DE69637301T2

DE69637301T2 - Verpackung zur Kryokonservierung und Lagerung von kultivierten Gewebeäquivalenten

Info

Publication number: DE69637301T2
Application number: DE69637301T
Authority: DE
Inventors: Stephen R. Canton Watson; Mehmet Canton Toner; Alexander G. Canton Tschumakov
Original assignee: Organogenesis Inc
Current assignee: Organogenesis Inc
Priority date: 1995-01-30
Filing date: 1996-01-30
Publication date: 2008-08-14
Anticipated expiration: 2016-01-31
Also published as: DE69633854D1; HUP9800411A2; ATE282805T1; CZ294950B6; JP2006325598A; CN1173220A; FI972563A0; PL181762B1; AU4908296A; EP1516532A1; DE69637301D1; SK103397A3; JPH11501298A; JP2007161723A; JP4361550B2; NO310491B1; SG106553A1; KR19980701927A; PT807234E; PL321089A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Kryokonservierung sowohl eines geernteten Gewebes wie auch gezüchteter Gewebe-Äquivalente unter Verwendung der In-Vitro-Technologie. Diese Erfindung betrifft auch ein Kryokonservierungspackungsdesign sowohl für ein geerntetes Gewebe wie auch für gezüchtete Gewebe-Äquivalente, das sowohl ein kosteneffektives wie auch ein leicht handhabbares Packungsdesign ist, das eine maximale Lebensfähigkeit des zu kryokonservierenden Gewebes oder Gewebe-Äquivalents ermöglicht. Unter Verwendung der Kryokonservierungstechnologie kann entweder kryokonserviertes geerntetes Gewebe oder kryokonserviertes gezüchtetes Gewebe vor der Verwendung über unbeschränkte Zeitperioden gelagert werden. Das gezüchtete Gewebe ist ein In-Vitro-Modell des äquivalenten menschlichen Gewebes, das, wenn es aus dem Lager genommen wird, zur In-Vivo-Transplantation oder -Implantation oder zum In-Vitro-Screening von Verbindungen verwendet werden kann.
2. Kurze Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung
Die In-Vitro-Technologie hat Gewebe-Äquivalente für den Zweck einer In-Vitro-Testung oder In-Vivo-Transplantation zur Wundreparatur entwickelt. Verfahren zur Herstellung solcher Gewebe-Äquivalente sind in US Patent Nr. 4,485,096 , 4,604,346 , 4,835,102 und 5,374,515 und EP-A-0418035 und WO 94/10940 offenbart.
Die Haltbarkeit lebender Gewebe ist begrenzt und daher ist ihr Verwendungsfenster klein, so dass viel Abfall entsteht. Es besteht ein Bedarf an der Konservierung solcher Gewebe über längere Zeitperioden, wie zum Versand und zur Lagerung, bevor sie zur Verwendung gelangen. Sowohl die Entwicklung eines Kryokonservierungsverfahrens wie auch einer Packung zur Kryokonservierung und Lagerung würde das Verwendungsfenster unbeschränkt vergrößern, den Versand erleichtern und eine Lagerbestandsführung ermöglichen. Ebenso ist ein Lagerbestand an Gewebe in Verbrennungsbehandlungskliniken und Spitälern wünschenswert. Andere Vorteile sind, dass Proben von verschiedenen Stufen des Herstellungszyklus für Qualitätskontrollarchive zurückgehalten werden können und größere Produktionschargen hergestellt werden können, da sie im gefrorenen Zustand aufbewahrt werden können.
Gegenwärtig wird die Lagerungszeit von zellulären biologischen Materialien durch Kühlen auf "kryogene" Temperaturen verlängert. Der Übergang vom flüssigen in den festen Zustand durch Senken der Temperatur des Systems kann entweder als Kristallisierung (Eis) erfolgen, die eine regelmäßige Anordnung von Wassermolekülen beinhaltet, oder als Vitrifizierung oder Amorphisierung (Glasbildung), wobei eine solche regelmäßige Anordnung einer kristallinen Phase fehlt. Die Herausforderung für einen Kryobiologen besteht darin, Zellen auf kryogene Temperaturen zu bringen und sie dann in physiologische Zustände zurückzuführen, ohne sie zu beschädigen.
Es gibt zwei grundlegende Verfahren für eine Kryokonservierung von Zellen und Geweben: Gefrieren-Auftauen und Vitrifizierung. Bei Gefrier-Auftau-Techniken wird die extrazelluläre Lösung gefroren (d. h., in kristalliner Form), aber es werden Schritte unternommen, um die intrazelluläre Eisbildung zu minimieren. Bei Vitrifizierungsprozeduren gibt es den Versuch, eine Eisbildung in der gesamten Probe zu verhindern. Das erstgenannte Verfahren ist problematisch, da, wenn Eiskristalle im Inneren der Zellen gebildet werden, diese für die Lebensfähigkeit der Zelle beim Auftauen schädlich sind. Zellen könnten jedoch einen Gefrier-Auftau-Zyklus überleben, wenn sie bei kontrollierten Raten in Gegenwart nicht-toxischer Werte kryoprotektiver Mittel gekühlt werden. Das letztgenannte Verfahren der Vitrifizierung versucht mögliche schädigende Auswirkungen von intra- und extrazellulärem Eis durch Unterdrückung einer Eisbildung zu vermeiden, wobei sehr hohe Konzentrationen von gelösten Stoffen und/oder Polymeren verwendet werden. Die Zellschädigung kann jedoch durch lange Belastung mit toxischen Werten dieser Zusatzstoffe eintreten, die zur Vitrifizierung erforderlich sind.
Kryoprotektive Mittel schützen lebende Zellen vor den Belastungen, die beim Gefrierprozess auftreten. Eine Art, in der kryoprotektive Mittel Zellen schützen, ist durch Verdünnen des Salzes, das in der ungefrorenen Lösung zunehmend konzentriert wird, da Wasser in Eis umgewandelt wird. Die Menge an Eis wird durch die Temperatur und anfängliche Zusammensetzung der Lösung bestimmt; während die Menge des ungefrorenen Anteils nur eine Funktion der Temperatur ist. Kryoprotektive Mittel haben mehrere andere Funktionen. Eine wichtige ist, dass sie für gewöhnlich die intrazellulären Eisbildungstemperaturen senken. Eine andere Funktion ist, dass sie Membrane und Proteine stabilisieren.
Alle Lösungen superkühlen unter ihrem Gefrierpunkt, bis sie eine zufällige Nukleierungsstelle zur Kristallbildung finden. Bei der Kryokonservierung durch eine Gefrier-Auftau-Methode sollte die Eisbildung im extrazellulären Medium vorsätzlich durch Seeding bei niederen Graden der Superkühlung ausgelöst werden. Wenn die Eisbildung nicht durch Seeding eingeleitet wird, bildet sich Eis spontan, wenn die Lösung ausreichend weit unter ihren Gleichgewichtsgefrierpunkt gekühlt wird. Da dieser Prozess in der Natur willkürlich ist, erfolgt die Eisbildung bei willkürlichen, nicht vorhersagbaren Temperaturen; folglich schwanken die Überlebensraten stark zwischen wiederholten Versuchen mit demselben Gefrierprotokoll. Ferner kann die extrem rasche Kristallisierung, die sich ergibt, wenn sich Eis in einer stark supergekühlten Lösung bildet, eine Beschädigung an Zellen und Geweben verursachen. Ferner wurde gezeigt, dass, wenn eine extrazelluläre Eisbildung bei hohen Graden einer Superkühlung ausgelöst wird, die Wahrscheinlichkeit einer intrazellulären Eisbildung drastisch ansteigt. Dieses Phänomen ergibt sich aus dem verzögerten Beginn der durch Gefrierung induzierten Zelldehydrierung, was zu einer verstärkten Rückhaltung von intrazellulärem Wasser und somit zu einer höheren Wahrscheinlichkeit einer Eisbildung in der Zelle führt.
Sobald das Seeding des extrazellulären Eises durchgeführt ist und die Probe von der Eisphase umschlossen ist, muss die Probe auf einen kryokonservierten Zustand gekühlt werden. Der Kühlungsschritt ist einer der kritischsten Schritte in dem Gefrier-Auftau-Protokoll. Aufgrund der Eisbildung, d. h., des reinen Wassers, ist die teilweise gefrorene, extrazelluläre Lösung stärker konzentriert als das intrazelluläre Kompartiment. Folglich dehydriert die Zelle durch Wasserverlust in dem Bemühen, wieder ein thermodynamisches Gleichgewicht herzustellen. Während das System kühlt, wird mehr extrazelluläres Eis erzeugt und die Konzentration der gelösten Stoffe steigt und zwingt die Zellen zu einer weiteren Dehydrierung. Es gibt drei Eigenschaften der Zellen, die ihre Dehydrierungsrate kontrollieren. Eine ist die Wasserdurchlässigkeit der Zellmembran; je geringer die Wasserdurchlässigkeit, umso länger dauert die Dehydrierung der Zellen. Eine andere ist die Temperaturabhängigkeit der Wasserdurchlässigkeit der Zellmembran; alle Zellen verringern ihre Wasserdurchlässigkeit bei sinkenden Temperaturen. Die letzte ist die Zellgröße; größere Zellen brauchen länger zum Dehydrieren als kleinere Zellen. Unter der Voraussetzung, dass jede Zellenart drastisch unterschiedliche Eigenschaften aufweisen kann, können die optimalen Kryokonservierungsbedingungen bei verschiedenen Zellenarten um Größenordnungen variieren.
Obwohl die exakten Mechanismen der Zellschädigung während der Kryokonservierung bisher nicht vollständig geklärt wurden, scheinen charakteristische Überlebensmerkmale, die durch Messung des Überlebens einer Zelle als Funktion der Kühlungsrate erhalten werden, qualitativ für alle Zellenarten ähnlich zu sein, und zeigen eine umgekehrte U-förmige Kurve. Das Überleben einer Zelle ist bei sehr langsamen und sehr schnellen Kühlungsraten gering, und es gibt eine dazwischen liegende Kühlungsrate, die ein optimales Überleben bedeutet.
Selbst wenn die optimale Kühlungsrate und die Breite der Kurve für verschiedene Zellarten drastisch variieren können, scheint das qualitative Verhalten universell zu sein. Schnellere Kühlungsraten geben den Zellen nicht genug Zeit zum Dehydrieren und Zellen bilden intern Eis. Eine Zellbeschädigung bei schnellen Kühlungsraten wird auf die intrazelluläre Eisbildung zurückgeführt. Bei langsamen Kühlungsraten ist eine Zellbeschädigung vermutlich auf die Wirkungen einer Belastung mit hoch konzentriertem intra- und extrazellulärem Salz und kryoprotektiven Lösungen oder auf mechanische Wechselwirkungen zwischen Zellen und dem extrazellulären Eis zurückzuführen.
Es ist notwendig, die Zellen soweit wie möglich zu dehydrieren, bevor sie die intrazelluläre Eisnukleierungskurve kreuzen. An diesem Punkt nukleiert praktisch das gesamte Wasser, das in der Zelle verbleibt, und bildet Eis. Es ist nicht möglich, die exakte Temperatur zu bestimmen, bei der dies eintritt, aber sie beträgt etwa –40°C bis –50°C, wenn die Zellen langsam in Gegenwart von 1 M bis 2 M Konzentrationen der kryoprotektiven Mittel gefroren werden. Es muss festgehalten werden, dass die Wassermenge, die an diesem Punkt im Inneren einer Zelle zu Eis wird, im gefrorenen Zustand unschädlich sein kann, aber wenn sie nicht rasch genug aufgetaut wird, sich ausdehnt und die Zelle beim Auftauen tötet. (The Biophysics of Organ Cryopreservation, S. 117–140, herausgegeben von David. E. Pegg und Armand M. Karow, Jr. NATO ASI Series A: Life Sciences Band 147 1987 Plenum Press, New York 233 Spring St., New York, NY 10013).
Vor der Entwicklung eines kommerziell existenzfähigen Hautäquivalents wurde für Transplantate Kadaverhaut verwendet. Kryokonservierungsprotokolle wurden entwickelt, so dass Verbrennungskliniken und Spitäler Hautbanken führen konnten. Es wurden zahlreiche verschiedene Protokolle unter Verwendung verschiedener kryoprotektiver Mittel, Gefrierraten, Packungsformate und Lagerbedingungen entwickelt. Die meisten Forscher einigten sich auf ein schnelles Auftauprotokoll. Das Gelingen oder Misslingen des Protokolls wurde entweder durch die Transplantataufnahme auf einem Wundbett oder durch einen Zellenlebensfähigkeitstest gemessen.
In US 3,842,831 an Beisang ist ein Verfahren für die Kryokonservierung von Kadaverhautflecken offenbart. Das Verfahren beinhaltet das Anbringen der Kadaverhaut auf einem lose Trägergewebe oder einer Unterlage und das Aufrollen der Hautflecken und des Trägergewebes vor dem Gefrieren. Es wird kein kryoprotektives Mittel verwendet, obwohl die Erfinder die Verwendung entweder von Glycerin oder DMSO vorschlagen. Das Gefrierprotokoll verwendet ein Protokoll mit rascher unkontrollierter (festgesetzte Temperatur) Gefrierrate auf eine kryogene Temperatur von –70°C.
May SR und Fa DeClement (Skin Banking Methodology, 17, 33–45 (1980)) führten eine Evaluierung einer Packungsgeometrie und von Kühlungs- und Erwärmungsraten unter Verwendung dermatomerer Kadaverhaut durch. Die Ergebnisse legen nahe, dass Kadaverhaut flach und nicht gerollt sein sollte, und dass eine langsamere kontrollierte Gefrierungsrate verwendet werden sollte.
US 5,040,677 an Tubo offenbart einen gasdichten versiegelbaren Behälter für einzelne Transplantate auf Epithelzellschichten. Der Behälter erfordert, dass die Epithelzellschicht an einer klebenden Substratschicht oder Unterlage durch Verwendung von Klemmen befestigt wird.
US 5,145,770 an Tubo offenbart ein Kryokonservierungsverfahren für Keratinozytenschichten, das ein kryoprotektives Mittel aus einem nicht zellpenetrierendem Mittel, wie Dextran, und ein zellpenetrierendes Reagens, wie Glycerol, verwendet, mit einer Kühlungsrate von etwa –1°C/Minute. Ebenso offenbart EP 0 364 306 an Chao et al. ein Verfahren zur Kryokonservierung einer Schicht aus lebenden, gezüchteten Epithelzellen, aber unter Verwendung sowohl von DMSO wie auch Glycerol als kryoprotektives Mittel und eines Gefrierprotokolls von vorzugsweise –1°C/Minute.
US 5,298,417 an Cancedda et al. offenbart ein Kryokonservierungsprotokoll, das für einschichtige Konstrukte, wie Epithelschichten, entwickelt wurde, die wie in US 4,016,026 , 4,304,866 und 4,456,687 beschrieben hergestellt werden. Epidermale Schichten wurden mit einem kryoprotektiven Mittel aus entweder 8 bis 15% Glycerol oder DMSO inkubiert und wurden unter Verwendung eines Protokolls mit kontrollierter Rate kryokonserviert, wobei die Kühlungsrate zu Beginn langsamer ist als am Ende des Protokolls und durch einen Anstieg in der Temperatur vor dem Höhepunkt der Gefrierprozedur gekennzeichnet ist.
Ein Verfahren für die Kryoprotektion dermaler Fibroblasten in einem Collagengel wurde von Teasdale et al., Burns, 19 (5) 406–410 (1993) untersucht. Teasdale bestimmte, dass eine optimale Zelllebensfähigkeit durch Gefrieren bei –0,5°C/Minute mit DMSO als kryoprotektives Mittel erhalten werden könnte.
Nanchahal et al., "Cultured composite skin grafts: Biological skin equivalents permitting massive expansion", The Lancet, 2 (8565), 191–193 (22. Juli 1989), bespricht eine Technik zur Lagerung zusammengesetzter gezüchteter Gewebetransplantate unter Verwendung eines kryoprotektiven Mittels aus 15% Glycerol und 10% FCS in Medium 199. Die Transplantate und das kryoprotektive Mittel wurden bei 37°C zwei Stunden inkubiert und wurden dann bei –1°C pro Minute auf –70°C gefroren und dann in flüssigem Stickstoff gelagert. Nach einem schnellen Auftauen der Transplantate wurde ihre Lebensfähigkeit durch Züchten über zwei Wochen und durch Transplantieren auf haarlose Mäuse bestimmt. Eine abschließende Evaluierung erfolgte durch Transplantate bei drei Patienten, die sich einer Tatoo-Entfernung unterzogen.
Johnstone et al. "Cryopreservation of Rabbit and Cat Corneas at –18 to –24°C", Cornea, 11(3); 211–220 (1992), betrifft eine einfache Prozedur zur Kryokonservierung von Kaninchen- und Katzenkorneas, die ein Haushaltsgefriermittel anstelle von flüssigem Stickstoff oder Gefriermitteln für niedere Temperaturen verwendet. Das Durchtränken mit kryokonservierendem Mittel wird erreicht, indem Korneas in aufeinander folgende Lösungen aus 50% fötalem Kalbserum und McCarey-Kaufman-Medium mit zunehmendem Glycerol- und Glucosegehalt gelegt werden.
Bei Verwendung der Verfahren nach dem Stand der Technik ist es nicht möglich, gezüchtete Gewebe-Äquivalente einer Kryokonservierung zu unterziehen, teilweise weil sie relativ dick sind und aus heterogenen Zellschichten bestehen. Eine der Funktionen dieser Gewebe in vivo ist die Bereitstellung einer Durchlässigkeitssperre. Gewebefunktionen müssen in der Entwicklung eines Kryokonservierungsprotokolls berücksichtigt werden.
Die gegenwärtigen Erfinder haben ein Verfahren zur Kryokonservierung und insbesondere ein Packungsdesign entdeckt, das bei einer Reihe gezüchteter Gewebe-Äquivalente und bei Haut von Säugern anwendbar ist und das eine überraschend effektive und kommerziell verwendbare Packung für die Kryokonservierung gezüchteter Gewebe-Äquivalente ist.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die erfolgreiche Kryokonservierung gezüchteter Gewebe-Äquivalente bei sehr geringen Temperaturen bereit, das die Bildung schädlicher intrazellulärer Eiskristalle verhindert, die effektive Konzentration potenziell schädlicher Chemikalien minimiert und das rasche Einführen und Entfernen von kryoprotektiven Mitteln bei praktikablen Temperaturen unter Verwendung eines programmierbaren Gefriergeräts ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein neues Packungsdesign bereit, das für die Kryokonservierung, Lagerung und den Vertrieb gezüchteter Gewebe-Äquivalente entwickelt wurde. Das neue Design bietet viele Vorteile gegenüber bestehenden Packungsdesigns. Gegenwärtig gibt es keine im Handel erhältlichen kryokonservierten gezüchteten Gewebe-Äquivalente und daher sind keine Packungsdesigns für die Regalhaltung verfügbar. Das Design der neuen Packung ermöglicht aufgrund einer effizienteren Wärmeübertragung eine bessere Temperaturverfolgung des Inneren der Packung mit der Außentemperatur der Gefrierkammer. Eine verbesserte Wärmeübertragungsrate ermöglicht einen besser kontrollierten Prozess; somit gleichförmige Kühlungs- und Erwärmungsraten des gezüchteten Gewebe-Äquivalents, wodurch eine Variabilität in der Zelllebensfähigkeit verringert wird.
Die Erfinder haben ein Verfahren zur Kryokonservierung gezüchteter Gewebe-Äquivalente entdeckt, die nach In-Vitro-Techniken hergestellt werden, so dass die Gewebe ihre Lebensfähigkeit und Nützlichkeit als Äquivalente von menschlichen Geweben beibehalten. Die Erfindung beinhaltet das Anwenden von Rühren, um die Durchdringung mit einer effektiven Menge an kryoprotektivem Mittel zu verbessern. Das vorliegende Verfahren bietet die Kryokonservierung sowohl eines geernteten Gewebes wie auch gezüchteter Gewebe-Äquivalente in einer Weise, die die strukturelle Integrität und zelluläre Lebensfähigkeit schützt.
Das Verfahren dieser Erfindung beinhaltet die folgenden Schritte:

1) Das geerntete Gewebe oder gezüchtete Gewebe-Äquivalent wird in eine kryoprotektive Lösung getaucht und die kryoprotektive Lösung und das eingetauchte Gewebe werden gerührt, um ein effektives Eindringen der kryoprotektiven Lösung in das Gewebe (Durchtränkung des Gewebes) zu erreichen; und
2) Nach dem Durchtränken des Gewebes mit der kryoprotektiven Lösung, Kühlen auf einen Fest-Flüssigphasen-Gleichgewichtstemperaturbereich für das kryoprotektive Mittel; Seeding des extrazellulärem Eises und Kühlen auf einen kryokonservierten Zustand durch Gefrieren des Gewebes bei einer langsamen Gefrierrate auf eine Temperatur bei oder unter mindestens etwa –70°C, insbesondere bei oder unter –120°C, bevorzugter bei –140°C und insbesondere bei –196°C.

Nach dem Gefrieren kann das kryokonservierte Gewebe unbeschränkte Zeitperioden bei Temperaturen zwischen etwa –120°C bis etwa –196°C gelagert werden, der Temperatur von flüssigem Stickstoff.
Das Auftauen des kryokonservierten Gewebes erfolgt durch Erwärmung des gefrorenen Gewebes bei hoher Rate, die in etwa 1 bis 2 Minuten durchgeführt wird. Das gefrorene Gewebe kann durch direkte Anwendung erwärmter Kulturmedien oder durch physiologisch gepufferte Lösung oder durch eine andere rasche Erwärmungsmethode aufgetaut werden. Das Packungsdesign ermöglicht ein Auftauen des Gewebes durch Eintauchen der Packung in ein Wasserbad, da das Packungsdesign sowohl eine rasche Erwärmungsrate wie auch eine kontrollierte thermische Gleichförmigkeit garantiert, während die Sterilität während der kritischen Auftauprozedur beibehalten wird.
Vor der Verwendung als Äquivalent für menschliches Gewebe zur Transplantation oder In-Vitro-Testung wird das aufgetaute gezüchtete Gewebe-Äquivalent gespült, um die kryoprotektive Lösung zu entfernen. Die kryoprotektive Lösung kann durch Spülen zum Beispiel mit einer isotonischen Pufferlösung bei physiologischem pH entfernt werden. Die gezüchteten Gewebe-Äquivalente können dann vorübergehend in einer solchen Pufferlösung gelagert oder in einem geeigneten Zellmedium vor der Verwendung erneut gezüchtet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A und 1B zeigen Ansichten des Deckels.
2 zeigt eine Draufsicht auf die Dichtung.
3A und 3B zeigen Ansichten der Dichtung, die am Deckel befestigt ist.
4A und 4B zeigen Ansichten des Trägers.
5A und 5B zeigen Ansichten der Schale.
6A und 6B zeigen Seitenansichten der Anordnung, in Einzelteile zerlegt oder fertig gestellt.
7 zeigt eine Nahansicht der Anordnung.
8 zeigt eine Draufsicht der fertig gestellten Anordnung.
9 zeigt eine Grafik der Lebensfähigkeit kryokonservierter gezüchteter Gewebe im Vergleich zu jener von nicht-kryokonservierten gezüchteten Geweben. Die Lebensfähigkeit von kryokonservierten gezüchteten Geweben, gemessen durch MTT, ist dargestellt. LSE wurde zusätzlich durch einen LDH-Test gemessen. Alle gezüchteten Gewebe werden mit alterabgestimmten, nicht kryokonservierten Kontrollen verglichen und als Prozent der Kontrolle angegeben.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gewebe-Engineering ist ein aufkommender Bereich, der gezüchtete Gewebezellen zur Konstruktion von Gewebe-Äquivalenten verwendet, die zur Untersuchung der Reaktion auf eine Verletzung durch chemische Mittel oder pharmazeutische Verbindungen verwendet werden kann. Das gezüchtete Gewebe kann auch zur Bildung transplantierbaren menschlichen Gewebes verwendet werden.
Gewebe-Äquivalente wurden umfassend in vielen Patenten beschrieben, einschließlich US Patent Nr. 4,485,096 , 4,485,097 , 4,539,716 , 4,546,500 , 4,604,346 , 4,837,379 und 5,374,515 . Eine erfolgreiche Anwendung des Gewebe-Äquivalents wird als "Living Skin Equivalent" bezeichnet, das eine ähnliche Morphologie wie tatsächliche menschliche Haut hat. Das Living Skin Equivalent (LSE) besteht aus zwei Schichten: der obere Abschnitt besteht aus differenzierten und mehrschichtigen humanen Epidermal-Keratinozyten, die eine untere Schicht aus humanen dermalen Fibroblasten in einer Collagenmatrix bedecken. Parenteau, et al., "Epidermis Generated in Vitro: Practical Considerations and Applications", J. of Cellular Biochemistry, 45: 245–251 (1991); Parenteau, et al., "The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function", Cytotechnology, 9: 163–171 (1992); und Bell et al., "The Living Skin Equivalent: Its Manufacture, Its Organotypic Properties and Its Response to Irritants", Toxic. in Vitro, 5: 591–596 (1991). LSE zur Transplantation wird derzeit in klinischen Versuchen auf Indikationen untersucht, die mit teilweisen Hautwunden und Hautwunden voller Dicke in Zusammenhang stehen: Exzisionschirurgie, Verbrennungen, venöse Stauungsgeschwüre, diabetische Geschwüre, Dekubitalgeschwüre und chronische Entzündungsgeschwüre. Das LSE ist ein zweischichtiges, in vitro hergestelltes Hautgewebe voller Dicke.
Ein In-Vitro-Organ-Äquivalent der Kornea des Auges wurde entwickelt, wie in US Patent Nr. 5,374,515 beschrieben ist. Das Korneagewebe-Äquivalent hat drei verschiedene Zellschichten, die äußere Schicht, ein mehrschichtiges Platte nepithel; die mittlere Schicht aus Collagenfasern und Stromazellen; und eine innere Schicht, ein einfaches Plattenepithel, das auch als Korneaepithel bezeichnet wird. Ein In-Vitro-Korneagewebe-Äquivalent kann für In-Vitro-Toxizitätstests verwendet werden, wobei es als exaktes und kostengünstiges, nicht tierisches Vorhersagemodell für ein in vivo Augen- und Hautreizungspotenzial vieler Arten von Produkten und Rohmaterialien dient.
Das Ziel der Kryokonservierung ist die Erhaltung der strukturellen Integrität und Lebensfähigkeit biologischer Materialien für eine unbeschränkte Zeitperiode, so dass diese Materialien nach Bedarf verfügbar und verwendbar sein können. Komplexe Gewebe mit begrenzter Lebensdauer erfordern eine Kryokonservierung zur Verlängerung der Produktverfügbarkeit und -nutzbarkeit. Die Geschichte der Kryokonservierung biologischen Materials hat jedoch gezeigt, dass die Optimierung eines Kryokonservierungsprotokolls für eine bestimmte Zelle nicht unbedingt gute Ergebnisse liefert, wenn es mit einer anderen Zellart oder mit anderen Zellen in einem Gewebe verwendet wird. Die Entwicklung spezialisierterer Methoden aufgrund der Unterschiede in der Zelldichte, im Wassergehalt und im Ausmaß der strukturellen Organisation von Gewebe-Äquivalenten voller Dicke war notwendig. Die Kryokonservierungsprotokolle dieser Erfindung sind überraschenderweise bei den einschichtigen epidermalen und dermalen Schichten alleine, zweischichtigen Gewebe-Äquivalenten, dreischichtigen Kornea-Äquivalenten und geernteter Haut von Säugern anwendbar. Die Entwicklung eines Packungsdesigns ermöglicht die Kryokonservierung dieser Gewebe in Prozessen im Produktionsmaßstab.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "gezüchtete Gewebe-Äquivalente" Gewebe-Äquivalente von Säuger-Geweben, wobei die Gewebe-Äquivalente durch In-Vitro-Techniken hergestellt werden, und soll einschichtige Haut-Äquivalente, entweder ein dermales Äquivalent oder eine epidermale Schicht; zweischichtige Haut-Äquivalente, insbesondere LSE; und dreischichtige Kornea-Äquivalente und Haut-Äquivalente umfassen. Die Morphologie der gezüchteten Gewebe-Äquivalente ist ähnlich jener des in vivo Säuger-Organs, für gewöhnlich des Organs des Menschen. Zur Veranschaulichung, die Morphologie des LSE hat viele Ähnlichkeiten mit menschlicher Haut. Metabolisch und mitotisch aktive, humane dermale Fibroblasten (HDF) finden sich in der gesamten dermalen Schicht des Konstrukts und es hat sich gezeigt, dass sie Collagen und andere Matrixkomponenten in das Gitter sezernieren. Die Epidermis besteht aus einer Basalschicht, die sich nachweislich mit einer mitotischen Rate ähnlich jener der menschlichen Haut teilt. Die suprabasale Epidermis zeigt dieselben Schichten wie die Haut in vivo, mit gut definierten Stachelzell- und Körnerschichten, die Keratohyalin und lamelläre Körner enthalten, die von einem Stratum Corneum bedeckt sind. Die Immunhistochemie zeigt das Vorhandensein extrazellulärer Matrixkomponenten, die für gewöhnlich an der dermo-epidermalen Verbindung in normaler menschlicher Haut vorgefunden werden, wie Laminin, Typ IV Collagen und Kalanin (GB3).
Gezüchtete Gewebe-Äquivalente, die durch organotypische Kulturmethoden erhalten werden, wie das Living Skin Equivalent (LSE), verwenden einen Träger als Gerüst, auf dem die Äquivalente gebildet werden. Gezüchtete Gewebe-Äquivalente werden auf einem Träger hergestellt, der die Manipulation des Konstrukts während der Herstellung, dem Versand und dem Endgebrauch ermöglicht, ohne das Konstrukt direkt zu kontaktieren. Verfahren zur Herstellung gezüchteter Gewebe-Äquivalente auf einem Träger sind in US Patent Nr. 5,374,515 und EP-A-0418035 und WO 94/10940 offenbart.
Ein Träger enthält eine flache permeable Membran, die an einem Ende einer im Wesentlichen rohrförmigen Stütze befestigt ist. Das andere Ende der rohrförmigen Stütze enthält einen sich nach außen erstreckenden Flansch, der seinerseits einen Rand aufweist, der auf dem oberen Ende einer Vertiefung in einer Gewebekulturschale und in dem Packungsdesign der vorliegenden Erfindung hängen kann. Die Membranstützenanordnung ist so groß, dass sie mit einer Kulturschale verwendet werden kann, die mindestens eine Vertiefung einer spezifischen Größe aufweist, so dass der passende Zwischenraum um die Stütze bereitgestellt ist und sie mit dem oberen Ende der Vertiefung in Eingriff gelangen kann. Die Membranstützenanordnung kann in verschiedenen Größen hergestellt werden, so dass sie mit verschiedenen Größen sowohl von Kulturschalen wie auch Kryokonservierungs- und Lagerungspackungen verwendet werden kann. Ein Beispiel für diese Träger ist ein TRANSWELL^® (Costar), wie in US Patent Nr. 5,466,602 beschrieben. Modifizierungen an dem Packungsdesign zur Anpassung an ähnliche Träger, die ein anderes Mittel zur Stütze und für den Eingriff mit den Kulturgefäßen verwenden, können von einem Fachmann vorgenommen werden. Ähnliche Träger sind in US Patent Nr. 5,358,871 und 5,366,893 beschrieben oder jene, die in US Patent Nr. 4,871,674 beschrieben sind.
Das bevorzugte Packungsdesign dieser Erfindung enthält das Trägergerüst und definiert eine Umgebung um das Gewebe-Äquivalent, die vorbestimmten Spezifikationen entsprechend kontrolliert werden kann. Die vorliegende Erfindung verwendet Materialien, die vorzugsweise von medizinischer Güte sind und einem weiten Temperaturbereich standhalten können. Diese Materialien werden zur Bildung einer Schale und eines Deckels geformt, die durch ein Dichtungsmittel miteinander versiegelt werden können. Die neue Packung ist so gestaltet, dass sie eine Trägerstütze enthält, auf der Gewebe-Äquivalente gebildet werden.
Das neue Packungsdesign umfasst eine Schale, einen Deckel und eine dazwischen liegende Dichtung. Die Schale und der Deckel sind so gestaltet, dass sie zu dem vorhandenen Träger passen, an dem das Gewebe-Äquivalent befestigt ist. Der Träger mit dem daran befestigten Gewebe-Äquivalent wird in die Schale gelegt und kryoprotektive Lösung wird hinzugefügt. Dann wird der Deckel auf der Schale platziert und die zwei Teile werden miteinander versiegelt, um einen dichten Verschluss zwischen der inneren und äußeren Umgebung der Packung zu bilden.
Das Packungsdesign ermöglicht eine gleiche Verteilung des kryoprotektiven Mittels unter dem Träger und über der Oberfläche des Gewebe-Äquivalents, während ein Kontakt des kryoprotektiven Mittels mit dem Gewebe-Äquivalent und sowohl der Schale wie auch dem Deckel aufrechterhalten wird. Das Design der Packung beruht auf dem Konzept, dass kontrollierte Kühlungs- und Gefrierraten mit einem gleichen Volumen eines kryoprotektiven Mittels beibehalten werden können, das mit einer gleichen Geometrie über und unter dem zu kryokonservierenden gezüchteten Gewebe angeordnet ist. Diese Anordnung stellt einen gleichförmigen Abstand bereit, gemessen von der oberen und unteren Fläche des gezüchteten Gewebe-Äquivalents zu der Außenwand der Packung (vorausgesetzt, dass die Packung auch gleichförmige Dicke hat). Diese Gleichförmigkeit sollte für einen gleichförmigen Wärmeaustausch von dem Gewebe-Äquivalent zu der Gefrierkammer beim Kühlen und von der äußeren Umgebung zu dem Gewebe-Äquivalent beim Tauen sorgen.
Die Schale umfasst eine Bodenfläche, die an eine Seitenwand und einen Flansch angrenzt. Der Flansch stellt eine plane Oberfläche für eine dichte Verbindung der Schale mit dem Deckel bereit. Die Seitenwand der Schale weist eine einzige kontinuierliche oder mehrere diskontinuierliche Stützen auf, die von der Seitenwand nach innen ragen und mit dieser einstückig ausgebildet sind. Wenn der Träger, der das gezüchtete Gewebe-Äquivalent enthält, in der Schale angeordnet ist, hängt seine obere Kante an den Stützen, die durch die Seitenwand der Schale bereitgestellt sind. Ein Raum ist zwischen dem hängenden Träger und der Bodenfläche der Schale definiert, dessen Dicke etwa 1,0 mm beträgt, mit einer Fläche von etwa der Größe des Gewebe-Äquivalents.
Der Deckel umfasst eine plane Bodenfläche, die an eine Seitenwand und einen Flansch angrenzt. Der Durchmesser des Deckelflansches ist etwas kleiner als der Durchmesser des Schalenflansches. Der Deckelflansch, wenn er auf der Schale liegt, die einen Träger enthält, ruht auf dem Träger, so dass die oberen Oberfläche sowohl des Schalenflansches wie auch des Deckelflansches auf oder etwa auf derselben Ebene in Kontakt ausgerichtet sind. Ein zweiter Raum ist durch den Deckel und die Oberfläche des gezüchteten Gewebe-Äquivalents definiert, der ebenso eine Dicke von etwa 1,0 mm aufweist, mit einer Fläche in etwa der Größe des Gewebe-Äquivalents.
Dieses Design ermöglicht insgesamt etwa 1 mm zwischen der Schale und dem Boden des Trägers, auf dem sich das Gewebe-Äquivalent befindet, und etwa 1 mm zwischen dem Deckel und dem Gewebe-Äquivalent, mit dem kryoprotektiven Mittel über und unter dem Gewebe-Äquivalent, das sowohl mit dem Deckel wie auch der Schale in Kontakt steht. Wenn der Deckel in die Schale, die das Medium enthält, gelegt wird, verdrängt der Deckel jede Luft in der Packung zu dem peripheren Raum, der die rohrförmige Stütze des Trägers enthält.
Der Deckel wird mit der Schale entlang der frei liegenden Ebene versiegelt, die durch die obere Oberfläche des Schalenbeziehungsweise Deckelflansches erzeugt wird. Die Versiegelung kann durch Wärme, Klebstoff oder ein anderes Mittel, das in der Technik bekannt ist, erreicht werden. Die Dichtung zwischen dem Deckel und der Schale verhindert ein Auslecken des kryoprotektiven Mittels und hält die Sterilität des Innenraums der Einheit aufrecht. Vorzugsweise wird ein ringförmiges Blatt aus heißsiegelbarem Deckelmaterial sowohl an den Schalen- wie auch den darauf befindlichen Deckelflansch heißgesiegelt. Das Deckelmaterial weist vorzugsweise eine Lasche auf, um den Deckel von der Schale abzuziehen und somit die Dichtung zu lösen, um auf das Gewebe-Äquivalent Zugriff zu haben. In einer anderen Ausführungsform wird ein Deckel mit einem Flansch mit etwa demselben Durchmesser wie der Schalenflansch auf eine Schale mit einem darin angeordneten Träger gelegt, so dass die Bodenfläche des Deckelflansches in engen Kontakt mit der oberen Oberfläche des Schalenflansches gelangt. Die Flansche werden dann durch ein siegelbares Mittel dicht miteinander verbunden.
1A und 1B zeigen den Deckel 10, den Deckelflansch 11, die Deckelseitenwand 12 und die Bodenfläche 13. Der Deckelflansch 11, die Deckelseitenwand 12 und die Bodenfläche 13 bilden eine durchgehende Oberfläche.
2 zeigt die ringförmige Dichtung 20 und eine Lasche 21.
3A und 3B zeigen die Dichtung 20, den Deckel 10, den Deckelflansch 11. Die Dichtung 20 wird an dem Deckelflansch 11 des Deckels 10 vor der Verwendung befestigt, um die Ausrichtung der Dichtung während des Versiegelungsprozesses zu erleichtern.
4A und 4B zeigen den Träger 30, den Trägerrand 31, die permeable Membran 32 und die rohrförmige Stütze 33. Auf der permeablen Membran 32 liegt ein gezüchtetes Gewebe-Äquivalent, das durch die rohrförmige Stütze 33 gehalten wird. Der Träger 30 ermöglicht die Übertragung des Gewebe-Äquivalents ohne Kontakt oder Entfernung des Gewebe-Äquivalents während des Kryokonservierungsprozesses.
5A und 5B zeigen die Schale 40, die Schalenbodenfläche 41, die Schalenseitenwand 42, den Schalenflansch 43 und die Trägerstützen 44. Die Schalenbodenfläche 41, die Schalenseitenwand 42, der Schalenflansch 43 und die Trägerstützen 44 bilden eine durchgehende Oberfläche. Die Trägerstützen 44 stehen mit dem Träger innerhalb der Schale in Kontakt und stützen diesen ab.
6A und 6B zeigen die Dichtung 20, den Deckel 10, den Träger 30 und die Schale 40. Der Träger 30, auf dem sich ein Gewebe-Äquivalent befindet, ist in der Schale 40 angeordnet und hängt in der Schale. Der Deckel 10 mit der Dichtung 20 ist über dem Träger 30 angeordnet und hängt über dem Träger.
7 zeigt die Dichtung 20, den Deckelflansch 11, den Deckel 10, den Träger 30, den Trägerrand 31, die Trägerstützen 44 und die Schale 40. Der Träger 30, auf dem sich ein Gewebe-Äquivalent befindet, ist in der Schale 40 angeordnet und hängt in der Schale durch einen Kontakt der Bodenfläche des Trägerrandes 31 mit den oberen Oberflächen der Trägerstützen 44. Der Deckel 10 mit der Dichtung 20 ist über dem Träger 30 angeordnet und hängt über dem Träger durch Kontakt der Bodenfläche des Deckelflansches 11 mit der oberen Oberfläche des Trägerrandes 31. Die oberen Oberflächen sowohl des Deckelflansches 11 wie auch des Schalenflansches 43 bilden eine plane Oberfläche für die Dichtung 20.
8 zeigt eine Draufsicht auf die Anordnung. Materialien, aus welchen Schalen und Deckel hergestellt werden können, sind starre oder halbflexible thermoplastische Materialien, die, wenn sie erwärmt werden, durch ein Vakuum geformt oder durch Spritzguss geformt werden, wie Polytetrafluorethylen (PTFE) oder Polyethylenterephthalatglycol (PETG). Die Packungsschalen und -deckel werden vorzugsweise vor der Verwendung durch Methoden sterilisiert, die in der Sterilisationstechnik bekannt sind. Die Materialien, die zur Herstellung der Schale und des Deckels verwendet werden, bestimmen die Sterilisationsmethode, die verwendet werden kann. Zur Sterilisierung von PTFE oder PETG ist eine Gammastrahlung bei 2,5 bis 3,0 Megarad bevorzugt. Elektrische und chemische Sterilisationsmethoden, die dem Fachmann bekannt sind, können als Alternative verwendet werden.
Gezüchtete Gewebe-Äquivalente umfassen ein dermales Äquivalent eines hydrierten Collagengitters, das durch ein Agens, vorzugsweise Fibroblasten, kontrahiert ist. In einer Ausführungsform wird eine mehrschichtige Schicht aus epidermalen Zellen auf der Oberfläche des dermalen Äquivalents gezüchtet. In einer anderen Ausführungsform ist das hydrierte kontrahierte Collagengitter, das durch Keratozyten kontrahiert ist, auf einer Schicht von Kornea-Endothelzellen mit einer mehrschichtigen Schicht aus Kornea-Endothelzellen angeordnet, die auf der Oberfläche des Gitters gezüchtet wird. Als Alternative können nur epidermale Zellen gezüchtet und zur Schichtenbildung angeregt werden, um eine epidermale Schicht zu bilden. Das gezüchtete Gewebe-Äquivalent wird entweder auf einer porösen Membran eines Trägers oder auf einem Collagengel gebildet, das an einer porösen Membran der Bodenfläche eines Trägers haftet. Zusätzlich können andere gezüchtete Gewebe-Äquivalente gemäß den Verfahren dieser Erfindung kryokonserviert werden, einschließlich, ohne aber darauf beschränkt zu sein, jeder gezüchteten epidermalen Schicht, jedes gezüchteten dermalen Äquivalents, jedes gezüchteten Kornea-Äquivalents oder geernteter Haut eines Säugers.
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Verwendung von Gewebe-Äquivalenten und dem bevorzugten Packungsdesign als Veranschaulichung beschrieben. Für den Fachmann ist offensichtlich, dass Modifizierungen an dem beschriebenen Verfahren vorgenommen werden können, die dennoch im Umfang dieser Erfindung liegen.
Das Verfahren zum Durchtränken eines Gewebe-Äquivalents mit einer kryoprotektiven Lösung besteht darin, das Gewebe-Äquivalent und seinen anhaftenden Träger in ein Volumen einer kryoprotektiven Lösung zu tauchen, die ausreichend ist, um die Probe einzutauchen, und ein gleiches Volumen an kryoprotektiver Lösung über und unter dem Gewebe-Äquivalent zu haben. Einer 100 mm Petri-Schale, die das Gewebe-Äquivalent und den Träger enthält, werden 25 ml 2 M Glycerol in DMEM über eine ausreichende Zeitperiode zugegeben, um die Probe vollständig zu durchtränken, vorzugsweise zwischen einer und zwei Stunden, aber insbesondere über etwa eine Stunde. Längere Zeitperiode in der kryoprotektiven Lösung führen zu einer verminderten Zelllebensfähigkeit in dem Gewebe, während eine zu kurze Zeit keine vollständige Durchdringung des Gewebes mit dem kryoprotektiven Mittel garantiert. Einschichtige Konstrukte erfordern für gewöhnlich weniger Zeit für das Durchtränken, da sie weniger Zellschichten und eine verminderte Sperrschichtfunktion aufweisen. Während dieser Stunde wird das Eindringen der kryoprotektiven Lösung durch Rühren der Probe und der kryoprotektiven Lösung verstärkt, für gewöhnlich, indem die Petri-Schale auf einem orbitalen Plattformschüttler (Orbitalschüttler von Bellco) bei 70 U/min in einer 10% CO₂ begasten Kammer geschüttelt wird. Die 10% CO₂-Umgebung, dieselbe wie die Kulturumgebung, in der das Gewebe-Äquivalent hergestellt wurde, verhindert eine Entgasung der Medien, wodurch der pH der Basismedienkomponente des kryoprotektiven Mittels beibehalten wird. Das Rühren ermöglicht eine schnellere und vollständigere Durchtränkung des Gewebe-Äquivalents mit dem kryoprotektiven Mittel und eine bessere Reproduzierbarkeit von Ergebnissen zwischen gefrorenen Gewebe-Äquivalenten. Ein Orbitalschüttler kann durch ein Gerät ersetzt werden, das eine rührende Bewegung in anderen räumlichen Ebenen vollzieht. Zusätzlich enthalten andere Methoden für ein mechanisch verstärktes Durchtränken, ohne aber darauf beschränkt zu sein, das Schwenken des Konstrukts mit dem kryoprotektiven Mittel in einem Gefäß auf einer Plattform, oder die Zentrifugation des Konstrukts mit dem kryoprotektiven Mittel und das Umspülen des Konstrukts mit dem kryoprotektiven Mittel mit Hilfe einer Pumpe.
Der Träger mit dem daran anhaftenden Gewebe-Äquivalent wird in die Schale gelegt und insgesamt werden etwa 16,0 ml der kryoprotektiven Lösung hinzugefügt. Das Packungsdesign ermöglicht eine gleichmäßige Verteilung des kryoprotektiven Mittels: Etwa 8,0 ml unter dem Träger und etwa 8,0 ml auf der Oberfläche des Gewebe-Äquivalents. Der Deckel wird dann auf die Schale gelegt und die zwei Teile werden heißgesiegelt, vorzugsweise an das Deckelmaterial.
Verpackte Gewebe-Äquivalente werden dann in ein programmierbares Gefriergerät (Cryomed oder Planer) eingebracht, der bei einer Anfangstemperatur von etwa Raumtemperatur eingestellt ist, vorzugsweise bei 20°C. Die Gefrierkammer, die verpackte Gewebe-Äquivalente enthält, wird bei –10,0°C/Minute auf den Fest-Flüssigphasen-Gleichgewichtstemperaturbereich für das kryoprotektive Mittel gekühlt, die für gewöhnlich für 2,0 M Glycerol in DMEM zwischen etwa –5,3°C und –6,0°C liegt. Die Fest-Flüssigphasen-Gleichgewichtstemperatur ist die Temperatur die für ein Seeding des Eises in dem kryoprotektiven Mittel notwendig ist. Die Kammertemperatur wird über eine Zeit gehalten, um die interne Temperatur der verpackten Gewebe-Äquivalente mit der Kammertemperatur auszugleichen. Die Kühlungsrate, die verwendet wird, um die Seeding-Temperatur zu erreichen, ist nicht kritisch. Eine Haltezeit von etwa 40 Minuten ist ausreichend, um ein thermisches Gleichgewicht zu garantieren, aber die Zeit variiert, abhängig von der Kammergröße, der Luftzirkulation innerhalb der Kammer und der Anzahl einzufrierender Packungen.
Während für gewöhnlich mindestens 30 Minuten erforderlich sind, kann es bis zu einer Stunde dauern, um die Herstellung eines Gleichgewichts zu garantieren. Nach der Haltezeit wird eine extrazelluläre Eisbildung durch Seeding angeregt.
Das Eis-Seeding ist als eine Methode zur Auslösung einer Eisbildung in dem extrazellulären kryoprotektiven Mittel definiert. Eine bevorzugte Methode des Eis-Seedings beinhaltet das Kontaktieren der Seite der Schale, die das Gewebe enthält, mit einer gekühlten Sonde, wie einem gekühlten (–196°C) Flüssigstickstoff-Stahlstab. Die Kontaktstelle des Stabes mit der Packung muss unter dem Pegel des kryoprotektiven Gefriermediums in der Packung liegen. Eine andere bevorzugte Methode ist die direkte Freisetzung expandierender Gase, wie Freon oder CO₂, an die Außenseite der Packung. Die Eisbildung kann durch einen Kammer-Spike ausgelöst werden, wobei die Temperatur der Kammer innerhalb eines Bereichs gesenkt und angehoben wird, der zur Bildung eines Eiskristalls ausreicht. Andere Methoden des Eis-Seedings, die in der Technik bekannt sind, können statt dessen verwendet werden.
Sobald alle Gewebe-Äquivalente einem Eiskristall-Seeding unterzogen wurden, werden die Einheiten eine weitere Stunde gehalten, um die Herstellung eines thermodynamischen Gleichgewichts und die Ausbreitung der Eiskeimkristalle in dem gesamten kryoprotektiven Mittel zu ermöglichen. Dann wird die Kühlung bei einer Rate von vorzugsweise etwa –0,02°C/Minute bis etwa –0,3°C/Minute wieder aufgenommen; insbesondere von etwa –0,05 bis etwa –0,1°C/Minute; und besonders bevorzugt von etwa –0,07°C/Minute bis zu einer Endtemperatur, die vorzugsweise mindestens –70,0°C oder weniger beträgt; insbesondere –120°C; noch bevorzugter –140°C; oder besonders bevorzugt –196°C. Wenn sich die Gefrierendtemperatur der Glasübergangstemperatur von Wasser, –120°C, nähert, werden schädliche Temperaturschwankungen während der Beförderung zu Endlagerstätten weniger wahrscheinlich.
Kryokonservierte Gewebe-äquivalente werden von dem programmierbaren Gefriergerät zu einem Lager in einem Dampfphasen-Flüssigstickstofflagertank (Dewar) bei einer Temperatur zwischen etwa –120°C bis –150°C oder in flüssigem Stickstoff bei –196°C bis zur Verwendung befördert.
Zum Auftauen werden die kryokonservierten gezüchteten Gewebe-Äquivalente dem Dampfphasen-Flüssigstickstofflagertank entnommen und auf Trockeneis überführt, wo sie auf etwa –75°C erwärmt werden. Sobald sie bei –75°C equilibriert sind, werden die gezüchteten Gewebe-Äquivalente dann in eine Umgebung gebracht, vorzugsweise ein Wasserbad, das vorzugsweise bei 37°C eingestellt ist; oder insbesondere bei 4°C eingestellt ist, oder besonders bevorzugt bei Raumtemperatur eingestellt ist. Sobald erkennbar ist, dass das gesamte kryoprotektive Medium in die flüssige Phase übergegangen ist, werden die gezüchteten Gewebe-Äquivalent-Packungseinheiten vorzugsweise zu einer Sterilbank (Biological Safety Cabinet) oder zu einem anderen aseptischen Bereich befördert und mit Ethanol desinfiziert. Die Deckel der Schalen werden entfernt, indem das Deckelmaterial vom Boden der Einheit abgezogen oder abgeschnitten wird. Die Träger, die gezüchtete Gewebe-Äquivalente enthalten, werden dann in Petri-Schalen überführt, während überschüssiges kryoprotektives Mittel abgegossen wird. Zum Abspülen des verbleibenden kryoprotektiven Mittels von dem gezüchteten Gewebe-Äquivalent werden dann 25 ml Spüllösung, vorzugsweise DMEM bei Raumtemperatur, für etwa 30 Minuten der Petri-Schale zugegeben, die das gezüchtete Gewebe-Äquivalent enthält. Andere ausreichende Spülmittel, vorzugsweise Lösungen physiologischer Stärke, wie Zellkulturmedien oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung, können von einem Fachmann bestimmt werden. Die Spüllösung wird ein zweites Mal für weitere 30 Minuten getauscht. Die Spülzeiten sind abhängig von der Komplexität des Gewebes unterschiedlich.
Die gezüchtete Gewebe-Äquivalenteinheit kann dann wieder in die ursprüngliche Kulturschale überführt und in Kulturerhaltungsmedium bei 37°C/10% CO₂ erneut gezüchtet werden. Als Alternative kann das Äquivalent bei einem Patienten angewendet oder auf eine Reaktion auf den Kontakt mit einer Substanz getestet werden, wie in US Patent 4,835,102 beschrieben ist.
Die folgenden Beispiele sind für eine bessere Erklärung der Durchführung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt und sollten in keiner Weise als Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung verstanden werden. Dem Fachmann ist klar, dass verschiedene Modifizierungen an den hierin beschriebenen Verfahren vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung Abstand zu nehmen.
BEISPIELE
Beispiele 1 bis 3
Die Beispiele 1 bis 3 zeigen die Kryokonservierungs- und Auftautechniken dieser Erfindung mit dem bevorzugten Verpackungsdesign.
Beispiel 1: Kryokonservierung des Living Skin Equivalent (LSE) mit dem Verpackungsdesign
Living Skin Equivalent (LSE) Konstrukte wurden nach EP-A-0418035 hergestellt. LSEs und daran haftende 75 mm Trägereinsätze (TRANSWELL^®, Costar, Cambridge) 9 bis 10 Tage nach dem Air-Lift wurden in 100 mm Petri-Schalen (Costar) eingebracht. LSE-Konstrukte wurden mit kryoprotektivem Mittel durchtränkt, indem die Konstrukte und der Transwell-Einsatz eine Stunde in 25 ml kryoprotektives Medium, 2 M Glycerol in DMEM, in den 100 mm Petri-Schalen getaucht wurden. Während der Durchtränkung wurden die Konstrukte eine Stunde auf einem Orbitalschüttler (Bellco) bei 70 U/min in einer 10% CO₂ begasten Kammer gerührt. Das Rühren ermöglicht eine vollständigere Durchtränkung und bessere Reproduzierbarkeit des Kryokonservierungsverfahrens. Sobald das LSE durchtränkt war, wurden die Petri-Schalen, die LSE, Trägereinsätze und extrazelluläre Gefriermedien (2 M Glycerol und DMEM) enthielten, in eine Kryokonservierungspackung eingebracht und heißgesiegelt.
Die Kammer eines programmierbaren Gefriergeräts (Planer) wurde mit der hierin beschriebenen Erfindung bestückt. Das Gefriergerät wurde auf eine Anfangstemperatur von 20,0°C eingestellt. Die Schlauchleitungen wurden mit Freon ein einziges Ein-Sekundenintervall gespült, um etwaige Luft in den Leitungen zu entfernen. Verpackte LSE-Einheiten wurden sicher in Regale gestellt, die jeweils acht LSE-Einheiten aufnahmen. Die Regale, die durch Positionierstifte geführt wurden, wurden neben den Sprühschienen positioniert. Die Kammertüre des Gefriergeräts wurde geschlossen, um die Kammer von der äußeren Umgebung abzuschotten.
LSE-Einheiten wurden bei –10°C/Minute auf –6°C gekühlt und die Kammertemperatur wurde 40 Minuten bei –6°C gehalten, um das kryoprotektive Mittel und die durchtränkten Konstrukte auf die Kammertemperatur zu äquilibrieren. Nach 40 Minuten Haltezeit wurde extrazelluläres Eis durch direkte Abgabe von Freon über eine Sekunde nahe der Seite der Packung angeregt. Freon, während es von der Oberfläche der Packung verdampft wird, veranlasst, dass die Kontaktfläche des Freons ausreichend an Temperatur verliert, um eine extrazelluläre Eisbildung anzuregen.
Sobald bei allen LSE-Einheiten ein Eiskristall-Seeding durchgeführt war, wurden die Einheiten eine Stunde bei –6°C äquilibrieren gelassen. Die Kammertemperatur wurde dann bei –0,07°C/Minute auf eine Endtemperatur von –20°C gekühlt. Die Kammer wurde dann bei –0,5°C/Minute auf eine Endtemperatur von –70°C gekühlt. Sobald die LSE-Einheiten kryokonserviert waren, wurden sie in einen Dampfphasenlagertank (Dewar) bei einer Temperatur von –120°C bis –150°C überführt.
Beispiel 2: Auftauen des kryokonservierten LSE
Kryokonservierte LSEs wurden aus dem Dampfphasen-Flüssigstickstofflager entnommen und auf Trockeneis überführt, wo sie auf etwa –75°C erwärmt wurden. Sobald die gezüchteten Gewebe-Äquivalente bei –75°C äquilibriert waren, wurden sie in ein Wasserbad überführt, das vorzugsweise bei 37°C eingestellt war, insbesondere bei 4°C eingestellt war, oder besonders bevorzugt bei Raumtemperatur eingestellt war. Sobald erkennbar ist, dass das gesamte kryoprotektive Medium in die flüssige Phase übergegangen ist, werden die gezüchteten Gewebe-Äquivalent-Packungseinheiten vorzugsweise zu einer Sterilbank (Biological Safety Cabinet) oder zu einem anderen aseptischen Bereich befördert und mit Ethanol desinfiziert. Die Deckel der Schalen werden entfernt, indem das Deckelmaterial vom Boden der Einheit abgezogen oder abgeschnitten wird. Die Träger, die gezüchtete Gewebe-Äquivalente enthalten, werden dann in Petri-Schalen überführt, während überschüssiges kryoprotektives Mittel abgegossen wird. Zum Abspülen des verbleibenden kryoprotektiven Mittels von dem gezüchteten Gewebe-Äquivalent werden dann 25 ml (Raumtemperatur) Spüllösung, vorzugsweise DMEM, für etwa 30 Minuten der Petri-Schale zugegeben, die das gezüchtete Gewebe-Äquivalent enthält. Andere ausreichende physiologische Spüllösungen, wie andere Zellkulturmedien oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung, können von einem Fachmann bestimmt werden. Die Spüllösung wird ein zweites Mal für weitere 30 Minuten getauscht.
Aufgetaute kryokonservierte und Kontrollproben wurden mit histologischen Methoden bearbeitet und durch Lichtmikroskopie auf morphologische Organisation und Lebensfähigkeit evaluiert und zeigten nahezu 100% Lebensfähigkeit und waren von einer Kontrolle nahezu nicht zu unterscheiden.
Beispiel 3: Evaluierung des Kryokonservierungspackungsdesigns auf Erwärmungsrate und thermische Gleichförmigkeit
Eine Kryokonservierungspackung der vorliegenden Erfindung wurde auf gleichförmige Wärmeübertragung evaluiert. An einer Trägermembran, ohne gezüchtetes Gewebe-Äquivalent, wurden fünf Thermosonden montiert, eine in der Mitte und vier mit gleichmäßigem Abstand von 1,0 mm zu der Umfangswand des Trägers. Thermosondenleiter erregten die Packung von der Seite zwischen Deckel- und Schalenflanschen zu einem Temperaturschreiber (Azonix Scanner Plus). Die Packung wurde mit 17 ml kryoprotektivem Mittel gefüllt und die Packung wurde heißgesiegelt. Die Packung wurde auf –70°C äquilibiriert und dann in ein Wasserbad überführt, das bei 20°C eingestellt war. Der Temperaturschreiber zeichnete die Temperatur an jeder Thermosonde alle 1 bis 2 Sekunden während der Erwärmung auf. Die Packung erwärmte sich anfangs bei einer Rate von 700°C/min, die sich verlangsamte, wenn sie sich dem Schmelzpunkt der kryoprotektiven Lösung näherte. Die thermische Gleichförmigkeit lag zwischen 2°C und 6°C der durchschnittlichen Thermosondentemperatur während der schnellsten Erwärmungsraten und näherte sich 8°C, wenn sie den Schmelzpunkt der Lösung erreichte.
Beispiele 4 bis 12 zeigen das Kryokonservierungsverfahren dieser Erfindung bei verschiedenen Geweben.
Beispiel 4: Kryokonservierung epidermaler Schichten
Epidermale Schichten wurden aus reifem LSE 12 Tage nach einem Air-Lift gewonnen. Die Entfernung der epidermalen Schicht wurde durch Abziehen der dermalen Substratschicht von der epidermalen Schicht mit Pinzetten und Verwerfen der dermalen Schicht erreicht. Jede Schicht wurde in drei äquivalente Stücke geschnitten. Ein Stück von jeder Schicht wurde als Kontrolle fixiert. Die verbleibenden zwei Stücke von jeder Schicht wurden auf eine 75 mm Polycarbonat-Transwell-Membran (Costar) in 100 mm Kulturschalen (Costar) gelegt. Jedes Stück wurde mit 25 ml DMEM und 2 M Glycerol eine Stunde durchtränkt. Die Schalen, die die Konstrukte enthielten, wurden eine Stunde auf einen Orbitalschüttler (Bellco) bei 70 U/min in einer 10% CO₂ begasten Kammer gestellt. Sobald die epidermale Schicht durchtränkt war, wurde die Petri-Schale, die die epidermale Schicht, den Transwell-Einsatz und extrazelluläres Gefriermedium (2 M Gylcerol und DMEM) enthielt, in einen Beutel gelegt und vakuumgesiegelt (Audiovox), mit einer Programmierung für ein Vakuum über 5 Sekunden und einer Versiegelungszeit von 3,9 Sekunden.
Verpackte epidermale Schichten wurden in das programmierbare Gefriergerät (Planer) bei einer Anfangstemperatur von 20,0°C eingebracht. Die epidermalen Schichten wurden bei –10,0°C/Minute auf –6,0°C gekühlt. Die Temperatur wurde 20 Minuten bei –6,0°C gehalten, um auf die Kammertemperatur zu äquilibrieren. Nach der Haltezeit von 20 Minuten wurde extrazelluläres Eis durch den Kontakt der Außenseite des Beutels, unterhalb des Pegels des Gefriermediums, mit einer gekühlten Flüssigstickstoffsonde ausgelöst. Sobald bei allen epidermalen Schichten ein Eiskristall-Seeding durchgeführt war, wurde die Temperatur weitere 5 Minuten bei –6,0°C gehalten. Die Kammer wurde dann bei –1,0°C/Minute auf –8,0°C gekühlt. Die Temperatur wurde 30 Minuten bei –8,0°C gehalten, um eine gleichförmige Verteilung des Eises in der Probe zu ermöglichen. Die Kammer wurde dann bei –0,1°C/Minute auf eine Endtemperatur von –70,0°C gekühlt.
Kryokonservierte epidermale Schichten wurden dem Gefriergerät entnommen und die Beutel wurden aus den Petri-Schalen geschnitten und die Deckel wurden entfernt. Zum Auftauen wurden 40 ml des erwärmten (37°C) DMEM aseptisch in jede Petri-Schale gegossen. Nach 45 Sekunden wurde die gesamte Flüssigkeit aus den Schalen entfernt und ein zusätzliches 40 ml Aliquot wurde jeder Schale für zwei Minuten zugegeben. Sobald das gesamte Eis aufgetaut war, wurden die epidermalen Schichten 30 Minuten mit 25 ml DMEM gespült. Das Medium wurde ein zweites Mal für weitere 30 Minuten getauscht. Die epidermalen Schichten wurden dann in einem Kulturerhaltungsmedium bei 37°C/10% CO₂ 24 Stunden vor der Analyse inkubiert. Die Inkubationszeit wird aufgrund der Verzögerung gewährt, die für gewöhnlich bei gefrorenen Zellen beobachtet wird, bis sie wieder Steady-State-Bedingungen herstellen. Auch hier wurde die Inkubationszeit aufgrund der Verzögerung gewährt, die für gewöhnlich bei gefrorenen Zellen beobachtet wird, bis sie wieder Steady-State-Bedingungen herstellen.
Von den zwei verbleibenden Stücken von jeder epidermalen Schicht wurde eines für die Histologie verarbeitet und ein Stück von jeder Schicht wurde nach dem MTT-Testprotokoll getestet. Ein Vergleich von Fotomikrografien einer nicht-kryokonservierten epidermalen Schicht und kryokonservierten epidermalen Schicht von Beispiel 4 zeigt, dass alle drei grundlegenden Merkmale der Epidermis: die Basalschicht der Epidermis, die Suprabasalschichten der Epidermis und das Stratum corneum der Epidermis, durch dieses Verfahren konserviert wurden. Alle Schichten waren intakt und die gesamte Morphologie der kryokonservierten epidermalen Schicht war mit jener der nicht-kryokonservierten epidermalen Schicht identisch.
Beispiel 5: Kryokonservierung des dermalen Äquivalents
Dermale Äquivalente, die in dieser Studie verwendet wurden, waren die nicht-epidermalisierte Komponente des LSE. Dermale Äquivalente wurden 8 Tage nach dem Aussäen eingefroren. Die dermalen Äquivalente wurden mit kryoprotektivem Mittel durch Eintauchen durchtränkt, indem die dermalen Äquivalente, die an 75 mm Transwell-Einsätzen (Costar) hafteten, die in 100 mm Petri-Schalen (Costar) platziert waren, eine Stunde mit 25 ml DMEM und 2 M Glycerol getaucht wurden. Die Petri-Schalen wurden eine Stunde auf einen Orbitalschüttler (Bellco) bei 70 U/min in einer 10% CO₂ begasten Kammer gestellt. Sobald die dermalen Äquivalente durchtränkt waren, wurden die Petri-Schalen, die dermalen Äquivalente, die Transwell-Einsätze und extrazellulären Gefriermedien in das programmierbare Gefriergerät (Planer) bei einer Anfangstemperatur von 20,0°C eingebracht. Die Kammer wurde dann bei –10,0°C/Minute auf –6,0°C gekühlt. Die Temperatur wurde 20 Minuten bei –6,0°C gehalten, um auf die Kammertemperatur zu äquilibrieren. Nach der Haltezeit von 20 Minuten wurde extrazelluläres Eis durch den Kontakt der Außenseite der Schalen, unterhalb des Pegels des Gefriermediums, mit einer gekühlten Flüssigstickstoffsonde ausgelöst. Sobald bei allen dermalen Äquivalenten ein Eiskristall-Seeding durchgeführt war, wurde die Temperatur weitere 5 Minuten bei –6,0°C gehalten. Die Kammer wurde dann bei –1,0°C/Minute auf –8,0°C gekühlt. Die Kammertemperatur wurde wieder 30 Minuten bei –8,0°C gehalten, um eine gleichförmige Verteilung des Eises in der Probe zu ermöglichen. Die dermalen Äquivalenteinheiten wurden dann bei –0,1°C/Minute auf eine Endtemperatur von –70,0°C gekühlt.
Kryokonservierte dermale Äquivalente wurden dann dem Gefriergerät entnommen und der Deckel der Schale wurde entfernt. Zum Auftauen wurden 40 ml erwärmtes (37°C) DMEM aseptisch in jede Petri-Schale gegossen. Nach 45 Sekunden wurde die gesamte Flüssigkeit aus den Schalen entfernt und ein zusätzliches 40 ml Aliquot wurde jeder Schale für zwei Minuten zugegeben. Sobald das gesamte Eis aufgetaut war, wurden die dermalen Äquivalente 30 Minuten mit 25 ml DMEM gespült. Das Medium wurde ein zweites Mal für weitere 30 Minuten getauscht. Die dermalen Äquivalente, die noch an den Transwell-Einsätzen hafteten, wurden dann wieder in die Kulturschalen eingebracht und in einem Kulturerhaltungsmedium bei 37°C/10% CO₂ 24 Stunden vor der Analyse inkubiert. Die Inkubationszeit wird aufgrund der Verzögerung gewährt, die für gewöhnlich bei gefrorenen Zellen beobachtet wird, bis sie wieder Steady-State-Bedingungen herstellen. Die Proben wurden nach dem MTT-Testprotokoll getestet.
Beispiel 6: Kryokonservierung von Kornea-Äquivalenten
Kornea-Äquivalente, die an 24 mm Kultur-Transwell-Einsätzen (Costar) hafteten, 9 Tage nach einem feuchten Air-Lift, wurden in Cluster-Schalen mit sechs Vertiefungen (Costar) eingebracht. Das Verfahren zum Durchtränken von Kornea-Äquivalenten mit kryoprotektivem Mittel beinhaltete das Eintauchen jedes Kornea-Äquivalents und Transwell-Einsatzes in 4 ml extrazelluläres Gefriermedium (2 M Glycerol in DMEM) in den Cluster-Schalen mit sechs Vertiefungen über eine Stunde. Die Cluster-Schalen mit sechs Vertiefungen, die die Kornea-Konstrukte enthielten, wurden eine Stunde auf einem Orbitalschüttler (Bellco) bei 70 U/min in einer 10% CO₂ begasten Kammer geschüttelt. Sobald die Kornea-Äquivalente durchtränkt waren, wurden die Petri-Schalen, die die Kornea-Äquivalente, die Transwell-Einsätze und extrazelluläres Gefriermedium enthielten, in ein programmierbares Gefriergerät (Planer) bei einer Anfangstemperatur von 20,0°C eingebracht. Die Kornea-Äquivalente wurden bei –10,0°C/Minute auf –6,0°C gekühlt. Die Temperatur wurde 20 Minuten gehalten, um auf die Kammertemperatur zu äquilibrieren. Nach der Haltezeit von 20 Minuten wurde extrazelluläres Eis durch den Kontakt der Außenseite jeder Vertiefung in der Cluster-Platte, unterhalb des Pegels des Gefriermediums, mit einer gekühlten Flüssigstickstoffsonde ausgelöst. Sobald bei allen Kornea-Äquivalenten ein Eiskristall-Seeding durchgeführt war, wurde die Temperatur weitere 5 Minuten bei –6,0°C gehalten, bevor bei –1,0°C/Minute auf –8,0°C gekühlt wurde. Die Temperatur wurde wieder 30 Minuten bei –8,0°C gehalten, um eine gleichförmige Verteilung des Eises in der Probe zu ermöglichen. Die Kornea-Äquivalenteinheiten wurden bei –0,1°C/Minute auf eine Endtemperatur von –70,0°C gekühlt.
Die kryokonservierten Kornea-Äquivalente wurden dem Gefriergerät entnommen. Der Deckel der Schale wurde entfernt. Zum Auftauen wurden 6 ml des erwärmten (37°C) DMEM aseptisch in jede Vertiefung der Cluster-Platte gegossen. Nach 45 Sekunden wurde die gesamte Flüssigkeit aus der Schale entfernt und ein zusätzliches 6 ml Aliquot wurde jeder Schale für zwei Minuten zugegeben. Unter Verwendung steriler Pinzetten wurden die Kornea-Äquivalente und die daran haftenden Transwell-Einsätze in eine neue Cluster-Schale überführt. Zum Spülen wurden 4 ml DMEM jeder Vertiefung für 30 Minuten zugegeben. Das Medium wurde ein zweites Mal für weitere 30 Minuten getauscht. Die Kornea-Einheiten wurden dann in dieselbe Kulturschale zurückgeführt und in einem Korneaerhaltungsmedium bei 37°C/10% CO₂ 24 Stunden vor der Analyse inkubiert. Die Inkubationszeit wird aufgrund der Verzögerung gewährt, die für gewöhnlich bei gefrorenen Zellen beobachtet wird, bis sie wieder Steady-State-Bedingungen herstellen. Die Proben wurden nach dem MTT-Testprotokoll getestet.
Beispiel 7: Kryokonservierung geernteter Haut von Mäusen
Wildtyp-Mäuse, Stamm B6CB6YF1, wurden mit einer Nembutal-Überdosis euthanasiert. Die Haut wurde aseptisch geerntet. Überschüssige Blutgefäße, Fett und Bindegewebe wurden von der Dermis entfernt. Die Mäusehaut wurde auf ein Rechteck von 1 cm × 2 cm zugeschnitten. Mäusehautstücke wurden dann auf einen 75 mm Transwell-Einsatz (Costar) in 100 mm Petri-Schalen (Costar) gelegt. Die Mäusehaut wurde mit kryoprotektivem Mittel durchtränkt, indem sie eine Stunde in 25 ml 2 M Glycerol in DMEM in den 100 mm Petri-Schalen eingetaucht wurde. Während der Durchtränkung wurden die Petri-Schalen, die jeweils die Mäusehaut und die Transwell-Einsätze enthielten, eine Stunde auf einem Orbitalschüttler (Bellco) bei 70 U/min in einer 10% CO₂ begasten Kammer geschüttelt. Nicht-kryokonservierte Kontrollmäusehaut wurde für die Dauer der Kryokonservierung und des Auftauprozesses (2 Tage) vor der Hauttransplantation in Nährmedium bei 4°C gehalten.
Sobald die Mäusehaut durchtränkt war, wurden die Petri-Schalen, die die Mäusehaut, die Transwell-Einsätze und extrazelluläres Gefriermedium enthielten, in ein programmierbares Gefriergerät (Planer) bei einer Anfangstemperatur von 20,0°C eingebracht. Die Mäusehaut wurde bei –10,0°C/Minute auf –6,0°C gekühlt und 20 Minuten bei –6,0°C gehalten, um auf die Kammertemperatur zu äquilibrieren. Nach der Haltezeit von 20 Minuten wurde extrazelluläres Eis durch den Kontakt der Außenseite der Schale mit einer gekühlten Flüssigstickstoffsonde ausgelöst. Die Kontaktstelle muss unterhalb des Pegels des Gefriermediums liegen. Sobald bei der gesamten Mäusehaut Eiskristall-Seeding durchgeführt war, wurde die Temperatur weitere 5 Minuten bei –6,0°C gehalten, bevor bei –1,0°C/Minute auf –8,0°C gekühlt wurde. Die Temperatur wurde wieder 30 Minuten bei –8,0°C gehalten, um eine gleichförmige Verteilung des Eises in der Probe zu ermöglichen. Die Einheiten wurden dann bei –0,1°C/Minute auf eine Endtemperatur von –70,0°C gekühlt.
Kryokonservierte Mäusehaut wurde dem Gefriergerät entnommen und der Deckel der Schale wurde entfernt. Zum Auftauen wurden 40 ml des erwärmten (37°C) DMEM aseptisch in die Petri-Schalen gegossen. Nach 45 Sekunden wurde die gesamte Flüssigkeit aus den Schalen entfernt und ein zusätzliches 40 ml Aliquot wurde den Schalen für zwei Minuten zugegeben. Sobald das gesamte Eis aufgetaut war, wurde die Mäusehaut in den Schalen mit 25 ml DMEM 30 Minuten gespült. Das Medium wurde ein zweites Mal für weitere 30 Minuten getauscht.
Aufgetaute kryokonservierte und Kontrollproben wurden für die Histologie bearbeitet oder auf Mäuse transplantiert. Die Fotomikrografien einer nicht-kryokonservierten Mäusehaut im Vergleich zu einer kryokonservierten Mäusehaut zeigten, dass alle vier grundlegenden Merkmale der Mäusehaut, die Dermis mit Fibroblasten, die Basalschicht der Epidermis, die Suprabasalschichten der Epidermis und das Stratum corneum der Epidermis, durch dieses Verfahren konserviert wurden. Alle Schichten waren intakt und die gesamte Morphologie der kryokonservierten Mäusehaut war mit jener der nicht-kryokonservierten Mäusehaut identisch.
Beispiel 8: Kryokonservierung von ATS SKIN2^TM
SKIN2^TM, Modell ZK 1300 (Advanced Tissue Sciences, La Jolla, CA) wurde bei der Ankunft der Packung entsprechend den Versandbeilagen entnommen und in Kulturschalen (Costar) eingebracht. Transwell-Einsätze wurden über die SKIN2^TM gelegt, um das Hautkonstrukt eingetaucht zu halten. SKIN2^TM wurde mit einem kryoprotektiven Mittel durchtränkt, indem SKIN2^TM eine Stunde in 2 M Glycerol in DMEM in den Kulturschalen eingetaucht wurde. Während der Durchtränkung wurden die Kulturschalen, die das Konstrukt und den Transwell-Einsatz enthielten, eine Stunde auf einem Orbitalschüttler (Bellco) bei 70 U/min in einer 10% CO₂ begasten Kammer geschüttelt.
Sobald die SKIN2^TM durchtränkt war, wurden die Einheiten in ein programmierbares Gefriergerät (Planer) bei einer Anfangstemperatur von 20,0°C eingebracht. Die SKIN2^TM-Einheiten wurde bei –10,0°C/Minute auf –6,0°C gekühlt und 20 Minuten bei –6,0°C gehalten, um auf die Kammertemperatur zu äquilibrieren. Nach der Haltezeit von 20 Minuten wurde extrazelluläres Eis durch den Kontakt der Außenseite der Schalen unterhalb des Pegels des Gefriermediums mit einer gekühlten Flüssigstickstoffsonde ausgelöst. Sobald bei allen SKIN2^TM-Einheiten ein Eiskristall-Seeding durchgeführt war, wurde die Temperatur weitere 5 Minuten bei –6,0°C gehalten. Die Kammertemperatur wurde dann bei –1,0°C/Minute auf –8,0°C gekühlt. Die SKIN2^TM-Einheiten wurden wieder 30 Minuten bei –8,0°C gehalten, um eine gleichförmige Verteilung des Eises in der Probe zu ermöglichen. Die SKIN2^TM-Einheiten wurden dann bei –0,1°C/Minute auf eine Endtemperatur von –70,0°C gekühlt.
Die kryokonservierten SKIN2^TM wurden dem Gefriergerät entnommen, die Deckel der Schalen wurden entfernt und erwärmtes (37°C) DMEM wurde aseptisch in jede Petri-Schale gegossen. Nach 45 Sekunden wurde die gesamte Flüssigkeit aus den Schalen entfernt und zusätzliches DMEM wurde jeder Schale für zwei Minuten zugegeben. Sobald die SKIN2^TM-Einheit aufgetaut war, wurde sie mit dem anhaftenden Transwell-Einsatz unter Verwendung steriler Pinzetten in neue Kulturschalen überführt. Zum Abspülen des kryoprotektiven Mittels von der SKIN2^TM wurde DMEM jeder Kulturschale, die die SKIN2^TM enthielt, für 30 Minuten zugegeben. Das Medium wurde ein zweites Mal für weitere 30 Minuten getauscht. Die SKIN2^TM-Einheit wurde dann in dieselbe Kulturschale zurückgeführt und in einem Kulturerhaltungsmedium bei 37°C/10% CO₂ 24 Stunden vor der Analyse inkubiert. Auf hier wird die Inkubationszeit aufgrund der Verzögerung gewährt, die für gewöhnlich bei gefrorenen Zellen beobachtet wird, bis sie wieder Steady-State-Bedingungen herstellen.
Kryokonservierte und Kontrollkonstrukte wurden nach dem MTT-Testprotokoll für das SKIN2^TM Modell ZK1300 getestet, das dem Produkt beigelegt ist, und auch durch histologische Evaluierung. Die Fotomikrografien einer nicht-kryokonservierten SKIN2^TM im Vergleich zu einer kryokonservierten SKIN2^TM zeigten, dass alle vier grundlegenden Merkmale der SKIN2^TM, das Collagengitter mit Fibroblasten, die Basalschicht der Epidermis, die Suprabasalschichten der Epidermis und das Stratum corneum der Epidermis, durch dieses Verfahren konserviert wurden. Alle Schichten waren intakt und die gesamte Morphologie der kryokonservierten SKIN2^TM war ähnlich jener der nicht-kryokonservierten SKIN2^TM
Beispiel 9: Metabolischer mitochondraler Aktivitätstest (MTT)
Gefrorenes und nicht gefrorenes (Kontroll-) LSE, epidermale Schicht, dermale Äquivalente und Kornea-Äquivalente wurden unter Verwendung des MTT-Tests getestet. [SKIN2^TM-Kon strukte wurden nach dem "MTT Assay Protocol for use with Model ZK1300" getestet, das den Versanddokumenten beigelegt ist]. Die Zelllebensfähigkeit der Konstrukte wurde unter Verwendung des MTT-Tests, eines kolorimetrischen MTT-Umwandlungstests, der zur Messung des zellulären Wachstums und der Lebensfähigkeit entwickelt wurde, gemessen. Dieser Test ist ausführlich in Gay et al., "The Living Skin Equivalent as a Model In Vitro for Ranking the Toxic Potential of Dermal Irritants", Toxic. in Vitro, 6: 303–315, (1992), beschrieben. Die metabolische Reduktion des löslichen Tetrazolsalzes zu einem blauen Formazan-Präzipitat hängt von der Gegenwart lebensfähiger Zellen mit intakter mitochondraler Funktion ab. Der Test wird zur Quantifizierung der Zytotoxizität in einer Reihe von Zelltypen verwendet, einschließlich gezüchteter menschlicher Keratinozyten.
Zu den Kulturschalen, die LSE, epidermale Schicht und dermales Äquivalent enthielten, wurden 40 ml Testmedium zugegeben, und den Vertiefungen, die Kornea-Äquivalente enthielten, wurden 1,5 ml Testmedium zugegeben, das 0,33 mg/ml MTT (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt. Die Gewebe-Äquivalente wurden in dem MTT-Testmedium 3 bis 4 Stunden inkubiert. Am Ende der Umwandlungsperiode wurde das Gewebe-Äquivalent unter Verwendung einer Hautbiopsiestanze mit 8 mm Durchmesser biopsiert. Die Stanzbiopsien wurden dann 2 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur in 0,3 ml Isopropanol, angesäuert mit 0,04 N HCl, extrahiert. Am Ende der Extraktionsperiode wurden 0,2 ml jedes Extrakts in eine Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen überführt. Die Extinktion wurde auf einem Plattenlesegerät (Dynatech) bei 570 nm mit dem Isopropanol-Extraktionsmedium als Blindprobe abgelesen. MTT-Werte, die von aufgetauten kryokonservierten Proben erhalten worden waren, wurden mit den entsprechenden Kontrollproben verglichen und als Prozent der Kontrolle angegeben (9).
Beispiel 10: Laktose-Dehydrogenase-Test (LDH)
LDH ist ein Enzym, das für gewöhnlich in einer lebensfähigen Zelle vorgefunden wird. Eine Schädigung der Zelle bewirkt eine Freisetzung des Enzyms und eine entsprechende Abnahme in der Enzymaktivität, die durch diesen Test erfasst wird.
Aufgetaute kryokonservierte und Kontrollproben von LSE wurden unter Verwendung einer Hautbiopsiestanze mit 8 mm Durchmesser gestanzt. Drei Proben wurden von jeder LSE-Einheit entnommen. Die Stanzproben wurden in 15 mm Röhrchen mit 1 ml 0,1 M Triethanolaminpuffer (auf Eis) eingebracht und mit einem elektrischen Gewebehomogenisator eine Minute homogenisiert. Die Proben wurden dann bei 1000 g bei 4,0°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dann getestet. Ein LDH-Cocktail-Reagens wurde durch Mischen der folgenden Substanzen hergestellt: 3,00 ml Phosphatpuffer (0,1 Mol/l; pH 7,0); 0,1 ml Pyruvat, Na-Salz (2,5 mg/ml) und 0,05 ml NADH, Na-Salz (10 mg/ml). 100 μl Probenüberstand wurden zu 900 μl der Reagenzien zugegeben und zwei Minuten reagieren gelassen. Die Änderung in der Extinktion im Laufe der zwei Minuten wurde aufgezeichnet. Der Durchschnitt von drei Proben pro kryokonservierter LSE-Einheit wurde mit den nicht gefrorenen Kontrollen verglichen. Probenwerte wurden mit entsprechenden Kontrollwerten verglichen und als Prozent der Kontrolle angegeben (9).
Beispiel 11: Bioäquivalenz von kryokonserviertem LSE mit nicht-kryokonserviertem LSE
Für den Nachweis der Bioäquivalenz von kryokonserviertem und nicht-kryokonserviertem LSE wurde eine Transplantatsstudie an athymischen Mäusen durchgeführt.
LSE-Einheiten, die nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren kryokonserviert waren, wurden einen Tag vor einer Transplantation aufgetaut und in Erhaltungsmedium vierundzwanzig Stunden gewonnen.
Es wurden vier Experimente durchgeführt, in welchen insgesamt 66 athymische Mäuse des Stamms B6CB6YF1/J-nu (Jackson Harbor Labs) entweder ein Transplantat des kryokonservierten LSE (n = 43) oder des nicht-kryokonservierten (Kontroll-) LSE (n = 23) erhielten. Die Tiere wurden mit Nembutal anästhesiert. Ein 2 × 2 cm Hautabschnitt voller Dicke wurde aus dem Dorsum jeder Maus unter Aussparung des Panicculus carnosus geschnitten. LSE-Transplantate, entweder die Kontrolle oder die kryokonservierten, wurden auf die Wunde gelegt und passend zurechtgeschnitten. Alle Transplantate wurden mit einer Lage Petrolat-imprägniertem Verbandsmull (Lieferant) verbunden und mit zwei Haftbandagen (Lieferant) bedeckt. Die Verbände wurden 7 Tage nach der Transplantation entfernt.
14 Tage nach der Transplantation wurden alle Tiere euthanasiert und fotografiert. Die Transplantationsstelle wurde dann zur histologischen Analyse und Evaluierung ausgeschnitten. Die Großaufnahmen und Mikrographien zeigten keinen Unterschied in der Transplantatsintegration zwischen Kontroll-LSE oder aufgetautem, kryokonservierten LSE. Es wurde kein signifikanter Unterschied in den Raten der Wundkontraktur zwischen Kontroll- oder kryokonserviertem Transplantat beobachtet.
Beispiel 12: Syngenische Hauttransplantation kryokonservierter und Kontroll-Mäusehaut
Für den Nachweis der Bioäquivalenz von kryokonservierter und nicht-kryokonservierter Mäusehaut wurde eine syngenische Hauttransplantationsstudie durchgeführt.
Wildtyp-Mäuse, Stamm B6CB6YF1, wurden mit einer Nembutal-Überdosis euthanasiert. Die Haut wurde aseptisch geerntet. Überschüssige Blutgefäße, Fett und Bindegewebe wurden von der Dermis als Vorbereitung zur Hauttransplantation entfernt. Die Mäusehaut wurde nach der Methode von Beispiel 7 kryokonserviert und aufgetaut. Nicht-kryokonservierte Kontroll-Mäusehaut wurde vor der Hauttransplantation für die Dauer des Kryokonservierungs- und Auftau-Prozesses in einem Nährmedium bei 4°C gehalten, insgesamt zwei Tage.
Sechs Mäuse desselben Stamms erhielten Hauttransplantate, zwei erhielten nicht-kryokonservierte Kontroll-Mäusehaut, und vier erhielten aufgetaute, kryokonservierte Mäusehaut. Die Mäuse wurden mit Nembutal anästhesiert. Ein 2 × 2 cm Hautabschnitt voller Dicke wurde aus dem Dorsum jeder Maus unter Aussparung des Panicculus carnosus geschnitten.
Mäusehauttransplantate, entweder die Kontrolle oder die kryokonservierten, wurden auf die Wunde gelegt und passend zurechtgeschnitten. Alle Transplantate wurden mit einer Lage Petrolat-imprägniertem Verbandsmull verbunden, die mit zwei Haftbandagen bedeckt wurde. Die Verbände wurden 7 Tage nach der Transplantation entfernt.
Dreißig Tage nach der Transplantation wurden alle Tiere euthanasiert und fotografiert. Die Transplantationsstelle wurde dann zur histologischen Analyse und Evaluierung ausgeschnitten. Die Großaufnahmen und Mikrographien zeigten keinen Unterschied in der Transplantatsintegration zwischen Kontroll-Mäusehaut oder aufgetauter, kryokonservierter Mäusehaut. Es wurde kein signifikanter Unterschied in den Raten der Wundkontraktur zwischen Kontroll- oder kryokonserviertem Transplantat beobachtet.
Obwohl die vorangehende Erfindung ausführlich anhand von Darstellungen und Beispielen der besseren Erklärung wegen beschrieben wurde, ist für den Fachmann offensichtlich, dass gewisse Änderungen und Modifizierungen innerhalb des Umfangs der beiliegenden Ansprüche ausgeführt werden können.

Claims

Vorrichtung zur Kryokonservierung eines geernteten Säuger-Gewebes oder eines gezüchteten Gewebe-Äquivalents, mit: einer Schale (40) mit einer Bodenfläche (41), die an eine Seitenwand (42) und einen Flansch (43) angrenzt, wobei die Seitenwand (42) nach innen ragende Stützen aufweist, die von der Seitenwand abstehen und mit dieser einstückig ausgebildet sind; einem Träger (30), einschließlich einer flachen, permeablen Membran (32), die an einem Ende einer im Wesentlichen rohrförmigen Stütze (33) befestigt ist, und einem Rand (31) am gegenüberliegenden Ende der rohrförmigen Stütze (33), wobei der Rand (31) von den nach innen ragenden Stützen der Schale (40) abgestützt ist, einem Deckel (10) mit einer planen Bodenfläche (13), die an eine Seitenwand (12) und einen Flansch (11) angrenzt, wobei der Flansch (11) in innigem Kontakt mit dem Flansch (43) der Schale steht; und einer Dichtung (20) zwischen der Schale (40) und dem Deckel (10)
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Dichtung (20) mit einem Klebstoff dichtend mit den Flanschen verbunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Dichtung (20) mit den Flanschen durch Heißsiegelung verbunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei die Dichtung (20) zwischen der Schale (40) und dem Deckel (10) ein ringförmiges Blatt aus heißsiegelbarem Deckelmaterial ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Deckel (10) eine entfernbare Lasche aufweist.
Vorrichtung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Schale (40) und der Deckel (10) aus starren oder halbflexiblen thermoplastischen Materialien erzeugt sind.
Vorrichtung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Träger (30) so innerhalb der Schale (40) angeordnet ist, dass bei Benützung ein gleiches Volumen einer kryoprotektiven Flüssigkeit unter dem Träger und an der Oberfläche eines Gewebe-Äquivalents verteilt ist, wenn dieses im Träger platziert ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei ein biologisches Material im Träger (30) und auf der Membran (32) ist und eine kryoprotektive Lösung in der Tasse (40) ist, so dass ein vertikaler Abstand vom biologischen Material zum Deckel (10) gleich ist einem vertikalen Abstand vom biologischen Material zur Bodenfläche (41) der Schale (40).