CN112638157A

CN112638157A - 一种防止样品和细胞外冰直接接触的有效低温保存装置

Info

Publication number: CN112638157A
Application number: CN201980055919.1A
Authority: CN
Inventors: 韩旭; 彼得·库伦; 约翰·K·克莱泽
Original assignee: Missouri Administration, University of
Current assignee: Missouri Administration, University of
Priority date: 2018-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2039-08-30
Also published as: EP3843545A2; JP2021534787A; US20210195890A1; CN112638157B; JP7398434B2; WO2020047369A2; EP3843545A4; WO2020047369A3

Abstract

一种低温保护装置通过防止生物材料与破坏细胞的大冰晶直接接触，从而保护了含水生物材料免受在低温冷冻和/或低温储存期间由于冰的形成而导致的机械损伤，所述低温保护储存装置具有带有内腔的壳体。壳体配置为在内腔内容纳具有生物材料的可冻结介质。壳体包括半透膜。所述膜对于大于所述膜的平均孔径的冰晶是不可渗透的，以防止这种冰晶从所述壳体的外部进入所述内腔，使得在所述壳体内的介质中形成的冰晶具有与壳体外部介质中形成的冰晶相比较小的晶体尺寸。从而，保护了生物材料免受由直接与大冰晶接触而产生的机械损伤。

Description

一种防止样品和细胞外冰直接接触的有效低温保存装置

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年8月30日提交的美国临时专利申请序列号62/724,959的权益，其全部公开内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及低温生物学和低温保存以及冰形成控制技术以及生物和临床样品的储存领域。

背景技术

低温保存是一种允许将生物材料在非常低的温度(通常为大约-80℃到-196℃)下存储在例如机械深度冷冻器或液氮低温冷冻器或储罐中的技术。已知低温保存可以在相对长的时间段内潜在地无限期地存储这种生物材料，而没有生物材料的功能性降解或有基本上有限的降解。尽管对于促进生物医学研究和临床应用的低温保存效率至关重要，但传统的低温保存和低温保存程序导致许多对于移植、再生医学和个性化医学非常有价值的细胞和组织类型的生存能力较差。

在许多其他细胞和组织类型中，角膜是典型的例子，其在传统的低温储存后遭受低生存力和功能受损。在全球范围内，每年大约进行100,000例角膜移植医疗程序，但潜在的患者有1000万人。低温是角膜组织常用的储存方法，其中在约2-8℃下储存角膜组织，但这种保存方法只能在角膜组织受损且不合适移植之前有效储存少于两周的时间。因此，目前，对于许多发展中国家来说，由于文化或政策限制以及技术限制，国内角膜的捐赠或收集很少，而且这些国家的患者从发达国家获得合格的角膜也面临着很大的挑战。生物合成角膜的移植是非常有前途的解决方案，不久将需要有效的长期组织储存，其对于国际配送是不可行的。角膜组织对于医学或基础研究应用也非常重要。每年约有30,000个供体角膜用于此类医学和/或研究目的。质量可控的角膜组织无法获得，或者在许多情况下无法负担得起。

近年来，与已在液氮中低温保存的人角膜的医学移植相关的功效仅取得了不太显著的进展，并且遭受了约30％或更多的内皮细胞损失。因此，即使经过数十年的努力，由于其设施和劳动力的苛刻要求，其成本低效以及所获得的高度可变的临床和实验结果，角膜的低温保存也未能获得广泛的认可。类似地，对于其他相对复杂的组织类型，例如血管和卵巢组织，没有实用性的低温保存方法，即使这种组织类型对于关键疾病治疗或相关生物医学技术的发展非常重要。

在传统的低温保存技术中，两种通用的冷却方法被广泛采用以达到储存温度；即非平衡(玻璃化冷冻)和平衡(缓慢冻结)。

对于非平衡冷却方法，生物材料(例如可以是细胞和/或组织样品)通常装载有非常高浓度(例如，以体积计通常为40-60％)的细胞膜渗透性冷冻保护剂(通常是小的有机分子，例如二甲基亚砜(DMSO)，乙二醇，甘油和丙二醇)，然后通过将生物材料直接浸入液氮或其他低温液体或混合物中以高冷却速率(例如10²至10⁴K/分钟)进行冷却，即通过玻璃化以在生物材料中实现无定形固态而不形成冰晶。非平衡冷却方法不仅由于高的冷冻保护剂浓度而引起严重的细胞渗透破坏和毒性，而且对于将冷冻保护剂装载到细胞和组织中以及从细胞和组织中去除来说是复杂且耗时的过程。生物材料的反玻璃化(devitrification)产生了另一个关键的技术问题。例如，如果将玻璃化的样品转移到没有低温(例如-80℃以上)的环境中进行储存，则当样品中的温度变得高于反玻璃化温度时，玻璃化的样品内部就会发生冰晶化，会引起样品严重的机械损坏。

对于传统的平衡或缓慢冻结方法，所涉及的程序通常包括在冷却之前向生物材料(例如细胞)中添加相对低浓度(例如，通常为10％或更少)的冷冻保护剂；在细胞悬浮液的凝固点或低于凝固点数度以下接种生物材料的一种或多种样品，并将细胞冷却至储存细胞的储存温度；加热细胞；从细胞中去除冷冻保护剂。减少冻结过程引起的细胞损伤对于提高低温保存后的细胞存活至关重要。在冻结期间，在外部(例如，组织或细胞的外部)低温保存介质中有冰形成，并且与细胞外冰晶相关的机械应力已经证明可引起细胞损伤和致死性组织机械损伤。在缓慢冻结期间，对分离的细胞的损伤归因于细胞尺度上的冰剪切力或压缩力，这在某种程度上对于许多细胞类型是可耐受的。然而，对于组织而言，与组织的直接接触以及不断增长的冰面在剪切力和压缩力的作用下都会造成宏观损伤，并在组织间隙中尤其是组织的微型结构中引入相对较大的冰晶，不仅造成细胞损失而且还会由于结构变形而丧失组织功能。

在本发明的装置之前，没有可用的装置或有效的物理方法来防止由缓慢冻结程序引起的组织机械损伤，并且玻璃化是用于组织低温保存的一般方法。

在生物细胞和组织的短期存储(通常少于一星期)的许多实际应用中，用没有任何冷冻保护剂的低温介质处理样本，并在例如2-8℃，低于室温，但高于低温介质的凝固点(约0℃)的温度下冷藏。将储存温度进一步降低至低于0℃的温度可以延长储存时间，但是在没有冷冻保护剂的情况下，低于低温介质的凝固点的不可避免的冰的形成，对细胞和组织造成致命的损伤。目前，不存在不使用冷冻保护剂来减轻由冰形成所产生的细胞损伤的已知装置或有效方法。该限制将低温方法的效率限制在短时间内。此外，这样的样本被储存的低温温度接近凝固点，并且在正常的存储条件下，机械冰箱的正常运行引起的温度波动可能导致由于意外的冰形成而意外破坏样本。因此，没有已知的装置或有效的方法可用于最小化在样本的低温保存期间由这种意外的冰形成所产生的损害。

发明内容

本概述列出了当前公开的主题的几个实施方式，并且在许多情况下列出了这些实施方式的变化和置换。本概述仅是众多和可变实施方式的示例。提及的给定实施方式的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施方式通常可以具有或不具有所提到的特征。同样，那些特征可以应用于当前公开的主题的其他实施方式，而不管是否在本概述中列出。为避免过多的重复，本概述未列出或建议此类特征的所有可能的组合。

根据第一方面，提供了一种用于在低温保存期间保护样本免受机械损伤的低温保护装置，所述装置包括：形成内腔的壳体，其中，所述壳体配置为在所述内腔内容纳可冻结介质；其中，壳体包括半透膜，所述膜对于冰晶不可渗透，所述冰晶显著大于膜的平均孔径，以防止任何此类冰晶从壳体外部的区域进入内腔，使得在壳体内的介质中形成的冰晶具有小于在壳体外部的可冻结介质中形成的冰晶的晶体尺寸。

在所述装置的一些实施方式中，第一开口形成在所述壳体的第一纵向端，并且所述膜设置在形成在所述壳体中的第二开口上方。

在所述装置的一些实施方式中，所述壳体配置为通过所述第一开口将样本容纳在所述内腔内。

在所述装置的一些实施方式中，所述壳体是浮力支撑件，所述膜附接到浮力支撑件上以限定所述内腔，使得所述膜可浸入所述壳体外部的可冻结介质内，其中是浮力支撑件的至少一部分没有浸入壳体外部的可冻结介质中。

在一些实施方式中，所述样本包括在天然或常规培养基和/或溶液中的细胞悬浮液或生物组织，视情况而定，其自身可以不含任何冷冻保护剂。已经发现，在没有这种冷冻保护剂的情况下具有最小或可接受的细胞和/或组织损失，在低温下短期储存可以是有效的。

在所述装置的一些实施方式中，所述膜是多孔固体层。无法加载全部结果

重试

正在重试…

在所述装置的一些实施方式中，所述多孔固体层允许水和液态材料渗透通过其中，但是阻止大于所述膜的孔径的冰晶通过所述膜，当装置暴露于低温下时，冰晶是通过外壳外部的低温保存的固化而形成的。

在所述装置的一些实施方式中，所述多孔固体层包括具有直径在约0.1纳米(nm)至约1毫米(mm)，约0.5nm至约0.1mm，约1nm至约100nm或约2nm至约10nm范围内的孔。

在所述装置的一些实施方式中，所述膜包含天然或合成的聚合物。

在所述装置的一些实施方式中，所述膜包含合成的聚合物，其包括聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚砜、乙烯醇共聚物或其任何组合或化学衍生物。

在所述装置的一些实施方式中，所述膜包含纤维素材料。

在所述装置的一些实施方式中，所述纤维素材料包括再生纤维素，变性纤维素，二乙酸纤维素，三乙酸纤维素或其任何组合或化学衍生物。

在所述装置的一些实施方式中，所述膜是由变性纤维素制成的透析膜。

在所述装置的一些实施方式中，所述膜对于水、有机和/或无机液体溶剂或其任何组合是可渗透的。

在所述装置的一些实施方式中，所述膜是可分离的膜，其配置为选择性地安装以覆盖第二开口。

在所述装置的一些实施方式中，所述介质包括冷冻保护介质，所述冷冻保护介质具有作为添加剂悬浮在其中的冷冻保护材料。

在所述装置的一些实施方式中，所述壳体包括凹槽，其中膜被安装在壳体中以覆盖第二开口，所述装置包括支撑环，支撑环配置为当支撑环附接到壳体时，选择性地附接到壳体以将膜固定在第二开口上。

在所述装置的一些实施方式中，所述支撑环包括外部支撑构件，所述外部支撑构件具有穿过其形成的孔，使得当支撑环安装到所述壳体上时，所述膜通过形成于支撑环中的孔暴露于所述壳体外部的介质。

在所述装置的一些实施方式中，所述壳体包括至少一个锁定凸片(tab)，所述锁定凸片与所述支撑环锁定地接合以将所述支撑环紧固到所述壳体。

在所述装置的一些实施方式中，所述第一开口配置为使得样品可传递到内腔中。

在一些实施方式中，所述装置包括盖，其配置为固定至壳体以关闭第一开口。

在所述装置的一些实施方式中，所述盖包括形成在所述盖的周边的至少一个通风口，以在所述盖固定到所述壳体时允许内腔中的介质流过至少一个通风口。

在所述装置的一些实施方式中，所述盖包括具有凸出形状的内表面，使得盖在所述盖的中心处比所述盖的周边更深地伸入内腔。

在所述装置的一些实施方式中，所述壳体具有带有圆形横截面的大体上圆柱形的形状。

在所述装置的一些实施方式中，所述可冻结介质在25℃时为液体，在0℃以下为固体。

另一方面，提供了一种用于在低温下储存样本的系统，所述系统包括：至少一个如本文公开的任何实施方式中所述的低温保护储存装置；以及外部容器，其配置为容纳一个或多个低温保护储存装置；以及可冻结介质，用于在壳体的内腔中以及在壳体外部的外部容器中。

在所述系统的一些实施方式中，所述可冻结介质包括亲水且无毒的大分子以及水性液体。在所述系统的一些这样的实施方式中，可冻结介质包括冷冻保护剂。

在所述系统的一些实施方式中，所述冷冻保护剂包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖和其他多糖、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇以及其他聚合物、其他非渗透性冷冻保护剂，包括，但不限于硫酸软骨素和乳糖酸或其任何组合。

在所述系统的一些实施方式中，所述亲水且无毒的大分子是聚合物。

在所述系统的一些实施方式中，所述聚合物形成三维结构，当溶解在水性液体中时，所述三维结构的形状基本上为球形。

在所述系统的一些实施方式中，所述水性液体包含细胞培养基、营养培养基、盐水或其任何组合。

在所述系统的一些实施方式中，所述水性液体包含血清、胎牛血清(FBS)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，冲洗-保持培养基(flushing-holding medium)(FHM)，磷酸盐缓冲血清(PBS)，达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)，洛斯维·帕克纪念研究所培养基(RPMI)，BF5培养基，EX-CELL培养基，溶菌肉汤(LB)培养基，CaCl₂水溶液，NaCl水溶液，KCl水溶液或其任何组合。

在所述系统的一些实施方式中，所述介质中聚合物的浓度大于约5％(w/v)，大于约10％(w/v)，大于约20％(w/v)或大于约50％(w/v)。

在所述系统的一些实施方式中，所述介质中的冷冻保护剂的浓度等于或大于介质中聚合物浓度的约20％，等于或大于约50％，等于或大于约75％或等于或大于约100％。

在所述系统的一些实施方式中，所述介质包含约10％(w/v)的聚蔗糖(Ficoll)，约5％(w/v)的DMSO，约2％(w/v)的硫酸软骨素和约1％(w/v)葡聚糖40。

在所述系统的一些实施方式中，所述聚蔗糖是通过蔗糖和表氯醇的共聚形成的多糖。

在所述系统的一些实施方式中，所述聚合物选自由亲水性多糖，聚合的环糊精或糖，球状蛋白质或球形蛋白，通过连接球状蛋白质的寡糖链形成的球状糖蛋白，球状蛋白质的其他衍生物和其组合组成的组。

在所述系统的一些实施方式中，所述聚合物是亲水性多糖。

在所述系统的一些实施方式中，所述多糖通过蔗糖和表氯醇的共聚形成。

在所述系统的一些实施方式中，所述介质填充外部容器和至少一个低温保护储存装置之间的空间的一部分或全部，提供足够量的所述介质以至少覆盖朝向远离内腔的膜的表面。

在所述系统的一些实施方式中，在低温保护储存装置外部的介质的组成与在低温保护储存装置的内腔中的介质的组成不同或相同。

另一方面，提供了一种在低温冷冻期间保护样本免受损伤的方法，所述方法包括：提供具有内腔的壳体，其中，所述壳体包括半透膜；在所述壳体的所述内腔中提供样本和第一可冻结介质；将所述壳体放置在所述壳体外部的第二可冻结介质内，使得所述壳体被部分或全部浸没在所述第二可冻结介质中，其中所述第二可冻结介质与所述第一可冻结介质相同或不同；将第二可冻结介质暴露于低温下，使得具有第一尺寸的冰晶在第二可冻结介质中在壳体的外部形成；其中第二可冻结介质中第一尺寸的冰晶的生长被所述膜阻止，使得只有具有小于所述膜的孔径的第二尺寸的冰晶可以穿过所述膜并引起在壳体的内腔内的第一可冻结介质中形成冰，从而在壳体内产生的冰晶具有小于在壳体的外部的第二可冻结介质中形成的冰晶的尺寸。

在所述方法的一些实施方式中，第一开口形成在壳体的第一纵向端处，并且所述膜设置在形成在壳体中的第二开口上方。

在所述方法的一些实施方式中，所述壳体配置为通过所述第一开口将样本容纳在所述内腔内。

在所述方法的一些实施方式中，所述壳体是浮力支撑件，所述膜附接到浮力支撑件上以限定所述内腔，使得所述膜可浸入所述壳体外部的可冻结介质内，其中至少一部分浮力支撑件不能浸入所述壳体外部的可冻结介质中。

在所述方法的一些实施方式中，所述第一和/或第二可冻结介质包含亲水且无毒的大分子以及水性液体。

在所述方法的一些实施方式中，所述第一和/或第二可冻结介质还包括冷冻保护剂；并且，随着第一可冻结介质的温度降低，腔室内的第一可冻结介质中的水透过膜渗透，从而在低温冷冻期间增加了第一可冻结介质内的冷冻保护剂的浓度。

在所述方法的一些实施方式中，所述水通过膜从第一可冻结介质渗透到第二可冻结介质增加了第一可冻结介质中的溶质浓度和/或第一可冻结介质的冷冻温度降低，以防止第一种可冻结介质过冷。

在所述方法的一些实施方式中，与在第一可冻结介质中形成的冰晶相比，在第二可冻结介质中形成的冰晶更大并且在更高的温度下形成；所述膜包括多孔材料，所述多孔材料的孔径小于在第二可冻结介质中形成的冰晶的直径；和/或相对于将样本存储在没有允许水渗透通过的膜的壳体中，减少了对样本的损坏。

在所述方法的一些实施方式中，将所述膜定位在第二开口上方以允许通过其流体连通。

在一些实施方式中，所述方法包括将支撑环附接到壳体，使得所述膜在第二开口上方固定到壳体，所述支撑环具有形成在其中的一个或多个开口，以允许通过第一和第二可冻结介质之间的所述膜之间流体连通。

在所述方法的一些实施方式中，所述壳体是低温保护储存装置的一部分。

在一些实施方式中，所述方法包括在将第二可冻结介质的温度暴露于低温温度之前，提供包含第二可冻结介质的外部容器，其中将第二可冻结介质的温度暴露于低温温度包括将外部容器处于具有低温的环境中，并且其中将所述壳体放置在外部容器中，以使所述壳体部分或全部浸入第二可冻结介质中。

在所述方法的一些实施方式中，所述外部容器包括冷冻瓶。

在所述方法的一些实施方式中，通过第所述一开口在所述内腔中提供所述样品和所述第一可冻结介质。

在一些实施方式中，所述方法包括将盖固定在所述第一开口上方。

在所述方法的一些实施方式中，当将所述盖固定在所述第一开口上方时，内腔中的任何多余的第一可冷结流体都从所述内腔中移出，使得当所述盖固定在所述第一开口上时，所述内腔基本上没有空气。

在所述方法的一些实施方式中，所述样本包括悬浮在第一可冻结介质中的细胞或至少一个组织样品。

在所述方法的一些实施方式中，所述组织样品包括天然生物组织、人造组织或其组合。

在所述方法的一些实施方式中，所述天然生物组织包括人多细胞组织、动物多细胞组织、植物多细胞组织或微生物多细胞组织或其组合。

在所述方法的一些实施方式中，所述人造组织包括人造的人多细胞组织、动物多细胞组织、植物多细胞组织或微生物多细胞组织或其组合。

在所述方法的一些实施方式中，所述组织样品包括角膜组织或视网膜组织。

在所述方法的一些实施方式中，细胞包括一种或多种真核细胞，一种或多种原核细胞或其组合。

在所述方法的一些实施方式中，所述一种或多种真核细胞包括至少一种哺乳动物细胞。

在所述方法的一些实施方式中，所述至少一种哺乳动物细胞包括一种或多种鼠类细胞、一种或多种猪细胞、一种或多种人类细胞或其组合。

在所述方法的一些实施方式中，所述至少一种哺乳动物细胞包括一种或多种干细胞、一种或多种体细胞、一种或多种生殖细胞或其组合。

在所述方法的一些实施方式中，所述一种或多种原核细胞包括至少一种细菌细胞、至少一种古细菌细胞或其组合。

在所述方法的一些实施方式中，所述低温温度为约-273℃至约0℃，包括端值。

在所述方法的一些实施方式中，所述低温温度为约-196℃至约-20℃，包括端值。

在所述方法的一些实施方式中，所述低温温度为约-100℃至约-40℃，包括端值。

在所述方法的一些实施方式中，所述低温温度为约-85℃至约-65℃，包括端值。

本公开内容涉及通过使用半透膜保护样本免于直接与细胞外冰直接接触来提高细胞或组织低温保存效率的装置、系统和方法。该装置还具有一些特殊特征，可促进其用于组织低温保存的临床应用，包括可选的实现一次性和一次性使用方式设计的结构设计以及提高组织负荷和装置的空气密封的机械设计。

冻结温度在本文中定义为在-273℃至0℃范围内的温度。

在一些方面，密封的壳体包含在可冷冻的介质中的细胞或组织悬浮液，所述可冷冻的介质可以是低温保存介质。选择壳体的尺寸以适合可冻结介质的体积，其中壳体的一个或多个壁或侧面或盖是由这样的膜制成或以其他方式构造成固定在该膜上的，该膜在冻结温度下是半渗透的。

在一些方面，提供一种外部容器以容纳一个或多个这样的壳体，其中，这些壳体浸入所述外部容器中的另外一种可冻结介质(也可以是与所述壳体中可冻结介质相同或不同的冷冻保护介质)。

在一些方面，所述膜将所述壳体内部的可冻结介质与所述壳体外部的可冻结介质(例如，在外部容器中)分离。

在一些方面，在样本的低温冷冻期间，在壳体外部的可冻结介质内(例如，在容器内)的冰形成逐渐增加了位于所述腔室外部的溶质的浓度。

在一些方面，在样本的低温冷冻期间，当所述壳体外部的可冻结介质冻结时，所述壳体内部的可冻结介质通过半渗透膜将水损失到所述壳体外部的可冻结介质，从而保持跨膜的化学势之间的平衡。

在一些方面，在样本的低温冷冻期间，所述壳体内部的可冻结介质保持不含冰晶，直到所述壳体内部的可冻结介质的温度足够低以允许位于所述壳体外部(例如在所述壳体外部的膜的表面上)的冰晶穿过膜并在壳体内部产生冰核并在所述壳体内部形成冰晶，在所述壳体内形成的冰晶的尺寸比位于腔室外部的冰晶的尺寸小得多。由于在低温冷冻过程中形成了冰晶，从而最大程度地减少对壳体内部样本(例如细胞或组织)的机械损伤。

在某些方面，允许位于所述壳体外部的冰晶通过膜的温度低于可冻结介质的凝固点，但高于低温储存温度(例如，在低温冷冻过程中将可冻结介质暴露的环境温度)。

在一些方面，在组装之前，所述盖和/或所述壳体的一个所述壁与所述壳体分离，以允许将所述样本装载到所述壳体中。在一些这样的方面，所述盖和/或所述壳体的一个所述壁具有凸面，以在样本的加载期间或在系统组装期间排斥或推开所述壳体内的过量的可冻结介质。在一些这样的方面，所述盖和/或所述壳体的一个所述壁具有在其中提供和/或形成的排气通道，以释放过量的可冻结介质，以防止在壳体中建立压力，该压力会损坏所述膜并导致所述壳体泄漏。在一些这样的方面中，通风口为排气通道的形式，在组装之后，所述排气通道被所述壳体的壁覆盖，以确保壳体的空气密封并防止气泡的形成。

在某些方面，在壳体的膜下方，附接有十字形的支撑环。在一些这样的方面，可以以最小的机械力容易地将支撑环从壳体拆卸。在一些这样的方面，支撑环通过要求最终用户在经历解冻过程之后移除支撑环以移除所述膜用于从所述壳体内部取回样本而提供了一种一次性使用的方式。在一些这样的方面，在将所述壳体与所述盖、所述膜和所述支撑环中的一个或多个组装之后，如果不以导致壳体无法密封的方式损坏壳体，则无法打开壳体。

在一些其他方面，本文公开的装置和/或系统或其一个或多个部分是可重复使用的。

附图说明

图1是用于低温冷冻和储存样本(例如生物样品)的装置的示例性实施方式的截面图。

图2是用于低温冷冻和储存样本(例如生物样品)的装置的立体图。

图3A是图2所示装置的截面图。

图3B是图2所示装置的分解图。

图4是装置内部和外部以及邻近图2的所述膜一段时间内的温度测量的曲线图，表明在低温冷冻过程中装置内形成的冰晶尺寸的减小。

图5A-5C示出了在低温冷冻过程中的几个阶段，图2的装置内冰晶形成的进程。

图6A-6D示出了图2的装置的截面图，装置中放置了一个样本，示出了在低温冷冻过程中几个阶段的冰晶形成的进程。

图6E-6H示出了图2的装置的截面图，装置中放置了一个样本，但省略了膜，示出了在低温冷冻过程中几个阶段的冰晶形成进程。

图7是比较在图2所示装置中但是利用具有不同分子量截留值的膜低温冷冻后被解冻的人角膜的内皮细胞活力的图示。

图8示出了在如图2所示的具有图7中不同分子量截留值的所述膜的装置中进行低温冷冻之前和之后的人角膜内皮细胞的图像。

图9是包括位于外部容器中的图2的装置的低温储存系统的顶部透视图。

图10是图9的系统的截面图。

图11A和11B是来自自动细胞计数器的示意图，示出了图9的装置低温冷冻后解冻后的内部(图11A)和外部(图11B)的液体的活力。

图12是具有一个组织样本放置在装置中的图9的系统的顶部透视图。

图13是图12的系统的截面图。

图14是已被低温冷冻并随后解冻的图12中所示的有机样本的示例性立体显微镜图。

图15是与图12所示的基本相似的有机样本的示例性立体显微镜图，但是该有机样本根据传统的低温技术进行低温冷冻。

具体实施方式

现在将在下文中更全面地描述本公开的主题，其中描述了本公开的主题的部分但不是全部实施方式。实际上，所公开的主题可以以许多不同的形式来体现，并且不应被解释为限于在此阐述的实施方式。相反，提供这些实施方式是为了使本公开满足可应用的法律要求。

本文所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，并且不旨在限制当前公开的主题。

虽然以下术语被本领域的普通技术人员很好地理解，但是提出以下定义以促进对本公开的主题的解释。

除非下文另有定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。本文所用技术的引用旨在指代本领域中通常理解的技术，包括对本领域技术人员而言显而易见的那些技术的变型或等效技术的替代。尽管相信以下术语是本领域普通技术人员充分理解的，但是提出以下定义以促进对本公开的主题的解释。

在描述本公开的主题时，将理解，公开了许多技术和步骤。这些中的每一个都有各自的益处，并且每个也可以与一个或多个，或者在某些情况下，与所有其他公开的技术结合使用。

因此，为了清楚起见，该描述将避免以不必要的方式重复各个步骤的每个可能的组合。然而，应当在理解这样的组合完全在本公开和权利要求的范围之内的情况下阅读说明书和权利要求。

本文中引用的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用其全部内容整体并入本文，以用于与其中存在引用的句子和/或段落有关的教导。

遵循长期的专利法惯例，当在包括权利要求书的本申请中使用时，术语“一(a)”，“一(an)”和“该(the)”是指“一个或多个”。因此，例如，对“一个细胞”的引用包括多个这样的细胞，依此类推。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、反应条件等的所有数字均应理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在本说明书和所附权利要求书中阐述的数字参数是近似值，其可以根据本公开的主题寻求获得的期望特性而变化。

如本文所用，术语“约”在指数值或组合物的量，质量，重量，温度，时间，体积，浓度，百分比等时，意指包含相对于指定量的变化，在一些实施方式中为±20％，在一些实施方式中为±10％，在一些实施方式中为±5％，在一些实施方式中为±1％，在一些实施例方式为±0.5％，在一些实施方式中为±0.1％，因为这样的变化是适合于执行公开的方法或采用公开的组合物。

与“包括(including)”，“包含(contaning)”或“特征在于(characterized by)”同义的术语“包括(comprising)”是包含性的或开放式的，并且不排除其他未叙述的元素或方法步骤。“包括”是在权利要求语言中使用的技术术语，这意味着指定的元素是必不可少的，但是可以添加其他元素，并且仍然构成权利要求范围内的结构成分(construct)。

如本文所用，短语“由...组成”不包括权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。当在权利要求的正文中出现短语“由...组成”时，而不是紧跟在前序之后时，它仅限制了该从句中列出的元素；整体上其他元素也不排除在权利要求范围内。

如本文中所使用的，短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤，以及不实质上影响所要求保护的主题的基本和新颖特征的那些。

关于术语“包括”，“由...组成”和“基本上由...组成”，在本文中使用这三个术语之一的情况下，本公开和要求保护的主题可以包括对其他两个术语中一个术语的使用。

如本文所用，术语“和/或”当在实体列表的上下文中使用时，是指实体单独或组合存在。因此，例如，短语“A，B，C和/或D”分别包括A，B，C和D，但是还包括A，B，C和D的任何和所有组合和子组合。

如本文所用，术语“基本上”是指数值、活性或组合物的量，质量，重量，温度，时间，体积，浓度，百分比等，意指包含相对于指定量的变化，在一些实施方式中为±40％，在一些实施方式中为±30％，在一些实施方式中为±20％，在一些实施方式中为±10％，在一些实施方式中为±5％，在一些实施方式中为±1％，在一些实施方式中为±0.5％，并且在一些实施方式中为±0.1％，因为这样的变化适合于执行公开的方法或采用公开的设备和装置。例如，当介质或环境缺氧至少为60％，或至少为75％，或至少为80％，或至少为85％，或至少为90％，或至少为95％，在某些情况下，至少为99％时，则为“基本上缺氧”。

如本文所用，术语“基础培养基”是指可以添加其他成分的最低限度的基本类型的培养基，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基、Ham's F12、伊格尔氏培养基、RPMI、AR8等。该术语不排除已制备或打算用于特定用途的培养基，但其经修饰可用于其他细胞类型等。

如本文所用，“化合物”是指通常被认为是药、治疗剂、药物、小分子或与其相同使用的候选物的任何类型的物质或试剂，以及以上的组合和混合物。

“检测”一词及其语法变体的使用是指对种类(species)的测定而没有量化，而“确定”或“测量”及其语法变体的含义是指对“种类”具有量化的测量。术语“检测”和“识别”在本文中可互换使用。

术语“成分”是指可以在细胞培养基中用于维持或促进细胞的增殖、存活或分化的无论是化学来源还是生物学来源的任何化合物。术语“组分”、“营养物”、“补充物”和“成分”可以互换使用，并且均表示这些化合物。在细胞培养基中使用的典型的非限制性成分包括氨基酸、盐、金属、糖、脂质、核酸、激素、维生素、脂肪酸、蛋白质等。根据特定需要，本领域技术人员可以选择促进或维持离体细胞培养的其他成分。

如本文所用，基于术语“抑制”使用的上下文，术语“抑制”是指化合物、试剂或方法降低或阻碍所描述的功能、水平、活性、速率等的能力。优选地，抑制为被抑制至少10％，更优选地至少25％，甚至更优选地至少50％，最优选地，功能被抑制了至少75％。术语“抑制”与“减少”和“阻碍”可互换使用。

如本文所用，术语“材料”是指合成的和天然的材料，例如基质组分。如本文所用，术语“材料和化合物”尤其是指材料、化合物、细胞、肽、核酸、药物、基质组分和显像剂。

如本文所使用的，术语“调节”是指改变活性、功能或过程的水平。术语“调节”包含抑制和刺激活性、功能或过程。术语“调节”(modulate)在本文中与术语“调节”(regulate)互换使用。

如本文所用，术语“预防”是指阻止某些事情发生，或针对可能发生的事情采取预先措施。例如，在本公开的主题的上下文中，“预防”通常是指为减少低温保存期间冰的形成和/或组织/细胞损伤的机会而采取的措施。

术语“调节”(regulate)是指刺激或抑制感兴趣的功能或活性。

如本文所用，“样品”是指来自受试者的生物样品，包括但不限于正常组织样品，患病组织样品，活检组织，血液，唾液，粪便，精液，眼泪和尿液。样品也可以是从受试者获得的任何其他材料来源，其包含感兴趣的细胞，组织或液体。

如本文所用，术语“刺激”是指诱导或增加活性或功能水平，使得其相对于对照值更高。刺激可以通过直接或间接机制进行。一方面，与对照值相比，活性或功能被刺激至少10％，更优选至少25％，甚至更优选至少50％。如本文所用，术语“刺激剂”是指任何组合物、化合物或试剂，其应用导致刺激感兴趣的过程或功能，包括但不限于伤口愈合、血管生成、骨愈合、成骨细胞的产生和功能、以及破骨细胞的产生、分化和活性。

“组织”是指(1)一组联合起来执行特定功能的相似细胞；(2)由具有相似结构和功能的细胞聚集体组成的生物体的一部分；和/或(3)一组类似地以其结构和功能为特征的细胞，例如肌肉或神经组织。

如本文其他地方所述，在低温保存期间，当组织样品的外表面随着冰锋面(icefront)的生长而被冰接触以包裹组织时，在生长的冰锋面上的尖锐冰树枝晶会机械损伤组织表面上的细胞。因此，在其表面上具有功能性细胞层的组织(例如，具有内皮细胞层的角膜)容易受到这种类型的机械损伤。因此，根据本文公开的主题，在这种低温保存装置和/或系统中提供半透膜是有利的，以“过滤”大的冰树枝晶并仅允许具有小或细的晶体结构(例如，没有形成现有技术的低温保存装置、系统和方法中已知的大的冰树枝晶)的冰晶通过所述膜生长。通过包含这种半透膜，可以防止如现有技术所知的由于组织样品的外细胞层之间与冰面上存在的尖锐的冰树枝晶直接接触而产生的机械损伤。

根据本文公开的主题，在低温保存冷冻过程中，半渗透膜(例如，细胞质膜)可以用作冰生长屏障。例如，细胞膜上通道的孔径可以在10^-10m的数量级，这种尺寸的孔仅允许冰晶在大约-20℃的过冷条件下通过它们生长。由于细胞内溶液(例如低温保存介质)的这种过冷，细胞内溶液的溶质浓度保持低于细胞外溶液的溶质浓度，因此细胞内水和细胞外水的化学势之间的差异驱动细胞内的水透过膜渗透并混入细胞外溶液中。该过程增加了细胞内溶质的浓度，并进一步降低了细胞内溶液的凝固点，更重要的是，防止了细胞内细胞器与细胞外冰之间的直接接触。因此，当选择适当的冷却速度时，细胞内溶液保持无冰并且玻璃化，或在低温保存过程完成时形成非常小的冰晶(例如，具有1-100纳米(nm)之间的结晶尺寸)。这种用于低温冷冻保存的细胞膜的使用通过使大冰晶与生物材料之间的直接接触最小化而使经受低温保存的生物材料的机械损伤最小化。对于分离的细胞，除细胞膜外，此类膜的另一层将进一步保护细胞表面或细胞体上的细胞微型结构，尤其是对于精子尾和神经元树突。

这样，本前公开的主题涉及一种装置，该装置在缓慢冻结过程中从冰的形成中分离出包含生物材料(例如，其低温保存介质中的组织或细胞)的样本，以从大冰晶形成中最小化低温损伤效应。这种装置的示例性实施方式总体上以100表示，在图2至3B中示出。该装置使用半渗透膜140来防止样本与生长冰锋面的直接接触，并阻止相对较大的冰晶的生长，否则该冰晶会通过膜140所占据的区域生长直至温度足够低。在低温冷冻过程中，冰的形成主要发生在装置100的壳体110的外部。冰晶的形成增加了装置100的壳体110外部的低温介质中的溶质浓度。跨膜140(例如，在壳体100的内部和外部的低温介质之间)的化学势之间的不平衡，使壳体110内部的水穿过和/或通过膜140渗透到壳体110的外部。水穿过膜140的渗透还防止了容纳含有样本的装置的外部隔室的过冷(例如，参见图9、10、12和13)，并且如果没有这种防止，过冷过程可能导致瞬间直接在样品周围或内部形成大冰晶。水穿过膜140的渗透还防止了尖锐的冰晶(例如树枝晶)的形成，其直接接触并破坏了这种生物材料样本(例如，角膜表面上的角膜内皮)的外表面上的功能性细胞。

如在本文其他地方呈现的各种实施例中更详细地描述的，装置100在低温冷冻过程期间有效地防止大冰晶通过膜140的生长，从而有效地将装置100内的样本与常规低温冷冻过程中形成的生长的冰锋面分离。装置100通过减少在样本区域中通过膜140生长的大冰晶的形成，显著提高了组织低温保存效率。在某些实施方式中，膜140是软的半透膜。在一些实施方式中，膜140的表面积与被低温处理的样本的表面积基本上相同或更大。在一些实施方式中，膜140的表面积基本上等于或大于要低温保护的样本的部分的表面积，例如组织的有价值区域，可以是例如角膜。术语“半渗透性”是指膜140对水可渗透但对盐、离子、任何大的有机分子等而言不可渗透。在一些实施方式中，膜对于小有机分子可渗透或不可渗透(例如，二甲基亚砜或DMSO和乙二醇)。在一些实施方式中，膜140包括合成的聚合物，该合成的聚合物包括聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚砜、乙烯醇共聚物或其任何组合或化学衍生物。在一些实施方式中，膜140是纤维素材料，其可以包括再生纤维、变性纤维素、二乙酸纤维素、三乙酸纤维素或其任何组合或化学衍生物。在一些实施方式中，装置100显著提高了对于包括例如角膜组织的样本的低温保存效率。

根据图1所示的一个实施方式，所述装置包括如本文其他地方所述的半透膜140，其充当位于膜140内和膜140外部的流体310之间的冰屏障。将样本10放置在由膜140形成的腔室内，然后将其至少部分浸入可冻结介质(例如，在低温或非低温冷冻温度下冻结的流体)的浴中。可冻结介质被冻结，并且只有足够小的冰晶(例如具有尺寸或直径等于或小于膜140的孔的尺寸或直径)可通过膜140冻结在样本表面附近，导致样本仅暴露于具有与膜140的孔的尺寸或直径基本类似(例如，在25％以内，在10％以内，在5％以内，在1％以内)的冰晶。将膜140附接到支撑组件上可能是有利的，例如，环形浮力组件，使得膜140可以呈所示形式。支撑组件可以采取任何形状，包括在三维上延伸，以在冻结和/或低温保存期间获得膜140的任何期望的形状。在一些实施方式中，膜140具有基本上平坦的底部部分。在一些实施方式中，膜140形成用于在冻结或低温保存期间保持样本10的袋或柔性容器。

装置100包括壳体110，壳体110限定内腔，样本被装载在所述内腔中以进行低温保存。装置100包括膜140，该膜位于壳体110的内腔的外部，但是在与内腔相邻并限定内腔的底表面的位置处固定至壳体110。膜140通过支撑环150固定到壳体110，支撑环150在膜140的相对侧附接(例如，通过(一个或多个)紧固件，过盈配合等)到壳体110，以将膜140固定到壳体110。支撑环150具有大致环形的形状，该大致环形的形状基本上类似于膜的形状。支撑环150和膜140可具有任何合适的形状，该形状将导致壳体110的内腔在其底表面处基本上密封。示出的支撑件具有两个“X”形的横梁(cross-member)，以用作膜140的垂直支撑件。可以考虑将任何数量的横梁用于支撑环150，并且在一些实施方式中，支撑环150可以完全没有横梁。装置100还包括盖120，其可以固定到壳体110的上表面。当膜140安装在壳体110的内腔的底表面并且盖120固定在壳体110的内腔的顶部时。装置被组装成使得壳体110、盖120和膜140形成基本上密封的腔室。在一些实施方式中，壳体和膜140可配置成使得膜140位于壳体110和/或盖120的一个侧壁中以在装置100的任何部分中限定半渗透边界。在一些实施方式中，装置100可具有设置在壳体110的底表面、壳体110的侧壁和/或盖120中的两个或更多个或全部中的膜140。这样，盖120和/或壳体110的侧壁或底部的部分可以由如本文关于膜140所公开的半透膜材料制成。在某些实施方式中，装置100的底部是用框架(例如，支撑环150)固定变性纤维素膜140的结构，所述框架结合到装置100或装置100的壳体110。

在一些实施方式中，盖120配置为当一个或多个样本被加载到装置100中时允许低温保存介质在壳体110内流动，并且通过密封填充有低温保存介质并包含样本的壳体110来释放在低温保存过程中装置100内产生的任何压力，以防止在装置100内形成气泡。在一些实施方式中，盖120的底表面具有凸出形状，所述凸出形状当放置在和/或固定到装置100的壳体110上时面对内腔。在一些这样的实施方式中，盖120具有形成在其中的至少一个排气通道。这种盖120的凸出形状将低温保存介质推向壳体的周边而不产生气泡，其中排气通道允许低温保存介质从壳体110内释放而不在其中形成压力。

在一些实施方式中，当盖120允许在低温保存过程中低温保存介质流入壳体时，支撑环150保护膜140免受机械损坏或变形。在一些实施方式中，支撑环150包括结合到装置100的底部的框架。在一些这样的实施方式中，支撑环150的框架为由薄横梁形成的十字形。在一些实施方式中，有利的是，支撑环150可以以最小的机械力从装置100移除，但是支撑环150仍然与壳体110连接，其足够牢固以防止由于在低温保存过程中支撑环150变得从壳体上脱落而使膜被损坏或变形。当需要使用装置100内的样本时，将装置100解冻，将支撑环150与壳体110分离，并且将膜破坏、变形、移除等，从而可以将样本直接使用。这样，在一些实施方式中，装置100不可重复用于样本的重复低温保存。

图9、10、12和13示出了总体上以101表示的低温保存系统的示例性实施方式，该低温保存系统包括总体上以300表示的外部容器，以保持低温保存装置100，如上文所描述并且在图2-3A中所示。在某些实施方式中，外部容器300是冷冻瓶或冷冻管，其提供足够的空间来将装置100和足够量的冷冻保护剂溶液保持在通常指定为310的空间中，该空间被定义为在装置100的外部但在外部容器300内。

通过以下非限制性实施例说明本发明的某些方面。

实施例1.该装置设计成在低温保存介质冻结期间阻止大冰晶的生长。

具有壳体110的装置100，壳体110具有在其中形成的大致圆柱形的内腔，装置外径为2.5厘米(cm)，高度为1.4cm。这种装置的示例性实施方式在图2-3B中示出。盖120基本上是盘形的，从顶部看时是圆形的，在其底表面上形成有高度约为2毫米(mm)的凸面，并围绕盖120的周边形成了四个小的排气通道。壳体100是大体上圆柱形的结构，其高度为1cm，外径为2.5cm和内径为2cm。支撑环150插入形成在壳体110的外表面中的凹槽内，并具有外径为2cm，内径为1.8cm的外环，具有厚度为1mm的薄的X形框架，框架的横梁具有宽度为1mm附接到环的内径向表面。支撑环150通过紧密地插入形成在壳体110的底部外表面中的互补形状的凹槽中而连接到壳体。术语互补形状是指该凹槽具有与支撑环150的外径基本相同的内径，如果不是稍微小一点的话，使得在该实施例中，壳体110的凹槽具有2cm的内径。壳体具有四个高度为3mm的支脚，使得壳体可以与支脚的接触表面间隔开以在壳体110下方形成空腔，该空腔具有由支脚的高度限定的高度。壳体110的支脚使装置能够在低温保存系统中的外腔(例如，15毫升(mL)冷冻瓶)中保持直立，如图9、10、12和13所示。可以通过任何适当的制造技术来形成装置100的部件，包括例如注射成型，增材制造等。

在该实施例中，装置100装有2mL包含10％DMSO和10％聚蔗糖作为聚合物冷冻保护剂的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)溶液，以防止在-80℃低温储存中重结晶，然后关闭盖120。关闭盖120的动作将多余的低温保存介质推出壳体110。将装置100放置在15mL的冷冻瓶中(例如300，图9、10、12和13)，该冷冻瓶也装有包含10％DMSO和10％聚蔗糖的10mL的DMEM溶液。尽管在通常使用期间不是必需的，但是为了说明装置100提供的优点，第一热电偶通过仅为该说明性实施例提供的孔位于壳体110的中心。第二热电偶位于壳体110的外部，紧邻膜。第二热电偶固定在支撑环150的一个横梁上。然后将冷冻瓶暴露于-80℃的环境温度环境中(例如，在低温冷冻机中)，然后以0.5℃/分钟的冷却速率缓慢冷却至-80℃

记录从两个热电偶读取的温度曲线，并在图4中示出。在冷却至-80℃期间，第二热电偶与冰锋面接触时，壳体110外部的温度变化显示出放热峰。从冰锋面释放的潜热将过冷的热电偶带回到溶液凝固点。相反，由于膜140在冻结过程中阻碍了冰的生长的事实，由位于壳体110内部的第一热电偶测量的温度变化显示出非常小的温度“凸点(bump)”作为放热峰。因此，膜140充当屏障，以防止大冰晶直接接触容纳在壳体110中的样本，从而导致显著较少的过冷，并且还防止了对容纳在壳体110中的任何样本的机械损伤。在低温保存期间对样本的机械损伤通常是由过冷过程期间形成的特征树枝晶冰晶产生的。这些结果与图5A-5C所示的结果非常吻合。图5A-5C中所示的结果是通过使用中子核磁共振(NMR)技术直接观察壳体110内部和外部的冰形成而获得的。

实施例2.NMR成像直接证明了通过本发明的装置的膜结构分离的冰的冰形成过程的差异。

在配备有一个内径为10cm的正交驱动鸟笼式射频线圈的7T/210mm水平孔的Varian Unity Inova MRI系统(Varian Inc.，美国加利福尼亚州帕洛阿尔托)上进行装置100内低温保存介质的冻结过程的NMR成像。如上文实施例1中所述加载的装置100被安装在高度为5cm，直径为5cm的小外部容器(例如，聚丙烯桶)中，该容器具有配置在其底部的粉碎的干冰(大约10毫升)。装置100的底部(例如，壳体110的底表面)直接接触干冰(1.01×10⁵Pa下表面为-78℃)，从而模拟了-80℃周围环境中的冷却过程。如图5A-5C所示，当冰锋面接近膜140时，冰锋面的前进(例如，冰晶的形成)被膜140阻止，而冰锋面继续沿着壳体110的侧壁生长。当膜140处的低温保存介质的温度足够低时(例如，大约为-40℃)，小冰晶能够通过膜140并在壳体110内形成弯曲但形状均匀的冰锋面，从膜140的内表面进入壳体110。这些位于壳体110内的小冰晶的生长速度比位于壳体110外部的较大冰晶的生长速度慢得多。图5A-5C的NMR图像示出的结果清楚地表明位于壳体110外部的冰的形态具有树枝晶结构，并且该形态与位于壳体110内部的冰锋面的形态形成了鲜明的对比。因此，其示出膜140充当冰筛，其阻止大冰晶进入壳体110，并且仅允许小冰晶在足够低的温度下通过膜140。

图5A示出了处于低温保存的初始阶段的装置100，其中冰锋面已经移动通过膜140并进入壳体110的内腔(通常标记为200)。内腔200内的小冰晶202被标记为在壳体110外部的区域210中形成的大冰晶212相比具有更细的交叉影线图案。内腔中的大部分低温保存介质是液体204，而在区域210外部的大部分低温保存介质是液体214。图5B示出了处于低温保存的中间阶段的装置100，其中冰锋面已经进一步移入内腔200和区域210中。因此，内腔200内的大部分低温保存介质现在处于小冰晶202的形式，其中的其余的低温保存介质为液体204的形式。类似地，区域210内的大部分低温保存介质为大冰晶212的形式，其中的其余的低温保存介质为液体214的形式。图5C示出了处于低温保存的晚期阶段的装置100，其中冰锋面已经移动通过整个内腔200，使得整个内腔200被小冰晶202占据。类似地，区域210内的大部分低温保存介质为与图5B中所示相比的大冰晶212的形式，区域210内其余的低温保存介质处于液态。

实施例3.NMR成像示出所述装置如何防止角膜内皮细胞与生长的尖锐的冰树枝晶直接接触

在实施例3中使用与实施例2中描述的相同的MRI系统和冷却程序。使用更高的分辨率来检测冰树枝晶细节。结果示于图6A-6H中。将两个样本10(例如，人角膜组织)安装在两个不同的装置100中，第一个这样的装置具有如图2-3A所示的在适当位置的半透膜140，并且第二个这样的装置100具有省略的膜140。填充装置100和保持每个装置100的相应的冷冻瓶(例如300，图9、10、12和13)的低温保存介质均是含有10％DMSO和10％聚蔗糖的DMEM溶液。

如图6A-6D所示，具有膜140的装置100有效地减慢了壳体110中冰的形成，并且还从接近角膜内皮层(面对膜140的组织的表面)的生长的冰锋面中去除了尖锐的冰树枝晶。

在图6A中，冰锋面在膜140处并且已经部分地通过膜140，使得壳体110内的几乎所有(例如90％或更多)的内腔200被液态低温保存介质204占据，而少数的内腔200被小冰晶202占据。在区域210内，壳体110外部的低温保存介质被部分冷冻，在壳体110的底部下方区域邻近膜140形成大冰晶212，区域210内其余的低温保存介质为液态。如图6A-6D中较大的阴影线所示，内腔200中的小冰晶202的尺寸小于(例如，至少一个数量级)区域210中的大冰晶212的尺寸。

在图6B中，冰锋面在内腔200内前进，使得小冰晶202部分地包裹样本10，内腔200内的大部分低温保存介质仍然是液态204。与图6A所示相比，区域210内壳体110外的低温保存介质被冷冻的程度更大，具有形成在壳体110的底部下方区域邻近膜140并围绕壳体110的侧面前进的大冰晶212，区域210内其余的低温保存介质处于液态。如本文其他地方所述，形成在内腔200内的小冰晶202保持比形成在壳体110外部的大冰晶212小。

在图6C中，冰锋面已经在内腔200内前进，使得小冰晶202几乎完全包裹样本10，而内腔200内的大部分低温保存介质现在呈小冰晶202的形式，且内腔内的少数低温保存介质处于液态形式204。区域210内的壳体110外部的低温保存介质比图6B所示进一步冷冻，具有形成在壳体110的底部下方区域邻近膜140并且围绕壳体110的侧面进一步前进的大冰晶212，区域210内其余的低温保存介质处于液态。如本文其他地方所述，形成在内腔200内的小冰晶202保持比形成在壳体110外部的大冰晶212小。

在图6D中，冰锋面已经在内腔200内前进，使得小冰晶202完全包裹样本10，而内腔200的整个体积现在呈小冰晶202的形式，使得内腔内没有低温保存介质或基本上没有低温保存介质为液态形式204。区域210内的壳体110外部的低温保存介质比图6C所示进一步冷冻，具有形成在壳体110的底部下方区域邻近膜140并且基本上围绕壳体110的所有侧面的大冰晶212，区域210内其余的低温保存介质处于液态状态。随着低温保存冷冻过程的进行，区域210内的所有低温保存介质将被冷冻以形成大的冰晶212，使得壳体110内的所有低温保存介质呈小冰晶202的形式并且壳体110外部所有的低温保存介质将是大冰晶202的形式。如本文其他地方所述，形成在内腔200内的小冰晶202保持比壳体110外部形成的大冰晶212小。

在图6E-6H中，其中在装置100中不存在这样的膜140，装置100不对角膜内皮提供任何保护功能，并且导致角膜内皮与尖锐的冰树枝晶直接接触。

在图6E中，冰锋面位于并已经部分地进入壳体110的内腔200中，位于或超出可以安装膜的狭缝(slot)，使得几乎所有(例如90％或更多)的壳体110内的内腔200被液态低温保存介质204占据，内腔200的一小部分被大冰晶212占据。区域210内的壳体110外部的低温保存介质被部分冷冻，具有形成在壳体110的底部下方区域邻近膜140的大冰晶212，以及区域210内其余的低温保存介质处于液态。如在图6E-6H中阴影线图案所示，对于大冰晶212，内腔200中的大冰晶212的尺寸与区域210中的大冰晶212的尺寸相同。

在图6F中，冰锋面在内腔200内前进，使得大冰晶212部分地包裹样本10，内腔200内的大部分低温保存介质保持液态204。区域210内，壳体110外部的低温保存介质比图6E所示进一步冷冻，具有形成在壳体110的底部下方区域邻近膜140并围绕壳体110的侧面前进的大冰晶212，区域210内其余的低温保存介质处于液态。如本文其他地方所述，形成在内腔200内的大冰晶212保持与在壳体110外部形成的大冰晶212基本相同的尺寸。

在图6G中，冰锋面已经在内腔200内前进，使得大冰晶212几乎完全包裹了样本10，而内腔200内的大部分低温保存介质现在以大冰晶212的形式存在，且内腔内的少数低温保存介质处于液态形式204。区域210内的壳体110外部的低温保存介质比图6F所示进一步冷冻，具有形成在壳体110的底部下方区域邻近膜140并且进一步围绕壳体110的侧面前进的大冰晶212，区域210内其余的低温保存介质处于液态。如本文其他地方所述，形成在内腔200内的大冰晶212保持与在壳体110外部形成的大冰晶212基本相同的尺寸。

在图6H中，冰锋面已在内腔200内前进，使得大冰晶212完全包裹样本10，内腔200的整个体积现在呈大冰晶212的形式，使得内腔内没有低温保存介质或基本上没有低温保存介质为液态形式204。在区域210内的壳体110外部的低温保存介质比图6G所示进一步冷冻，具有形成在壳体110的底部下方区域邻近膜140并且基本上围绕壳体110的所有侧面的大冰晶212，区域210内其余的低温保存介质处于液态。随着低温保存冻结过程的进行，区域210内的所有低温保存介质将被冷冻以形成大冰晶212，使得在壳体110内部和外部的所有低温保存介质都为大冰晶212的形式。如本文其他地方所述，在内腔200内形成的大冰晶212与在壳体110外部形成的大冰晶212保持基本相同的尺寸。

实施例4.通过使用用于-80℃低温保存的装置实现了角膜低温保存的改善

为了证明通过本文公开的工作机制将装置100用于低温保存包含生物材料的样本的效率，从而防止样本在冻结过程中与大冰晶的直接接触，基本上类似于图2-3B中所示的实施方式的装置100中保存了六个人角膜。为了该证明的目的，使用增材制造技术来构造装置100，但是在不脱离本文公开的主题的范围的情况下，可以设想任何类型的制造。两种不同类型的膜140安装在各个装置内。安装在装置100的第一子设备中的第一类型的膜是具有7500克/摩尔(g/mol)的分子量截留值(MWCO)的再生纤维素膜。安装在装置100的第二子设备中的第二类型的膜是具有10,000g/mol的MWCO的再生纤维素膜。这样的再生纤维素膜可以从制造商例如Millipore获得。在壳体110内部和周围添加的低温保存介质包括5％DMSO，10％聚蔗糖，1％葡聚糖40和2％硫酸软骨素。将每个角膜安装在其中一个装置的壳体110中，所述壳体中装有上文所述的低温保存介质，然后将其储存在-80℃的周围环境中(例如，在低温冷冻机中)。储存三个月后，通过将每个装置100直接插入37℃水浴中解冻每个装置100。解冻后内皮细胞计数和形态在图7和图8中示出。与传统的角膜低温保存方法相比，其在低温保存期间通常导致50％或更多的内皮细胞损失，第一或第二类型的膜140所达到的效率通过本公开所述的装置100用于例如用于人角膜组织的低温保存而显著提高(例如，达到约90％或更高)。

实施例5：所述装置在低温冻结程序中使用不含低温保护剂添加剂的培养基，减轻哺乳动物细胞的损伤

使用装置100对细胞外冰形态的改进可以用于在冻结期间使用不含任何细胞渗透性低温保护剂添加剂的培养基来减轻细胞损伤。为了证明即使不使用特定的低温保存介质的装置100的效率，也如本文其他地方所述，将小鼠间充质干细胞(mMSC)用作样本，并在-20℃中在装置100中在原始培养基中冷冻。具体而言，如本文其他地方所公开的，将来自细胞培养物样品的约200微升(μL)的mMSC悬浮液(通常标记为310)，其细胞密度约为10^5-6细胞/mL(由自动细胞计数器确定)，分布在包括膜140的装置100的底部，所述膜为7500MWCO薄的变性纤维素膜形式。然后，细胞悬液310在膜140的顶部上形成液体的薄层(例如，直径约2cm，厚度小于1mm)。来自相同的mMSC培养物样品中的另外3mL细胞悬浮液310加入到内径为2.5cm的15mL冷冻瓶，并在壳体110外部的冷冻瓶(例如300，图9、10、12和13)的底部形成大约0.8cm高的液体部分。然后，将保持细胞悬浮液310层的装置100安装到冷冻瓶中，如图9和10所示，壳体110的下部至少部分地浸入到容纳在冷冻瓶内但在壳体110外部的细胞悬液310中。

因此，培养基和装置内部和外部的细胞被膜140分离。然后将冷冻瓶置于-20℃实验室冷冻机中。90分钟后，所有液体组分(例如装置100内部和外部的细胞悬浮液310)被完全冷冻(例如已完全从液相转变为固相)。然后将装置100放入37℃水浴中解冻，并通过在标准自动细胞计数器中的标准台盼蓝拒染实验分析来自装置100内部和外部的解冻的细胞悬液310的mMSC的解冻后的活力。

使用来自五个不同细胞培养物样品的细胞悬浮液310将实验重复五次。通过自动细胞计数器确定装置100内悬浮液层的解冻后活力为45.8±6.0％，而装置100外部(例如，在冷冻瓶内)的细胞悬浮液的解冻后活力仅为16.8±8.1％。图11A和11B示出了由自动细胞计数器得到的在冻结过程中由装置100保护的细胞悬浮液310(图11A)和不受装置100保护(例如在装置外部)的细胞悬浮液310的典型结果。在图11A中，测得的总细胞浓度为2.46×10⁵细胞/mL，其中活细胞的浓度为1.29×10⁵细胞/mL(52％)，而死细胞的浓度为1.17×10⁵细胞/mL(48％)。相比之下，如图11B所示，测得的总细胞浓度为3.99×10⁵细胞/mL，其中活细胞的浓度为4.69×10⁴细胞/mL(12％)，而死细胞的浓度为3.52×10⁵细胞/mL(88％)。

如清楚显示的，被膜保护的细胞(例如，在装置100内)的解冻后活力比未保护的细胞几乎高200％。关于装置内部一半细胞在冻结过程中变得无法存活的原因的一种假设是，当不存在渗透性低温保护剂(例如DMSO)时，-20℃的冷冻机温度非常接近哺乳动物细胞的细胞内冰的成核温度。这种效应可能会导致作为对整个细胞群体是随机且渐进的过程的致命的细胞内冰形成。因此，即使不使用细胞渗透性低温保护剂，本发明的装置能够减轻由细胞外冰形成产生的细胞损伤；但是，这种功能不能完全保护细胞免受随机细胞内冰形成造成的损伤效应。

实施例6：该装置在冻结程序中不使用任何低温保护剂添加剂的情况下减轻了植物组织的损伤

在冻结期间不使用任何低温保护剂的情况下，使用装置100的细胞外冰形态的改进可以应用于减轻对包括植物组织的样本的损伤。为了证明该应用的效率，将其最上层为表皮细胞层的洋葱果肉(pulp)组织用作样本10。将样本切成1cm×1cm的大小，平均厚度约为3-4mm。将体积为1mL的PBS(标准盐溶液)溶液310样品添加到装置100的壳体110中，然后将一个样本10浸入PBS溶液中，使表皮细胞层面向变性纤维素膜140(在此具有7500MWCO)。然后将装置100放入包含3mL PBS溶液310的15mL冷冻瓶(例如300)中，如图12和13所示，使得壳体至少部分地浸入PBS溶液310中。因此，位于装置100内部和外部的PBS溶液310被膜140分离。然后将整个样品暴露于-80℃的周围环境(例如，在低温冷冻机中)。60分钟后，将样本10以及装置100内和冷冻瓶内的PBS溶液基本上或完全冷冻，然后浸入37℃水浴中解冻。解冻后的样本10在其表皮细胞层上被台盼蓝染色，并使用标准的立体显微镜分析细胞活力和组织结构。

为了进行比较，将相同大小的新鲜组织直接装载到15mL冷冻瓶中的3mL PBS溶液310中，而无需使用装置100，然后按照上述相同程序进行冷冻，解冻和分析。在立体显微镜的观察下，解冻后的和染色的样本10的典型形态如图14和15所示，为在冻结过程中受这种装置100保护的组织(图14)或不受这种装置100保护的组织(图11B)。如图14所示，对于由装置100保护的组织，样本10的组织结构被很好地保存，所有细胞形态类似于新鲜组织，基于其染色的细胞核外观，标本的大约一半细胞是不能存活的。相反，如图15所示，没有被这种装置100保护的样本10的组织结构变形，并且所有细胞在结构上都受到严重破坏。

因此，本文公开的装置100可用于保存植物组织结构并改善其细胞活力，而无需使用任何具有溶解有细胞渗透性低温保护剂添加剂的低温保存介质。在有或没有保护装置100的情况下将洋葱组织冷冻在-20℃时，没有细胞失去生存能力，并且由于细胞壁的保护作用而没有破坏组织结构，这在结构上类似于装置100使用的变性纤维素膜140。因此可以得出结论，本发明的装置在冻结过程中对温度低于-20℃的温度提供了比类似植物组织的细胞壁所提供的保护更好的保护。因此，该结果是一个还证明了，与由植物组织的细胞壁(其主要成分之一是纤维素)自然形成的某种相似的保护机制相比，本公开的装置100在细胞保护方面产生了更高的效率的实施例。

将理解的是，在不脱离本公开主题的范围的情况下，可以改变本公开主题的各种细节。此外，前述描述仅出于说明的目的，而非出于限制的目的。

Claims

1.一种用于在低温保存期间保护样本免受机械损伤的低温保护装置，所述装置包括：

形成内腔的壳体，其中所述壳体配置为在所述内腔内容纳可冻结介质，其中所述壳体包括半透膜，所述膜对于显著大于所述膜平均孔径的冰晶不可渗透，以防止任何此类冰晶从壳体外部的区域进入内腔，使得与在所述壳体外部的可冻结介质中形成的冰晶相比，在所述壳体内的所述介质中形成的冰晶具有较小的晶体尺寸。

2.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，其中，在所述壳体的第一纵向端处形成第一开口，并且所述膜设置在形成在所述壳体中的第二开口上方。

3.根据权利要求2所述的低温保护储存装置，其中，所述壳体配置为通过所述第一开口将所述样本容纳在内腔内。

4.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，其中，所述壳体是浮力支撑件，所述膜附接到所述浮力支撑件上以限定所述内腔，使得所述膜可浸入所述壳体外部的所述可冻结介质内，并且至少一部分浮力支撑件不会浸入所述壳体外部的所述可冻结介质中。

5.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，其中，所述壳体基本上完全由所述膜形成。

6.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，其中，所述膜是多孔固体层。

7.根据权利要求6所述的低温保护存储装置，其中，所述多孔固体层允许水和液态材料渗透通过，但是阻止大于所述膜的孔径的冰晶通过所述膜，所述冰晶是当所述装置暴露于低温温度下时，通过所述壳体外部低温保存的固化而形成。

8.根据权利要求6所述的低温保护储存装置，其中，所述多孔固体层包括孔，所述孔的孔径范围为约0.1纳米（nm）至约1毫米（mm），约0.5nm至约0.1mm，约1nm至约100nm，或约2nm至约10nm。

9.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，其中，所述膜包括天然或合成的聚合物。

10.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，其中，所述膜包括合成的聚合物，所述合成的聚合物包括聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚砜、乙烯醇共聚物或其任何组合或化学衍生物。

11.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，其中，所述膜包括纤维素材料。

12.根据权利要求11所述的低温保护储存装置，其中，所述纤维素材料包括再生纤维素、变性纤维素、二乙酸纤维素、三乙酸纤维素或其任何组合或化学衍生物。

13.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，其中，所述膜是由变性纤维素制成的透析膜。

14.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，其中，所述膜可渗透水、有机和/或无机液体溶剂或其任何组合。

15.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，其中，所述膜是可分离的膜，其配置为被选择性地安装以覆盖所述第二开口。

16.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，其中，所述介质包括具有低温保护材料作为添加剂悬浮其中的低温保护介质。

17.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，其中，所述壳体包括凹槽，所述膜在所述凹槽中安装到壳体以覆盖所述第二开口，所述装置包括支撑环，其配置为当所述支撑环附接到所述壳体时选择性地附接到所述壳体以将所述膜固定在所述第二开口上方。

18.根据权利要求17所述的低温保护储存装置，其中，所述支撑环包括外部支撑构件，所述外部支撑构件具有穿过其形成的孔，使得当所述支撑环安装到壳体上时，所述膜通过在所述支撑环中形成的所述孔而暴露于所述壳体外部的所述介质。

19.根据权利要求1所述的低温保护储存设备，其中，所述壳体包括至少一个锁定凸片，其与所述支撑环锁定地接合以将所述支撑环紧固到所述壳体。

20.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，其中，所述第一开口配置为使得所述样品可通过进入所述内腔。

21.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，包括盖，其配置为固定到所述壳体以关闭所述第一开口。

22.根据权利要求21所述的低温保护储存装置，其中，所述盖包括形成在所述盖的周边中的至少一个通风口，以当所述盖固定至所述壳体时允许所述内腔中的介质流过所述至少一个通风口。

23.根据权利要求21所述的低温保护储存装置，其中，所述盖包括具有凸出形状的内表面，使得所述盖在所述盖的中心处比在所述盖的周边处更深地伸入所述内腔中。

24.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，其中，所述壳体为具有圆形横截面的大体上圆柱形的形状。

25.根据权利要求1所述的低温保护储存装置，其中，所述可冻结介质在约25℃下是液体，在约-20℃下是固体。

26.一种用于在低温温度下储存样本的系统，所述系统包括：

至少一个根据权利要求1所述的低温保护储存装置；

外部容器，配置为容纳一个或多个所述低温保护储存装置；和

一种可冻结介质，用于壳体的内腔和壳体外部的外部容器中。

27.根据权利要求23所述的系统，其中，所述可冻结介质包括亲水且无毒的大分子和水性液体。

28.根据权利要求27所述的系统，其中所述可冻结介质包括低温保护剂。

29.根据权利要求28所述的系统，其中，所述低温保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖和其他多糖、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇以及其他聚合物，其他非渗透性低温保护剂，包括但不限于：硫酸软骨素和乳糖酸或其任何组合。

30.根据权利要求28所述的系统，其中，所述亲水且无毒的大分子是聚合物。

31.根据权利要求30所述的系统，其中，所述聚合物形成三维结构，所述三维结构当溶解在水性液体中时基本上为球形。

32.根据权利要求27所述的系统，其中所述水性液体包括细胞培养基，营养培养基，盐水或其任何组合。

33.根据权利要求27所述的系统，其中所述水性液体包括血清、胎牛血清（FBS）、达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM）、4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、冲洗保持培养基（FHM）、磷酸盐缓冲血清（PBS）、达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）、洛斯维·帕克纪念研究所培养基（RPMI）、BF5培养基、EX-CELL培养基、溶菌肉汤（LB）培养基，CaCl₂水溶液，NaCl水溶液，KCl水溶液或其任何组合。

34.根据权利要求30所述的系统，其中，所述聚合物在所述介质中的浓度大于约5％（w/v），大于约10％（w/v），大于约20％（w/v），或大于约50％（w/v）。

35.根据权利要求30所述的系统，其中，所述低温保护剂在所述介质内的浓度等于或大于介质中聚合物浓度的约20％，等于或大于约50％，等于或大于约75％，或等于或大于约100％。

36.根据权利要求24所述的系统，其中，所述介质包含约10％（w/v）的聚蔗糖，约5％（w/v）的DMSO，约2％（w/v）的硫酸软骨素和约1％（w/v）葡聚糖40。

37.根据权利要求36所述的系统，其中，所述聚蔗糖是通过蔗糖和表氯醇的共聚作用形成的多糖。

38.根据权利要求30所述的系统，其中，所述聚合物选自由亲水性多糖、聚合的环糊精或糖、球状蛋白质或球形蛋白、通过连接球状蛋白质的寡糖链形成的球状糖蛋白、球状蛋白质的其他衍生物以及组合组成的组。

39.根据权利要求30所述的系统，其中，所述聚合物是亲水性多糖。

40.根据权利要求37所述的系统，其中所述多糖通过蔗糖和表氯醇的共聚作用形成。

41.根据权利要求26所述的系统，其中，所述介质填充所述外部容器与所述至少一个低温保护储存装置之间的空间的一部分或全部，所述介质以足够的量提供以至少覆盖朝向远离内腔的所述膜的表面。

42.根据权利要求41所述的系统，其中，所述低温保护储存装置外部的所述介质的组成与所述低温保护储存装置的所述内腔中的所述介质的组成不同或相同。

43.一种保护样本在冻结期间不受损伤的方法，所述方法包括：

提供形成内腔的壳体，其中所述壳体包括半透膜；

在所述壳体的内腔中提供样本和第一可冻结介质；

将所述壳体放置在所述壳体外部的第二可冻结介质内，使得所述壳体部分或全部浸入所述第二可冻结介质中，其中所述第二可冻结介质与所述第一可冻结介质相同或不同；

将所述第二可冻结介质暴露于冷冻温度，以使具有第一尺寸的冰晶在所述第二可冻结介质中在所述壳体外部形成；

其中所述第二可冻结介质中所述第一尺寸的冰晶的生长被所述膜阻止，使得只有小于所述膜的孔径的第二尺寸的冰晶可以穿过所述膜并引起在所述壳体的所述内腔内的所述第一可冻结介质中形成冰，从而在所述壳体内产生的冰晶具有小于在所述壳体的外部的所述第二可冻结介质中形成的冰晶的尺寸。

44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述冻结包括低温冻结，并且其中，所述冷冻温度包括低温温度。

45.根据权利要求43所述的方法，其中，所述冻结包括非低温冻结，并且其中，所述冷冻温度包括非低温温度。

46.如权利要求45所述的方法，其中，所述样本和第一可冻结介质包括天然或常规培养基和/或溶液中的细胞悬浮液或生物组织，其中所述第一可冻结介质不含低温保护剂。

47.根据权利要求43所述的方法，其中，第一开口形成在所述壳体的第一纵向端，并且所述膜设置在形成在所述壳体中的第二开口上方。

48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述壳体被配置为通过所述第一开口将所述样本容纳在所述内腔内。

49.根据权利要求43所述的方法，其中，所述壳体是浮力支撑件，所述膜附接到所述浮力支撑件上以限定所述内腔，使得所述膜可浸入所述壳体外部的所述可冻结介质内，并且至少一部分浮力支撑件不会浸入所述壳体外部的所述可冻结介质中。

50.根据权利要求73所述的方法，其中所述第一和/或第二可冻结介质包括亲水且无毒的大分子以及水性液体。

51.根据权利要求44所述的方法，其中：

所述第一和/或第二可冻结介质包含低温保护剂；和

当第一可冻结介质的温度降低时，所述壳体内的所述第一可冻结介质中的水渗透通过所述膜，从而在低温冻结期间增加了第一可冻结介质内的低温保护剂的浓度。

52.根据权利要求51所述的方法，其中将水通过所述膜从所述第一可冻结介质渗透到所述第二可冻结介质增加了所述第一可冻结介质中的溶质的浓度和/或降低了所述第一可冻结介质的冷冻温度，以防止所述第一可冻结介质过冷。

53.根据权利要求52所述的方法，其中：

与在所述第一可冻结介质中形成的冰晶相比，在所述第二可冻结介质中形成的冰晶更大并且在更高的温度下形成；

所述膜包括多孔材料，其孔径小于在所述第二可冻结介质中形成的冰晶的直径；和/或

相对于将样本存储在没有允许水渗透通过的膜的壳体中而言，减少了对样本的损伤。

54.根据权利要求47所述的方法，其中，将所述膜定位在所述第二开口上方以允许通过其流体连通。

55.根据权利要求47所述的方法，包括将支撑环附接到所述壳体，使得所述膜在所述第二开口上方固定至所述壳体，所述支撑环具有在其中形成的一个或多个开口，以允许在所述第一和第二可冻结介质之间通过所述膜的流体连通。

56.根据权利要求47所述的方法，其中，所述壳体是低温保护储存装置的一部分。

57.根据权利要求47所述的方法，包括在将所述第二可冻结介质的温度暴露于低温温度之前，提供容纳所述第二可冻结介质的外部容器，其中将所述第二可冻结介质的温度暴露于所述低温温度包括将所述外部容器放置在具有低温温度的周围环境中，并且其中将所述壳体放置在外部容器中，以使所述壳体部分或全部浸入所述第二可冻结介质中。

58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述外部容器包括冷冻瓶。

59.根据权利要求43所述的方法，其中，所述样本和所述第一可冻结介质通过所述第一开口提供在所述内腔中。

60.根据权利要求43所述的方法，包括将盖固定在所述第一开口上方。

61.根据权利要求60所述的方法，其中，当将所述盖固定在所述第一开口上方时，所述内腔中的任何过量的第一可冻结流体都从所述内腔移位，使得当所述盖固定在所述第一个开口上时所述内腔基本上没有空气。

62.根据权利要求43所述的方法，其中，所述样本包括悬浮在所述第一可冻结介质中的细胞或至少一个组织样品。

63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述组织样品包括天然生物组织、人造组织或其组合。

64.根据权利要求63所述的方法，其中所述天然生物组织包括人多细胞组织、动物多细胞组织、植物多细胞组织或微生物多细胞组织，或其组合。

65.根据权利要求63所述的方法，其中所述人造组织包括人造的人多细胞组织、动物多细胞组织、植物多细胞组织或微生物多细胞组织，或其组合。

66.根据权利要求62所述的方法，其中所述组织样品包括角膜组织或视网膜组织。

67.根据权利要求62所述的方法，其中所述细胞包括一种或多种真核细胞，一种或多种原核细胞或其组合。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述一种或多种真核细胞包括至少一种哺乳动物细胞。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述至少一种哺乳动物细胞包括一种或多种鼠类细胞、一种或多种猪细胞、一种或多种人类细胞，或其组合。

70.根据权利要求68所述的方法，其中所述至少一种哺乳动物细胞包括一种或多种干细胞、一种或多种体细胞、一种或多种生殖细胞，或其组合。

71.根据权利要求67所述的方法，其中所述一种或多种原核细胞包括至少一种细菌细胞、至少一种古细菌细胞，或其组合。

72.根据权利要求43所述的方法，其中，所述冷冻温度为约-273℃至约0℃，包括端值。

73.根据权利要求43所述的方法，其中，所述冷冻温度为约-196℃至约-20℃，包括端值。

74.根据权利要求43所述的方法，其中，所述冷冻温度为约-100℃至约-40℃，包括端值。

75.根据权利要求43所述的方法，其中，所述冷冻温度为约-85℃至约-65℃，包括端值。