HU223789B1 - Eljárás emlősökből kinyert szövetek és tenyésztett szövetekvivalensek hidegtartósítására és tárolására - Google Patents
Eljárás emlősökből kinyert szövetek és tenyésztett szövetekvivalensek hidegtartósítására és tárolására Download PDFInfo
- Publication number
- HU223789B1 HU223789B1 HU9800411A HUP9800411A HU223789B1 HU 223789 B1 HU223789 B1 HU 223789B1 HU 9800411 A HU9800411 A HU 9800411A HU P9800411 A HUP9800411 A HU P9800411A HU 223789 B1 HU223789 B1 HU 223789B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- tissue
- cold
- temperature
- solution
- skin
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 title description 33
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 43
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 37
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 31
- 230000002595 cold damage Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 16
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 22
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 18
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 14
- 208000009084 Cold Injury Diseases 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 claims description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 abstract description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 148
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 96
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 71
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 65
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 35
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 29
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 26
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 12
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 10
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 9
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 description 8
- 108010053481 Antifreeze Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 7
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 7
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 7
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 7
- 210000005081 epithelial layer Anatomy 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 5
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 5
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 4
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 4
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 4
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 4
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 4
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 3
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 3
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 210000004920 epithelial cell of skin Anatomy 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 3
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- -1 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000012487 rinsing solution Substances 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920005644 polyethylene terephthalate glycol copolymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 2
- 230000010388 wound contraction Effects 0.000 description 2
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N Butyraldehyde Chemical compound CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000001692 EU approved anti-caking agent Substances 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010015946 Eye irritation Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 206010040880 Skin irritation Diseases 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003443 Unconsciousness Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000002266 amputation Methods 0.000 description 1
- 239000002519 antifouling agent Substances 0.000 description 1
- 239000007798 antifreeze agent Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 231100000013 eye irritation Toxicity 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000036556 skin irritation Effects 0.000 description 1
- 231100000475 skin irritation Toxicity 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012815 thermoplastic material Substances 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 231100000721 toxic potential Toxicity 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0236—Mechanical aspects
- A01N1/0263—Non-refrigerated containers specially adapted for transporting or storing living parts whilst preserving, e.g. cool boxes, blood bags or "straws" for cryopreservation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0278—Physical preservation processes
- A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B65—CONVEYING; PACKING; STORING; HANDLING THIN OR FILAMENTARY MATERIAL
- B65D—CONTAINERS FOR STORAGE OR TRANSPORT OF ARTICLES OR MATERIALS, e.g. BAGS, BARRELS, BOTTLES, BOXES, CANS, CARTONS, CRATES, DRUMS, JARS, TANKS, HOPPERS, FORWARDING CONTAINERS; ACCESSORIES, CLOSURES, OR FITTINGS THEREFOR; PACKAGING ELEMENTS; PACKAGES
- B65D55/00—Accessories for container closures not otherwise provided for
- B65D55/02—Locking devices; Means for discouraging or indicating unauthorised opening or removal of closure
- B65D55/06—Deformable or tearable wires, strings, or strips; Use of seals, e.g. destructible locking pins
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B65—CONVEYING; PACKING; STORING; HANDLING THIN OR FILAMENTARY MATERIAL
- B65D—CONTAINERS FOR STORAGE OR TRANSPORT OF ARTICLES OR MATERIALS, e.g. BAGS, BARRELS, BOTTLES, BOXES, CANS, CARTONS, CRATES, DRUMS, JARS, TANKS, HOPPERS, FORWARDING CONTAINERS; ACCESSORIES, CLOSURES, OR FITTINGS THEREFOR; PACKAGING ELEMENTS; PACKAGES
- B65D77/00—Packages formed by enclosing articles or materials in preformed containers, e.g. boxes, cartons, sacks or bags
- B65D77/04—Articles or materials enclosed in two or more containers disposed one within another
- B65D77/048—Articles or materials enclosed in two or more containers disposed one within another the inner and outer containers being rigid and the outer container being of curved cross-section, e.g. cylindrical
- B65D77/0486—Articles or materials enclosed in two or more containers disposed one within another the inner and outer containers being rigid and the outer container being of curved cross-section, e.g. cylindrical the inner container being coaxially disposed within the outer container
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B65—CONVEYING; PACKING; STORING; HANDLING THIN OR FILAMENTARY MATERIAL
- B65D—CONTAINERS FOR STORAGE OR TRANSPORT OF ARTICLES OR MATERIALS, e.g. BAGS, BARRELS, BOTTLES, BOXES, CANS, CARTONS, CRATES, DRUMS, JARS, TANKS, HOPPERS, FORWARDING CONTAINERS; ACCESSORIES, CLOSURES, OR FITTINGS THEREFOR; PACKAGING ELEMENTS; PACKAGES
- B65D85/00—Containers, packaging elements or packages, specially adapted for particular articles or materials
- B65D85/50—Containers, packaging elements or packages, specially adapted for particular articles or materials for living organisms, articles or materials sensitive to changes of environment or atmospheric conditions, e.g. land animals, birds, fish, water plants, non-aquatic plants, flower bulbs, cut flowers or foliage
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Hematology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Packages (AREA)
- Packging For Living Organisms, Food Or Medicinal Products That Are Sensitive To Environmental Conditiond (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás emlősökből kinyert szövetek vagytenyésztett szövetekvivalensek hidegtartósítására, melynek során azadott szövetet hidegkárosodás-gátló oldatba merítik. A találmányt azjellemzi, hogy a) miközben az adott szövetet a hidegkárosodás-gátlóoldatba merítik, a hidegkárosodás-gátló oldatot és a belemerítettszövetet egyaránt mozgatják, így elegendő mennyiségű hidegkárosodás-gátló oldatnak a szövetbe való behatolását és átáramlását idézik elő;b) a hidegkárosodás-gátló oldatban és az átáramoltatott szövetbenextracelluláris jégképződést váltanak ki; c) hidegtartósított szövetetállítanak elő olyan módon, hogy a b) lépésben kapott átáramoltatottszövetet –3 °C/min vagy ennél kisebb hűtési sebességgel körülbelül –70°C-ra vagy annál alacsonyabb hőmérsékletre hűtve megfagyasztják; és d)a hidegtartósított szövetet körülbelül –70 °C-on vagy annálalacsonyabb hőmérsékleten tárolják. ŕ
Description
(57) Kivonat
A találmány tárgya eljárás emlősökből kinyert szövetek vagy tenyésztett szövetekvivalensek hidegtartósítására, melynek során az adott szövetet hidegkárosodásgátló oldatba merítik.
A találmányt az jellemzi, hogy
a) miközben az adott szövetet a hidegkárosodásgátló oldatba merítik, a hidegkárosodás-gátló oldatot és a belemerített szövetet egyaránt mozgatják, így elegendő mennyiségű hidegkárosodás-gátló oldatnak a szövetbe való behatolását és átáramlását idézik elő;
b) a hidegkárosodás-gátló oldatban és az átáramoltatott szövetben extracelluláris jégképződést váltanak ki;
c) hidegtartósított szövetet állítanak elő olyan módon, hogy a b) lépésben kapott átáramoltatott szövetet -3 °C/min vagy ennél kisebb hűtési sebességgel körülbelül -70 “C-ra vagy annál alacsonyabb hőmérsékletre hűtve megfagyasztják; és
d) a hidegtartósított szövetet körülbelül -70 °C-on vagy annál alacsonyabb hőmérsékleten tárolják.
HU 223 789 Β1
A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 7 lap ábra).
HU 223 789 Β1
A találmány emlősökből kinyert szövetek és tenyésztett szövetekvivalensek hidegtartósítására és tárolására alkalmas eljárásra vonatkozik. A találmány szerinti eljáráshoz speciális tárolószerkezetre van szükség, mely olcsó, könnyen kezelhető és maximális életképességet biztosít a hidegen tartósítandó szövetnek vagy szövetekvivalensnek. A hidegtartósítási technológia alkalmazásával emlősökből kinyert szövetek és tenyésztett szövetek hidegen tartósított állapotban felhasználásuk időpontja előtt korlátlan ideig tárolhatók. A tenyésztett szövet in vitro modellje az ekvivalens humán szövetnek, amely a tárolás után visszanyerve in vivő körülmények között átültetésre vagy beültetésre, illetve in viro körülmények között vegyületek szűrővizsgálatára alkalmazható.
In vitro vizsgálatokhoz vagy sebek begyógyítását célzó in vivő szövetátültetéshez fejlesztettek már ki in vitro technológiával szövetekvivalenseket. Ilyen szövetekvivalensek előállítására alkalmas módszereket ismertetnek a 4 485 096, 4 604 346, 4 835 102 és 5 374 515 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban, valamint a 08/193 809 számú és a 08/337 830 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben. Ezeknek a szabadalmi dokumentumoknak a szövegét a találmány ismertetését kiegészítő referenciaanyagnak tekintjük.
Az élő szövetek tárolhatóságai ideje korlátozott, ezért rövid ideig használhatók fel, vagyis nagy a veszteség. Szükség van arra, hogy ezeket a szöveteket hosszabb időszakokra - így a szállítás és a tárolás időtartamára - tartósítsák. Mind a hidegtartósítási eljárás, mint a hidegtartósításhoz és a tároláshoz használatos tárolószerkezet továbbfejlesztésével korlátlanul meg lehetne hosszabbítani a tárolhatóság időtartamát, meg lehetne könnyíteni a szállítást, és lehetővé lehetne tenni szövetbankok fenntartását. Szövetbankok létesítése az égési sérülteket ellátó központokban és kórházakban is kívánatos. További előnyök származnának abból, hogy a gyártási folyamat különböző szakaszaiból származó mintákat félre lehetne tenni, és minőségellenőrzés céljára meg lehetne őrizni, továbbá a szöveteket nagyobb adagokban lehetne tenyészteni, minthogy fagyasztott állapotban fenn lehetne őket tartani.
Jelenleg a sejtekből álló biológiai anyagok tárolhatóságí idejét rendkívül alacsony hőmérsékletekre való lehűtéssel hosszabbítják meg. Egy rendszer hőmérsékletének a csökkentésekor a folyadék a vízmolekulák szabályos elrendeződésével járó kikristályosodása útján (jégképződés) vagy - ilyen szabályos elrendezésű kristályos fázis hiányában - vitrifikáció vagy amortizáció (üvegképződés) útján mehet át szilárd halmazállapotba. A hűtéstechnikával foglalkozó biológus (kriobiológus) számára szakmai kihívást jelent az a feladat, hogy a sejteket rendkívül alacsony hőmérsékletre kell hűteni, majd utána fiziológiai körülmények közé kell őket visszahelyezni anélkül, hogy megsérülnének.
A sejtek és a szövetek hidegtartósítására két alapvető megoldás van: a megfagyasztás/felolvasztás és a vitrifikálás. A megfagyasztáson és felolvasztáson alapuló megoldások esetében a sejten kívüli oldatot - például kristályos formában - megfagyasztják, de arra törekednek, hogy minimálisra csökkentsék a sejten belüli jégképződést. A vitrifikálási eljárások alkalmazásakor az egész minta tömegében megkísérlik megakadályozni a jégképződést. Az elsőként ismertetett megoldásnál az jelent problémát, hogy ha a sejteken belül jégkristályok képződnek, azok a felolvasztáskor csökkentik a sejtek életképességét. Ezzel kapcsolatban azonban meg kell jegyezni, hogy a sejtek képesek túlélni a fagyasztási/olvasztási ciklust, ha mérgezést még nem okozó koncentrációban alkalmazott hidegkárosodás-gátló anyagok jelenlétében szabályozott ütemben hűtik le őket. Az utóbbi vitrifikációs módszer esetében oldott anyagok és/vagy polimerek igen nagy koncentrációkban való alkalmazásával arra törekednek, hogy a jégképződés visszaszorításával a lehetőségét is elkerüljék annak, hogy a sejten belüli és a sejten kívüli jég káros hatást gyakoroljon a sejtekre. Meg kell azonban jegyezni, hogy a sejtek akkor is károsodhatnak, ha hosszú ideig vannak kitéve a vitrifikáláshoz megkívánt, mérgező koncentrációban alkalmazott ilyen adalék anyagok hatásainak.
A hidegkárosodás-gátló anyagok védik az élő sejteket a fagyasztási művelettel járó igénybevételek ellen. A védelemnyújtásnak az a módja, hogy a hidegkárosodás-gátló anyagok felhígítják a még meg nem fagyott oldatot, amely - azzal párhuzamosan, hogy a víz átalakul jéggé - egyre töményebbé válik a benne oldott sóra nézve. Ajég mennyiségét a hőmérséklet és az oldat eredeti összetétele határozza meg, míg a ki nem fagyott oldatfrakció mennyisége csak a hőmérséklet függvénye. A hidegkárosodás-gátló anyagoknak van néhány más funkciója is. Az egyik fontos szerepük például az, hogy a sejten belül rendszerint csökkentik a jégképződési hőmérsékletet. Másik funkciójuk a sejtmembránok és a fehérjék stabilizálása.
Minden oldat túlhűthető a fagyáspontjához képest, amíg véletlenszerűen nem adódik egy gócképződési hely a kristályképződéshez. A megfagyasztáson és felolvasztáson alapuló hldegtartósítási eljárás alkalmazásakor a sejten kívüli közegben a jégképződést szándékosan meg kell indítani a csekély mértékben túlhűtött oldat beoltásával. Abban az esetben, ha a beoltás nem vált ki jégképződést, külső behatás nélkül keletkezik majd jég, amikor az oldat hőmérséklete elég alacsony értékét ér el az egyensúlyi fagyáspontja alatt. Tekintettel arra, hogy ez a folyamat sztochasztikus jellegű, a jégképződés előre meg nem határozható hőmérsékleten, véletlenszerűen történik, következésképpen nagyon szóródnak az ugyanazon fagyasztási előírás szerint megismételt kísérletek eredményei. Ezenkívül a nagymértékben túlhűtött oldatban rendkívül gyors kikristályosodással végbemenő jégképződés károsíthatja a sejteket és a szöveteket. Azt is kimutatták, hogy amennyiben nagymértékben túlhűtött oldatban indul meg az extracelluláris jégképződés, rendkívül nagy mértékben megnő az intracelluláris jégképződés valószínűsége is. Ez a jelenség azért lép fel, mert a fagyás által indukált sejtdehidratálódás megindulása késleltetett, és ennek eredményeként megnövekszik a sejten
HU 223 789 Β1 belül visszatartott víz mennyisége, és ezáltal megnő a sejten belüli jégképződés valószínűsége.
Ha már egyszer a sejten kívüli oldat be van oltva, és a mintát körülveszi a jégfázis, a mintát le kell hűteni a hidegtartósításhoz szükséges hőmérsékletre. A megfagyasztás és a felolvasztás megtervezésekor a hűtés az egyik legkritikusabb művelet. Mivel a képződött jég tiszta vízből áll, a vízben megfagyott sejten kívüli oldat töményebb, mint a sejten belüli kompartmentben levő oldat. Ennek az a következménye, hogy a sejt vízvesztéssel dehidratálódva próbálja meg helyreállítani a termodinamikai egyensúlyt. Amint a rendszer hűl, egyre több jég keletkezik a sejten kívül, az oldott anyagok koncentrációja növekszik, és ez arra készteti a sejtet, hogy tovább dehidratálódjék. A sejtnek három olyan jellemzője van, amely szabályozza a dehidratálódás sebességét. Az egyik a sejtmembrán vízáteresztő képessége: minél kisebb a vízáteresztő képesség, annál több idő kell a sejt dehidratálódásához. A második jellemző a sejtmembrán vízáteresztő képességének a hőmérsékletfüggése: a hőmérséklet csökkenésével romlik valamennyi sejt vízáteresztő képessége. A harmadik jellemző a sejt mérete: nagyobb sejtek hosszabb idő alatt hidratálódnak, mint a kisebb sejtek. Tekintettel arra, hogy az egyes sejttípusok jellemzői nagymértékben eltérhetnek egymástól, a különféle sejttípusok esetében az optimális hidegtartósítási feltételek nagyságrendekkel különbözhetnek egymástól.
Bár a hidegtartósítás alatt bekövetkező sejtkárosodás pontos mechanizmusát eddig még senkinek sem sikerült teljesen kiderítenie, úgy tűnik, hogy az életben maradt sejtek számának a hűtési sebesség függvényében való mérésével meghatározott jellegzetes túlélési jellemzők kvalitatív szempontból valamennyi sejttípusnál hasonlóságot mutatnak, és fordított U alakú görbével ábrázolhatok. Kevés a túlélő sejt, ha nagyon kicsi vagy nagyon nagy a hűtési sebesség. A sejtek túlélése szempontjából létezik valamilyen optimális közbenső hűtési sebesség. Annak ellenére, hogy az optimális hűtési sebesség és a görbe szélessége igen nagy mértékben változhat az egymástól eltérő sejttípusok esetében, az összefüggés kvalitatív szinten általánosnak tűnik. Nagyobb hűtési sebességek esetén a sejteknek nincs elég idejük arra, hogy dehidratálódjanak, és így jég képződik a sejteken belül. A nagy hűtési sebességek mellett bekövetkező sejtsérülések a sejten belüli jégképződésnek tulajdoníthatók. A kis hűtési sebességek mellett bekövetkező sejtsérülések feltételezések szerint azzal magyarázhatók, hogy a sejtek igen koncentrált intracelluláris, extracelluláris és hidegkárosodás-gátló oldatok hatásainak vannak kitéve, vagy mechanikai kölcsönhatások lépnek fel a sejtek és a sejten kívüli jég között.
A sejteket még a sejten belüli jégre vonatkozó magképződési görbe metszése előtt a lehető legnagyobb mértékben vízmentesíteni kell. Ez az a pont, ahol a sejtben visszamaradó gyakorlatilag összes víz gócot képez és jéggé alakul. Az ehhez a jelenséghez tartozó pontos hőmérsékletet nem lehet meghatározni, de körülbelül -40 °C és -50 °C között van az a hőmérséklet, amelyen a sejtek 1-2 mol/liter koncentrációban jelen levő hidegkárosodás-gátló anyag jelenlétében lassan megfagynak. Fontos felhívni a figyelmet arra, hogy a sejt belsejében az ezen a hőmérsékleten jéggé átalakuló vízmennyiség ártalmatlan lehet a megfagyasztás folyamán, de ha a felolvasztás nem elég gyors, a jég kiterjed és a felolvasztás közben elpusztítja a sejtet [Dávid E. Pegg és Armand M. Karow, Jr. szerkesztésében: The Biophysics of Organ Cryopreservation (A szervek hidegtartósításának biofizikája), NATO ASI Series A: Life Sciences, 147, Plenum Press, New York, 1987, 117-140. oldalak).
A gazdaságossági szempontból elfogadható bőrekvivalensek kifejlesztése előtt hullákból származó bőrt használtak fel a bőrátültetésekhez. Hidegtartósítási előírásokat dolgoztak ki, hogy az égési sérülteket ellátó központok és kórházak bőrbankokat tudjanak fenntartani. Számos különböző előírást készítettek különféle hidegkárosodás-gátló anyagok, fagyasztás! sebességek, csomagolási formák és tárolási feltételek alkalmazására. A legtöbb kutató egyetértett abban, hogy gyors felolvasztást kell előírni. Azt, hogy az előírás megfelel-e, sebre való átültetéssel vagy sejtéletképességi vizsgálattal állapították meg.
A 3 842 831 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (Beisang) módszert ismertetnek hullákból származó bőrfoltok hidegtartósítására. Az eljárás szerint a hullából származó bőrt lazán szőtt függönyszövethez vagy bélésszövethez fűzik, majd fagyasztás előtt a szövetanyaggal együtt feltekercselik. Nem alkalmaznak hidegkárosodás-gátló anyagot, de a feltalálók javasolják glicerin vagy dimetil-szulfoxid (DMSO) felhasználását. Gyors, szabályozatlan - állandó sebességű - hűtést írnak elő a rendkívül alacsony, -70 °C-os hőmérséklet eléréséig.
S. R. May és F. A. DeClement [Skin Banking Methodology, 17, 33-45 (1980)] hullából plasztikai műszerrel eltávolított bőrön értékelte ki, hogy milyen szerepe van a tárolószerkezet geometriájának, valamint a hűtési és a melegítési sebességnek. Az eredményekből arra lehetett következtetni, hogy a tetemekből származó bőrt inkább síkban, mintsem feltekercselve kell tárolni, és a lehűtést lassabban, szabályozott sebességgel kell végezni.
Az 5 040 677 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (Tubo) gáztömören lezárható tárolóedényt ismertetnek bőrhámsejtlapokból álló egyedi transzplantátumok tárolásához. A tárolóedényben olyan bőrhámsejtrétegeket lehet tárolni, amelyek csipeszekkel tapadó alaplaphoz vagy hátlaphoz vannak rögzítve.
Az 5 145 770 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (Tubo) keratinocitarétegek hidegtartósítására olyan eljárást ismertetnek, amely szerint egy, a sejtekbe be nem hatoló hidegkárosodásgátló anyagot - például dextránt - és egy, a sejtekbe behatoló vegyszert - például glicerint -, valamint mintegy -1 °C/min hűtési sebességet alkalmaznak. Ehhez hasonló eljárást ismertetnek a 364 306 számú európai szabadalmi leírásban (Chao és munkatársai), amely szerint élő, tenyésztett bőrhámsejtekből álló rétegeket
HU 223 789 Β1 hidegtartósítanak. A hűtési előírás szerint előnyös esetben szintén -1 °C/min hűtési sebességgel dolgoznak, de hidegkárosodás-gátló anyagként dimetilszulfoxidot és glicerint együttesen alkalmaznak.
Az 5 298 417 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásból (Cancedda és munkatársai) olyan hidegtartósítási előírás ismerhető meg, amelyet egyrétegű konstrukciókhoz, például a 4 016 036 számú, a 4 304 866 számú és a 4 456 687 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások szerint előállított bőrhámsejtlapokhoz fejlesztettek ki. Bőrhámsejtlapokat 8-15 tömeg% mennyiségű hidegkárosodás-gátló anyaggal - glicerinnel vagy dimetilszulfoxiddal - együtt inkubáltak és hidegtartósítottak szabályozott hűtéssel, amelyre az volt jellemző, hogy a hűtési sebesség az induláskor kisebb volt, mint a hűtési művelet végén, és a hűtési művelet befejezése előtt a hőmérsékletet növelték.
Teasdale és munkatársai [Burns, 19 (5), 406—410 (1993)] bőrkötőszövetek kollagéngélben való hidegtartósítását vizsgálták. Teasdale meghatározta, hogy dimetil-szulfoxid hidegkárosodás-gátló anyag alkalmazása mellett a sejtek akkor lesznek legéletképesebbek, ha a hűtési sebesség -0,5 °C/min.
Nanchahal és munkatársai a „Cultured composite skin grafts: Biological skin equivalents permitting massive expansion” (Tenyésztett összetett bőrtranszplantátumok: nagymértékű kitágulást lehetővé tevő biológiai bőrekvivalensek) című cikkükben [The Láncét, 2 (8565), 191-193 (1989. július 22.)] olyan eljárást ismertetnek tenyésztett összetett szövettranszplantátumok tárolására, amelynek megvalósításához hidegkárosodás-gátló anyagként 15 tömeg% glicerin és 10% FCS-t tartalmazó Médium 199-et használnak fel. A transzplantátumokat és a hidegkárosodás-gátló anyagot 37 °C-on 2 óra hosszat inkubálják, majd -1 °C/min hűtési sebességgel -70 °C-ra hűtve megfagyasztják és ezt követően cseppfolyós nitrogénben tárolják. Gyors felolvasztás után úgy határozták meg a transzplantátumok életképességét, hogy 2 hétig tenyésztették, majd meztelenegerekbe ültették át őket. A végső kiértékelésre azután került sor, hogy a transzplantátumokat három, tetováláskimetszésen átesett beteg testére ültették át.
Johnstone és munkatársai a „Cryopreservation of Rabbit and Cat Corneas at -18 to -24 °C” (Nyulak és macskák szaruhártyáinak hidegtartósítása -18 °C és -24 °C közötti hőmérsékleten) [Cornea, 11(3), 211-220 (1992)] nyulak és macskák szaruhártyáinak a hidegtartósítására egyszerű eljárást ismertetnek, amelyet nem cseppfolyós nitrogén vagy nagyon alacsony hőmérsékleteken működő fagyasztógépek alkalmazásával, hanem háztartási hűtőgép segítségével valósítanak meg. A hidegkárosodás-gátló oldatot úgy áramoltatjuk át, hogy a szaruhártyákat egymást követően olyan, 50 tömeg% magzatszérumot, valamint McCarey-Kaufman-közeget tartalmazó oldatokba helyezik, amelyek egyre növekvő koncentrációban tartalmaznak glicerint és glükózt.
A technika állásához tartozó eljárásokkal nem lehet hidegtartósítani tenyésztett szövetekvívalenseket:
részben azért nem, mert ezek a szövetekvivalensek viszonylag vastagok, másrészt azért nem, mert az említett szövetekvivalensek heterogén sejtrétegekből állnak. Ezeknek a szöveteknek in vivő körülmények között éppen az az egyik szerepük, hogy korlátozzák az áteresztőképességet. A szövetfunkciókat tekintetbe kell venni a hidegtartósításra vonatkozó előírások kidolgozásakor.
A találmány megalkotásakor kidolgoztunk egy hidegtartósítási módszert, amely meglepően eredményesen és tömegméretekben alkalmazható tenyésztett szövetekvivalensek hidegtárolásához.
A találmány szerinti, tenyésztett szövetekvivalensek nagyon alacsony hőmérsékleteken való hidegtartósítására eredményesen használható eljárás programozható fagyasztógép alkalmazásával lehetővé teszi a káros intracelluláris jégkristályok képződésének a megakadályozását, a potenciálisan káros vegyi anyagok tényleges koncentrációjának a lehető legkisebb értékre való csökkentését, és a hidegkárosodás-gátló anyagok gazdaságosan elérhető hőmérsékleteken való gyors bevezetését, valamint eltávolítását.
Az eljáráshoz új tárolószerkezetet használunk, melynek sok előnye van a már létező, hasonló szerkezetekkel szemben. Jelenleg nincsenek kereskedelmi forgalomban hidegen tartósított, tenyésztett szövetekvivalensek, ezért nem lehet a polcról leemelni megfelelő tartószerkezeteket. Az új tárolószerkezetnek olyan a konstrukciója, hogy a fagyasztótérben uralkodó külső hőmérséklettel jobban lehet szabályozni a tárolószerkezet belsejében uralkodó hőmérsékletet, mert hatásosabb a hőátadás. A hőátadási sebesség növekedésének köszönhetően jobban lehet szabályozni a folyamatot, így egyenletes sebességgel lehet hűteni és melegíteni a tenyésztett szövetekvivalenst, és ezáltal csökkenteni lehet a sejtek életképességében mutatkozó ingadozásokat.
Olyan eljárást dolgoztunk ki in vitro körülmények között előállított tenyésztett szövetekvivalensek hidegtartósítására, amellyel meg lehet őrizni az emberi szövetekkel ekvivalens szövetek életképességét és felhasználhatóságát. A találmány szerinti eljárást keveréssel valósítjuk meg, hogy fokozzuk a szövetekbe hatolt hidegkárosodás-gátló anyag tényleges mennyiségét. A találmány szerinti eljárás a sejtek szerkezeti épségének és életképességének a biztosításával ad lehetőséget mind a kinyert szövetek, mind a tenyésztett szövetekvivalensek hidegtartósítására.
A találmány szerinti eljárást a következőkben ismertetett módon valósítjuk meg:
1. A kinyert szövetet vagy a tenyésztett szövetekvivalenst hidegkárosodás-gátló oldatba mártjuk, majd a hidegkárosodás-gátló oldatot és a belemártott szövetet keverjük, hogy hatásos mennyiségű hidegkárosodásgátló oldat hatolhasson be a szövetbe (szövetperfúzió).
2. A hidegkárosodás-gátló oldatnak a szövetbe való beáramoltatása után az elegyet lehűtjük, hogy hőmérséklete abban a tartományban legyen, amelyben a hidegkárosodás-gátló oldat szilárd fázisa és cseppfolyós fázisa egyensúlyban van egymással, ez4
HU 223 789 Β1 után a sejteken kívül jégkristályokat képezünk, majd hűtéssel olyan módon érjük el a hidegtartósítási állapotot, hogy a szövetet lassú ütemben legalább mintegy -70 °C-ra vagy még alacsonyabb hőmérsékletre, előnyösen -120 °C-ra vagy még alacsonyabb hőmérsékletre, még előnyösebben -140 °C-ra vagy még alacsonyabb hőmérsékletre, legelőnyösebben -196 °Cra hűtve megfagyasztjuk.
A már egyszer megfagyasztott, hidegen tartósított szövetek mintegy -120 °C és mintegy -196 °C vagyis a cseppfolyós nitrogén hőmérséklete - közötti hőmérséklet-tartományban korlátlan ideig tárolhatók.
A hidegen tartósított szövetet úgy olvasztjuk fel, hogy a fagyott szövetet gyorsan - mintegy 1-2 perc alatt - felmelegítjük. A fagyott szövetet felmelegített tápközeg vagy pufferolt fiziológiai oldat közvetlen alkalmazásával, vagy valamilyen más gyors melegítési módszerrel lehet felolvasztani. A tárolószerkezetet úgy terveztük meg, hogy a szövetet a tárolószerkezet vízfürdőjébe való merítéssel fel lehessen olvasztani. A tárolószerkezet a sterilitásnak a kritikus felolvasztási művelet alatti fenntartása mellett biztosítja mind a gyors felmelegedést, mind az egyenletes hőmérsékletszabályozást.
A felolvasztott tenyésztett szövetekvivalenst - mielőtt humán szövetekvivalensként szövetátültetésre vagy in vitro kísérletekhez felhasználnánk - a hidegkárosodás-gátló oldat eltávolítása céljából öblítjük. A hidegkárosodás-gátló oldatot például fiziológiai pH-jú izotóniás pufferoldattal végzett öblítéssel távolíthatjuk el. A tenyésztett szövetekvivalenseket felhasználásuk előtt ilyen pufferoldatokban átmenetileg tárolhatjuk, vagy sejtek táplálására megfelelő közegekben ismét tenyészthetjük őket.
Az ábrák rövid ismertetése
Az 1A. és az 1B. ábrán a fedél nézetrajzai láthatók.
A 2. ábrán a tömítés látható felülnézetben.
A 3A. és a 3B. ábra a fedélre felszerelt tömítést mutatja be két nézetben.
A 4A. és a 4B. ábra a keretet szemléltetik.
Az 5A. és az 5B. ábrán a tányér nézetrajzai láthatók.
A 6A. és a 6B. ábrán a tárolószerkezet szétszerelt és összeszerelt állapotban látható oldalnézetben.
A 7. ábra a tárolószerkezet egy részének kinagyított metszetrajza.
A 8. ábra felülnézetben szemlélteti az összeszerelt tárolószerkezetet.
A 9. ábrán látható diagram alapján összehasonlíthatjuk a hidegen tartósított tenyésztett szövetek életképességét a hidegtartósításon át nem esett, tenyésztett szövetek életképességével.
A hidegen tartósított, tenyésztett szövetek életképességét a metabolikus mitokondriumaktivitás meghatározása (MTT) alapján mértük és ábrázoltuk. Ezenkívül a laktóz-dehidrogenáz-enzim meghatározásával (LDH) mértük az élőbőr-ekvivalenst (LSE) is. Minden egyes tenyésztett szövetet összehasonlítottunk a hasonló korú, de hidegtartósításon át nem esett kontroliszövettel, és az eredményeket a kontrollértékek százalékában kifejezve adtuk meg.
A szövettechnológia fejlődő szakterület, amelynek művelői tenyésztett szöveti sejteket használnak fel olyan szövetekvivalensek létrehozására, amelyeknek a felhasználásával vizsgálni lehet, hogy a szervezet hogyan reagál a vegyi anyagok vagy a gyógyszerek által előidézett sérülésekre.
A tenyésztett szövetek felhasználhatók átültethető emberi szövetek elkészítéséhez is.
Részletesen ismertettek már szövetekvivalenseket számos szabadalmi leírásban, például a 4 485 096, a 4 485 097, a 4 539 716, a 4 546 500, a 4 604 346, a 4 837 379 és az 5 374 515 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban, amelyeknek a szövegét a találmány ismertetését kiegészítő referenciaanyagnak tekintjük. Az egyik sikeresen alkalmazható szövetekvivalens az úgynevezett élőbőr-ekvivalens (LSE), amely morfológiai szempontból hasonlít a valódi emberi bőrhöz. Az élőbőr-ekvivalens két rétegből áll: a felső réteg elkülönített és rétegzett humán felhámkeratinocitákból, az alsó réteg pedig kollagén mátrixban levő humán bőrkötőszöveti sejtekből áll [Parenteau és munkatársai: Epidermis Generated In vitro Practical Considerations and Applications (In vitro körülmények között létrehozott felhám: gyakorlati szempontok és alkalmazások), J. of Cellular Biochemistry, 45, 245-251 (1991); Parenteau és munkatársai: The organotypic culture of humán skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function (Emberi bőrből származó keratinociták és fibroblasztok organotípusos tenyészete a forma és a funkció biztosításához), Cytotechnology, 9, 163-171 (1992) és Bell és munkatársai: The Living Skin Equivalent: Its Manufacture, Its Organotypic Properties and Its Responses to Irritants (Az élőbőr-ekvivalens előállítása, organotípusos tulajdonságai és irritálóanyagokra való reagálása), Toxic. in vitro, 5, 5921-596 (1991)]. Jelenleg klinikai kísérleteket végeznek annak eldöntésére, hogy lehet-e javallani az LSE-t átültetésre a bőrréteg egészére vagy egy részére kiterjedő sebek (amputációs sebészet, égések, pangó véna miatt keletkezett fekélyek, cukorvelős fekélyek, felfekvéses fekélyek és idült gyulladások által előidézett fekélyek) esetében. Az LSE teljes vastagságú, kétrétegű, in vitro körülmények között előállított bőrszövet.
Az 5 374 515 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint kifejlesztettek már egy olyan eljárást is, amellyel in vitro körülmények között elő lehet állítani a szem szaruhártyájának a szervekvivalensét. Ennek a szabadalmi leírásnak a szövegét a találmány ismertetését kiegészítő referenciaanyagnak tekintjük. A szaruhártya-szövetekvivalensnek három különböző sejtrétege van: a külső réteg, amely többrétegű pikkelyes laphám, a középső réteg, amely kollagén rostokból és vázsejtekből áll, valamint a belső réteg, amely szaruhártya-belhámnak is nevezett egyszerű pikkelyes laphám. Az in vitro körülmények között előállított szaruhártya-ekvivalenseket fel lehet használni in vitro toxicitási vizsgálatokhoz. Ezek a szaruhártya5
HU 223 789 Β1 ekvivalensek pontos és olcsó, kísérleti állatokat nem igénylő előrejelzési modellként szolgálnak a különböző típusú termékek és nyersanyagok szem- és bőrirritáló képességének in vivő meghatározásához.
A hidegtartósítással az a célunk, hogy meghatározatlan ideig megőrizzük a biológiai anyagok szerkezeti épségét és életképességét, hogy ezek az anyagok elérhetők és alkalmazhatók legyenek, amikor szükség van rájuk. Véges élettartamú összetett szövetek esetében szükség van a hidegtartósításra, hogy ezek a termékek hosszabb ideig hozzáférhetők és hasznosíthatók legyenek. A biológiai anyagok hidegtartósításának eddigi tapasztalatai azonban azt mutatják, hogy egy adott sejtre optimalizált hidegtartósítási előírást nem lehet szükségképpen jó eredményekkel alkalmazni egy másik sejttípusra, vagy a szövetben lévő többi sejtre. A teljes vastagságú szövetekvivalensek sejtsűrűségében, víztartalmában és strukturális szervezettségi szintjében mutatkozó eltérések miatt szükség volt szakszerűbb módszerek kidolgozására. A találmány szerinti hidegtartósítási módszerek meglepő módon egyaránt alkalmazhatók csak egyrétegű felhám- és bőrrétegek, kétrétegű szövetekvivalensek, háromrétegű szaruhártya-ekvivalensek és emlősökből kinyert szövetek esetében. A tárolószerkezet kifejlesztésével ezeknek a szöveteknek a hidegtartósítása tömeggyártás keretében is megvalósítható.
A leírásban használt „tenyésztett szövetekvivalensek” kifejezés emlősök szöveteinek szövetekvivalenseire utal. A szövetekvivalensek in vitro technikákkal készülnek. Ezek közé a szövetekvivalensek közé tartoznak az egyrétegű bőrekvivalensek - mind a bőrekvivalens, mind a felhámréteg -, a kétrétegű bőrekvivalensek - mindenekelőtt az LSE -, valamint a háromrétegű szaruhártya-ekvivalensek és bőrekvivalensek. A tenyésztett szövetekvivalensek morfológiailag hasonlók az in vivő körülmények között levő emlősszervhez, tipikus esetben a humán szervhez. Példaként megemlítjük, hogy az LSE formáját tekintve nagyon hasonlít az emberi bőrre. Anyagcsere és közvetett sejtosztódás szempontjából aktív emberi kötőszöveti sejtek (HDF) a bőrrétegben találhatók mindenütt. Igazolták, hogy ezek a sejtek kollagént és más mátrixkomponenseket választanak ki. A felhám egy alapréteget tartalmaz, amelyből kimutatták, hogy - az emberi bőrhöz hasonlóan - mitózisos ütemben osztódik. Az alapréteg feletti felhámban ugyanolyan rétegek vannak, mint az in vivő körülmények között lévő bőrben: jól definiált, keratohialint és lemezes granulumokat tartalmazó, szaruréteggel fedett, tövises és szemcsés rétegek. Az immunszövettani kémia módszereivel kimutatható olyan sejten kívüli mátrixkomponensek - így például a laminin, a IV. típusú kollagén és a kalanin (GB3) - jelenléte, amelyek a bőr és a felhám érintkezési felületén általában megtalálhatók.
Az organotípusos tenyésztési módszerekkel előállított tenyésztett szövetekvivalensek - például az élőbőrekvivalens (LSE) - esetében vázszerkezetként keretet alkalmaznak, amelyen megformálják az ekvivalenseket. A tenyésztett szövetekvivalenseket olyan kereten alakítják ki, amely közvetlen érintkezés nélkül teszi lehetővé a konstrukció kezelését a gyártás, a szállítás és a végfelhasználás során. Keretes szövetekvivalensek gyártására alkalmas eljárásokat ismertetnek a következő szakirodalmi helyek: 5 374 515 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, 08/193 809 számú és 08/337 830 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés.
A kerethez hozzátartozik egy síkáteresztő membrán, amely egy lényegében cső alakú tartórész egyik végéhez csatlakozik. A cső alakú tartórész másik végén egy kifelé nyúló perem van, amely viszont egy karimát hordoz, amelyet függő helyzetben lehet tartani egy szövettenyésztő edényben, a találmány szerinti tárolószerkezetben levő mélyedés felső vége fölött. A membrán/tartórész szerelvény úgy van méretezve, hogy olyan módon lehessen legalább egy speciális méretű mélyedéssel rendelkező tenyésztőcsészével együtt alkalmazni, hogy a tartórész körül megfelelő térközt biztosítson, és illeszkedjék a mélyedés felső végéhez. A membrán/tartórész szerelvényt el lehet készíteni különböző méretekben, hogy eltérő méretű tenyésztőedényekhez és tárolószerkezetekhez is rendelkezésre álljon. Ilyen keretekre példaként megemlítjük az 5 466 602 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett TRANSWELL® (Costar) termékeket. A szakmában jártas szakember mechanikus módosításokat hajthat végre a tárolószerkezeten, hogy alkalmazni lehessen hozzá a tenyésztőedényben a hasonló, de különböző tartórészű és kapcsolódású kereteket. Hasonló kereteket ismertetnek az 5 358 871 számú, az 5 366 893 és a 4 871 674 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban.
A találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazható tárolószerkezet magában foglalja a keretes vázszerkezetet, és meghatározza a szövetekvivalens körüli környezetet, amelyet előre meghatározott előírások szerint szabályozni lehet. A találmány keretében gyógyszerkönyvi tisztaságú és széles hőmérséklet-tartományban ellenállóképes anyagokat célszerű felhasználni. Ezekből az anyagokból olyan tányért és fedelet sajtolunk, amelyeket tömítőeszközökkel jól záróan egymáshoz lehet illeszteni. Az új tárolószerkezet úgy van megtervezve, hogy magában foglalja a keret tartórészét, amelyen a szövetekvivalenseket alakítjuk ki.
Az új tárolószerkezet egy tányérból, egy fedélből és a köztük levő, légmentes záródást biztosító tömítésből áll. A tányér és a fedél úgy van megtervezve, hogy illeszkedjék a meglevő, a hozzáerősített szövetekvivalenst tartalmazó kerethez. A keretet a hozzáerősített szövetekvivalenssel együtt a tányérba helyezzük, majd hozzáadjuk a hidegkárosodás-gátló oldatot. A fedelet ezután ráhelyezzük a tányérra. A két résznek úgy kell egymáshoz illeszkednie, hogy légmentesen záró tömítés jöjjön létre a tárolószerkezet belső és külső környezete között.
A tárolószerkezet lehetővé teszi, hogy a hidegkárosodás-gátló oldat egyformán oszoljék el a keret alatt és a szövetekvivalens felülete fölött, és ugyanakkor a hidegkárosodás-gátló oldat állandóan érintkez6
HU 223 789 Β1 zék a szövetekvivalenssel, valamint mind a tányérral, mind a fedéllel. A tárolószerkezet megtervezése azon az elképzelésen alapszik, hogy abban az esetben lehet biztosítani a hűtési és a fagyasztás! sebesség szabályozhatóságát, ha a hidegen tartósítandó tenyésztett szövet fölött és alatt hasonló geometriai elrendezésben azonos térfogatú hidegkárosodás-gátló anyag van jelen. Ha a tárolószerkezet vastagsága egyenletes, ilyen elrendezés esetén a tenyésztett szövetekvivalens felső és alsó felszíne azonos távolságra van a tárolószerkezet külső falától. A távolságok azonossága miatt a hőcserének egyenletesnek kell lennie: hűtés esetén a szövetekvivalenstől a hűtőtér felé, felolvasztáskor pedig a külső környezettől a szövetekvivalens irányában.
A tányér aljának a felszíne összefügg az oldalfallal és a peremmel. A perem sík felületet biztosít a tányér és a fedél tömítéséhez. A tányér oldalfalán - az oldalfallal egy testet képezve - egy folytonos vagy több, hézagokkal elválasztott tartórész nyúlik be a tányér belsejébe. A tányérba való behelyezéskor a tenyésztett szövetekvivalenst tartalmazó keret felső szélét ráakasztjuk a tányér oldalfalán levő tartórészekre. A felfüggesztett keret és a tányér aljának a felszíne által meghatározott térköz vastagsága a szövetekvivalens méretének megfelelő felszín mentén mintegy 1,0 mm.
A fedél sík alsó felszíne összefügg az oldalfallal és a peremmel. A fedélperem átmérője valamivel kisebb, mint a tányérperem átmérője. A keretet tartalmazó tányérra helyezett fedélnek a pereme úgy támaszkodik rá a keretre, hogy a tányér peremének a felső felülete és a fedél peremének a felső felülete ugyanabban a síkban vagy körülbelül ugyanabban a síkban érintkezik. A fedél és a tenyésztett szövetekvivalens felszíne meghatároz egy másik térközt is, amely szintén körülbelül 1,0 mm méretű, és kiterjedése körülbelül ugyanakkora, mint a szövetekvivalens mérete.
A konstrukciónak megfelelően összesen körülbelül 1 mm távolság van a tányér és a rajta elhelyezett szövetekvivalenst tartalmazó keret között, és ugyancsak körülbelül 1 mm a távolság a fedél és a szövetekvivalens között, amely fölött és alatt a mind a fedéllel, mind a tányérral érintkező hidegkárosodás-gátló anyag van. Amikor a fedelet belehelyezzük a közeget tartalmazó tányérba, a fedél kiszorít minden, a szerkezetben levő levegőt a keret cső alakú tartórészét tartalmazó külső tér felé.
A tányért a fedéllel lezárjuk a tányér peremének a felső felülete és a fedél peremének a felső felülete által képzett, kifelé irányuló sík mentén. A lezárást megvalósíthatjuk hőkezeléssel, ragasztóanyaggal vagy más, a szakterületen ismert módon. A fedél és a tányér közötti tömítés meggátolja a hidegkárosodás-gátló anyag szivárgását, és fenntartja a sterilitást a tárolószerkezet belsejében. Előnyös esetben a fedél hegeszthető anyagából készült, gyűrű alakú lap van ráhegesztve mind a tányér peremére, mind a fedél peremére. A fedél anyagából előnyös esetben ki van képezve egy, a lezáráskor szabadon maradó fülecs, amellyel a fedél lehámozható a tányérról, és ilyen módon a szövetekvivalens hozzáférhető. Egy másik megvalósítási forma szerint a tányér peremével körülbelül azonos átmérőjű peremmel rendelkező fedelet helyezünk egy tányérra, amelynek a belsejében egy keret úgy van elhelyezve, hogy a fedélperem alsó felülete szorosan érintkezik a tányér peremének a felső felületével. A peremeket ezután - abban az esetben, ha hegeszthető anyagból készültek - egymáshoz hegesztjük.
Az 1A. és az 1B. ábrán a 10 fedél, a 11 fedélperem, a 12 fedél-oldalfal és a 13 alsó felület látható. A 11 fedélperem, a 12 fedél-oldalfal és a 13 alsó felület egymással összefüggő felületet alkot.
A 2. ábra a 20 gyűrűs tömítést és a 21 fülecset szemlélteti.
A 3A. és a 3B. ábrán a 20 tömítést, a 10 fedelet és a 11 fedélperemet szemléltetjük. A 20 tömítés használat előtt fel van szerelve a 10 fedél 11 peremére, hogy a lezárási művelet végrehajtásakor könnyebb legyen a tömítést a megfelelő helyen tartani.
A 4A. és a 4B. ábrán a 30 keret, a 31 kerek karima, a 32 áteresztőmembrán és a 33 cső alakú tartórész látható. A 32 áteresztőmembránon van a 33 csőszerű tartórésszel rögzített tenyésztett szövetekvivalens. A 30 keret lehetővé teszi az egész hidegtartósítási folyamat alatt a szövetekvivalens áthelyezését anélkül, hogy hozzá kellene érni vagy le kellene venni.
Az 5A. és az 5B. ábrákon a 40 tányért, a tányér aljának a 41 felületét, a tányér 42 oldalfalát, a 43 tányérperemet és a keret 44 tartórészeit szemléltetjük. A tányér aljának a 41 felülete, a tányér 42 oldalfala, a 43 tányérperem és a keret 44 tartórészei összefüggő felületet képeznek. A keret 44 tartórészei érintkeznek a tányérban levő, általuk alátámasztott kerettel.
A 6A. és a 6B. ábrákon a 20 tömítést, a 10 fedelet, a 30 keretet és a 40 tányért szemléltetjük. A 30 keret a rajta levő szövetekvivalenssel együtt a 40 tányérban van elhelyezve, és a tányéron belül felfüggesztett állapotban van. A 10 fedél a 20 tömítéssel együtt a 30 keret fölött van elhelyezve, és a keret fölött fel van függesztve.
A 7. ábrán a 20 tömítés, a 11 fedélperem, a 10 fedél, a 30 keret, a keret 30 karimája, a keret 44 tartórészei és a 40 tányér láthatók. A 30 keret a rajta levő szövetekvivalenssel együtt a 40 tányérban van elhelyezve, és olyan módon van a tányéron belül felfüggesztve, hogy érintkezik a keret 31 karimájának az alsó felületével, és a keret 44 tartórészeinek a felső felületeivel. A 10 fedél a 20 tömítéssel együtt a 30 keret fölé van helyezve, és fel van függesztve a keret fölött olyan módon, hogy érintkezik a 11 fedélperem alsó felületével és a keret 31 karimájának a felső felületével. A 11 fedélperem és a 43 tányérperem felső felületei sík felszínt képeznek a 20 tömítés számára.
A 8. ábrán a szerkezet felülnézetben látható.
A tányérokat és a fedeleket merev vagy bizonyos mértékben rugalmas, hőre lágyuló anyagokból lehet előállítani, amelyek - mint a poli(tetrafluor-etilén) vagy a poli(etilén-tereftalát-glikol) (PTEG) - vákuumban formázhatok vagy fröccsönthetők. A tárolószerkezetek tányérjait és fedeleit a felhasználás előtt a szakterületen ismert módszerek alkalmazásával célszerű sterilizálni.
HU 223 789 Β1
A tányér és a fedél gyártásához felhasznált anyagok meghatározzák, hogy milyen sterilizálási módszert lehet alkalmazni. PTFE-t és PTEG-t gamma-sugarakkal célszerű sterilizálni, amíg az enyhe sugárzási dózis el nem éri a (2,5-3,0)χ104 Gy értéket. Alternatív megoldásként lehet alkalmazni a szakemberek által ismert elektromos és kémiai sterilizálási módszereket is.
A tenyésztett szövetekvivalensek valamilyen szerrel - célszerűen kötőszöveti sejtekkel - zsugorított, hidratált kollagénrács bőrekvivalensét foglalják magukban. Az egyik megoldás szerint többrétegű felhámsejtből álló réteget alakítunk ki tenyésztéssel a bőrekvivalens felületén. Egy másik megoldás szerint a hidratált, keratocitákkal zsugorított kollagénrácsot a szarurétegnek a rácsfelületen tenyésztett hámsejtjeiből álló, többrétegű rétegével együtt helyezzük rá a szaruréteg belhámsejtjeiből álló rétegre.
Úgy is eljárhatunk, hogy csak felhámsejteket tenyésztünk és késztetünk arra, hogy rétegződéssel felhámréteget alakítsanak ki. A tenyésztett szövetet a keret porózus membránján, vagy a keret alsó felületének porózus membránjához tapadó kollagéngélen alakítjuk ki. Ezen túlmenően azt is megemlítjük, hogy a találmány szerinti eljárással más tenyésztett szövetekvivalenseket is lehet hidegtartósítani, például bármilyen tenyésztett felhámréteget, bármilyen tenyésztett bőrekvivalenst, bármilyen tenyésztett szaruhártya-ekvivalenst, vagy emlősökből származó bőrt, azzal a megjegyzéssel, hogy ez a felsorolás nem korlátozó jellegű.
A következőkben a találmányt szövetekvivalensek és az előnyös tárolószerkezet alkalmazásával szemléltetjük. A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy az ismertetett eljárást még a találmány keretein belül maradva számos vonatkozásban módosítani lehet.
A szövetekvivalens hidegkárosodás-gátló oldattal való átáramoltatását úgy végezzük, hogy a szövetekvivalenst a hozzáerősített kerettel együtt olyan mennyiségű hidegkárosodás-gátló oldatba merítjük, amely elegendő ahhoz, hogy a minta alá merüljön, ugyanakkor biztosítjuk, hogy a szövetekvivalens alatt ugyanolyan térfogatú hidegkárosodás-gátló oldat legyen, mint a szövetekvivalens fölött. Egy 100 mm-es Petricsészébe, amely a szövetekvivalenst és a keretet tartalmazza, beadagolunk 25 ml 2 M DMEM-es glicerinoldatot annyi idő alatt - előnyösen 1-2 óra, legelőnyösebben mintegy 1 óra alatt -, amennyi elegendő ahhoz, hogy az oldat teljesen átáramolják a mintán. Ha a minta hosszabb időt tölt a hidegkárosodás-gátló oldatban, akkor csökken a szövetben levő sejtek életképessége, míg abban az esetben, ha túl rövid a tartózkodási idő, a hidegkárosodás-gátló oldat nem tud teljes mértékben behatolni a szövetbe. Egyrétegű konstrukciók esetében jellemzően kevesebb idő szükséges az átáramoltatáshoz, minthogy kevesebb a sejtréteg és mérsékeltebb a gátfunkció. Ezalatt az egy óra alatt úgy fokozzuk a hidegkárosodás-gátló oldat áthatolóképességét, hogy mozgásban tartjuk a mintát és a hidegkárosodás-gátló oldatot. A Petri-csészét rendszerint 10% szén-dioxidot tartalmazó gázzal töltött térben 70 min-1 forduiatszámmal működtetett, körpályán mozgó rázógépre (Bellco orbital shaker) téve rázatjuk. Tekintettel arra, hogy a környező gáz ugyanannyi (10%) szén-dioxidot tartalmaz, mint az a tenyészetet körülvevő gáz, amelyben a szövetekvivalens elkészült, a közegből nem távozik el gáz, a hidegkárosodás-gátló anyag alapkomponensének a pH-ja állandó marad.
A rázatásnak köszönhetően a hidegkárosodásgátló oldatnak a szövetekvivalensbe való beáramlása gyorsabb és tökéletesebb, a megfagyasztott szövetekvivalensekre vonatkozó eredmények pedig jobban reprodukálhatók. Az orbitális rázógépet helyettesíteni lehet olyan készülékkel, amely más térsíkokban végez rázást eredményező mozgást. Ezenkívül más módszerek is vannak az átáramlás mechanikai úton való fokozására. A teljesség igénye nélkül megemlítjük az egy állványon elhelyezett edényben levő konstrukciónak a hidegkárosodás-gátló oldattal való együttes himbálását, a konstrukciónak a hidegkárosodás-gátló oldattal való együttes centrifugálását és a hidegkárosodásgátló oldatnak a konstrukció körüli átáramoltatását szivattyú segítségével.
Az állványt a hozzáerősített szövetekvivalenssel együtt belehelyezzük a tányérba, és összesen beadagolunk körülbelül 16,0 ml hidegkárosodás-gátló oldatot. A tárolószerkezet kialakítása lehetővé teszi a hidegkárosodás-gátló oldat egyenlő elosztását: körülbelül 8,0 ml oldat van a keret alatt, és körülbelül 8,0 ml oldat van a szövetekvivalens felületén. A fedelet ezután a tányérra helyezzük, majd a két részt hőközléssel lezárjuk, célszerűen a tányért hegesztjük a fedél anyagához.
Az így becsomagolt szövetekvivalenseket ezután programozható fagyasztóberendezésbe (Cryomed vagy Planer) tesszük, amelynek a kiindulási hőmérséklete megegyezik a környezet hőmérsékletével; az utóbbi célszerűen 20 °C. A tárolószerkezetben levő szövetekvivalenst tartalmazó fagyasztóteret -10,0 °C/min sebességgel a hidegkárosodás-gátló oldat szilárd/cseppfolyós fázisegyensúlyához tartozó hőmérséklet-tartomány eléréséig hűtjük. Ez a hőmérséklet-tartomány 2,0 M DMEM-es glicerinoldat esetében rendszerint körülbelül -5,3 °C és -6,0 °C között van. A szilárd/cseppfolyós fázisok egyensúlyi hőmérséklete az a hőmérséklet, amelyet el kell érni ahhoz, hogy a hidegkárosodás-gátló oldatban beoltó jégkristálymagok keletkezzenek. A hűtőtér hőmérsékletét egy ideig ezen az értéken tartjuk, hogy a tárolószerkezetben levő szövetekvivalens belső hőmérséklete egyensúlyba kerüljön a hűtőtér hőmérsékletével. A kristálymag-képződési hőmérséklet eléréséhez alkalmazott hűtési sebesség nem kritikus tényező. A termikus egyensúly biztosításához körülbelül 40 percig elegendő a hőmérsékletet a megadott értéken tartani, de meg kell említeni, hogy az időtartam a hűtőtér méretétől, a hűtőtéren belüli levegőcirkulációtól és a fagyasztásra betett tárolószerkezetek számától függően változik. Az egyensúly biztosításához tipikus esetben legalább 30 perc és legfeljebb 1 óra szükséges. A hőmérséklet állandó értéken való tartása után beoltással megindítjuk a sejten kívüli jégképződést.
HU 223 789 Β1
A jégkristálymagokkal való beoltást olyan módszerként definiáljuk, amely alkalmas arra, hogy megindítsa a jégképződést a sejteken kívüli hidegkárosodás-gátló anyagban. A jégkristálymagokkal való beoltás egyik előnyösen alkalmazható módszere szerint hűtött próbapálcával - például cseppfolyós nitrogénnel -196 °Cra hűtött acélrúddal - érintkeztetjük a szövetet tartalmazó tányér oldalfalát. A rúd és a tányér érintkezési helyének a tárolószerkezetben lévő hidegkárosodásgátló fagyasztóközeg szintje alatt kell lennie. Egy másik, előnyösen alkalmazható módszer szerint közvetlenül a tárolószerkezet külső falára expandáltatunk gázokat, például freont vagy szén-dioxidot. Jégképződést lehet kiváltani egy hűtőtéri tüskével, ha a hűtőtér hőmérséklete olyan hőmérséklet-tartományon belül csökken és emelkedik, amely megfelelő jégkristályok kialakulásához. Más, a szakterületen ismert módszereket is lehet alkalmazni jégkristálymagokkal való beoltásra.
Miután a szövetekvivalenseket beoltottuk jégkristályokkal, a tárolószerkezeteket további 1 órán át a megadott hőmérséklet-tartományban tartjuk, hogy a termodinamikai egyensúly kialakulhasson, és a jégkristálymagok elterjedhessenek a hidegkárosodás-gátló oldat teljes térfogatában. Ezután körülbelül (-0,02)-(-0.3) °C/min, még előnyösebben körülbelül (-0,05)-(-0,1) °C/min és legelőnyösebben mintegy (-0,07) °C/min sebességgel folytatjuk a hűtést az előnyösen legalább -70,0 °C-os vagy az alatti, még előnyösebb esetben a -120 °C-os, még ennél is előnyösebb esetben a -140 °C-os és legelőnyösebben a -196 °C-os véghőmérséklet eléréséig. Amikor a fagyasztás! véghőmérséklet megközelíti a víz üvegátalakulási hőmérsékletét (a -120 °C-t) a legkisebb lesz a valószínűsége annak, hogy káros hőmérséklet-ingadozások lépjenek fel a végső tárolási helyre való juttatás során.
A hidegen tartósított szövetekvivalenseket a programozható fagyasztóberendezésből körülbelül (-120)-(-150) °C-os, gőzfázisú cseppfolyós nitrogént tartalmazó tárolótartályba (Dewar-edénybe) vagy -196 °C-os cseppfolyós nitrogénbe helyezzük át tárolás céljából.
A hidegen tartósított tenyésztett szövetekvivalenseket úgy olvasztjuk fel, hogy kivesszük őket a gőzfázisú cseppfolyós nitrogént tartalmazó tárolóedényből és áttesszük őket szárazjégbe, hogy felmelegedjenek körülbelül -75 °C-ra. Ha már kialakult -75 °C-on az egyensúly, a tenyésztett szövetekvivalenseket a környezetbe, előnyös esetben vízfürdőbe, célszerűen 37 °C-os vízfürdőbe, még célszerűbben 4 °C-os vízfürdőbe, legelőnyösebb esetben pedig a környezet hőmérsékletén levő vízfürdőbe helyezzük át. Ha már látható, hogy a hidegkárosodás-gátló közeg teljes egésze cseppfolyós halmazállapotba került, a tenyésztett szövetekvivalenst tartalmazó tárolószerkezeteket célszerű biológiai szempontból biztonságos szekrénybe vagy más, fertőzésmentes, metanollal tisztított térbe áthelyezni. Az edények fedelét olyan módon távolítjuk el, hogy a fedél anyagát lehámozzuk vagy levágjuk az egység aljáról. Ezután a tenyésztett szövetekvivalenseket tartalmazó keretek mindegyikét ezután Petri-csészékbe tesszük át, míg a hidegkárosodás-gátló oldat feleslegét óvatosan leöntjük. Ezután a tenyésztett szövetekvivalenst tartalmazó Petri-csészékbe körülbelül 30 perc alatt beadagolunk 25 ml öblítőoldatot - célszerűen szoba-hőmérsékletű DMEM-et -, hogy a maradék hidegkárosodás-gátló oldatot leöblítsük a tenyésztett szövetekvivalensről. Az ezen a területen járatos szakember könnyen kiválaszthat más, megfelelő öblítőszert is, előnyösen fiziológiai oldatot, például sejttenyészetből származó közegeket vagy foszfáttal pufferolt sóoldatot. Az öblítőoldatot további 30 perc alatt ismételten lecseréljük. Az öblítési idők a szövet bonyolultsági fokától függően eltérhetnek.
A tenyésztett szövetekvivalenst ezután visszatehetjük abba a csészébe, ahol eredetileg kitenyésztettük, és a tenyésztést 37 °C-on, 10% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában, a tenyészet fenntartására alkalmas közegben megismételhetjük. Választhatunk olyan megoldást is, hogy a szövetekvivalenst beteg kezelésére használjuk fel, vagy - a 4 835 102 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módon - teszteljük, milyen reakciót vált ki, ha egy anyaggal érintkezik.
A következőkben példákat közlünk, hogy részletesebben megismertessük a találmány gyakorlati alkalmazását. A közölt példák semmilyen vonatkozásban nem használhatók fel a találmány terjedelmének a korlátozására. A szakemberek számára világos, hogy a leírt megoldások számos vonatkozásban módosíthatók anélkül, hogy a módosítások eltérést eredményeznének a találmány gondolattól, vagy meghaladnák a találmány terjedelmét.
Példák
1-3. példa
Az 1-3. példákkal a találmány szerinti hidegtartósítási és felolvasztási technikákat mutatjuk be, az előnyösen, de nem kötelezően alkalmazható tárolószerkezettel együtt.
1. példa
Élőbőr-ekvivalens (LSE) hidegtartósítása
Élőbőrekvivalens-konstrukcióket (LSEkonstrukciókat) készítünk a 08/193 809 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés szerint. Élőbőr-ekvivalenseket és hozzájuk erősített, 75 mm-es keretbetéteket (TRANSWELL®, Costar, Cambridge)
9-10 napos, levegőáramoltatással végzett kezelés után 100 mm átmérőjű Petri-csészékbe (Costar, Crambidge) helyezünk. Az LSE-konstrukciókat hidegkárosodás-gátló oldattal áramoltatjuk át olyan módon, hogy a konstrukciókat és a keretbetéteket 100 mm átmérőjű Petri-csészékben 1 órán keresztül 25 ml hidegkárosodás-gátló közegben - 2 M DMEM-es glicerinoldatban - alámerítve tartjuk. Az átáramoltatás alatt a konstrukciókat 10% szén-dioxidot tartalmazó gázzal töltött térben 1 órán át 70 min-1 fordulatszámmal működtetett orbitális rázógéppel (Bellco) rázatjuk. A rázatás eredményeként tökéletesebb az átáramlás, és jobban reprodukálható a hidegtartósítási eljárás. Miután az élő9
HU 223 789 Β1 bőr-ekvivalenseket átáramoltattuk, az élőbőr-ekvivalenst, a keretbetétet és az extracelluláris fagyasztóközeget (2 M DMEM-es glicerinoldat) tartalmazó Petricsészéket hidegtartósító csomagolásba tesszük, és hőkezeléssel lezárjuk.
A találmány szerinti eljárás megvalósításához egy programozható hűtőgépet (Planar) használunk. A hűtőgép hőmérsékletét beállítjuk a 20,0 °C-os kiindulási hőmérsékletre. A csővezetéket 1 másodperc alatt egyszer átöblítjük freonnal, hogy eltávolítsuk a közegben levő összes levegőt. A becsomagolt LSE-egységeket biztonságosan elhelyezzük tartókeretekben, amelyek közül mindegyik 8 LSE-egység befogadására alkalmas. A beállító csapszeggel irányított tartókeretek a permetezőrácsok mellett vannak elhelyezve. A hűtőgép ajtaját lezárjuk, hogy a hűtőteret elszigeteljük a külső környezettől.
Az LSE egységeket -10 °C/min hűtési sebességgel -6 °C-ra hűtjük, és a hűtőtér hőmérsékletét 40 percig -6 °C-on tartjuk, hogy a hidegkárosodás-gátló oldat és az átáramoltatott konstrukció felvegye a hűtőtér hőmérsékletét. 40 perc elteltével extracelluláris jégképződést váltunk ki olyan módon, hogy 1 másodpercig freont engedünk ki a csomag oldalfalának a közvetlen környezetébe. Miközben a freon elpárolog a csomag felszínéről, a vele érintkezésbe került felületet eléggé lehűti ahhoz, hogy a sejteken kívül meginduljon a jégképződés.
Miután az összes LSE-egységet beoltottuk jégkristályokkal, az egységeket 1 órán át -6 °C-on tartjuk, hogy egyensúlyba kerüljenek a környezetükkel. A hűtőtér hőmérsékletét ezután először -0,07 °C/min sebességgel -20 °C, majd -0,5 °C/min hűtési sebességgel -70 °C véghőmérsékletre csökkentjük. Mihelyt az LSE-egységek hidegtartósítása befejeződik, áttesszük őket egy -120 °C és -150 °C közötti hőmérsékletű, gőzfázisú nitrogént tartalmazó tárolótartályba (Dewaredénybe).
2. példa
A hidegtartósított LSE felolvasztása
A hidegtartósított LSE-t kivesszük a gőzfázisú nitrogént tartalmazó tárolótartályból, és áttesszük szárazjégbe, hogy felmelegedjék mintegy -75 °C-ra. Mihelyt az egyensúly -75 °C-on kialakult, a tenyésztett szövetekvivalenst vízfürdőbe tesszük át, amelyet előnyös esetben 37 °C-on, még előnyösebb esetben 4 °C-on, legelőnyösebb esetben pedig a környezet hőmérsékletén tartunk. Amikor a hidegkárosodás-gátló közeg teljes mennyisége szemmel láthatóan cseppfolyós halmazállapotúvá válik, a becsomagolt tenyésztett szövetekvivalensegységeket célszerűen áttesszük egy biológiai szempontból biztonságos szekrénybe, vagy más fertőzésmentes térbe, és etanollal lemossuk őket. A csészék fedelét olyan módon távolítjuk el, hogy a fedél anyagát az egység aljáról lehámozzuk vagy levágjuk. Ezután a tenyésztett szövetekvivalenseket tartalmazó keretek mindegyikét Petri-csészékbe tettük át, miközben a hidegkárosodás-gátló oldat feleslegét lecsepegtetjük. A tenyésztett szövetekvivalenst tartalmazó Petricsészékbe ezután mintegy 30 perc alatt beadagolunk ml szoba-hőmérsékletű öblítőoldatot - célszerűen DMEM-t -, hogy a tenyésztett szövetekvivalensről leöblítsük a hidegkárosodás-gátló oldat maradékát. Az ezen a területen járatos szakember előírhat más megfelelő fiziológiai öblítőoldatokat, például más sejttenyészetből származó tápközeget vagy foszfáttal pufferolt sóoldatot. Az öblítőoldatot lecseréljük, és a második öblítőoldattal további 30 percig öblítünk.
A felolvasztott hidegtartósított mintákat és kontrolimintákat szövettani módszerekkel előkészítjük, és fénymikroszkópos vizsgálattal morfológiai szempontból és az életképességre vonatkozóan kiértékeljük. A hidegtartósított minták közel 100%-os életképességet mutatnak, és csaknem megkülönböztethetetlenek a kontrollmintától.
A találmány szerinti hidegtartósítási eljárást különböző szövetek felhasználásával mutatjuk be a 3-11. példákban.
3. példa
Felhámrétegek hidegtartósítása
Felhámrétegeket készítünk kifejlődött LSE-ből. A felhámrétegeket úgy távolítjuk el, hogy csipesszel lehámozzuk róluk az alsó bőrréteget, amelyet azután eldobunk. Mindegyik réteget három egyforma darabra vágjuk. Minden rétegből az egyik darab a kontrolldarab. Minden egyes rétegből a megmaradt két darabot 100 mm átmérőjű tenyésztőcsészékben (Costar) levő, TRANSWELL® keretbetétek 75 mm-es membránjainak a tetejére helyezzük. Minden egyes rétegdarabot 1 órán át 25 ml 2 M DMEM-es glicerinoldattal áramoltatunk át. A konstrukciókat tartalmazó csészéket orbitális rázógépre (Bellco) helyezzük, amelyet 1 órán át 70 min-1 fordulatszámmal 10% szén-dioxidot tartalmazó gázzal töltött térben működtetünk. A felhámréteg átáramoltatása után a felhámréteget, a TRANSWELL® keretbetétet és az extracelluláris fagyasztóközeget (2 M DMEM-es glicerinoldat) tartalmazó Petri-csészét egy tasakba tesszük, és a tasakot vákuum alá helyezve lezárjuk. A lezárást 5 másodperc vákuumozási időre és 3,9 másodperc lezárási időre programozott Audiovox készülékkel végezzük.
A csomagolt felhámrétegeket 20 °C kiindulási hőmérsékletű, programozható hűtőgépbe (Planer) helyezzük. A felhámrétegeket -10,0 °C/min hűtési sebességgel -6,0 °C-ra hűtjük. A hőmérsékletet 20 percig -6,0 °C-on tartjuk, hogy a felhámrétegek felvegyék a hűtőtér hőmérsékletét. 20 perc eltelte után extracelluláris jégképződést váltunk ki olyan módon, hogy a tasak külső falát a fagyasztóközeg szintje alatt cseppfolyós nitrogénnel hűtött próbapálcával érintkeztetjük. Miután az összes mintát beoltottuk jégkristályokkal, a hőmérsékletet további 5 percig -6,0 °C-on tartjuk. A hűtőteret ezután -1,0 °C/perc sebességgel -8,0 °C-ra hűtjük, majd a hőmérsékletet 30 percig -8,0 °C-on tartjuk, hogy a jég egyenletesen oszoljék el a minta egész térfogatában. A hűtőteret ezután -0,1 °C/min sebességgel -70,0 °C véghőmérsékletre hűtjük.
A hidegen tartósított felhámrétegeket kivesszük a hűtőgépből, a tasakokat kivágjuk a Petri-csészékből,
HU 223 789 Β1 és eltávolítjuk a fedeleket. A minták felolvasztása céljából steril körülmények között minden egyes Petricsészébe 40 ml 37 °C-ra melegített DMEM-et öntünk. 45 másodperc elteltével az összes folyadékot eltávolítjuk a csészékből, és 2 perc alatt további 40 ml DMEM-et engedünk pipettákból a csészékbe. Miután az egész jég felolvadt, a felhámrétegeket 30 percen át 25 ml DMEM-vel öblítjük. A kicserélt közeggel további 30 percig öblítünk. A felhámrétegeket ezután az elemzés előtt 24 órán át 37 °C-os tenyészetfenntartó közegben, 10% szén-dioxidot tartalmazó gázzal töltött térben inkubáljuk. Az inkubációs időt a pihentetéshez tipikus esetben úgy határozzuk meg, hogy a megfagyasztott sejtek ismét stacioner állapotba jussanak. Az inkubációs időt a pihentetéshez tipikus esetben ismételten úgy határozzuk meg, hogy a megfagyasztott sejtek ismét stacioner állapotba jussanak.
Minden egyes felhámréteg megmaradt két darabjából az egyiket szövettani vizsgálatokhoz használjuk, a másik darabot pedig az MTT-meghatározás előírása szerint vizsgáljuk. A hidegtartósításon át nem esett felhámréteg és a 4. példa szerint hidegtartósított felhámréteg mikrofotogramjainak az összehasonlítása alapján megállapítható, hogy ezzel az eljárással a felhám három legfontosabb rétege - a felhám alaprétege, a felhám alapréteg feletti rétege és a felhám szarurétege jól tartósítható. Valamennyi réteg érintetlen, és a hidegen tartósított felhámréteg morfológiai szempontból összességében ugyanolyan, mint a nem hidegtartósított felhámréteg.
4. példa
Bőrekvivalensek hidegtartósítása
Az ennek a vizsgálatnak a keretében alkalmazott bőrekvivalensek az LSE nem felhámosított összetevői. Bőrekvivalenseket fagyasztunk meg a kivételük utáni
8. napon. A bőrekvivalenseket hidegkárosodás-gátló oldattal olyan módon áramoltatjuk át, hogy 100 mm átmérőjű Petri-csészékbe (Costar) helyezett, 75 mm-es TRANSWELL® keretbetétekhez (Costar) erősítjük és 1 órán át 2 M DMEM-es glicerinoldatba merítve tartjuk őket. A Petri-csészéket orbitális rázógépre (Bellco) helyezzük, amelyet 1 órán át 10% szén-dioxidot tartalmazó gázzal töltött térben 70 min-1 fordulatszámmal működtetünk. Miután a bőrekvivalenseket átáramoltattuk, a bőrekvivalenseket a TRANSWELL® keretbetétet és az extracelluláris fagyasztóközeget tartalmazó Petricsészéket 20,0 °C kiindulási hőmérsékletre beállított programozható hűtőgépbe (Planer) helyezzük. A hűtőteret -10,0 °C/min hűtési sebességgel -6,0 °C-ra hűtjük. A hőmérsékletet 20 percig -6 °C-on tartjuk, hogy a hűtőtérben kialakuljon a hőmérséklet-egyensúly. 20 perc eltelte után extracelluláris jégképződést váltunk ki olyan módon, hogy a csészék külső falához a fagyasztóközeg szintje alatt cseppfolyós nitrogénnel hűtött próbapálcát érintünk. Miután valamennyi bőrekvivalenst beoltottunk jégkristályokkal, a hőmérsékletet további 5 percig -6 °C-on tartjuk. A hűtőteret ezután -1,0 °C/min sebességgel -8,0 °C-ra hűtjük, majd a hűtőtér hőmérsékletét 30 percig -8,0 °C-on tartjuk, hogy egyenletes legyen a hőmérséklet-eloszlás a minta teljes térfogatában. A bőrekvivalens-egységeket ezután
-0,1 °C/min sebességgel -70,0 °C véghőmérsékletre hűtjük.
A hidegtartósított bőrekvivalenseket kivesszük a hűtőgépből, és a csésze fedelét eltávolítjuk. A felolvasztást úgy végezzük, hogy minden egyes Petricsészébe steril körülmények között 40 ml 37 °C-ra felmelegített DMEM-et öntünk. A csészékből 45 másodperc múlva az összes folyadékot eltávolítjuk, és 2 perc alatt pipettából további 40 ml DMEM-et adagolunk be a csészékbe. Miután valamennyi jég felolvadt, a bőrekvivalenseket 30 percig 25 ml DMEM-mel öblítjük. Az öblítőközeg kicserélése után további 30 percig öblítünk. A még mindig a TRANSWELL® keretbetétekhez erősített bőrekvivalenseket ezután visszatesszük a tenyésztőcsészékbe, és az elemzés előtt 24 órán át 37 °C-on, 10% szén-dioxidot tartalmazó gázzal töltött térben tenyészetfenntartó közegben inkubáljuk.
A mintákat az MTT-vizsgálati előírások szerint megelemezzük.
5. példa
Szaruhártya-ekvivalensek hidegtartósítása mm-es tenyésztőkeret-betétekhez (Costar) erősített szaruhártya-ekvivalenseket 9 napos, nedves levegő áramoltatásával végzett kezelés után 6 mélyedéssel rendelkező csészébe (Costar) helyezünk.
A szaruhártya-ekvivalenseket úgy áramoltatjuk át hidegkárosodás-gátló oldattal, hogy minden egyes szaruhártya-ekvivalenst és TRANSWELL® keretbetétet a 6 mélyedéssel rendelkező csészében 1 órán át 4 ml extracelluláris fagyasztóközegben (2 M DMEM-es glicerinoldatban) tartunk. A szaruhártya-konstrukciókat tartalmazó, 6 mélyedéssel rendelkező csészéket 1 órán át 10% szén-dioxidot tartalmazó gázzal töltött térben 70 min-1 fordulatszámmal működtetett orbitális rázógéppel (Bellco) rázatjuk. Miután a szaruhártya-ekvivalenseket átáramoltattuk, a szaruhártya-ekvivalenseket a TRANSWELL® keretbetéteket és az extracelluláris fagyasztóközegeket tartalmazó Petri-csészéket 20,0 °C kiindulási hőmérsékletű, programozható hűtőgépbe (Planer) helyezzük. A szaruhártya-ekvivalenseket -10,0 °C/min hűtési sebességgel -6,0 °C-ra hűtjük. A hőmérsékletet 20 percig -6,0 °C-on tartjuk, hogy a hűtőtérben kialakuljon a hőmérséklet-egyensúly. 20 perc elteltével extracelluláris jégképződést váltunk ki olyan módon, hogy a 6 mélyedéssel rendelkező tányér minden egyes mélyedésének a külső falához cseppfolyós nitrogénnel hűtött próbapálcát érintünk a fagyasztóközeg szintje alatt. Miután a szaruhártya-ekvivalenseket beoltottuk jégkristályokkal, a hőmérsékletet további 5 percen át -6,0 °C-on tartjuk, majd -1,0 °C/min sebességgel -8,0 °C-ra csökkentjük. A hőmérsékletet 30 percig -8,0 °C-on tartjuk, hogy a jég eloszlása a minta egész térfogatában egyenletes legyen. A szaruhártyaekvivalenseket -0,1 °C/min hűtési sebességgel -70,0 °C véghőmérsékletre hűtjük.
A hidegtartósított szaruhártya-ekvivalenseket kivesszük a hűtőgépből. A csészék fedelét eltávolítjuk.
HU 223 789 Β1
A 6 mélyedéssel rendelkező tányér minden egyes mélyedésébe steril körülmények között megolvasztás céljából 6 ml, 37 °C-ra melegített DMEM-et öntünk. 45 másodperc múlva a csészéből az összes folyadékot eltávolítjuk, és 2 perc alatt a csészébe pipettából további 6 ml DMEM-et folyatunk. Steril csipeszek segítségével a szaruhártya-ekvivalenseket és a hozzájuk erősített TRANSWELL® keretbetéteket áthelyezzük egy másik, 6 mélyedéssel rendelkező csészébe. Ezután minden egyes mélyedésbe 4 ml DMEM-et adagolunk, amellyel 30 percig öblítünk.
A közegek kicserélése után további 30 percig öblítünk. A szaruhártya-egységeket ezután visszatesszük az eredeti tenyésztőedénybe, és elemzés előtt szaruhártya-fenntartó közegben 37 °C-on, 10% széndioxidot tartalmazó gázzal töltött térben 24 órán át inkubáljuk őket. Az inkubációs időt a pihentetéshez tipikus esetben úgy határozzuk meg, hogy a megfagyasztott sejtek ismét stacioner állapotba jussanak. A mintákat az MTT-vizsgálati előírások szerint értékeljük ki.
6. példa
Egérből kinyert bőr hidegtartósítása
Wild típusú, B6CB6YF1 törzshöz tartozó egereket nembutal túladagolásával megölünk. Az egerek bőrét steril körülmények között kinyerjük. A bőrről eltávolítjuk a felesleges ereket, zsírt és kötőszövetet. Az egérbőrt 1*2 cm-es, téglalap alakú darabokra vagdaljuk. Az egérbőrdarabokat ezután 75 mm-es TRANSWELL® keretbetétekre (Costar) helyezve 100 mm átmérőjű Petricsészékbe (Costar) tesszük. Az egérbőröket átáramoltatjuk hidegkárosodás-gátló oldattal olyan módon, hogy a 100 mm-es Petri-csészékben 1 órán át 25 ml 2 M DMEM-es glicerinoldatba mártva tartjuk őket. Az átáramoltatás alatt az egérbőrt és a TRANSWELL® keretbetéteket tartalmazó Petri-csészéket 10% szén-dioxidot tartalmazó gázzal töltött térben orbitális rázógépre (Bellco) helyezve 70 min-1 fordulatszámmal 1 órán át rázatjuk. Összehasonlítás céljából nem hidegtartósított egérbőrt a hidegtartósítási és a felolvasztási eljárás időtartama alatt (2 napon át) 4 °C-on tápközegben tartunk a bőrátültetést megelőzően.
Miután az egérbőrt átáramoltattuk, az egérbőrt, a TRANSWELL® keretbetétet és az extracelluláris fagyasztóközeget tartalmazó Petri-csészéket 20,0 °C kiindulási hőmérsékletű, programozható hűtőgépbe (Planer) helyezzük. Az egérbőrt -10,0 °C/min sebességgel -6,0 °C-ra hűtjük és 20 percen át ezen a hőmérsékleten tartjuk, hogy a minta felvegye a hűtőtér hőmérsékletét. 20 perc eltelte után extracelluláris jégképződést váltunk ki olyan módon, hogy a csésze külső falához cseppfolyós nitrogénnel hűtött próbapálcát érintünk. Az érintkezési helynek a fagyasztóközeg szintje alatt kell lennie. Az egérbőr jégkristályokkal való beoltása után a hőmérsékletet további 5 percen át -6,0 °C-on tartjuk, majd -1,0 °C/perc hűtési sebességgel -8,0 °C-ra hűtjük. A hőmérsékletet további 30 percig -8,0 °C-on tartjuk, hogy a jégeloszlás a minta egész térfogatában egyenletes legyen. Az egységeket ezután -0,1 °C/perc sebességgel -70,0 °C véghőmérsékletre hűtjük.
A hídegtartósított egérbőrt kivesszük a hűtőgépből, és a csésze fedelét eltávolítjuk. A Petri-csészékbe felolvasztás céljából steril körülmények között 40 ml 37 °C-ra melegített DMEM-et öntünk. 45 másodperc eltelte után a csészékből az összes folyadékot eltávolítjuk, és a csészékbe pipettából 2 perc alatt további 40 ml DMEM-et folyatunk. Miután az összes jég felolvadt, az egérbőrt a csészékben 25 ml DMEM-mel 30 percig öblítjük. A közeg kicserélése után további 30 percig öblítünk.
A felolvasztott hidegtartósított mintákat és kontrolimintákat előkészítjük szövettani vizsgálathoz vagy átültetjük egerekbe. A nem hidegtartósított és a hidegtartósított egérbőr mikrofotogramjainak az összehasonlítása alapján megállapítható, hogy ezzel az eljárással az egérbőr négy legfontosabb összetevője - az irharéteg a kötőszöveti sejtekkel, a felhám alaprétege, a felhám alapréteg feletti rétegei és a felhám szarurétege - tartósítható. Valamennyi réteg sértetlen, és a hidegtartósított egérbőr morfológiai szempontból összességében azonos a nem hidegtartósított egérbőrrel.
7. példa
ATS SKIN2™ hidegtartósítása
A ZK 1300-es SKIN2™-mintákat (Advanced Tissue Sciences, La Jolla, CA, USA) megérkezésük után kivesszük a szállítási előírásoknak megfelelő csomagolásból és tenyésztőcsészékbe (Costar) helyezzük őket. TRANSWELL® keretbetéteket helyezünk a SKIN2™minták fölé, hogy megtartsák az alámerített bőrkonstrukciót. A SKIN2™-mintákat olyan módon áramoltatjuk át a hidegkárosodás-gátló oldattal, hogy a tenyésztőcsészékben 1 órán át 2 M DMEM-es glicerinoldatba mártjuk őket. Az átáramoltatás alatt a bőrkonstrukciókat és a TRANSWELL® keretbetéteket tartalmazó tenyésztőcsészéket 10% szén-dioxidot tartalmazó gázzal töltött térben orbitális rázógéppel (Bellco) 70 min-1 fordulatszámmal rázatjuk.
A SKIN2™ átáramoltatása után az egységeket 20,0 °C kiindulási hőmérsékletű, programozható hűtőgépbe (Planer) helyezzük. A SKIN2™-egységeket -10,0 °C/min hűtési sebességgel -6,0 °C-ra hűtjük, majd ezen a hőmérsékleten tartjuk 20 percig, hogy a kamrában beálljon a hőmérsékleti egyensúly. 20 perc eltelte után extracelluláris jégképződést váltunk ki olyan módon, hogy a csészék külső falát a fagyasztóközeg szintje alatt cseppfolyós nitrogénnel hűtött próbapálcával érintkeztetjük. Miután az összes SKIN2™egységet beoltottuk jégkristályokkal, a hőmérsékletet további 5 percen át -6,0 °C-on tartjuk. A hűtőtér hőmérsékletét ezután -1,0 °C/min hűtési sebességgel -8,0 °C-ra csökkentjük. A SKIN2™-egységeket 30 percig -8,0 °C-on tartjuk, hogy a jégeloszlás a minta egész térfogatában egyenletes legyen. A SKIN2™egységeket ezután 0,1 °C/min sebességgel -70,0 °C véghőmérsékletre hűtjük.
A hidegtartósított SKIN2™-egységeket a hűtőgépből kivesszük, a csészék fedelét eltávolítjuk, és minden egyes tenyésztőcsészébe steril körülmények között felmelegített (37 °C-os) DMEM-et öntünk. 45 másodperc
HU 223 789 Β1 elteltével a csészékből az összes folyadékot eltávolítjuk, és 2 percen át minden egyes csészébe további DMEMmennyiséget adagolunk. A felolvadás után a SKIN2™egységeket és a hozzájuk erősített TRANSWELL® keretbetéteket steril csipeszek alkalmazásával más tenyésztőcsészékbe helyezzük át. A hidegkárosodásgátló oldat eltávolítása céljából a SKIN2™-egységeket olyan módon öblítjük, hogy minden egyes, SKIN2™egységet tartalmazó csészébe 30 percen át DMEM-et adagolunk. A közeg kicserélése után az öblítést további 30 percig folytatjuk. A SKIN2™-egységet ezután visszahelyezzük ugyanolyan típusú tenyésztőedénybe, mint amilyenben volt, és az elemzés előtt tenyészetfenntartó közegben 10% szén-dioxidot tartalmazó levegővel töltött térben 37 °C-on 24 órán át inkubáljuk. Az inkubációs időt a pihentetéshez tipikus esetben úgy határozzuk meg, hogy a megfagyasztott sejtek ismét stacioner állapotba jussanak.
A hidegtartósított konstrukciókat és a kontrollkonstrukciókat kiértékeljük a ZK 1300-as SKIN2™-mintára vonatkozó, a termékhez mellékelt MTT-vizsgálati előírások szerint, valamint szövettani vizsgálatok alapján. A nem hidegtartósított SKIN2™ és a hidegtartósított SKIN2™ mikrofotogramjainak az összehasonlítása alapján megállapítható, hogy a SKIN2™ négy legfontosabb összetevője - a kollagénrács a kötőszöveti sejtekkel, a felhám alaprétege, a felhám alapréteg feletti rétegei és a felhám szarurétege - ezzel a módszerrel tartósítható. Valamennyi réteg sértetlen, és a hidegtartósított SKIN2™ morfológiai szempontból összességében hasonlít a nem hidegtartósított SKIN2™-hez.
8. példa
A metabolikus mitokondriális aktivitás (MTT) elemzése
Fagyasztott és nem fagyasztott (kontroll) LSE-t, felhámréteget, bőrekvivalenseket és szaruhártyaekvivalenseket vizsgálunk a MTT-elemzés alkalmazásával. [A SKIN2™-konstrukciókat a szállítási okmányokhoz mellékelt „MTT Assay Protocol fór use with Model ZK 1300” (MTT-elemzési előírások a ZK 1300as minta alkalmazásához) szerint vizsgáljuk.] A konstrukciókban lévő sejtek életképességét MTTelemzéssel - a sejtek szaporodásának és életképességének a mérésére kifejlesztett, kolorimetriás MTT konverziós elemzéssel - mérjük. Ezt az elemzést részletesen ismertetik a szakirodalomban. [Gay és munkatársai: The Living Skin Equivalent as a Model In vitro fór Ranking the Toxic Potential of Dermal Irritants (Élőbőr-ekvivalensek mint bőrt irritáló szerek mérgező hatás szerinti rangsorolására in vitro körülmények között felhasználható minták.), Toxic. in vitro, 6, 303-315 (1992)]. Az oldódó tetrazóliumsó kék színű formazáncsapadékká való metabolikus redukálódása az ép mitokondriális működésű életképes sejtek jelenlététől függ. Ezzel az elemzéssel különböző típusú sejtekben - például tenyésztett emberi keratinocitákban mennyiségileg határozzuk meg a citotoxicitást.
LSE-t, felhámréteget és bőrekvivalenst tartalmazó tenyésztőcsészékbe 40 ml tesztközeget és a szaruhártya-ekvivalenseket tartalmazó mélyedésekbe
- 1,5 ml mennyiségű, 0,33 mg/ml MTT-t (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) tartalmazó tesztközeget adagolunk.
A szövetekvivalenseket az MTT-vizsgálathoz alkalmazott közegben 3-4 órán át inkubáljuk. A konverziós időszak végén a szövetekvivalensekből 8 mm átmérőjű lyukasztószerszámmal bőrdarabokat vágunk ki. A lyukasztással kivágott bőrdarabokat ezután a környezet hőmérsékletén 0,04 N sósavoldattal megsavanyított, 0,3 ml mennyiségű izopropanollal 2-3 órán át extraháljuk. Az extrahálási idő elteltével valamennyi extraktumból áttöltünk 0,2 ml-t egy 96 mélyedéssel rendelkező lemezre. Az izopropanol extraháiószert vakpróbaként felhasználva egy lemezleolvasó műszerrel (Dynatech) 570 nm-en leolvassuk az abszorpcióképességre jellemző értékeket. A felolvasztott hidegtartósított mintákra és a megfelelő kontrollmintákra így kapott MTTértékeket összehasonlítjuk, és a felolvasztott hidegtartósított mintákra kapott értékeket a kontrollértékek százalékában kifejezve adjuk meg (9. ábra).
9. példa
Laktóz-dehidrogenáz meghatározása (LDH)
A laktóz-dehidrogenáz egyike az élő sejtekben jellemző módon megtalálható enzimeknek. Ezzel a vizsgálattal a sejtnek az enzim felszabadulását eredményező károsodása és az enzimaktivitás ennek megfelelő csökkenése határozható meg.
Felolvasztás után hidegtartósított és kontroll-LSEből 8 mm átmérőjű lyukasztószerszámmal bőrdarabokat vágunk ki. Minden egyes LSE-egységből három mintát veszünk. A lyukasztással kivágott mintákat 1 ml 0,1 M mennyiségű, jégen tartott 0,1 M trietanol-aminpufferrel együtt 15 mm átmérőjű kémcsövekbe tesszük, és elektromos szövethomogenizáló készülékkel 1 percig homogenizáljuk. A mintákat ezután 1000 g-nek megfelelő fordulatszámmal 4,0 °C-on centrifugáljuk. Ezt követően a felülúszót megelemezzük. LDHreagens-koktélt készítünk a következő komponensek összekeverésével: 3,00 ml foszfátpuffer (0,1 mol/liter; pH=7,0), 0,1 ml nátrium-piruvát (2,5 mg/ml) és 0,05 ml NADH-nátrium-só (10 mg/ml). A reagens 900 μΙ-éhez hozzáadunk 100 μΙ-t a minta felülúszójából, majd 2 percig várunk, amíg a reakció végbemegy. Az abszorpcióképességnek a 2 perc alatt bekövetkező változását regisztráljuk. A mélyhűtött LSE-egységenként vett három mintára vonatkozó átlagértéket összehasonlítjuk a nem fagyasztott mintákra vonatkozó kontrollértékekkel, és a mintákra vonatkozóan kapott értékeket a kontrollértékek százalékában kifejezve adjuk meg (9. ábra).
10. példa
A hidegtartósított LSE és a nem hidegtartósított
LSE bioekvivalenciájának igazolása
Eszméletlen egereken szövetátültetéses vizsgálatot hajtunk végre annak igazolására, hogy a hidegtartósított LSE és a nem hidegtartósított LSE bioekvivalens.
Az 1. példában ismertetett eljárás szerint hidegtartósított LSE-egységeket egy nappal az átültetés előtt
HU 223 789 Β1 felolvasztunk, és 24 órán keresztül fenntartó közegben tartva regenerálunk.
Négy kísérletet hajtunk végre, amelyeknek a keretében összesen 66 B6CB6YF1/J-nu törzsbeli egér (Jackson Harbor Labs) közül 43-ra hidegtartósított LSE-t, 23-ra pedig nem hidegtartósított (kontroll) LSE-t ültetünk át. Az állatokat nembutallal érzéstelenítjük. Minden egyes egér hátából 2*2 cm-es bőrdarabot metszünk ki teljes vastagságban a húsréteg megkímélésével. Az LSE-transzplantátumokat - a kontrolltranszplantátumokat és a hidegtartósított transzplantátumokat egyaránt - a sebre helyezzük és a seb méretére vágjuk. Az összes transzplantátumot bekötözzük egyetlen rétegben alkalmazott, petrolátummal átitatott gézzel (Vendor), és befedünk két tapadó sebpólyával (Vendor). A kötéseket az átültetést követő 7. nap elteltével távolítjuk el.
Az átültetést követő 14. nap után az összes állatot kíméletesen megöljük és lefényképezzük. A transzplantált helyen a bőrt szövettani elemzésre és kiértékelésre kimetsszük. A kinagyított fényképeket és a mikrofotogramokat összehasonlítva a transzplantátum beépülése tekintetében semmilyen különbség nem mutatható ki a kontroll-LSE és a felolvasztott, előzőleg hidegtartósított LSE között. A sebösszehúzódás mértékét illetően sem állapítható meg semmilyen jelentős eltérés a kontrolltranszplantátum és a hidegtartósított transzplantátum között.
11. példa
Hidegtartósított és kontrollegérbőr szingenetikus átültetése
Szingenetikus bőrátültetéssel vizsgálatot végzünk annak igazolására, hogy a hidegtartósított egérbőr biológiai szempontból egyenértékű a nem hidegtartósított egérbőrrel.
Wild-típusú, a B6CB1YF1 törzshöz tartozó egereket nembutal túladagolásával kíméletes módon megölünk. Az egérbőrt steril körülmények között kinyerjük. Az irharétegről a felesleges ereket, zsírszövetet és kötőszövetet a bőrtranszplantátumok elkészítése céljából eltávolítjuk. Az egérbőrt a 7. példában ismertetett módon hidegtartósítjuk, majd felolvasztjuk. A kontrollként felhasznált, nem hidegtartósított egérbőrt a bőrátültetés előtt összesen 2 napig - a hidegtartósítás és a felolvasztás alatt - 4 °C-on tápközegben tartjuk.
Hat, ugyanahhoz a törzshöz tartozó egérre ültetünk át bőrtranszplantátumokat: kettőre nem hidegtartósított egérbőrt (kontroll), négyre pedig hidegtartósított, majd felolvasztott egérbőrt. Az egereket nembutallal érzéstelenítjük. A húsréteg megkímélésével minden egyes egér hátából kimetszünk egy 2*2 cm-es, teljes vastagságú bőrdarabot. Az egérbőr-transzplantátumokat - a kontrolltranszplantátumokat és a hidegtartósított transzplantátumokat egyaránt - a sebekre helyezzük, és a sebeknek megfelelő méretre vágjuk. Valamennyi transzplantátumot bekötözzük egyrétegű, petrolátummal átitatott gézzel és lefedjük két tapadó sebpólyával. Ezeket a kötéseket a bőrátültetést követő 7. nap elteltével távolítjuk el.
A bőrátültetés utáni 30. napon az összes állatot kíméletes módon megöljük és lefényképezzük. A transzplantált helyeken a bőrt ezután szövettani elemzés és kiértékelés céljából kimetsszük. A nagyított fényképek és a mikrofotogramok alapján megállapítható, hogy a transzplantátum beépülése szempontjából nincs különbség a kontrollegérbőr és a hidegtartósított, majd felolvasztott egérbőr között. Nem látható semmilyen jelentős eltérés a kontrolltranszplantátumok és a hidegtartósított transzplantátumok között a sebösszehúzódás mértékét illetően sem.
Bár a találmányt a leírásban a jobb megértés elősegítése céljából bizonyos részletességgel példákkal ismertettük, szakemberek számára nyilvánvaló, hogy bizonyos változtatások és módosítások a találmánynak a mellékelt igénypontok által meghatározott terjedelmén belül lehetségesek.
Claims (10)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás emlősökből kinyert szövetek vagy tenyésztett szövetekvivalensek hidegtartósítására, melynek során az adott szövetet hidegkárosodás-gátló oldatba merítjük, azzal jellemezve, hogya) miközben az adott szövetet a hidegkárosodásgátló oldatba merítjük, a hidegkárosodás-gátló oldatot és a belemerített szövetet egyaránt mozgatjuk, így elegendő mennyiségű hidegkárosodás-gátló oldatnak a szövetbe való behatolását és átáramlását idézzük elő;b) a hidegkárosodás-gátló oldatban és az átáramoltatott szövetben extracelluláris jégképződést váltunk ki;c) hidegtartósított szövetet állítunk elő olyan módon, hogy a b) lépésben kapott átáramoltatott szövetet -3 °C/min vagy ennél kisebb hűtési sebességgel körülbelül -70 °C-ra vagy annál alacsonyabb hőmérsékletre hűtve megfagyasztjuk; ésd) a hidegtartósított szövetet körülbelül -70 °C-on vagy annál alacsonyabb hőmérsékleten tároljuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) művelet végrehajtásakor körülbelül 20 °C kiindulási hőmérsékletet alkalmazunk, majd az átáramoltatás folyamán a hőmérsékletet körülbelül -10 °C/min sebességgel mintegy -6 °C-ra csökkentjük.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben a hőmérsékletet -1 °C/min sebességgel körülbelül -8 °C-ra csökkentjük, és ezen a hőmérsékleten tartjuk annyi ideig, amennyi elegendő ahhoz, hogy az adott hidegkárosodás-gátló oldat az adott szöveten belül fizikailag és biológiailag egyaránt egyensúlyba kerüljön.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben a hőmérsékletet annyi ideig tartjuk állandó értéken, amennyi elegendő ahhoz, hogy az adott hidegkárosodás-gátló oldat az adott szöveten belül fizikailag és biológiailag egyensúlyba kerüljön.
- 5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hűtés során a hőmérsékletet körülbelülHU 223 789 Β1 (-0,3)-(-0,02) “C/min sebességgel csökkentjük körülbelül -70 °C-ra vagy annál alacsonyabb értékre.
- 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlősökből kinyert szövetként emlősökből kinyert bőrt alkalmazunk. 5
- 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tenyésztett szövetekvivalensként tenyésztett szövetekvivalenst, tenyésztett irhaszövet-ekvivalenst vagy tenyésztett szaruhártya-ekvivalenst alkalmazunk. 10
- 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidegtartósítást körülbelül -120 °C és körülbelül -196 °C közötti hőmérsékleten végezzük.
- 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hidegkárosodás-gátló oldatként 1,5-2,5 M koncentrációjú, Dulbecco által módosított Eagle-féle közeg felhasználásával készült glicerinoldatot használunk.
- 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidegtartósított szövet körülbelül 1-2 perc alatt, felolvasztási művelettel felolvasztható.HU 223 789 Β1Int. Cl.7: A 01 N 1/021A. ábraHU 223 789 Β1Int. Cl.7: A 01 N 1/02 10^|i i Γ ,i3B. ábraHU 223 789 Β1Int. Cl.7: A 01 N 1/02HU 223 789 Β1Int. Cl.7: A 01 N 1/025A. ábraHU 223 789 Β1Int. Cl.7: A 01 N 1/02HU 223 789 Β1Int. Cl.7: A 01 N 1/02HU 223 789 Β1Int. Cl.7: A 01 N 1/02
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/380,099 US5891617A (en) | 1993-09-15 | 1995-01-30 | Cryopreservation of harvested skin and cultured skin or cornea equivalents by slow freezing |
| PCT/US1996/001217 WO1996024018A1 (en) | 1995-01-30 | 1996-01-30 | Method and package design for cryopreservation and storage of cultured tisse equivalents |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9800411A2 HUP9800411A2 (en) | 1998-06-29 |
| HU223789B1 true HU223789B1 (hu) | 2005-01-28 |
Family
ID=23499896
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9800411A HU223789B1 (hu) | 1995-01-30 | 1996-01-30 | Eljárás emlősökből kinyert szövetek és tenyésztett szövetekvivalensek hidegtartósítására és tárolására |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5891617A (hu) |
| EP (2) | EP0807234B1 (hu) |
| JP (4) | JPH11501298A (hu) |
| KR (1) | KR100328742B1 (hu) |
| CN (2) | CN1119599C (hu) |
| AT (2) | ATE282805T1 (hu) |
| AU (1) | AU716869B2 (hu) |
| BR (1) | BR9606864A (hu) |
| CZ (1) | CZ294950B6 (hu) |
| DE (2) | DE69633854T2 (hu) |
| ES (1) | ES2231804T3 (hu) |
| FI (1) | FI113694B (hu) |
| HU (1) | HU223789B1 (hu) |
| NO (1) | NO310491B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ302913A (hu) |
| PL (1) | PL181762B1 (hu) |
| PT (1) | PT807234E (hu) |
| RU (1) | RU2178865C2 (hu) |
| SG (1) | SG106553A1 (hu) |
| SK (1) | SK284801B6 (hu) |
| WO (1) | WO1996024018A1 (hu) |
Families Citing this family (91)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5891617A (en) * | 1993-09-15 | 1999-04-06 | Organogenesis Inc. | Cryopreservation of harvested skin and cultured skin or cornea equivalents by slow freezing |
| US5689961A (en) | 1996-01-30 | 1997-11-25 | Organogenesis Inc. | Ice seeding apparatus for cryopreservation systems |
| GB2330516A (en) * | 1997-10-22 | 1999-04-28 | Elizabeth Acton | Cryopreservation of cell suspensions |
| US6291240B1 (en) * | 1998-01-29 | 2001-09-18 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Cells or tissues with increased protein factors and methods of making and using same |
| WO1999060849A1 (en) | 1998-05-26 | 1999-12-02 | Lifecell Corporation | Cryopreservation of human red blood cells |
| CN1333818A (zh) | 1998-11-19 | 2002-01-30 | 奥加诺吉尼西斯公司 | 生物工程化的组织构建物、其制备方法及其应用 |
| US20010036665A1 (en) * | 1999-03-18 | 2001-11-01 | Susan M. Young | Method of preparing cryogenically preserved adherent cell containing plate for tissue culture applications |
| US6576265B1 (en) | 1999-12-22 | 2003-06-10 | Acell, Inc. | Tissue regenerative composition, method of making, and method of use thereof |
| US6579538B1 (en) | 1999-12-22 | 2003-06-17 | Acell, Inc. | Tissue regenerative compositions for cardiac applications, method of making, and method of use thereof |
| US20040043006A1 (en) * | 2002-08-27 | 2004-03-04 | Badylak Stephen F. | Tissue regenerative composition |
| CA2403273A1 (en) * | 2000-03-14 | 2001-09-20 | Alnis Biosciences, Inc. | Cryoprotective system |
| JP4204784B2 (ja) * | 2000-03-24 | 2009-01-07 | 株式会社メニコン | 組織等価物の凍結保存方法および凍結保存された組織等価物 |
| US6521402B1 (en) | 2000-06-14 | 2003-02-18 | The Texas A&M University System | Cryopreservation of tissues for use in nuclear transfer |
| US20020069649A1 (en) * | 2000-12-08 | 2002-06-13 | Ardais Corporation | Container for cryopreserved material |
| DE10061968A1 (de) * | 2000-12-13 | 2002-06-20 | Friedrich Hoffmann | Verfahren und Vorrichtung zum Einfrieren von Hornhautgewebe |
| AU2002226094A1 (en) * | 2000-12-15 | 2002-06-24 | The Texas A And M University System | Cloning bovines by nuclear transplantation |
| WO2002058588A2 (en) * | 2000-12-27 | 2002-08-01 | Ortec International, Inc. | Processes for making cryopreserved composite living constructs and products resulting therefrom |
| RU2003124058A (ru) * | 2001-01-02 | 2005-01-10 | Сьюпачилл Текнолоджиз Пти. Лтд. (Au) | Способ и система приготовления образцов тканей для гистологического и патологического исследования |
| WO2003024496A1 (en) * | 2001-09-05 | 2003-03-27 | Hans Biomed Corporation | A process for preparing a biomaterial for tissue repair |
| WO2003024213A1 (en) * | 2001-09-17 | 2003-03-27 | Provincia Italiana Della Congregazione Dei Figli Dell'immacolata Concezione - Istituto Dermopatico Dell'immacolata | Case for the protection and the transportation of epidermis or skin grafts cultivated in vitro from a skin graft cut from a donor |
| US6656380B2 (en) | 2001-10-16 | 2003-12-02 | Supachill Technologies Pty. Ltd. | Super-coolable composition having long-duration phase change capability, process for preparation of same, process for super-cooling same and articles comprising same |
| DE10151296A1 (de) * | 2001-10-17 | 2003-04-30 | Boehringer Ingelheim Pharma | Keratinozyten verwendbar als biologisch aktive Substanz bei der Behandlung von Wunden |
| WO2003037082A1 (en) * | 2001-11-01 | 2003-05-08 | Integrated Biosystems, Inc. | Systems and methods for freezing, storing and thawing biopharmaceutical material |
| US6681581B2 (en) | 2001-11-20 | 2004-01-27 | Supachill Technologies Pty. Ltd. | Pre-conditioned solute for use in cryogenic processes |
| AU2003219830A1 (en) * | 2002-02-22 | 2003-09-09 | Ebi, L.P. | Methods and compositions for treating bone or cartilage defects |
| WO2004011616A2 (en) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | The General Hospital Corporation | Systems and methods for cell preservation |
| WO2004010780A2 (en) * | 2002-07-30 | 2004-02-05 | General Biotechnology, Llc | Innocuous intracellular ice |
| WO2004069156A2 (en) * | 2003-01-30 | 2004-08-19 | The Regents Of The University Of California | Inactivated probiotic bacteria and methods of use thereof |
| US20040176855A1 (en) * | 2003-03-07 | 2004-09-09 | Acell, Inc. | Decellularized liver for repair of tissue and treatment of organ deficiency |
| US20040175366A1 (en) * | 2003-03-07 | 2004-09-09 | Acell, Inc. | Scaffold for cell growth and differentiation |
| WO2005002601A1 (en) | 2003-06-25 | 2005-01-13 | Badylak Stephen F | Conditioned matrix compositions for tissue restoration |
| WO2005118785A1 (en) | 2004-06-02 | 2005-12-15 | Es Cell International Pte Ltd | Cell preservation method |
| CN100386061C (zh) * | 2005-05-17 | 2008-05-07 | 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 | 一种经冰冻处理的低抗原的异种角膜基质及制备方法 |
| WO2007038629A2 (en) | 2005-09-26 | 2007-04-05 | Lifecell Corporation | Dry platelet composition |
| BRPI0621107A2 (pt) * | 2005-12-22 | 2011-11-29 | Jane Ennis | método de recuperação de células viáveis do tecido de cordão umbilical, método de preservação da viabilidade de células presentes no tecido de cordão umbilical, tecido de cordão umbilical e método de recuperação de hucpvcs viáveis |
| KR101039758B1 (ko) | 2006-04-28 | 2011-06-09 | 젤티크 애스세틱스, 인코포레이티드. | 피하 지질 과다 세포의 개선된 냉각을 위한 치료 장치와함께 사용하기 위한 동결 방지제 |
| WO2008022651A1 (en) | 2006-08-21 | 2008-02-28 | Antoine Turzi | Process and device for the preparation of platelet rich plasma for extemporaneous use and combination thereof with skin and bone cells |
| US8192474B2 (en) | 2006-09-26 | 2012-06-05 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Tissue treatment methods |
| US20080077201A1 (en) | 2006-09-26 | 2008-03-27 | Juniper Medical, Inc. | Cooling devices with flexible sensors |
| US9132031B2 (en) | 2006-09-26 | 2015-09-15 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Cooling device having a plurality of controllable cooling elements to provide a predetermined cooling profile |
| US20080287839A1 (en) | 2007-05-18 | 2008-11-20 | Juniper Medical, Inc. | Method of enhanced removal of heat from subcutaneous lipid-rich cells and treatment apparatus having an actuator |
| US8523927B2 (en) | 2007-07-13 | 2013-09-03 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | System for treating lipid-rich regions |
| US8285390B2 (en) | 2007-08-21 | 2012-10-09 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Monitoring the cooling of subcutaneous lipid-rich cells, such as the cooling of adipose tissue |
| US8603073B2 (en) | 2008-12-17 | 2013-12-10 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Systems and methods with interrupt/resume capabilities for treating subcutaneous lipid-rich cells |
| EP2221362A1 (en) * | 2009-02-19 | 2010-08-25 | Naturin GmbH & Co | Method for the cryopreservation of cells, artificial cell constructs or three-dimensional complex tissues assemblies |
| EP2769703B1 (en) | 2009-04-30 | 2022-04-06 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Device for removing heat from subcutaneous lipid-rich cells |
| BR112012018521A2 (pt) | 2010-01-25 | 2019-09-24 | Zeltiq Aesthetics Inc | aplicadores para uso doméstico para remover de forma não invasiva calor de células subcutâneas ricas em lipídeos por meio de refrigerantes de mudança de fase, e dispositivos, sistemas e métodos associados |
| EP2536825B1 (en) | 2010-02-18 | 2024-03-27 | Osiris Therapeutics, Inc. | Immunocompatible amniotic membrane products |
| KR101089614B1 (ko) * | 2010-02-26 | 2011-12-05 | (주)시지바이오 | 무세포 진피 기질의 제조 방법 및 그로부터 제조된 무세포 진피 기질 |
| GB201004072D0 (en) | 2010-03-11 | 2010-04-28 | Turzi Antoine | Process, tube and device for the preparation of wound healant composition |
| CN103179852B (zh) * | 2010-05-28 | 2015-04-08 | 格尼亚有限公司 | 改良的显微操作和储存装置以及方法 |
| US8676338B2 (en) | 2010-07-20 | 2014-03-18 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Combined modality treatment systems, methods and apparatus for body contouring applications |
| EP2616025A4 (en) * | 2010-09-13 | 2015-02-18 | Singapore Health Serv Pte Ltd | METHOD FOR REALIZING A REVERSIBLE REFRACTION PROCEDURE |
| JP5915977B2 (ja) * | 2011-11-29 | 2016-05-11 | 学校法人明治大学 | 凍結細胞シートの製造方法 |
| EP2854824A1 (en) | 2012-05-25 | 2015-04-08 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Use of keratinocytes as a biologically active substance in the treatment of wounds, such as diabetic wounds, optionally in combination with a dpp-4 inhibitor |
| DE102012013267A1 (de) | 2012-07-04 | 2014-01-09 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Substrateinrichtung, Konservierungsgerät und Verfahren zur Kryokonservierung einer biologischen Probe |
| TW201422155A (zh) | 2012-07-06 | 2014-06-16 | Arigos Biomedical Inc | 以氣體灌注快速冷卻與升溫預防玻璃質化組織受熱-力破壞的方法與裝置 |
| ES2705043T3 (es) * | 2013-03-13 | 2019-03-21 | Stratatech Corp | Criopreservación de sustitutos de piel humana viables |
| US9844460B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-12-19 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Treatment systems with fluid mixing systems and fluid-cooled applicators and methods of using the same |
| US9545523B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-01-17 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Multi-modality treatment systems, methods and apparatus for altering subcutaneous lipid-rich tissue |
| US10575890B2 (en) | 2014-01-31 | 2020-03-03 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Treatment systems and methods for affecting glands and other targeted structures |
| US10675176B1 (en) | 2014-03-19 | 2020-06-09 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Treatment systems, devices, and methods for cooling targeted tissue |
| USD777338S1 (en) | 2014-03-20 | 2017-01-24 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Cryotherapy applicator for cooling tissue |
| US10952891B1 (en) | 2014-05-13 | 2021-03-23 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Treatment systems with adjustable gap applicators and methods for cooling tissue |
| US10568759B2 (en) | 2014-08-19 | 2020-02-25 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Treatment systems, small volume applicators, and methods for treating submental tissue |
| US10935174B2 (en) | 2014-08-19 | 2021-03-02 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Stress relief couplings for cryotherapy apparatuses |
| JP6130868B2 (ja) * | 2015-02-19 | 2017-05-17 | テルモ株式会社 | 単離されたシート状細胞培養物の製造方法 |
| ES2892598T3 (es) | 2015-10-19 | 2022-02-04 | Zeltiq Aesthetics Inc | Métodos de tratamiento vascular para enfriar estructuras vasculares |
| AU2017206118B2 (en) | 2016-01-07 | 2021-09-30 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Temperature-dependent adhesion between applicator and skin during cooling of tissue |
| US10765552B2 (en) | 2016-02-18 | 2020-09-08 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Cooling cup applicators with contoured heads and liner assemblies |
| US10682297B2 (en) | 2016-05-10 | 2020-06-16 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Liposomes, emulsions, and methods for cryotherapy |
| US11382790B2 (en) | 2016-05-10 | 2022-07-12 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Skin freezing systems for treating acne and skin conditions |
| US10555831B2 (en) | 2016-05-10 | 2020-02-11 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Hydrogel substances and methods of cryotherapy |
| MX2019003680A (es) | 2016-10-04 | 2019-09-26 | Membrane Protective Tech Inc | Sistemas y metodos para crioprotectores naturales para la preservacion de celulas. |
| CN110461149A (zh) | 2017-01-27 | 2019-11-15 | 斯特拉塔泰克公司 | 组织容器系统 |
| AU2018214954B2 (en) * | 2017-02-01 | 2023-07-13 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Devices for tissue cryopreservation and recovery |
| RU2650694C1 (ru) * | 2017-02-15 | 2018-04-17 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна" (ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России) | Способ эффективной и безопасной криоконсервации донорских сосудистых трансплантатов, обеспечивающий оптимизацию их дальнейшего процессинга - радиационной стерилизации и децеллюляризации |
| US11076879B2 (en) | 2017-04-26 | 2021-08-03 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Shallow surface cryotherapy applicators and related technology |
| WO2019124339A1 (ja) * | 2017-12-18 | 2019-06-27 | テルモ株式会社 | 保護機構を具備する脆弱物保持デバイス |
| WO2020028472A1 (en) | 2018-07-31 | 2020-02-06 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Methods, devices, and systems for improving skin characteristics |
| JP7398434B2 (ja) * | 2018-08-30 | 2023-12-14 | ザ キュレイターズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミズーリ | 試料と細胞外氷との直接接触を防ぐのに有効な凍結保存装置 |
| US11154052B2 (en) | 2018-09-14 | 2021-10-26 | University Of Miami | Dual-chamber vial for corneal graft preservation |
| WO2020061429A1 (en) | 2018-09-20 | 2020-03-26 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of tils from cryopreserved tumor samples |
| CA3127191A1 (en) | 2019-01-21 | 2020-07-30 | Eclipse Medcorp, Llc | Methods, systems and apparatus for separating components of a biological sample |
| US10610280B1 (en) | 2019-02-02 | 2020-04-07 | Ayad K. M. Agha | Surgical method and apparatus for destruction and removal of intraperitoneal, visceral, and subcutaneous fat |
| CA3159372A1 (en) | 2019-10-31 | 2021-05-06 | Eclipse Medcorp, Llc | Systems, methods and apparatus for separating components of a sample |
| RU2731287C1 (ru) * | 2019-11-21 | 2020-09-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СПбГПМУ Минздрава России) | Пробирка для криоконсервации ткани яичников |
| RU2731065C1 (ru) * | 2019-12-24 | 2020-08-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (ИБР РАН) | Состав криоконсерванта для длительного хранения первичных кератиноцитов |
| WO2022025240A1 (ja) * | 2020-07-31 | 2022-02-03 | 学校法人同志社 | 角膜内皮細胞を保存するための方法および容器 |
| WO2023196877A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies |
| WO2023220608A1 (en) | 2022-05-10 | 2023-11-16 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist |
Family Cites Families (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2348448A (en) * | 1942-02-16 | 1944-05-09 | Kimble Glass Co | Apparatus for the cultivation of anaerobic and microaerophilic organisms |
| US3842831A (en) * | 1972-10-27 | 1974-10-22 | Genetic Labor Inc | Cellular skin patch |
| FR2486915A1 (fr) * | 1980-07-21 | 1982-01-22 | Biomerieux Sa | Boite etanche a fermeture par joint |
| US4539716A (en) * | 1981-03-19 | 1985-09-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Fabrication of living blood vessels and glandular tissues |
| US4546500A (en) * | 1981-05-08 | 1985-10-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Fabrication of living blood vessels and glandular tissues |
| US4485096A (en) * | 1982-02-26 | 1984-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Tissue-equivalent and method for preparation thereof |
| US4485097A (en) * | 1982-05-26 | 1984-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Bone-equivalent and method for preparation thereof |
| FR2558337B1 (fr) * | 1984-01-19 | 1986-05-02 | Air Liquide | Dispositif de congelation de produits biologiques conditionnes en paillettes |
| US5084377A (en) * | 1984-09-19 | 1992-01-28 | Larry Rowan | Cryogenic suspension method |
| US4604346A (en) * | 1984-10-09 | 1986-08-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Skin-equivalent prepared by the use of punch biopsy |
| US5026649A (en) * | 1986-03-20 | 1991-06-25 | Costar Corporation | Apparatus for growing tissue cultures in vitro |
| US4890457A (en) * | 1987-01-02 | 1990-01-02 | Cryolife, Inc. | Method for cryopreserving heart valves |
| IT1207525B (it) * | 1987-06-23 | 1989-05-25 | Ist Naz Ric Sul Cancro | Metodo per la preservazione difogli trapiantabili di epitelio coltivato in vitro vitale. |
| US4978540A (en) * | 1988-01-20 | 1990-12-18 | Lee Tung Ching | Production of frozen foods and other products |
| US5194269A (en) * | 1988-01-20 | 1993-03-16 | Lee Tung Ching | Production of frozen foods and other products |
| US4837379A (en) * | 1988-06-02 | 1989-06-06 | Organogenesis Inc. | Fibrin-collagen tissue equivalents and methods for preparation thereof |
| CA1335723C (en) * | 1988-08-04 | 1995-05-30 | Thomas Glonek | Method and composition for cryopreservation of tissue |
| CA2000181A1 (en) * | 1988-10-14 | 1990-04-14 | Chung-Faye Chao | Process for producing cultured epidermal sheet, product and method of use |
| JPH0651601B2 (ja) * | 1988-10-27 | 1994-07-06 | 伊藤忠飼料株式会社 | 豚の凍結受精卵及び凍結保存方法 |
| JPH02300101A (ja) * | 1989-05-12 | 1990-12-12 | Tabai Espec Corp | 生物試料凍結保存装置における植氷方法および植氷装置 |
| US4988302A (en) * | 1989-06-08 | 1991-01-29 | Difco Laboratories Incorporated | Culture media package |
| US5131850A (en) * | 1989-11-03 | 1992-07-21 | Cryolife, Inc. | Method for cryopreserving musculoskeletal tissues |
| CA2068993A1 (en) * | 1989-11-20 | 1991-05-21 | George John Morris | Cooling process and apparatus |
| US5040677A (en) * | 1990-06-04 | 1991-08-20 | Biosurface Technology, Inc. | Container for storage and distribution of a skin wound dressing |
| US5145770A (en) * | 1990-06-04 | 1992-09-08 | Biosurface Technology, Inc. | Cryopreservation of cultured epithelial sheets |
| US5336616A (en) * | 1990-09-12 | 1994-08-09 | Lifecell Corporation | Method for processing and preserving collagen-based tissues for transplantation |
| JPH04365434A (ja) * | 1991-06-12 | 1992-12-17 | Oji Paper Co Ltd | 不定根および／または毛状根の凍結保存法 |
| JP3672201B2 (ja) * | 1991-12-26 | 2005-07-20 | 雪印乳業株式会社 | 哺乳動物胚移植用ストロー及びその製造法 |
| US5366893A (en) * | 1993-01-13 | 1994-11-22 | Becton, Dickinson And Company | Culture vessel |
| US5518878A (en) * | 1993-09-15 | 1996-05-21 | Organogenesis Inc. | Cryopreservation of cultured skin or cornea equivalents with agitation |
| US5891617A (en) * | 1993-09-15 | 1999-04-06 | Organogenesis Inc. | Cryopreservation of harvested skin and cultured skin or cornea equivalents by slow freezing |
| US5689961A (en) * | 1996-01-30 | 1997-11-25 | Organogenesis Inc. | Ice seeding apparatus for cryopreservation systems |
-
1995
- 1995-01-30 US US08/380,099 patent/US5891617A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-01-30 JP JP8523665A patent/JPH11501298A/ja not_active Withdrawn
- 1996-01-30 RU RU97116150/13A patent/RU2178865C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 PT PT96905275T patent/PT807234E/pt unknown
- 1996-01-30 CN CN96191673A patent/CN1119599C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-30 DE DE69633854T patent/DE69633854T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-30 SG SG9802806A patent/SG106553A1/en unknown
- 1996-01-30 AU AU49082/96A patent/AU716869B2/en not_active Ceased
- 1996-01-30 AT AT96905275T patent/ATE282805T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 WO PCT/US1996/001217 patent/WO1996024018A1/en active IP Right Grant
- 1996-01-30 DE DE69637301T patent/DE69637301T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-30 AT AT04077072T patent/ATE376356T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 PL PL96321089A patent/PL181762B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 NZ NZ302913A patent/NZ302913A/en unknown
- 1996-01-30 SK SK1033-97A patent/SK284801B6/sk unknown
- 1996-01-30 KR KR1019970705324A patent/KR100328742B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 CZ CZ19972413A patent/CZ294950B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 ES ES96905275T patent/ES2231804T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-30 EP EP96905275A patent/EP0807234B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-30 HU HU9800411A patent/HU223789B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 BR BR9606864A patent/BR9606864A/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-01-30 EP EP04077072A patent/EP1516532B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-30 CN CNB031457983A patent/CN1292651C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-06-16 FI FI972563A patent/FI113694B/fi active
- 1997-07-28 NO NO19973463A patent/NO310491B1/no unknown
-
2006
- 2006-07-10 JP JP2006188993A patent/JP4361550B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-01-04 JP JP2007000107A patent/JP2007161723A/ja not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-12-27 JP JP2013272171A patent/JP2014065736A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU223789B1 (hu) | Eljárás emlősökből kinyert szövetek és tenyésztett szövetekvivalensek hidegtartósítására és tárolására | |
| US5964096A (en) | Method and package design for cryopreservation and storage of cultured tissue equivalents | |
| FI113833B (fi) | Viljeltyjen kudosjäljitelmien kylmäsäilytys | |
| CA1310588C (en) | Method for cryopreserving heart valves | |
| US20100233670A1 (en) | Frozen Viable Solid Organs and Method for Freezing Same | |
| CN112638157A (zh) | 一种防止样品和细胞外冰直接接触的有效低温保存装置 | |
| JP2004520828A (ja) | 凍結保存された複合生体構築物の製造方法および該方法から得られる製造物 | |
| CA2210532C (en) | Method and package design for cryopreservation and storage of cultured tissue equivalents | |
| KR20090108402A (ko) | 동결보존에 의한 스킨 드레싱 가공 방법 | |
| Muss et al. | Current opinion: advances in machine perfusion and preservation of vascularized composite allografts–will time still matter? |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20041213 |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |