举出实例进行说明，但显而易见的是，对于本领域的技术人员，可以在附加的权利要求范围内做出变动和修改。

Claims (10)

1.一种冷藏获取的哺乳动物皮肤组织或培养的皮肤组织相同物的方法，包括：
(a)将上述组织浸入冷藏液中，搅拌上述冷藏液和上述浸入组织，使冷藏液有效地渗透上述组织，得到渗透组织；
(b)在上述冷藏液和渗透组织中播种胞外冰；
(c)通过以缓慢的冷冻速度将由步骤(b)得来的上述渗透组织冷至一温度，该温度至少等于或低于-70℃，而使上述组织冷至冷藏状态，从而得到冷藏组织；和
(d)在至少等于或低于-70℃的温度下，贮存上述冷藏组织。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)所述的浸入，其起始温度约20℃，然后，在渗透过程中，以约-10℃/分钟的速度冷至约-6℃。
3.权利要求1的方法，其中步骤(c)的冷冻是以-1℃/分钟的速度冷至约-8℃，保持一段时间直至在上述组织中的上述冷藏液达到物理和生物学平衡。
4.权利要求1的方法，其中步骤(c)的温度是保持恒定一段时间足以使在上述组织中的上述冷藏液达到物理和生物学平衡。
5.权利要求3的方法，其中所述的冷却是以约-0.3℃到-0.02℃/分钟的速度一直持续到约-70℃或更低。
6.权利要求1的方法，其中所述的培养组织相同物是选自培养表皮相同物和培养真皮相同物。
7.权利要求1的方法，其中所述的冷藏状态的所述温度是等于或低于-120℃至等于或低于-196℃。
8.权利要求1的方法，其中所述的冷藏液是在Dulbeuo’s ModifiedEagle’s Medium(DMEM)基质中的1.5M到2.5M的甘油。
9.权利要求1的方法，进一步包括融化所述的玻璃化组织，其中所述的组织在约1到约2分钟的时间内融化。
10.一种用于冷藏获取的哺乳动物皮肤组织或培养的皮肤组织相同物的设备，包括：
一个盘子，包括一与侧壁和法兰相连的底面，其中侧壁具有向内伸出的支持物，该支持物从侧壁伸出并与侧壁形成一整体；
一个载体，包括一个连在一基本为管状的支持物一端的扁平透性膜和位于所述的管状支持物另一端的边缘，其中所述的边缘由所述的盘子的所述的向内伸出的支持物来支持；
一个盖子，包括一与侧壁和法兰相连的平底面，其中所述的法兰与所述盘子的法兰紧密接触；和
在所述盘子和所述盖子之间的密封垫。
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