NO310491B1 - Metode samt apparat for kryokonservering - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for kryokonservering av både høstet vev og dyrkede vevsekvivalenter fremstilt under anvendelse av in vitro teknologi. Ved

anvendelse av kryokonserveringsteknologi kan enten kryoonervert høstet ved eller kryokonservert dyrket vev lagres i ubestemte tidsperioder før bruk. Det dyrkede vev er en in vitro modell av det ekvivalente humane vev som, når fremhentet fra lagring, kan anvendes for transplantasjon eller implantasjon, in vivo, eller for screening av forbindelser in vitro.

In vitro teknologi har utviklet vevsekvivalenter for in vitro testing eller in vivo grafting for heling av sår. Metoder for fremstilling av slike vevsekvivalenter er omhandlet i US patenter nr. 4,485,096, 4,604,346, 4,835,102 og 5,374,515 og US serienr. 08/193,809 og 08/337,830, som alle er innlemmet heri ved referanse.

Holdbarheten av levende vev er begrenset og følgelig er deres tidsperspektiv for anend-lse kort, hvilket resulterer i mye avfall. Det er et behov for å konservere slike vev for lengre tidsperioder, som for forsendelse og lagring, inntil de skal anvendes. Både utvik-ing av en kryokonserveringsmetode og en emballasje for kryokonservering og lagring vill forlenge tidsperspektivet med hensyn til anvendelse på ubestemt tid, lette forsendlse og tillate opprettholdelse av et lager. Å muliggjøre et lager av vev ved sentre og sykehus for pleie av brannskader er også ønskelig. Andre fordeler er at prøver kan bevares fra forskjellig trinn av fremstillingssyklusen for kvalitetskontrollarkiver og større pro-duksjonsporsjoner kan fremstilles siden de kan opprettholdes i en frossen tilstand.

For tiden forlenges lagringstiden av cellulære biologiske materialer ved kjøling til kryogene" temperaturer. Overgangen fra flytende til fast tilstand ved å redusere temperaturen av systemet kan foregå enten som krystallisasjon (is), hvilket involverer et ordnet arrangement av vannmolekyler, eller som vitrifikasjon eller amorfisering glassdannelse) i fravær av et slikt ordnet arrangement av krystallinsk fase. Utfordringen for en kryo-biolog er å bringe celler til kryogene temperaturer og deretter returnere dem til fysiologiske betingelser uten å skade dem.

Det er to grunnleggende fremgangsmåter for kryokonservering av celler og vev: Frysing-tining og vitrifikasjon. I frysing-tining-teknikker fryses den ekstracellulære oppløsning (dvs. i krystallinsk form) men det treffes tiltak for å minimalisere den intracellulære isdannelse. I vitrifikasjonsprosedyrer forsøkes det å hindre isdannelse gjennom hele prøven. Den førstnevnte fremgangsmåte er problematisk ved at hvis det dannes iskrystaller inne i cellene, er de skadelige for cellenes levedyktighet ved tining. Celler kunne imidlertid overleve en frysing-tining-syklus hvis de avkjøles ved kontrol-lerte hastigheter i nærvær av ikke-toksiske mengder av kryobeskyttelsesmidler. Den sistnevnte fremgangsmåte med vitrifikasjon søker å unngå potensielt skadelige virknin-ger av intra- og ekstracellulær is ved å nedsette isdannelse under anvendelse av svært høy konsentrasjoner av oppløste produkter og/eller polymerer. Celleskade kan imidlertid forekomme ved langvarig eksponering for toksiske nivåer av disse additiver som er påkrevet for vitrifikasjon.

Kryobeskyttelsesmidler beskytter levende celler mot de påkjenninger som er involvert i fryseprosessen. En måte som kryobeskyttelsesmidler beskytter celler på er ved fortyn-ning av saltet som i økende grad blir konsentrert i den ufrossede oppløsningen ettersom vann omdannes til is. Mengden is dikteres av temperaturen og den initiale sammenset-ning av oppløsningen, mens mengden av ufrosset fraksjon er en funksjon av temperatur alene. Kryobeskyttelsesmidler har flere andre funksjoner. En viktig funksjon er at de vanligvis reduserer temperaturer for intracellulær isdannelse. En annen funksjon er at de stabiliserer membraner og proteiner.

Alle oppløsninger vil underkjøles under sitt frysepunkt inntil de finner et vilkårlig kjer-nedannelsessted for krystalldannelse. Når kryokonservering utføres ved hjelp av en frysing-tining-metode bør isdannelse i det ekstracellulære medium tilsiktet initieres ved tilveiebringelse av kim ved lave grader av underkjøling. Hvis isdannelse ikke induseres ved tilveiebringelse av kim vil is dannes spontant når oppløsningen kjøles tilstrekkelig langt under sitt likevekts-frysepunkt. Fordi denne prosessen er vilkårlig av natur vil isdannelse forekomme ved vilkårlige uforutsigbare temperaturer. Som en følge vil overlevelsesgrader være svært variable mellom gjentatte forsøk med den samme fryse-prosedyre. Dessuten kan den ekstremt hurtige krystalliseringen som resulterer når is dannes i en svært underkjølt oppløsning forårsake skader på celler og vev. Videre har det blitt vist at hvis ekstracellulær isdannelse initieres ved stor grad av underkjøling, øker sannsynligheten for intracellulær isdannelse dramatisk. Dette fenomenet kommer av den utsatte starten på fryseindusert celledehydrering, som resulterer i økt retensjon av intracellulært vann og gir således høyere sannsynlighet for isdannelse i cellen.

Så snart den ekstracellulære isen er krystallisert og prøven er omsluttet av isfasen, er det nødvendig å kjøle prøven til en kryokonservert tilstand. Kjøletrinnet er et av de mest kritiske trinn i frysing-tining-prosedyren. På grunn av dannelsen av is, dvs. rent vann, er den delvis frossede ekstracellulære oppløsning mer konsentrert enn det intracellulære rom. Som en konsekvens vil cellen dehydrere ved at den mister vann i et forsøk på å gjenopprette termodynamisk likevekt. Ettersom systemet avkjøles produseres mer ekstracellulær is og konsentrasjonen av oppløste produkter stiger og tvinger cellene til å dehydrere ytterligere. Det er tre egenskaper av cellene som kontrollerer deres dehydrer-ingsgrad. En er vannpermeabiliteten av cellemembranen. Jo lavere vannpermeabilitet, jo lengre tar det for cellene å dehydrere. En annen er temperaturavhengigheten av vannpermeabiliteten av cellemembranen. Alle celler reduserer sin vannpermeabilitet med avtagende temperaturer. Det siste er cellestørrelse. Større celler tar lengre tid og dehydrere enn mindre celler. Gitt at hver celletype kan ha drastisk forskjellige egenskaper, kan de optimale kryokonserveringsbetingelser variere med størrelsesordner for forskjellige celletyper.

Selv om nøyaktige mekanismer for celleskade under kryokonservering ennå ikke har blitt fullstendig belyst, viser karakteristiske overlevelses-kjennetegn frembragt ved måling av celleoverlevelse som en funksjon av avkjølingshastighet seg å være kvali-tativt lik for alle celletyper og utviser en U-formet kurve snudd opp-ned. Celleoverlevelse er lav ved svært lave og svært raske avkjølingshastigheter, og det er en mellom-liggende avkjølingshastighet som gir optimal overlevelse. Selv om den optimale avkjølingshastighet og bredden av kurven kan variere drastisk for forskjellige celletyper, viser den kvalitative oppførsel seg å være universell. Raskere avkjølingshastig-heter gir ikke cellene nok tid til å dehydrere og cellene danner is innvendig. Celleskade ved raske avkjølingshastigheter tilskrives intracellulær isdannelse. Ved lave avkjølings-hastigheter antas celleskade å skyldes virkningene av eksponering for svært konsentrerte intra- og ekstracellulære salt- og kryobeskyttelsesmiddel-oppløsninger eller for de me-kaniske interaksjoner mellom celler og den ekstracellulære is.

Det er nødvendig å dehydrere cellene så mye som mulig før de krysser den intracellulære is-kjernedannelseskurven. Det er ved dette punkt at praktisk talt alt vann gjenværende i cellen vil kjernedanne og danne is. Det er ikke mulig å bestemme den nøyaktige temperatur hvor dette vil skje, men den er omtrent -40° til -50°C når cellene fryses sakte i nærvær av IM til 2M konsentrasjoner av kryobeskyttelsesmidler. Det er viktig å merke at mengden vann som blir til is inne i en celle ved dette punkt kan være uskadelig når frosset, men hvis det ikke tines raskt nok vil det ekspandere og drepe cellen ved tining. (The Biophysics of Organ Cryopreservation, side 117-140, redigert av David E. Pegg og Armand M. Karow, Jr. NATO ASI Series A: Life Sciences vol. 147 1987 Plenum Press, New York, 233 Spring St., New York, NY 10013).

Før utviklingen av en kommersielt levedyktig hudekvivalent ble hud fra kadavere anvendt for graftingsformål. Kryokonserveringsprosedyrer ble utviklet slik at sentre og sykehus for brannskader kunne opprettholde hudbanker. Et antall forskjellige proto-koller ble utviklet under anvendelse av forskjellige kryobeskyttelsesmidler, frysehastigheter, emballasjeformater og lagringsbetingelser. De fleste forskere var enige om en rask tineprosedyre. Grad av vellykkethet av prosedyren ble målt enten ved feste av graft til en sårbunn eller ved cellelevedyktighets-analyse.

I US 3,842,831 til Beisang omhandles en metode for kryokonservering av hudstykker fra kadavere. Denne metode involverer fastgjøring av kadaverhuden til en løst vevet skrim eller underlag, og sammen rulles hudstykkene og skrim forut for frysing. Intet kryobeskyttelsesmiddel anvendes, selv om oppfinnerene foreslår anvendelse av enten glyserin eller DMSO. Fryseprosedyren benytter en rask ukontrollert (fiksert temperatur) frysehastighetsprosedyre til en kryogen temperatur på -70°C.

May SR og FA DeClement (Skin Banking Methodology, 17, 33-45 (1980)) utførte en evaluering av emballasjegeometri og avkjølings- og varmingshastigheter under anvendelse av dermatom-kadaverhud. Resultatene tyder på at kadaverhuden skulle være flat, snarere enn rullet, og at en lavere kontrollert frysehastighet anvendes.

US 5,040,677 til Tubo omhandler en gasstett lukkbar beholder for individuelle grafter av epitelcelle-flak. Beholderen krever at epitelcelle-flaket er festet til et adhesjonsmid-delsubstrat-ark eller underlag ved bruk av klemmer.

US 5,145,770 til Tubo omhandler en kryokonserveringsmetode for keratinocytt-flak som benytter et kryobeskyttelsesmiddel av et ikke-cellepenetrerende middel, slik som dekstran, og et cellepenetrerende reagens, slik som glyserol, med en avkjølingshastighet på omtrent -l°C/minutt. Likeledes omhandler EP 0 364 306 'til Chao et al en metode for kryokonservering av et flak av levende dyrkede epitelceller men under anvendelse av både DMSO og glyserol som et kryobeskyttende middel og en foretrukket fryseprose-dyre på -l°C/minutt.

US 5,298,417 til Cancedda et al omhandler en kryokonserveringsprosedyre utviklet for ett lags konstrueringer slik som epitel-flak fremstilt som beskrevet i US 4,016,036, 4,304,866 og 4,456,687. Epidermis-flak ble inkubert med et kryobeskyttelsesmiddel av enten 8-15% glyserol eller DMSO og ble kryokonservert ved anvendelse av en proto-koll med kontrollert hastighet hvorav kjølingshastigheten er lavere ved begynnelsen enn ved slutten av prosedyren og er kjennetegnet ved en økning i temperatur før kulminer-ing av fryseprosedyren.

En metode for kryobeskyttelse av dermal-fibroblaster i en kollagengel ble undersøkt av Teasdale et al, Burns, 19 (5) 406-410 (1993). Teasdale bestemte at optimal cellelevedyktighet kunne oppnås ved frysing ved -5°C/minutt med DMSO som et kryobeskyttelsesmiddel.

Nanchahal et al., "Cultured composite skin grafts. Biological skin equivalents permit-ting massive expansion", The Lancet, 2 (8565), 191-193 (22. juli 1989) omhandler en teknikk for lagring av dyrkede kompositt-vevsgrafter under anvendelse av et kryobeskyttende middel av 15% glyserol og 10% FCS i Medium 199. Graftene og kryobeskyttelsesmiddelet ble inkubert ved 37°C i to timer og ble deretter frosset ved -1°C pr. minutt til -70°C og deretter lagret i flytende nitrogen. Etter rask tining av graftene ble deres levedyktighet bestemt ved dyrking i to uker og ved grafting på hårløse mus. En endelig evaluering ble utført ved grafting på tre pasienter som fikk skåret bort tatover-ing.

Johnstone et al. "Cryopreservation of Rabbit and Cat Corneas at -18 to -24°C", Cornea, 11(3): 211-220 (1992), er rettet på en enkel prosedyre for kryokonservering av kornea fra kanin og katt som anvender en hjemmefryser snarere enn flytende nitrogen eller frysere med svært lav temperatur. Perfusjon av kryokonserveringsmiddel oppnås ved anbringelse av korneaer i suksessive oppløsninger av 50% føtalt kalveserum og McCa-rey-Kaufman medium med økende glyserol- og glykoseinnhold.

Under anvendelse av tidligere kjente metoder er det ikke mulig å kryokonservere dyrkede vevsekvivalenter, delvis fordi de er relativt tykke og består av heterogene cellelag. En av funksjonene til disse vevene in vivo er å tilveiebringe én permeabilitetsbærer. Vevsfunksjoner må vurderes i utviklingen av en kryokonserveringsprosedyre.

Oppfinnerene av den foreliggende søknad har oppdaget en metode for kryokonservering. En emballasjeutforming for et antall dyrkede vevsekvivalenter og for pattedyrhud, som er en overraskende effektiv og kommersiell praktisk emballasje for kryokonservering av dyrkede vevsekvivalenter kan anvendes.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en metode for vellykket kryokonservering av dyrkede vevsekvivalenter ved svært lave temperaturer som unngår dannelsen av skadelige intracellulære iskrystaller, minimaliserer den effektive konsentrasjon av potensielt skadelige kjemikalier, og tillater hurtig innføring og fjerning av kryobeskyttelsesmidler ved gjennomførbare temperaturer under anvendelse av programmerbart fryseutstyr.

En ny emballasjeutforming utviklet for kryokonservering, lagring og distribusjon av dyrkede vevsekvivalenter kan anvendes. Den nye utformingen frembyr mange fordeler i forhold til eksisterende emballasjeutforminger. For tiden er det ingen kommersielt tilgjengelige kryokonserverte dyrkede vevsekvivalenter, og derfor er det ingen emballasjeutforminger tilgjengelig som hyllevare. Utformingen av den nye emballasjen muliggjør bedre temperatursporing av emballasjens indre med den utvendige temperatur av frysekamre på grunn av mer effektiv varmeoverføring. En forbedret varmeoverfør-ingsgrad tillater en mer kontrollert prosess, og således jevne avkjølings- og oppvarm-ingshastigheter av den dyrkede vevsekvivalent idet variabiliteten i cellelevedyktighet derved reduseres.

Oppfinnerene har oppdaget en metode for kryokonservering av dyrkede vevsekvivalenter fremstilt fra in vitro teknikker slik at vevene opprettholder deres levedyktighet og anvendelighet som ekvivalenter av humane vev. Oppfinnelsen inkluderer anvendelse av omrøring for å fremme penetreringen av en effektiv mengde kryobeskyttelsesmiddel. Den foreliggende metode sørger for kryokonservering av både høstet vev og dyrkede vevsekvivalenter på en måte som beskytter strukturell integritet og cellulær levedyktighet.

Foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåte for kryokonservering av høstet mammalsk hud, dyrket hud eller cornea-ekvivalent, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) nedsenkning av nevnte vev i en kryobeskyttende oppløsning og omrøring av nevnte nedsunkede vev for å oppnå effektiv penetrering av den kryobeskyttende oppløsningen inn i nevnte vev; (b) senking av temperaturen tilstrekkelig til å tillate iskrystallisering og krystallisering av ekstracellulær is i nevnte kryobeskyttende oppløsning; og (c) nedkjøling til en kryokonservert tilstand av nevnte kryobeskyttende oppløsning og nevnte vev ved en rate på omtrent -0,3°C pr. minutt eller mindre, til en temperatur tilstrekkelig til å kryokonservere nevnte vev.

Så snart det er frosset kan det kryokonserverte vev lagres i ubestemte tidsperioder mellom temperaturer på omtrent -120° til omtrent -196°C, hvilket er temperaturen for flytende nitrogen.

Tining av det kryokonserverte vev utføres ved varming av det frossede vev ved en høy hastighet, hvilket utføres i løpet av 1 til 2 minutter. Det frossede vev kan tines ved direkte anvendelse av varmet dyrkingsmedium eller ved hjelp av fysiologisk bufret oppløsning eller ved en annen hurtig oppvarmingsmetode. Emballasjeutformingen tillater tining av vevet ved nedsenking av emballasjen i et vannbad da emballasjeutformingen sikrer både en rask oppvarmingshastighet og kontrollert termisk ensartethet mens sterilitet opprettholdes under den kritiske tineprosedyren.

Før bruk som en ekvivalent for humant vev, for grafting eller in vitro testing, skylles den tinte dyrkede vevsekvivalenten for å fjerne kryobeskyttelsesmiddel-oppløsningen. Kryobeskyttelsesmiddel-oppløsningen kan fjernes ved skylling med for eksempel en isotonisk bufferoppløsning ved fysiologisk pH. De dyrkede vevsekvivalenter kan deretter lagres midlertidig i en slik bufferoppløsning eller rekultureres i et passende cellemedium før bruk.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en fremgangsmåte for kryokonservering av høstet mammalsk hud, dyrket hud eller cornea-ekvivalent, kjennetgnet ved at den omfatter: (a) Nedsenkning av nevnte vev i en kryobeskyttende oppløsning og omrøring av nevnte kryobeskyttende oppløsning og nevnte nedsunkne vev for å oppnå effektiv penetrering av kryobeskyttende oppløsning inn i nevnte vev; (b) senking av temperaturen tilstrekkelig for å oppnå isdannelse og i en tid tilstrekkelig for å tillate fysisk og biologisk ekvilibrasjon av nevnte kryobeskyttende oppløsning i nevnte vev; (c) krystallisering av ekstracellulær is i nevnte kryobeskyttende oppløsning ved en

temperatur på -6°C eller lavere; og,

(d) avkjøling av nevnte kryobeskyttende oppløsning og nevnte vev ved en rate på

-0,3°C pr. minutt eller mindre, for å oppnå et kryokonservert vev.

Videre omfatter oppfinnelsen et apparat for kryokonservering av høstet mammalsk vev eller dyrket vevsekvivalent som tidligere nevnte, kjennetegnet ved at apparatet omfatter:

Et brett (40) som omfatter en bunnflate (41) sammenhengende med en sidevegg (42) og en flense (43) hvori sideveggen (42) har innover-ragende understøttelser (44) som rager ut fra og i ett med sideveggen (42);

en holder (30) som inkluderer en flat permeabel membran (32) festet til én ende av en essensiell rørformet støtte (33) og en kant (31) på den motsatte ende av den rørformede støtten (33), hvori nevnte kant (31) er støttet av nevnte innover-ragende understøttelser av nevnte brett (44);

deksel (10), som omfatter en plan bunnoverflate (13) sammenhengende med en sidevegg (12) og en flense (11), hvori nevnte

flense (11) er i nær kontakt med nevnte flense av nevnte brett (43), og en tetning (20) mellom nevnte brett (40) og nevnte deksel (10).

Kort beskrivelse av figurene

Fig. IA og IB viser en oversikt av dekselet.

Fig. 2 viser en oversikt ovenfra av tetningen.

Fig. 3 A og 3B viser en oversikt av tetningen montert på dekselet.

Fig. 4A og 4B viser en oversikt av holderen.

Fig. 5A og 5B viser en oversikt av brettet.

Fig. 6A og 6B viser en oversikt fra siden av sammenstillingen, hvor de enkelte delene er rykket ut fra hverandre og ferdig sammenstilt.

Fig. 7 viser et nærbilde av sammenstillingen.

Fig. 8 viser en oversikt ovenfra av sammenstillingen, ferdig sammenstilt.

Fig. 9 viser et diagram av levedyktigheten av kryokonserverte dyrkede vev sammen lignet med levedyktigheten av ikke-kryokonserverte dyrkede vev. Levedyktigheten av kryokonserverte dyrkede vev som målt ved hjelp av MTT er vist. LSE ble i tillegg målt ved hjelp av LDH analyse. Alle dyrkede vev er sammenlignet med alders-matchende ikke-kryokonserverte kontroller og er uttrykt som prosent av kontroll.

Teknikker for fremstilling av vev er et kommende område som benytter dyrkede vevs-celler til å konstruere vevsekvivalenter som kan anvendes til å undersøke responsen overfor skade av kjemiske midler eller farmasøytiske forbindelser. Det dyrkede vev kan også anvendes til å danne graftbart humant vev.

Vevsekvivalenter har blitt omfattende beskrevet i mange patenter inkluderende US patenter nr. 4,485,096, 4,485,097, 4,539,716, 4,546,500, 4,604,346, 4,837,379 og 5,374,515, som alle er innlemmet heri ved referanse. En vellykket anvendelse av vevsekvivalenten kalles "Living Skin Equivalent", som har en morfologi lignende virkelig human hud. Living Skin Equivalent (LSE) er sammensatt av to lag: den øvre del er fremstilt differensierte og lagdelte humane epidermiskeratinocytter som dekker et nedre lag av humane dermal-fibroblaster i en kollagenmatriks. Parenteau, et al. "Epidermis Generated In Vitro: Practical Considerations and Applications", J. og Cellular Biochemistry, 45:245-251 (1991); Parenteau et al. "The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function", Cytotechnology, 9:163-171 (1992); og Bell et al. "The Living Skin Equivalent: Its Manufacture, Its Organotypic Properties and Its Responses to Irritants", Toxic. in Vitro, 5:591-596

(1991). LSE for grafting er under utprøving i kliniske forsøk for indikasjoner vedrør-ende sår i huden av delvis og full tykkelse: eksisjonskirurgi, brannskader, venøs stase-ulcus, diabetiske ulcus, dekubitalsår og kroniske inflammatoriske ulcus. LSE er et tolags in vitro fremstilt hudvev av full tykkelse.

En in vitro organ-ekvivalent av kornea av øyet har blitt utviklet som beskrevet i US patent nr. 5,374,515, innlemmet heri ved referanse. Kornea-vevsekvivalenten har tre adskilte cellelag, det ytre lag som er et lagdelt skjellet epitel, midtlaget av kollagenfibre og stromaceller, og et indre lag, enkelt skjellet epitel, også kalt koraealendotel. En in vitro kornea-ekvivalent kan anvendes for in vitro toksisitetsanalyser for å tjene som nøyaktige og rimelige ikke-animalske forutsigelsesmodeller av in vivo okulært og dermalt irritasjonspotensial for mange typer produkter og råmaterialer.

Målet for kryokonservering er å konservere den strukturelle integritet og levedyktighet av biologiske materialer i en ubestemt tidsperiode slik at disse materialene kan være tilgjengelige og anvendes etter behov. Komplekse vev med begrenset levetid vil kreve kryokonservering for å utvide produkttilgjengelighet og -anvendelighet. Historien med kryokonservering av biologisk material har imidlertid vist at optimalisering av en kryokonserveringsprosedyre for en spesiell celle ikke nødvendigvis gir gode resultater når anvendt med en annen celletype eller med andre celler i et vev. Utviklingen av mer spesialiserte metoder på grunn av forskjellene i celletetthet, vanninnhold og grad av strukturell organisering av vevsekvivalentene ved full tykkelse var nødvendig. Kryo-konserveringsprosedyrene ifølge denne oppfinnelsen er overraskende anvendbare for de ettlags epidermis- og dermallag alene, tolags vevsekvivalenter, trelags korneaekviva-lenter og høstet pattedyrhud. Utviklingen av en emballasjeutforming gjør kryokonservering av disse vev praktisk for prosesser av produksjonsmålestokk.

Som anvendt heri betyr uttrykket "dyrkede vevsekvivalenter" vevsekvivalenter av pattedyrvev, hvori vevsekvivalentene er fremstilt ved in vitro teknikker og er ment å inklu-dere ettlags hudekvivalenter, enten en dermal ekvivalent eller et epidermis-flak, tosjikts hudekvivalenter og særlig LSE, og trelags kornea-ekvivalenter og hudekvivalenter. Morfologien av de dyrkede vevsekvivalenter er lignende in vivo pattedyrorganet, spesi-elt det humane organ. For illustrasjon bærer morfologien av LSE mange likheter med human hud. Metabolske og mitotisk aktive humane dermal-fibroblåster (HDF) finnes gjennom hele dermallaget av konstruksjonen, og har blitt vist å utskille kollagen og andre matrikskomponenter inn i gitterverket. Epidermis består av et basallag som er vist å deles med en mitotisk hastighet lignende den for human hud. Suprabasal epidermis viser de samme strata som hud in vivo, med veldefinerte spino- og granulæfe lag inneholdende keratohyalin og lamellære granuler dekket av et stratum corneum. Immunhistokjemi påviser nærværet av ekstracellulære matrikskomponenter rutinemessig funnet ved det dermo-epidermale forbindelsessted i normal human hud, slik som laminin, Type IV kollagen og kalanin (GB3).

Dyrkede vevsekvivalenter oppnådd ved hjelp av organotypiske dyrkingsmetoder, slik som Living Skin Equivalent (LSE), benytter en bærer som et rammeverk hvorpå ekvivalentene dannes. Dyrkede vevsekvivalenter fremstilles på en bærer som tillater mani-pulering av konstruksjonen under fremstilling, forsendelse og sluttbruk uten direkte å komme i kontakt med konstruksjonen. Metoder for fremstilling av dyrkede vevsekvivalenter på en bærer er omhandlet i US patent nr. 5,374,515 og US søknadsnr. 08/193,809 og 08/337,830.

En holder inkluderer en flat permeabel membran som er festet til en ende av en essen-sielt rørformet understøttelse. Den andre enden av den rørformede understøttelsen inkluderer en utoverragende flense som igjen bærer en kant som kan henge på den øvre enden av en brønn i en vevskulturskål og i emballasjeutformingen ifølge den foreliggende oppfinnelse. Membran-understøttelsessammenstillingen er laget i en viss stør-relse for å anvendes med en dyrkingsskål med minst en brønn med en spesifikk størrelse for å tilveiebringe den passende klaring rundt understøttelsen og bringes i kontakt med den øvre enden av brønnen. Membran-understøttelsessammenstillingen kan være fremstilt i forskjellige størrelser for å anvendes med forskjellige størrelser av både dyrkingsskåler og kryokonserverings- og lagringsemballasjer. Eksempler på slike holdere er en TRANSWELL (Costar) som beskrevet i US patent nr. 5,466,602, modifikasjoner av emballasjeutformingen kan utføres av den fagkyndige på området for å tilpasses lignende holdere som anvender forskjellige midler for understøttelse og inngrep i dyrkingsbeholdere/forsøkskar. Lignende bærere er beskrevet i US patenter nr. 5,358,871 og 5,366,893 eller dem beskrevet i US patent nr. 4,871,674.

Emballasjeutforming innlemmer holder-rammeverket og definerer omgivelse rundt vevsekvivalenten som er i stand til å kontrolleres til forutbestemte spesifikasjoner. Det blir benyttet materialer som helst er av en kvalitet som tilfredsstiller medisinske krav og er i stand til å tåle et bredt temperaturområde. Disse materialene formes til å danne et brett og et deksel som er i stand til å føyes tett sammen ved hjelp av et tetningsmiddel. Den nye emballasjen er utformet til å innlemme en holder-understøttelse hvorpå vevsekvivalentene dannes.

Den nye emballasjeutformingen omfatter et brett, et deksel og en tett tetning derimel-lom. Brettet og dekselet er utformet til å passe sammen med den eksisterende holder inneholdende den festede vevsekvivalent. Holderen med den festede vevsekvivalent anbringes i brettet og kryobeskyttelsesmiddel-oppløsning tilsettes. Dekselet anbringes deretter oppå brettet og de to delene føyes sammen på tett måte til å danne en tett tetning mellom de indre og ytre omgivelser av emballasjen. Emballasjeutformingen tillater en lik fordeling av kryobeskyttelsesmiddel under holderen og over overflaten av vevsekvivalenten mens det opprettholdes kontakt mellom kryobeskyttelsesmiddel og både brettet og dekselet. Utformingen av emballasjen er basert på det konsept at kon-trollerte kjøle- og frysehastigheter kan opprettholdes med et likt volum kryobeskyttelsesmiddel, arrangert med en lignende geometri over og under det dyrkede vev som kryokonserveres. Dette arrangement tilveiebringer en jevn avstand, målt fra både den øvre og nedre overflate av den dyrkede vevsekvivalent, til ytterveggen av emballasjen (forutsatt at emballasjen også har jevn tykkelse). Denne jevnheten bør tilveiebringe jevn varmeveksling fra vevsekvivalent til frysekammeret ved kjøling, og fra de ytre omgivelser til vevsekvivalenten, ved tining. Brettet omfatter en bunnoverflate som er tilgrensende med en sidevegg og en flense. Flensen tilveiebringer en plan overflate for tetning av brettet til dekselet. Sideveggen av brettet har en enkeltstående kontinuerlig eller et flertall av diskontinuerlige understøttel-ser innoverragende fra og i ett med sideveggen. Den øvre kanten av holderen inneholdende den dyrkede vevsekvivalenten, når plassert i brettet, er opphengt på understøttelsen tilveiebragt av sideveggen av brettet. Et rom defineres mellom den opphengte holderen og bunnoverflaten av brettet som måler omtrent 1,0 mm i tykkelse og med et areal på omtrent størrelsen av vevsekvivalenten.

Dekselet omfatter en plan bunnoverflate i ett med en sidevegg og en flense. Diameteren av dekselflensen er noe mindre enn diameteren av brettflensen. Dekselflensen, når anbragt på brettet inneholdende en holder, hviler på bæreren slik at toppoverflatene av både brettflensen og dekselflensen er i kontakt orientert på eller rundt det samme plan. Et andre rom defineres av dekselet og overflaten av den dyrkede vevsekvivalent som også måler omtrent 1,0 mm i tykkelse med et areal på omtrent størrelsen av vevsekvivalenten.

Utformingen tillater totalt omtrent 1 mm mellom brettet og bunnen av holderen inneholdende vevsekvivalenten anbragt derpå og omtrent 1 mm mellom dekselet og vevsekvivalenten med kryobeskyttelsesmiddelet over og under vevsekvivalenten i kontakt med både dekselet og brettet. Når dekselet er anbragt i brettet inneholdende medium fortrenger dekselet eventuell luft i emballasjen til det omgivende rom inneholdende den rørformede understøttelsen av holderen.

Dekselet tettes til-brettet langs det eksponerte plan dannet av toppoverflatene av brett-og dekselflensene. Tetning kan utføres ved hjelp av varme, adhesjonsmiddel eller andre midler kjent innen fagområdet. Tetningen mellom dekselet og brettet hindrer lekkasje av kryobeskyttelsesmiddel og opprettholder steriliteten av det indre av enheten. Et ring-formet sjikt av varmeforseglbart deksel-material varmeforsegles til både brettet og dekselflensen derpå. Deksel-material et har foretrukket en flik for avtrekkbar fjerning, og derfor bryte forseglingen, dekselet fra brettet for å gi adgang til vevsekvivalenten. I en annen utførelsesform anbringes et deksel med en flense av omtrent den samme diameter som brettflensen på brettet med en holder anbragt inni slik at bunnoverflaten av dekselflensen bringes i intim kontakt med toppoverflaten av brettflensen. Flensene forsegles deretter sammen ved hjelp av et forseglbart middel. Figurer IA og IB viser deksel 10, dekselflense 11, dekselsidevegg 12 og bunnoverflate 13. Dekselflense 11, dekselsidevegg 12 og bunnoverflate 13 danner en sammenhengende overflate. Figur 2 viser den ringformede forsegling 20 og avtrekksflik 21. Figurer 3 A og 3B viser forsegling 20, deksel 10 og dekselflense 11. Forsegling 20 er festet på dekselflensen 11 av dekselet 10 før anvendelse for å lette tilpasning av tetningen under forseglingsprosessen. Figurer 4A og 4B viser holderen 30, holderkanten 31, permeabel membran 32 og rørformet understøttelse 33. Den permeable membranen 32 inneholder en dyrket vevsekvivalent anbragt derpå bundet ved hjelp av den rørformede understøttelse 33. Holderen 30 tillater overføring av vevsekvivalenten uten kontakt eller fjerning av vevsekvivalenten i løpet av kryokonserveringsprosessen. Figurer 5A og 5B viser brett 40, brettets bunnoverflate 41, brettets sidevegg 42, brettflense 43 og holder-understøttelser 44. Brettets bunnoverflate 41, brettets sidevegg 42, brettflense 43 og holder-understøttelser 44 danner en sammenhengende overflate. Holder-understøt-telser 44 er i kontakt med og understøtter holderen i brettet. Figurer 6A og 6B viser tetning 20, deksel 10, holder 30 og brett 40. Holder 30 inneholdende en vevsekvivalent derpå er anbragt i brett 40 og er opphengt i brettet. Deksel 10 med tetning 20 er anbragt over holder 30 og er opphengt over holderen. Figur 7 viser tetning 20, dekselflense 11, deksel 10, holder 30, holderkant 31, holder-understøttelser 44 og brett 40. Holder 30 inneholdende en vevsekvivalent derpå anbragt i brett 40 og er opphengt i brettet ved kontakt mellom bunnoverflaten av holderkant 31 og toppoverflatene av holder-under-støttelsene 44. Deksel 10 med tetning 20 er anbragt over holder 30 og er opphengt over holderen ved kontakt mellom bunnoverflaten av dekselflense 11 og toppoverflaten av holderkant 31. Toppoverflatene av både dekselflense 11 og brettflense 43 danner en plan overflate for tetning 20. Figur 8 viser en oversikt ovenfra av sammenstillingen.

Materialer som brett og deksler kan fremstilles fra er rigide eller halvfleksible termo-plastiske materialer som, når varmet, formes ved hjelp av et vakuum eller sprøytestøpes slik som polytetrafluoretylen (PTFE) eller polyetylentereftalatglykol (PETG). Embal-lasjebrettene og -dekslene steriliseres foretrukket før bruk ved metoder som er kjent innen fagområdet sterilisering. Materialene anvendt for å fremstille brettet og dekselet vil avhenge av steriliseringsmetoden som kan anvendes. For å sterilisere PTFE eller PETG er gammastråling ved 2,5 til 3,0 megarad foretrukket. Elektriske og kjemiske metoder for sterilisering som er kjent av de fagkyndige innen fagområdet kan alternativt anvendes.

Dyrkede vevsekvivalenter omfatter en dermal ekvivalent av et hydrert kollagen-gitterverk trukket sammen av et middel, foretrukket fibroblaster. I en utførelsesform er et lagdelt sjikt av epidermis-celler dyrket på overflaten av den dermale ekvivalent. I en annen utførelsesform er det hydrerte sammentrukkede kollagen-gitterverk, sammen-trukket ved hjelp av keratocytter, anbragt på et lag av korneale endotelceller med et lagdelt sjikt av korneale epitelceller dyrket på overflaten av gitterverket. Alternativt kan epidermis-celler alene dyrkes og induseres til å lagdeles til å danne et epidermis-flak. Den dyrkede vevsekvivalenten dannes enten på en porøs membran av en holder eller på en kollagengel som er festet til en porøs membran av bunnoverflaten av en holder. I tillegg kan andre dyrkede vevsekvivalenter kryokonserveres i samsvar med metodene ifølge denne oppfinnelsen inkluderende, men ikke begrenset til, et hvilket som helst dyrket epidermis-flak, en hvilken som dyrket dermal-ekvivalent, en hvilken som helst dyrket kornea-ekvivalent, eller høstet pattedyrhud.

Anvendelse av vevsekvivalenter og emballasjeutforming som illustrasjon, vil nå be-skrives. Det vil forstås av de fagkyndige innen området at modifikasjoner kan utføres av den beskrevede metode og fremdeles være innenfor rammen av denne oppfinnelsen.

Metoden med perfusering av et vevsekvivalent med en kryobeskyttelsesmiddel-oppløs-ning er å nedsenke vevsekvivalenten og holderen festet dertil i et volum av kryobeskyttelsesmiddel-oppløsning som er tilstrekkelig til å nedsenke prøven og ha likt volum kryobeskyttelsesmiddel-oppløsning over og under vevsekvivalenten. Til en 100 mm petriskål inneholdende vevsekvivalenten og holderen tilsettes 25 mL av 2M glyserol i DMEM i løpet av en tidsperiode som er tilstrekkelig til å fullstendig perfusere prøven, foretrukket mellom en og to timer, men mest foretrukket i løpet av omtrent en time. Lengre tidsperioder i kryobeskyttelsesmiddel-oppløsning resulterer i redusert cellelevedyktighet i vevet, mens for kort tidsperiode ikke sikrer fullstendig permeasjon av kryobeskyttelsesmiddel inn i vevet. Ettlags konstruksjoner vil typisk kreve mindre tid for perfusjon siden de har færre cellelag og redusert barrierefunksjon. I løpet av denne timen fremmes penetrasjon av kryobeskyttelsesmiddel-oppløsning ved omrøring av prøven og kryobeskyttelsesmiddel-oppløsningen, typisk ved rysting av petriskålen på en ryster med sirkelbaneroterende plattform (Bellco sirkelbane-ryster) ved 70 opm i en 10% C02-gasset kammer. De 10% CO2 omgivelsene, de samme som dyrkingsomgiv-elsene hvori vevsekvivalenten ble fremstilt, hindrer media fra avgassing, og således opprettholdes pH av basismedia-komponenten av kryobeskyttelsesmiddelet. Omrøring tillater en raskere og mer fullstendig perfusjon av kryobeskyttelsesmiddel inn i vevsekvivalenten og bedre reproduserbarhet av resultater mellom frosne vevsekvivalenter. Man kan erstatte en sirkelbevegende ryster med et apparat som utfører en omrørende bevegelse i andre romlige plan. I tillegg inkluderer andre metoder for mekanisk frem-met perfusjon, men er ikke begrenset til, å gynge konstruksjonen med kryobeskyttelsesmiddel i et kar på en plattform eller sentrifugering av konstruksjonen med kryobeskyttelsesmiddel og perfusering av kryobeskyttelsesmiddel rundt konstruksjonen under anvendelse av en pumpe.

Holderen og festet vevsekvivalent anbringes i brettet og totalt omtrent 16,0 ml kryobeskyttelsesmiddel-oppløsning tilsettes. Emballasjeutformingen tillater jevn fordeling av kryobeskyttelsesmiddel: omtrent 8,0 ml under holderen og omtrent 8,0 ml på overflaten av vevsekvivalenten. Dekselet anbringes deretter på brettet og de to delene varmeforsegles, foretrukket til deksel-materialet.

Emballerte vevsekvivalenter anbringes deretter i en programmerbar fryser (Cryomed eller Planer) innstilt ved en begynnelsestemperatur på omtrent romtemperatur, foretrukket ved 20,0°C. Frysekammeret inneholdende emballerte vevsekvivalenter kjøles ved -10,0°C/minutt til fastfase-væskefase likevekts-temperaturområde for kryobeskyttelsesmiddelet som typisk er, for 2,0 M glyserol i DMEM, mellom omtrent -5,3°C og -6,0°C. Fastfase-væskefase likevekts-temperaturen er den temperatur som er nødvendig for tilveiebringelsen av kim av is i kryobeskyttelsesmiddelet. Temperaturen i kammeret holdes i en tidsperiode for det formål å ekvilibrere den indre temperatur av de emballerte vevsekvivalenter til temperaturen i kammeret. Den avkjølingshastighet som anvendes for å oppnå krystalliseringstemperaturen er ikke kritisk. En holdetid på omtrent 40 minutter er tilstrekkelig til å sikre termisk ekvilibrering men tiden vil variere avhengig av kammerets størrelse, luftsirkulasjon i kammeret, og antallet emballasjer som skal fryses. Mens det typisk er nødvendig med minst 30 minutter, kan det ta opptil en time for å sikre ekvilibrering. Etter holdetiden initieres ekstracellulær isdannelse ved krystal-1 i sering.

Iskrystallisering (ice seeding) defineres som en metode for initiering av isdannelse i det ekstracellulære kryobeskyttelsesmiddel. En foretrukket metode for iskrystallisering er

å anbringe siden av brettet inneholdende vevet i kontakt med en avkjølt sonde, slik som en stålstang nedkjølt med flytende nitrogen (-196°C). Kontaktstedet mellom stangen og emballasjen må være under nivået for kryobeskyttelsesmiddel-frysemedia i emballasjen. En annen foretrukket metode er å direkte frigjøre ekspanderte gasser slik som freon eller CO2 til utsiden av emballasjen. Isdannelse kan initieres ved hjelp av en spikerlignende gjenstand i kammeret hvor temperaturen i kammeret senkes og økes innen et område som er tilstrekkelig til å danne iskrystaller. Andre metoder for iskrystallisering som er kjent innen området kan brukes i stedet.

Etter at alle vevsekvivalentene er tilveiebragt med kimer av iskrystaller, holdes enhetene ytterligere en time for å tillate termodynamisk ekvilibrering og propagering av iskim-krystallen gjennom hele kryobeskyttelsesmiddelet. Kjøling gjenopptas deretter ved en hastighet på foretrukket mellom omtrent -0,02 og -0,3°C/minutt, mer foretrukket mellom omtrent -0,05 og -0,l°C/minutt, og mest foretrukket ved omtrent -0,07°C/minutt til en sluttemperatur foretrukket på minst eller under -70°C, mer foretrukket ved -120°C, enda mer foretrukket ved -140°C, eller mest foretrukket ved -196°C. Ettersom den endelige frysetemperatur nærmer seg glasstemperaturen til vann, -120°C, jo mindre sannsynlig er det for at det vil være skadelige temperaturfluktuasjoner under overfør-inger til endelige lagringslokaliteter.

Kyrokonserverte vevsekvivalenter overføres fra den programmerbare fryser til lagring i en dampfase-flytende nitrogenlagringstank (Dewar) ved en temperatur mellom -120 til

-150°C, eller i flytende nitrogen ved -196°C inntil bruk.

For å tine, fjernes kryokonserverte dyrkede vevsekvivalenter fra dampfase-flytende nitrogenlagring og overføres til tørris for å varmes til omtrent -75°C. Så snart de er ekvilibrert ved -75°C overføres dyrkede vevsekvivalenter deretter til en omgivelse, foretrukket et vannbad, foretrukket innstilt ved 37°C, eller mer foretrukket innstilt ved 4°C, eller mest foretrukket innstilt ved romtemperatur. Så snart det er synlig at alt kryobeskyttelsesmiddel-medie er blitt til væskefase overføres dyrket vevsekvivalent-embal-lasjeenheten foretrukket til et biologisk sikkert kabinett, eller annet aseptisk område og hygieniseres med etanol. Dekselet på skålene fjernes ved avtrekking eller ved å skjære deksel-materialet fra bunnen av enheten. Holderne inneholdende dyrkede vevsekvivalenter overføres deretter hver til petriskåler mens overskudd av kryobeskyttelsesmiddel helles av. For å skylle den dyrkede vevsekvivalent for resterende kryobeskyttelsesmiddel tilsettes deretter 25 mL skylleoppløsning, foretrukket DMEM ved romtemperatur, til petriskålen inneholdende den dyrkede vevsekvivalent i omtrent 30 minutter. Andre til-strekkelige skyllemidler, foretrukket oppløsninger av fysiologisk styrke, slik som celledyrkingsmedia eller fosfatbufret saltoppløsning, kan bestemmes av den fagkyndig på området. Skylleoppløsningen byttes en andre gang i ytterligere 30 minutter. Skylletider kan variere avhengig av kompleksiteten av vevet.

Den dyrkede vevsekvivalent-enhet kan deretter overføres tilbake til sin opprinnelige kulturskål og rekultureres i kulturopprettholdelses-medium ved 37°C/10% CO2. Alternativt kan ekvivalenten tilføres til en pasient eller testes for en respons overfor kontakt med en substans som beskrevet i US patent 4,835,102.

De etterfølgende eksempler tilveiebringes for bedre å belyse utførelsen av den foreliggende oppfinnelse og bør ikke på noen måte tolkes til å begrense rammen av den foreliggende oppfinnelse. De fagkyndige innen området vil forstå at ulike modifikasjoner kan utføres med hensyn til metodene beskrevet heri uten å avvike fra tanken og rammen av den foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPLER

Eksempler 1 til 3

Eksempler 1 til 3 viser kryokonserverings- og tineteknikkene ifølge denne oppfinnelsen med den foretrukne emballasjeutforming.

Eksempel 1:

Kryokonservering av Living Skin Equivalent ( LSE) med emballasjeutformingen Living Skin Equivalent (LSE) konstruksjoner ble fremstilt i samsvar med US søknads-nr. 08/193,809. LSE'er og festede 75 mm holder-innsatser (TRANSWELL, Costar, Cambridge), ved 9 til 10 døgn etter lufttransport, ble anbragt i 100 mm petriskåler (Costar). LSE konstruksjoner ble perfusert med kryobeskyttelsesmiddel med nedsenking av konstruksjonene og "transwell" holder-innsatsene med 25 mL kryobeskyttelsesmiddel-media, 2M glyserol i DMEM, i den 100 mm petriskålen i en time. Under perfusjon ble konstruksjonene omrørt i en time på en sirkelbevegende ryster (Bellco) ved 70 opm i et 10% CCVgasset kammer. Omrøring tillater mer fullstendig perfusjon og bedre reproduserbarhet av kryokonserveringsmetoden. Etter at LSE var perfusert ble petriskålene inneholdende LSE, bærer-innsatser og ekstracellulært frysemedia (2M glyserol og DMEM) anbragt i en kryokonserveringsemballasje og varmeforseglet. Kryokonserveringsemballasjer er beskrevet i løpende patentsøknad, US søknadsnr. 08/380.099, innlevert samme dag som denne søknaden.

Kammeret i en programmerbar fryser (Planar) ble utstyrt med oppfinnelsen beskrevet heri. Fryseren ble innstilt ved en begynnelsestemperatur på 20,0°C. Rørledningene ble spylt med freon i et enkelt ett sekunds intervall for å fjerne eventuell luft i ledningene. Emballerte LSE enheter ble anbragt sikret i stativer som rommer åtte LSE enheter hver. Stativene, ledet av styrepinner, ble anbragt i umiddelbar nærhet av sprøyterekkene. Kammerdøren i fryseren ble lukket for å forsegle kammeret fra de ytre omgivelser.

LSE enheter ble avkjølt ved -10°C/minutt til -6°C og kammertemperaturen ble holdt ved

-6°C i 40 minutter for å ekvilibrere kryobeskyttelsesmiddelet og perfuserte konstruk-

sjoner til kammertemperaturen. Etter perioden på 40 minutter, ble den ekstracellulær is initiert ved direkte uttømming av freon i ett sekund i umiddelbar nærhet av siden av beholderen. Freon, når det fordampet fra overflaten av emballasjen, bevirket at kontakt-området av freon falt tilstrekkelig i temperatur til å initiere ekstracellulær isdannelse.

Etter at alle LSE enheter var tilveiebragt med kimer av iskrystaller, fikk enhetene ekvilibrere i en time ved -6°C. Kammertemperaturen ble deretter avkjølt ved -0,07°C/minutt til en sluttemperatur på -20°C. Kammeret ble deretter avkjølt ved -0,5°C/minutt til en sluttemperatur på -70°C. Så snart LSE enhetene var kryokonservert, ble de overført til en dampfase-lagringstank (Dewar) ved en temperatur på -120° til -150°C.

Eksempel 2

Tining av kryokonservert LSE

Kryokonservert LSE ble fjernet fra dampfase-flytende nitrogenlagring og overført til tørris for å varmes til omtrent -75°C. Så snart den var ekvilibrert ved -75°C overføres den dyrkede vevsekvivalent til et vannbad foretrukket innstilt ved 37°C, eller mer foretrukket innstilt ved 4°C, eller mest foretrukket innstilt ved romtemperatur. Så snart det er synlig at alt kryobeskyttelsesmiddel-medie er blitt til væskefase, overføres dyrket vevsekvivalent-emballasjeenhetene til et biologisk sikkert kabinett, eller annet aseptisk område og renses med etanol. Dekselet på skålene fjernes ved avtrekking eller skjæring av deksel-materialet fra bunnen av enheten. Holderne inneholdende dyrkede vevsekvivalenter overføres deretter hver til petriskåler under avhelling av overskudd av kryobeskyttelsesmiddel. For å skylle den dyrkede vevsekvivalent for resterende kryobeskyttelsesmiddel tilsettes deretter 25 mL (romtemp.) skylleoppløsning, foretrukket DMEM, deretter til petriskålen inneholdende den dyrkede vevsekvivalent i omtrent 30 minutter. Andre tilstrekkelig fysiologiske skylleoppløsninger, slik som annet celledyrkingsmedia eller fosfatbufret saltoppløsning, kan bestemmes av den fagkyndige på området. Skylle-oppløsningen byttes en andre gang i ytterligere 30 minutter.

Tinede kryokonserverte og kontrollprøver ble bearbeidet ved hjelp av histologiske metoder og evaluert ved hjelp av lysmikroskopi med hensyn på morfologisk organisering og levedyktighet og viste nær 100% levedyktighet og kunne nesten ikke skjelnes fra kontrollen.

Eksempel 3

Evaluering av kryokonserverings- utforming for oppvarmingshastighet og termisk ensartethet

En kryokonserveringsemballasje ifølge den foreliggende oppfinnelse ble evaluert med hensyn på jevn varmeoverføring. Til en holdermembran, uten en dyrket vevsekvivalent, ble det festet fem termoelementer, ett i midten og fire anbragt med lik avstand 1,0 mm fra den periferiske veggen av holderen. Termoelementledninger gikk fra emballasjen fra siden mellom deksel og brettflenser til en et temperatur-registreringsapparat (Azonix Scanner Plus). Emballasjen ble fylt med 17 mL kryobeskyttelsesmiddel og emballasjen ble varmeforseglet. Emballasjen ble ekvilibrert til -70°C og deretter overført til et vannbad innstilt ved 20°C. Temperatur-registreringsapparatet registrerte temperaturen ved hvert termoelement hvert 1 til 2 sekunder under oppvarming. Emballasjen ble oppvar-met ved en hastighet på 700°C/minutt initialt og avtok ettersom den nådde smeltepunktet for kryobeskyttelsesmiddel-oppløsningen. Den termiske ensartethet var mellom 2°C og 6°C av den gjennomsnittlige termoelementtemperatur under de raskeste oppvarm-ingshastighetene og nærmet seg 8°C når den nådde smeltepunktet for oppløsningen.

Eksempler 4 til 12 viser kryobeskyttelsesmetoden ifølge denne oppfinnelsen på forskjellige vev.

Eksempel 4

Kryokonservering av epidermis- flak

Epidermis-flak ble anskaffet fra moden LSE ved 12 døgn etter lufttransport. Fjerning av epidermis-flak ble utført ved avtrekking av dermal-substratlaget fra epidermis-laget med pinsett og fjerning av dermallaget. Hvert flak ble skåret i tre tilsvarende stykker. Ett stykke fra hvert flak ble fiksert som en kontroll. De gjenværende to stykker fra hvert flak ble anbragt oppå en 75 mm polykarbonat "transwell" membran (Costar) i 100 mm dyrkingsskåler (Costar). Hvert stykke ble perfusert med'25 mL DMEM og 2 Molar glyserol i en time. Skålene inneholdende konstruksjoner ble anbragt på en sirkelbevegende ryster (Bellco) ved 70 opm i en time i et 10% C02-gasset kammer. Etter at epidermis-flaket var perfusert ble petriskålen inneholdende epidermis-flak "transwell" og ekstracellulært frysemedia (2M glyserol og DMEM) anbragt i en pose og vakuumfor-seglet (Audiovox) programmert for en 5 sekunder vakuumtid og en 3,9 sekunder for-seglingstid.

Emballerte epidermis-flak ble bragt i den programmerbare fryseren (Planer) ved en begynnelsestemperatur på 20,0°C. Epidermis-flak ble avkjølt ved -10,0°C/minutt til -6,0°C. Temperaturen ble holdt i 20 minutter ved -6,0°C for å ekvilibrere kammertemperaturen. Etter den 20 minutter holdetiden, ble ekstracellulær is initiert ved å bringe utsiden av posen, under nivået for frysemedia, i kontakt med en sonde nedkjølt med flytende nitrogen. Etter at alle epidermis-flak hadde blitt tilveiebragt med kim av iskrystaller, ble temperaturen holdt i ytterligere 5 minutter ved -6,0°C. Kammeret ble deretter avkjølt ved -l,0°C/minutt til -8,0°C. Temperaturen ble deretter holdt i 30 minutter ved -8,0°C for å tillate jevn fordeling av is gjennom hele prøven. Kammeret ble deretter avkjølt ved -0,l°C/minutt til en sluttemperatur på -70°C.

Kryokonserverte epidermis-flak ble fjernet fra fryseren og posene ble skåret fra petriskålene og dekslene fjernet. For å tine, ble 40 mL varmet (37°C) DMEM aseptisk helt i hver petriskål. Etter 45 sekunder ble all væske fjernet fra skålene og en ytterligere 40 mL prøvemengde ble tilsatt til hver skål i to minutter. Etter at all is var tint ble epidermis-flakene skyllet med 25 mL DMEM i 30 minutter. Media ble byttet en andre gang i ytterligere 30 minutter. Epidermis-flakene ble deretter inkubert i kulturopprettholdelses-medium ved 37°C/10% CO2 i 24 timer forut for analyse. Inkubasjonstiden ble foretatt på grunn av den forsinkelse som typisk sees for at frosne celler skal reetablere betingelser med stabil tilstand. Igjen ble inkubasjonstiden foretatt på grunn av den forsinkelse som typisk sees for at frosne celler skal reetablere betingelser med stabil tilstand.

Av de to gjenværende stykker fra hvert epidermis-flak, ble ett fra hvert bearbeidet for histologi og ett stykke fra hvert flak ble analysert ved å følge MTT analyseprosedyren. Sammenligning av mikrofotografier av ikke-kryokonservert epidermis-flak og kryokonservert epidermis-flak ifølge eksempel 4 viste at de tre basistrekkene av epidermis, basallaget av epidermis, suprabasallagene av epidermis og stratum corneum av epidermis ble alle konservert ved hjelp av denne metoden. Alle lagene.var intakte og den totale morfologi av det kryokonserverte epidermis-flak var identisk med den for det ikke-kryokonserverte epidermis-flak.

Eksempel 5

Kryokonservering av dermal- ekvivalent

Dermal-ekvivalenter anvendt i denne undersøkelsen var den ikke-epidermialiserte kom-ponent av LSE. Dermal-ekvivalenter ble frosset ved 8 døgn etter formgivning. Dermal-ekvivalentene ble perfusert med kryobeskyttelsesmiddel ved nedsenking av dermal-ekvivalentene festet til 75 mm "transwell" (Costar) anbragt i 100 mm petriskåler med 25 mL DMEM og 2 Molar glyserol i en time. Petriskålene ble plassert på en sirkelbevegende ryster (Bellco) ved 70 opm i en time i et 10% CCVgasset kammer. Etter at dermal-ekvivalentene var perfusert, ble petriskålene, dermal-ekvivalentene "transwells" og ekstracellulært frysemedia plassert i den programmerbare fryseren (Planer) ved en begynnelsestemperatur på 20,0°C. Kammeret ble deretter avkjølt ved -10,0°C/minutt til -6,0°C. Temperaturen ble holdt i 20 minutter for å ekvilibrere kammertemperaturen. Etter 20 minutter ble ekstracellulær is initiert ved å bringe utsiden av skålene, under nivået for frysemedia, i kontakt med en sonde nedkjølt med flytende nitrogen. Etter at alle dermal-ekvivalenter hadde blitt tilveiebragt med kim av iskrystaller, ble temperaturen holdt i ytterligere 5 minutter ved -6,0°C. Kammeret ble deretter avkjølt ved -l,0°C/minutt til -8,0°C. Kammertemperaturen ble igjen holdt i 30 minutter ved -8,0°C for å tillate jevn fordeling av is gjennom hele prøven. Dermalekvivalentenheter ble deretter avkjølt ved -0,l°C/minutt til en sluttemperatur på -70°C.

Kryokonserverte dermal-ekvivalenter ble deretter fjernet fra fryseren og dekselet på skålen ble fjernet. For å tine, ble 40 mL varmet (37°C) DMEM aseptisk helt i hver petriskål. Etter 45 sekunder ble all væske fjernet fra skålene og en ytterligere 40 mL prøvemengde ble tilsatt til skålene i to minutter. Etter at all is var tint, ble dermal-ekvivalentene skyllet med 25 mL DMEM i 30 minutter. Mediet ble byttet en andre gang i ytterligere 30 minutter. Dermal-ekvivalentene, fremdeles festet til "transwell'ene", ble deretter overført tilbake til dyrkingsskålene og inkubert i kulturopprettholdelses-medium ved 37°C/10% CO2 i 24 timer forut for analyse. Inkubasjonstiden ble utført på grunn av den forsinkelse som typisk sees for at frosne celler skal reetablere betingelser med stabil tilstand. Prøver ble analysert ved anvendelse av MTT analyseprosedyren.

Eksempel 6

Kryokonservering av kornea- ekvivalenter Kornea-ekvivalenter festet til 24 mm kultur "transwell'ene" (Costar), 9 døgn etter transport i fuktig luft, ble anbragt i skåler med grupper på seks brønner (Costar). Metoden for perfusering av kornea-ekvivalenter med kryobeskyttelsesmiddel var å nedsenke hver kornea-ekvivalent og "transwell" med 4 mL ekstracellulært frysemedia (2M glyserol i DMEM) i skålene med grupper av seks brønner i en time. Skålene med grupper av seks brønner inneholdende kornea-konstruksjonen ble rystet i en time på en sirkelbevegende ryster (Bellco) ved 70 opm i et 10% CCVgasset kammer. Etter at kornea-ekvivalentene var perfusert, ble petriskålene inneholdende kornea-ekvivalenter "transwell'ene" og ekstracellulært frysemedia plassert i den programmerbare fryseren (Planer) ved en begynnelsestemperatur på 20,0°C. Kornea-ekvivalenter ble avkjølt ved -10,0°C/minutt til -6,0°C. Temperaturen ble holdt i 20 minutter ved for å ekvilibrere kammertemperaturen. Etter den 20 minutter holdetiden, ble ekstracellulær is initiert ved å bringe utsiden av hver brønn i gruppe-platen, under nivået for frysemediet, i kontakt med en sonde nedkjølt med flytende nitrogen. Etter at alle kornea-ekvivalentene hadde blitt tilveiebragt med kim av iskrystaller, ble temperaturen holdt i ytterligere 5 minutter ved -6,0°C forut for avkjøling ved -l,0°C/minutt til -8,0°C. Temperaturen ble igjen holdt i 30 minutter ved -8,0°C for å tillate jevn fordeling av is gjennom hele prøven. Kornea-ekvivalentenheter ble avkjølt ved -0,l°C/minutt til en sluttemperatur på -70,0°C.

Kryokonserverte kornea-ekvivalenter ble fjernet fra fryseren. Dekselet på hver skål ble fjernet. For å tine, ble 6 mL varmet (37°C) DMEM aseptisk helt i hver brønn av gruppe-platen. Etter 45 sekunder ble all væske fjernet fra skålen og en ytterligere 6 mL prøvemengde ble tilsatt til skålen i to minutter. Ved anvendelse av en steril pinsett ble kornea-ekvivalentene og de festede "transwell'ene" overført til en gruppe-skål. For å skylle ble 4 mL DMEM tilsatt til hver brønn i 30 minutter. Mediet ble byttet en andre gang i ytterligere 30 minutter. Kornea-enhetene ble deretter overført tilbake til den samme dyrkingsskålen og inkubert i korneaopprettholdelses-medium ved 37°C/10% CO2 i 24 timer forut for analyse. Inkubasjonstiden ble utført på grunn av den forsinkelse som typisk sees for at frosne celler skal reetablere betingelser med stabil tilstand. Prøver ble analysert ved anvendelse av MTT analyseprosedyren.

Eksempel 7

Kryokonservering av høstet murin hud

Mus av vill type, stamme B6CB6YF1, ble avlivet ved hjelp av Nembutal-overdose. Huden ble høstet aseptisk. Overskytende blodkar, fett og bindevev ble fjernet fra dermis. Murin hud ble trimmet til et rektangulært stykke på en cm x 2 cm. Murine hudstykker ble deretter anbragt på en 75 mm "transwell" (Costar). i 100 mm petriskåler (Costar). Murin hud ble perfusert med kryobeskyttelsesmiddel ved nedsenking i 25 mL av 2M glyserol i DMEM i de 100 mm petriskålene i en time. Under perfusjon ble petriskålene hver inneholdende den murine hud og "transwell" rystet i en time på en sirkelbevegende ryster (Bellco) ved 70 opm i et 10% C02-gasset kammer. Kontroll ikke-kryokonservert musehud ble holdt i næringssubstrat ved 4°C under varigheten av kryokonserveringen og tinepro sessen (2 døgn) før hudpoding.

Etter at murin hud er perfusert plasseres petriskålene inneholdende murin hud, "transwell" og ekstracellulært frysemedia i den programmerbare Planer-fryseren ved en begynnelsestemperatur på 20,0°C. Murin hud ble avkjølt ved -10,0°C/minutt til -6,0°C og ble holdt ved -6°C i 20 minutter for å ekvilibrere kammertemperaturen. Etter den 20 minutter holdetiden, ble ekstracellulær is initiert ved å bringe utsiden av skålen i kontakt med en sonde nedkjølt med flytende nitrogen. Kontaktstedet må være under nivået for frysemediet. Etter at all murin hud hadde blitt tilveiebragt med kim av iskrystaller ble temperaturen holdt i ytterligere 5 minutter ved -6,0°C forut for avkjøling ved -1,0°C/- minutt til -8,0°C. Temperaturen ble igjen holdt i 30 minutter ved -8,0°C for å tillate jevn fordeling av is gjennom hele prøven. Enhetene ble deretter avkjølt ved -0,1°C/- minutt til en sluttemperatur på -70,0°C.

Kryokonserverte murin hud ble fjernet fra fryseren og dekselet på skålen ble fjernet. For å tine, ble 40 mL varmet (37°C) DMEM aseptisk helt i petriskålene. Etter 45 sekunder ble all væske fjernet fra skålene og en ytterligere 40 mL prøvemengde ble tilsatt til skålene i to minutter. Etter at all is var tint, ble murin hud skyllet i skålene med 25 mL DMEM i 30 minutter. Mediet ble byttet en andre gang i ytterligere 30 minutter.

Tinte kryokonserverte og kontrollprøver ble bearbeidet for histologi eller ble podet på mus. Mikrofotografiene av ikke-kryokonservert musehud sammenlignet med kryokonservert musehud viste at de fire basistrekkene av musehud, dermis med fibroblaster, basallaget av epidermis, suprabasallagene av epidermis og stratum corneum av epidermis var konservert ved hjelp av denne metoden. Alle lagene var intakte og den totale morfologi av kryokonservert musehud var identisk med den for ikke-kryokonservert musehud.

Eksempel 8

Kryokonserverin<g> av ATS SKIN2

SKIN2, modell ZK 1300 (Advanced Tissue Sciences, La Jolla, CA) ble fjernet fra emballasjen i samsvar med forsendelsesbilaget ved ankomst bg ble anbragt i dyrkingsskåler (Costar). "Transwell" innsatser ble plassert over SKIN2 for å holde hud-konstruksjonen nedsenket. SKIN2 ble perfusert med kryobeskyttelsesmiddel ved nedsenking av SKIN2 i 2M glyserol i DMEM i dyrkingsskålene i en time. Under perfusjon ble dyrkingsskålene inneholdende konstruksjonen og "transwell" rystet i en time på en sirkelbevegende ryster (Bellco) ved 70 opm i et 10% CCVgasset kammer.

Etter at SKTN2 er perfusert ble enhetene plassert i den programmerbare fryseren (Planar) ved en begynnelsestemperatur på 20,0°C. SKIN2 enheter ble avkjølt ved

-10,0°C/minutt til -6,0°C og holdt ved -6°C i 20 minutter for å ekvilibrere kammer-

temperaturen. Etter den 20 minutter holdetiden, ble ekstracellulær is initiert ved å bringe utsiden av skålene under nivået for frysemediet i kontakt med en sonde nedkjølt med flytende nitrogen. Kontaktstedet må være under nivået for frysemediet. Etter at alle SKIN2 enheter var tilveiebragt med kim av iskrystaller ble temperaturen holdt i ytterligere 5 minutter ved -6,0°C. Kammertemperaturen ble deretter avkjølt ved -l,0°C/minutt til -8,0°C. SKIN2 enheter ble holdt i 30 minutter ved -8,0°C for å tillate jevn fordeling av is gjennom hele prøven. SKTN2 enheter ble deretter avkjølt ved

-0, Tc/minutt til en sluttemperatur på -70,0°C.

Kryokonservert SKIN2 ble fjernet fra fryseren, dekslene på skålene ble fjernet og varmet (37°C) DMEM ble aseptisk helt i hver dyrkingsskål. Etter 45 sekunder ble all væske fjernet fra skålene og enda en tilsetning av DMEM ble tilsatt til hver skål i 2 minutter. Så snart den var tint, ble SKIN2 enheten og festet "transwell" overført til nye dyrkingsskåler, ved anvendelse av en steril pinsett. For å skylle SKIN2 for kryobeskyttelsesmiddel ble DMEM tilsatt til hver dyrkingsskål inneholdende SKIN2 i 30 minutter. Mediet ble byttet en andre gang i ytterligere 30 minutter. SKIN2 enheten ble deretter overført tilbake til den samme type kulturskål og ble inkubert i kulturopprettholdelses-medium ved 37°C/10%CO2 i 24 timer forut for analyse. Igjen ble inkubasjonstiden foretatt på grunn av den forsinkelse som typisk sees for at frosne celler skal reetablere betingelser med stabil tilstand.

Kryokonserverte og kontrollkonstruksjoner ble analyser ved å følge MTT analysepro-sedyre for SKIN2 modell SK1300, som er vedlagt produktet, og også ved histologisk evaluering. Mikrofotografiene av ikke-kryokonservert SKIN2 sammenlignet med kryokonservert SKIN2 viste at de fire basistrekkene av SKIN2, kollagen-gitterverket med fibroblaster, basallaget av epidermis, suprabasallagene av epidermis og stratum corneum av epidermis var alle konservert ved hjelp av denne metoden. Alle lagene var intakte og den totale morfologi av kryokonservert SKIN2 var lignende den for ikke-kryokonservert SKIN2.

Eksempel 9

Metabolsk mitokontrisk aktivitetsanalyser ( MTT)

Frossen og ikke-frossen (kontroll) LSE, epidermis-flat dermal-ekvivalenter og kornea-ekvivalenter ble testet ved anvendelse av MTT analyse. [SKIN2 konstruksjoner ble analysert i samsvar med "MTT Assay Protocol for use with Model ZK1300", vedlagt i forsendelsespakningen]. Cellelevedyktighet av konstruksjonene ble målt ved anvendelse av MTT analyse, en kalorimetrisk MTT konversjonsanalyse utviklet for å måle cellevekst og -levedyktighet. Denne analysen er beskrevet detaljert i Gay et al., "The Living Skin Equivalent as a Model In Vitro for Ranking the Toxic Potential of Dermal Irritants", Toxic. in Vitro, 6:303-315 (1992). Den metabolske reduksjon av det opp-løselige tetrazoliumsalt til et blått formazanpresipitat er avhengig av nærværet av levedyktige celler med intakt mitokondrisk funksjon. Denne analysen anvendes til å kvantifisere cytotoksisitet i en rekke forskjellige celletyper, inkluderende dyrkede humane keratinocytter.

Til dyrkingsskålene inneholdende LSE, epidermis-flak og dermal-ekvivalent, 40 mL analysemedium og til brønnene inneholdende korneal-valenter ble det tilsatt 1,5 mL analysemedium inneholdende 0,33 mg/mL MTT (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Vevsekvivalentene ble inkubert i MTT analysemediet i 3-4 timer. Ved slutten av om-danningsperioden ble vevsekvivalenten underkastet biopsi ved anvendelse av en hud-biopsi-stanseinnretning med 8 mm diameter. De utstansede prøver ble deretter ekstra-hert i 2-3 timer ved romtemperatur i 0,3 mL isopropanol, surgjort med 0,04 N HC1. Ved slutten av ekstraksjonsperioden ble 0,2 mL av hvert ekstrakt overført til en brønn i en 96-brønns plate. Absorpsjonsevnene ble avlest på en plateleser (Dynatech) ved 570 nm ved isopropanol-ekstraksjonsmediet som en blindprøve. MTT verdier oppnådd fra tinte kryokonserverte prøver ble sammenlignet med tilsvarende kontrollprøver og uttrykt som prosent av kontroll (figur 4).

Eksempel 10

Laktosedehydrogenase- analyse ( LDH)

LDH er et enzym som finnes i en levedyktig celle. Skade på cellen bevirker en frigjøring av enzymet og en tilsvarende reduksjon i enzymaktiviteten påvist ved hjelp av denne analysen.

Tinte kryokonserverte og kontrollprøver av LSE ble utstanset med en hudbiopsi-stanse-innretning med 8 mm diameter. Tre prøver ble tatt fra hver LSÉ enhet. Utstansede prøver ble anbragt i 15 mm rør med 1 mL av 0,1 M trietanolaminbuffer (på is) og homogenisert med en elektrisk vevshomogenisator i ett minutt. Prøvene ble deretter sentrifugert ved 1000g ved 4,0°C. Supernatanten ble deretter analysert. LDHbland-ingsreagens ble fremstilt ved å blande sammen det følgende: 3,00 mL fosfatbuffer (0,1 mol/liter, pH 7,0), 0,1 mL pyruvat, Na-salt (2,5 mg/mL) og 0,005 mL NADH, Na-salt (10 mg/mL). 100 uL prøve-supernatant ble tilsatt til 900 uL av reagensene og fikk reagere i to minutter. Endringen i absorbans i løpet av de to minuttene ble registrert. Gjennomsnittet av tre prøver pr. kryokonservert LSE enhet ble sammenlignet med de ikke-frosne kontrollene. Prøveverdier ble sammenlignet med tilsvarende kontroll-verdier og uttrykk som prosent av kontroll (figur 4).

Eksempel 11

Bioekvivalens av kryokonservert LSE til ikke- kryokonservert LSE

For å demonstrere bioekvivalens av kryokonservert og ikke-kryokonservert LSE ble det utført en graftingsundersøkelse på atymiske mus.

LSE enheter, kryokonservert i samsvar med metoden skissert i eksempel 1, ble tint ett døgn før grafting og gjenvunnet i opprettholdelsesmedia i 24 timer.

Fire forsøk ble utført hvori totalt 66 atymiske mus av stammen B6CB6YFl/J-nu (Jack-son Harbor Labs) ble graftet med enten kryokonservert LSE (n = 43) eller ikke-kryokonservert (kontroll) LSE (n = 23). Dyrene ble bedøvet med Nembutal. Et 2x2 cm hudstykke av full tykkelse ble skåret fra dorsum av hver mus, idet panicculus carnosus skånes. LSE grafter, enten kontroll eller kryokonserverte, ble anbragt på såret og tilpasset. Alle grafter ble bandasjert med ett lag av petrolatumimpregnert gass (handelsvare) og dekket med to heftbandasjer (handelsvare). Forbindingene ble fjernet 7 døgn etter grafting.

Ved 14 døgn etter grafting ble alle dyrene avlivet og fotografert. Graftstedet ble deretter bortskåret for histologisk analyse og evaluering. Fotografiene og mikrofotografiene viste i sin helhet ingen forskjell i graftintegrasjon mellom kontroll LSE eller tint kryokonservert LSE. Ingen betydelig forskjell ble observert i grader av sårkontraktur mellom kontroll- og kryokonserverte grafter.

Eksempel 12

Syngenisk grafting av kr<y>okonservert og kontroll- musehud

For å demonstrere bioekvivalens av kryokonservert og ikke-kryokonservert musehud ble det utført en syngeneisk hudgraftingsundersøkelse.

Mus av vill type, stamme B6CB6YF1, ble avlivet ved Nembutal overdose. Huden ble høstet aseptisk. Overskytende blodkar, fett og bindevev ble fjernet fra dermis ved preparering for hudgrafting. Musehud ble kryokonservert og tint ved å følge metoden i eksempel 7, kontroll ikke-kryokonservert musehud ble holdt i et næringsmedium ved 4°C for varigheten av kryokonserverings- og tineprosessen, totalt to døgn, før hudgrafting.

Seks mus av samme stamme mottok hudgrafter, to mottok kontroll ikke-kryokonservert musehud og fire mottok tint kryokonservert musehud. Musene ble bedøvet med Nembutal. Et 2x2 cm hudstykke av full tykkelse ble skåret fra dorsum av hver mus, idet panicculus carnosus skånes. Musehudgrafter, enten kontroll eller kryokonserverte, ble anbragt på sårene og tilpasset. Alle grafter ble bandasjert med ett lag av petrolatumimpregnert gass dekket med to heftbandasjer. Disse forbindingene ble fjernet 7 døgn etter grafting.

Ved 30 døgn etter grafting ble alle dyrene avlivet og fotografert. Graftstedet ble deretter bortskåret for histologisk analyse og evaluering. Fotografiene og mikrofotografiene viste i sin helhet at det ikke var noen forskjell i graftintegrasjon mellom kontroll-musehud eller tint kryokonservert musehud. Ingen betydelig forskjell ble observert i grader av sårkontraktur mellom kontroll- eller kryokonserverte grafter.

Selv om den foregående oppfinnelse har blitt beskrevet i noe detalj som illustrasjon og eksempel for det formål å bedre forståelsen, vil det være åpenbart for den fagkyndige innen området at visse forandringer og modifikasjoner kan utføres innenfor rammen av de vedføyde krav.

Claims (33)

1. Fremgangsmåte for kryokonservering av høstet mammalsk hud, dyrket hud eller cornea-ekvivalent, karakterisert ved at den omfatter: (a) nedsenkning av nevnte vev i en kryobeskyttende oppløsning og omrøring av nevnte nedsunkede vev for å oppnå effektiv penetrering av den kryobeskyttende oppløsningen inn i nevnte vev; (b) senking av temperaturen tilstrekkelig til å tillate iskrystallisering og krystallisering av ekstracellulær is i nevnte kryobeskyttende oppløsning; og (c) nedkjøling til en kryokonservert tilstand av nevnte kryobeskyttende oppløsning og nevnte vev ved en rate på omtrent -0,3°C pr. minutt eller mindre, til en temperatur tilstrekkelig til å kryokonservere nevnte vev.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte nedsenkning i trinn (a) blir fullført i et gasset miljø.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at i trinn (b) er ekstracellulær is initiert ved kontakt med en flytende nitrogenavkjølt probe.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at etter nevnte iskrystallisering, blir temperaturen senket med en rate på -1°C pr.minutt, til en temperatur på omtrent -8°C, og holdt der i en tid som er tilstrekkelig for å tillatte fysisk og biologisk ekvilibrasjon av nevnte kryobeskyttende oppløsning i nevnte vev, forut for avkjøling til en kryokonservert tilstand.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at nevnte nedkjølingsrate i trinn (c) er omtrent -0,2°C pr. minutt eller mindre.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at nevnte nedkjølingsrate i trinn (c) er omtrent -0,1°C pr. minutt eller mindre.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte dyrkede hud ekvivalent er selektert fra gruppen bestående av dyrket epidermal ekvivalent, dyrket dermal ekvivalent, tolaget hudekvivalent og trelaget hudekvivalent.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte temperatur på nevnte kryopreserverte tilstand er ved eller under -120°C.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte temperatur av nevnte kryokonserverte tilstand er ved eller under -140°C.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte temperatur hos nevnte kryokonserverte tilstand er ved eller under -196°C.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte kryobeskyttende oppløsning er 1,5M til 2,5M glyserol i et medium av Dulbec-co's Modified Eagle's Medium.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den ytterligere omfatter tining av nevnte kryokonserverte vev, hvori nevnte vev blir tint i omtrent 1 til omtrent 3 minutter.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte kryobeskyttende oppløsning omfatter én eller flere glassdannende midler selektert fra gruppen bestående av et cellepenetrerende, glassformende middel og et ikke-cellepenetrerende glassformende middel.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at ikke-cellepenetrerende, glassformende middel er en høymolekylær vektform av et kom-plekst karbohydrat omfattende ett eller flere medlemmer selektert fra gruppen bestående av kondroitinsulfat, polyvinylpyrrolidon og polyetylenglykol.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at nevnte ikke-cellepenetrerende, glassformende middel er en hetastivelse.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at nevnte hetastivelse er hydroksyetylstivel se.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at nevnte cellepenetrerende, glassformende middel er selektert fra gruppen bestående av glyserol, propylenglykol, etylenglykol og dimetylsulfoksyd.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at nevnte cellepenetrerende middel er glyserol.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at nevnte glassformende middel er fortynnet i et medium selektert fra gruppen bestående av DMEM, IDMEM, MEM, M199, RPMI 1640, Ham's F-12, Ffam's F-10, NCTC 109, NCTC 13 5 og fosfatbuffret saltlake.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte kryobeskyttende oppløsning er 2M glyserol i Dulbecco's Modified Eagle's Medium.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte nedsenking blir gjennomført ved en start-temperatur på omtrent 20°C og deretter senking av nevnte temperatur til omtrent -6°C.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at nevnte senking blir gjennomført ved en rate på omtrent -10°C pr.minutt.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte dannelse i trinn (b) blir gjennomført ved en temperatur på omtrent -6°C til omtrent -8°C.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte kryokonserverte vev blir lagret ved en temperatur på minst omtrent -70°C.

25. Fremgangsmåte for kryokonservering av høstet mammalsk hud, dyrket hud eller cornea-ekvivalent, karakterisert ved at den omfatter: (a) Nedsenkning av nevnte vev i en kryobeskyttende oppløsning og omrøring av nevnte kryobeskyttende oppløsning og nevnte nedsunkne vev for å oppnå effektiv penetrering av kryobeskyttende oppløsning inn i nevnte vev; (b) senking av temperaturen tilstrekkelig for å oppnå isdannelse og i en tid tilstrekkelig for å tillate fysisk og biologisk ekvilibrasjon av nevnte kryobeskyttende oppløsning i nevnte vev; (c) krystallisering av ekstracellulær is i nevnte kryobeskyttende oppløsning ved en temperatur på -6°C eller lavere; og, (d) avkjøling av nevnte kryobeskyttende oppløsning og nevnte vev ved en rate på -0,3°C pr. minutt eller mindre, for å oppnå et kryokonservert vev.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at nevnte kryokonserverte vev blir lagret ved en temperatur på minst omtrent -70°C.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at nevnte nedsenkning i trinn (a) blir gjennomført ved en start-temperatur på omtrent 20°C.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at nevnte temperatur i trinn (b) blir senket til omtrent -6°C.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at nevnte senking av temperaturen i trinn (b) blir gjennomført ved en rate på omtrent -10°C pr. minutt.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 25. karakterisert ved at nevnte dyrkede vevsekvivalent er selektert fra gruppen bestående av dyrket epidermal ekvivalent, dyrket dermalekvivalent og dyrket cornea-ekvivalent.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at nevnte kryobeskyttende oppløsning er 1,5M til 2,5M glyserol i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM).

32. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at den ytterligere omfatter tining av nevnte kryokonserverte vev, hvori nevnte vev blir tint i omtrent 1 til omtrent 3 minutter.

33. Apparat for kryokonservering av høstet mammalsk vev eller dyrket vevsekvivalent i-følge krav 1 eller 25, karakterisert ved at apparatet omfatter: Et brett (40) som omfatter en bunnflate (41) sammenhengende med en sidevegg (42) og en flense (43) hvori sideveggen (42) har innover-ragende understøttelser (44) som rager ut fra og i ett med sideveggen (42); en holder (30) som inkluderer en flat permeabel membran (32) festet til én ende av en essensiell rørformet støtte (33) og en kant (31) på den motsatte ende av den rørformede støtten (33), hvori nevnte kant (31) er støttet av nevnte innover-ragende understøttelser av nevnte brett (44); deksel (10), som omfatter en plan bunnoverflate (13) sammenhengende med en sidevegg (12) og en flense (11), hvori nevnte flense (11) er i nær kontakt med nevnte flense av nevnte brett (43), og en tetning (20) mellom nevnte brett (40) og nevnte deksel (10).