FI113694B - Menetelmä ja pakkausrakenne viljeltyjen kudosekvivalenttien kylmäsäilytykseen ja varastoimiseen - Google Patents

Description

113694

MENETELMÄ JA PAKKAUSRAKENNE VILJELTYJEN KUDOSEKVIVA-LENTTIEN KYLMÄSÄILYTYKSEEN JA VARASTOIMISEEN

Keksintö koskee sekä kerätyn kudoksen että in vitro -menetelmällä valmistettujen viljeltyjen kudose-5 kvivalenttien kylmäsäilytystä. Tämä keksintö koskee myös kylmäsäilytyspakkausrakennetta sekä kerättyä kudosta että viljeltyjä kudosekvivalentteja varten, joka on sekä edullinen että helposti käsiteltävä pakkausra-kenne, joka pitää huolen kylmässä säilytettävän kudok-10 sen tai kudosekvivalentin maksimaalisesta elinkelpoisuudesta. Käyttämällä kylmäsäilytysmenetelmää joko kylmässä säilytettyä kerättyä kudosta tai kylmässä säilytettyä viljeltyä kudosta voidaan varastoida rajoittamattomia ajanjaksoja ennen käyttöä. Viljelty ku-15 dos on vastaavan ihmisen kudoksen in vitro -malli, jota varastoinnista palautettuna voidaan käyttää kudok-sensiirtoon tai istutukseen elimistössä (in vivo) tai yhdisteiden seulontaan laboratorio-olosuhteissa (in vitro).

20 In vitro -tekniikka on kehittänyt kudosekvi valentteja in vitro -olosuhteissa testaustarkoituksiin tai in vivo -istutustarkoituksiin haavan korjaukseen. Menetelmiä tällaisten kudosekvivalenttien valmistami- • · · ; seksi on paljastettu patenttijulkaisuissa U.S.

: 25 4,485,096, 4,604,346, 4,835,102 ja 5,374,515 ja U.S.

:·. 08/193,809 ja 08/337,830, jotka kaikki sisällytetään • I > *... tähän hakemukseen tällä viittauksella.

• · • · * Elävien kudosten varastointiaika on rajoitet tu ja näin ollen niiden käyttöaika on lyhyt, mikä joh- • · i ·" ·' 30 taa runsaaseen hävikkiin. On tarvetta säilyttää täl- laisia kudoksia pidempiä ajanjaksoja, kuten kuljetusta . ja varastointia varten, niiden käyttöön asti. Sekä .··, kylmäsäilytysmenetelmän kehittäminen että pakkaus kyl mäsäilytystä ja varastointia varten pidentäisi käyttö-v ' 35 ajan rajoittamattomaksi, helpottaisi kuljetusta ja ’ sallisi varaston ylläpidon. Kudosvaraston mahdollista minen palovammojen hoitokeskuksissa ja sairaaloissa on 2 113694 myös suotavaa. Muita etuja ovat, että näytteet voidaan pitää valmistusjakson eri vaiheista tallessa laadunvalvonta-arkistoja varten ja voidaan tehdä suurempia valmistuseriä, koska niitä voidaan säilyttää jääty-5 neessä tilassa.

Nykyisin solubiologisten materiaalien varas-tointiaikaa pidennetään jäähdyttämällä hyvin mataliin lämpötiloihin. Muutos nesteestä kiinteään olomuotoon alentamalla järjestelmän lämpötilaa voi tapahtua joko 10 kiteytymisenä (jäätymisenä) käsittäen vesimolekyylien oikean järjestäytymisen tai lasittumisena eli muuttumisena amorfiseksi (lasin muodostumisena) ilman tällaista oikeaa kiteisen faasin järjestäytymistä. Kylmä-biologille on haaste saattaa solut hyvin mataliin läm-15 pötiloihin ja sitten palauttaa ne fysiologisiin olosuhteisiin niitä vahingoittamatta.

On kaksi perustapaa lähestyä solujen ja kudosten kylmäsäilytystä: jäädytys-sulatus ja lasittuminen. Jäädytys-sulatusmenetelmissä solujen ulkopuolinen 20 liuos jäädytetään (s.o. kiteisessä muodossa), mutta suoritetaan vaiheita solujen sisäisen jään muodostuk-sen minimoimiseksi. Lasittumismenetelmissä yritetään | estää jään muodostus koko näytteen alueella. Edellinen lähestymistapa on ongelmallinen siinä suhteessa, että 1 25 mikäli jääkiteitä muodostuu solujen sisään, ne ovat t : haitallisia solujen elinkelpoisuudelle niitä sulatet taessa. Solut kuitenkin voivat kestää jäädytys-: sulatusjakson, mikäli ne jäähdytetään säädetyllä no peudella ei-myrkyllisten kylmältä suojaavien ainemää-30 rien mukanaollessa. Viimeksi mainittu lasittumislähes- • · • » .· ·. tyrnistäpä yrittää välttää mahdolliset solujen sisäisen • * • ja ulkoisen jään vahingoittavat vaikutukset alentamal- M.' la jään muodostumista käyttäen hyvin korkeita liuot- I t t :,,,· teiden ja/tai polymeerien pitoisuuksia. Solujen vähin- 35 goittuminen voi kuitenkin tapahtua liian pitkän näille lasittumiseen tarvittavien lisäaineiden myrkyllisille • · määrille altistumisen seurauksena.

3 113694

Kylmältä suojaavat aineet suojaavat eläviä soluja jäätymisprosessiin sisältyviltä jännityksiltä. Yksi tapa, jolla kylmältä suojaavat aineet suojaavat soluja, on laimentamalla suolaa, jota lisääntyvästi 5 väkevöityy jäätymättömässä liuoksessa veden muuttuessa jääksi. Jään määrän sanelee lämpötila ja liuoksen al-kukoostumus; kun taas jäätymättömän osan määrä on ainoastaan lämpötilan funktio. Kylmältä suojaavi11a aineilla on useita muita toimintoja. Eräs tärkeä on se, 10 että ne tavallisesti alentavat solujen sisäisen jään muodostuksen lämpötiloja. Toinen vaikutus on, että ne stabiloivat kalvoja ja proteiineja.

Kaikki liuokset alijäähtyvät jäätymispisteensä alapuolella, kunnes ne löytävät satunnaisen kitey-15 tymiskeskuksen kidemuodostusta varten. Kylmäsäilytet- täessä jäädytys-sulatusmenetelmällä jään muodostuminen solun ulkopuolisessa väliaineessa pitäisi käynnistää varovaisesti ymppäämällä liuosta alhaisilla alijäähdy-tystasoilla. Jos jään muodostusta ei aiheuteta ymppää-20 mällä liuosta, jää muodostuu spontaanisti liuoksen jäähdyttyä riittävästi sen tasapainojäätymispisteen y .t alapuolelle. Koska tämä prosessi on luonteeltaan sa- • tunnainen, jään muodostus tapahtuu satunnaisesti ennä- • I · *·';* koimattomissa lämpötiloissa; sen seurauksena elossa- • * » '·· · 25 pysymisasteet vaihtelevat suuresti toistettujen kokei- ·. : den välillä samaa jäädytysmenettelyä käyttäen. Lisäksi • ♦ • '*· erittäin nopea kiteytyminen, joka on seurauksena, kun .* jää muodostuu erittäin alijäähdytettyyn liuokseen, voi aiheuttaa vahinkoa soluille ja kudoksille. Sen lisäksi :* . 30 on osoitettu, että jos solun ulkopuolinen jään muodos- tus käynnistetään suurilla alijäähdytystasoilla, solun sisäisen jään muodostumisen todennäköisyys kasvaa voi-makkaasti. Tämä ilmiö on seuraus jäätymisen aiheutta-man solun veden poistumisen viivästyneestä käynnistyk-35 sestä, joka johtaa lisääntyneeseen solun sisäisen ve-den retentioon ja siten suurempaan jään muodostuksen todennäköisyyteen solussa.

4 113694

Kun solun ulkopuolinen jää on ympätty liuokseen ja näytettä ympäröi jääfaasi, on tarpeen jäähdyttää näyte kylmäsäilytystilaan. Jäähdytysvaihe on yksi kriittisimmistä vaiheista jäädytys-sulatusmenettelys-5 sä. Jään muodostamisesta, s.o. puhtaasta vedestä, johtuen osittain jäätynyt solun ulkopuolinen liuos on väkevämpi kuin solun sisäinen osa. Sen seurauksena solu dehydratoituu menettämällä vettä yrittäessään palauttaa termodynaamisen tasapainon. Järjestelmän jäähtyes-10 sä kehittyy enemmän solun ulkopuolista jäätä ja liuot-teiden konsentraatio kasvaa ja pakottaa soluja dehyd-ratoitumaan enemmän. Kolme solujen ominais-piirrettä säätelee niiden dehydratoitumisnopeutta. Yksi on solukalvon veden läpäisevyys; mitä alhaisempi veden lä-15 päisevyys sitä kauemmin kestää solujen dehydratoitumi-nen. Toinen on solukalvon veden läpäisevyyden lämpötilariippuvuus; kaikki solut vähentävät niiden vedenläpäisevyyttä lämpötilojen kasvaessa. Viimeinen on solun koko; suurempien solujen dehydratoituminen kestää kau-20 emmin kuin pienten solujen. Syystä, että kullakin solutyypillä voi olla voimakkaasti erilaisia ominaisuuk-, . siä, optimaaliset kylmäsäilytysolosuhteet voivat vaih- t ; della suuruusluokiltaan erilaisia solutyyppejä varten.

• · ··'** Vaikka solun vahingoittumisen kylmäsäilytyk- » * · : 25 sen aikana tarkkoja mekanismeja ei vielä ole täysin • · selvitetty, solujen eloonjääminen jäähtymisnopeuden • '·· funktiona määrittämällä kehitetyt tunnusomaiset eloon- jäämisen merkit näyttävät olevan kvalitatiivisesti samanlaisia kaikille solutyypeille ja sitä kuvaa nurin-3 0 käännetty U-muotoinen käyrä. Solun eloonjääminen on .···, alhainen hyvin hitaalla ja hyvin nopealla jäähdytysno- peudella ja on olemassa välissä oleva jäähdytysnopeus, :.i.· joka tuottaa optimaalisen eloonjäämisen. Vaikka opti- * · · ί.,.Σ maalinen jäähdytysnopeus ja käyrän leveys voivat vaih- 35 della voimakkaasti eri solutyypeille, kvalitatiivinen käyttäytyminen näyttää olevan voimassa kaikille. Nopeammat jäähdytysnopeudet eivät anna soluille tarpeeksi 5 113694 aikaa dehydratoitua ja solut muodostavat jäätä sisäisesti. Solun vahingoittuminen nopeilla jäähdytysnope-uksilla liitetään solun sisäiseen jään muodostukseen. Hitailla jäähtymisnopeuksilla solun vaurion ajatellaan 5 johtuvan erittäin väkevöityneille solun sisäisille ja ulkoisille suola- ja kylmältä suojaaville liuoksille altistumisen seurauksista tai solujen ja solun ulkopuolisen jään välisistä keskinäisistä mekaanisista vaikutuksista.

10 On välttämätöntä dehydrata soluja mahdolli simman paljon ennen kuin ne ylittävät solun sisäisen jään kiteytymiskäyrän. Juuri tässä kohdassa käytännöllisesti katsoen kaikki soluissa jäljellä oleva vesi kiteytyy ja muodostaa jäätä. On mahdotonta määrittää 15 tarkka lämpötila, jossa tämä tapahtuu, mutta suunnilleen -40- -50°C:ssa solut jäätyvät hitaasti kylmältä suojaavien aineiden pitoisuuksien 1-2M ollessa läsnä. On tärkeää huomauttaa, että veden määrä, joka muuttuu jääksi solun sisällä tällä hetkellä, saattaa olla vaa-20 raton jäätyneenä, mutta jos sitä ei sulateta tarpeeksi nopeasti, se laajenee ja tappaa solun sulatettaessa. (Elinten kylmäsäilytyksen biofysiikka, ss. 117-140,

I toimittajat David E. Pegg ja Armand M. Karow, Jr. NATO

ASI Sarja A: Life Sciences, osa 147 1987, Plenum • : 25 Press, New York 233 Spring St., New York, NY 10013) .

1 Ennen kaupallisesti toteuttamiskelpoisen • ’*· ihoekvivalentin kehittämistä, kuolleen ihoa käytettiin : kudoksensiirtotarkoituksiin. Kylmäsäilytysmenetelmiä kehitettiin siksi, että palovammakeskukset ja sairaa-30 lat voisivat ylläpitää ihopankkeja. Lukuisia erilaisia .·*·. suunnitelmia kehitettiin käyttäen hyväksi erilaisia • i '·’ kylmältä suojaavia aineita, jäädytysnopeuksia, pak- kausmuotoja ja varastointiolosuhteita. Useimmat tutki-jät olivat yhtä mieltä nopeasta sulatusmenettelystä. 35 Menettelyn onnistumisen tai epäonnistumisen määritti joko siirrännäisen siirto haava-alustalle tai solujen • · elinkelpoisuusanalyysi.

6 113694

Beisangille myönnetyssä patentissa U.S. 3,842,831 on julkistettu menetelmä kuolleen ihopaikko-jen kylmäsäilyttämiseksi. Menetelmä käsittää kuolleen ihon kiinnittämisen löyhästi kudottuun harsokankaaseen 5 tai pohjakankaaseen ja ihopaikat ja harsokangas valssataan yhdessä ennen jäädytystä. Kylmältä suojaavaa ainetta ei käytetä, vaikka keksijät ehdottavat joko glyseriinin tai DMSO:n käyttöä. Jäädytysmenetelmä käyttää nopeaa säätelemätöntä (kiinteää lämpötilan) 10 jäädytysnopeuden ohjausta alhaiseen -70°C:een lämpötilaan.

May SR ja FA DeClement (Ihopankkitoiminnan metodologia, 17, ss. 33-45 (1980)) suorittivat pak- kausgeometrian ja jäähdytys- ja lämmitysnopeuksien ar-15 vioinnin käyttäen dermatomilla otettua kuolleen ihoa. Tulokset ehdottavat, että kuollen iho on valssaamaton, pikemmin kuin valssattu, ja että käytetään hitaampaa säädettyä jäädytysnopeutta.

Tuholle myönnetty patentti U.S. 5,040,677 20 julkistaa kaasutiiviisti suljettavan pakkauksen yksittäisiä epiteelisolukalvosiirrännäisiä varten. Pakkaus .. . edellyttää epiteelisolukalvon kiinnittämistä liima- * t i * alusta-arkkiin tai -pohjaan käyttämällä kiinnikkeitä.

• i · *··'** Tuholle myönnetty patentti U.S. 5,145,770 * 4 · : 25 julkistaa kylmäsäilytysmenetelmän keratinosyyttikalvo- ja varten, joka käyttää ei soluun tunkeutuvaa kylmältä • suojaavaa ainetta, kuten dekstraania, ja soluun tun- .* keutuvaa reagenssia, kuten glyserolia, jäähdytysnopeu- den ollessa n. -l°C/min. Vastaavasti Chao et ai:lie 30 myönnetty patentti EP 0 364 306 julkistaa menetelmän elävien, viljeltyjen epiteelisolujen kylmäsäilyttämi-seksi, mutta käyttäen sekä DMSO että glyserolia kyl-,· mältä suojaavana aineena ja jäähdytysmenettelynä edul- lisesti -l°C/min.

. 35 Cancedda et ai: lie myönnetty patentti U.S.

• * · (ii>; 5,298,417 julkistaa yksikerroksisille rakenteille, ku- » · ten epiteelikalvoille, jotka on valmistettu kuten pa- 7 113694 tenttijulkaisuissa U.S. 4,016,036, 4,304,866 ja 4,456,687 on kuvattu, kehitetyn kylmäsäilytysmenetel-män. Orvaskesikalvoja inkuboitiin kylmältä suojaavalla aineella, joko 8-15 % glyserolilla tai DMSO:lla, ja 5 kylmäsäilytettiin käyttämällä säädetyn nopeuden menettelyä, jossa jäähdytysnopeus on hitaampi menetelmän alussa kuin lopussa ja jolle on tunnusomaista lämpötilan nosto ennen jäädytysmenettelyn taitekohtaa.

Menetelmää ihon sidekudossolujen kylmältä 10 suojaamiseksi kollageenigeelissä tutkivat Teasdale et ai., Burns, 19 (5) ss. 406-410 (1993). Teasdale mää ritti, että solujen optimielinkelpoisuus voitiin saada aikaan jäädyttämällä -0,5°C minuutissa DMSO-.n ollessa kylmältä suojaava aine.

15 Nanchahal et ai., "Viljeltyjä yhdistelmäiho- siirrännäisiä: Massiivisen laajentamisen sallivia biologisia ihoekvivalentteja", The Lancet, 2 (8565), ss.

191-193 (Heinäkuu 22. 1989), tarkastelee menetelmää viljeltyjen yhdistelmäkudossiirrännäisten varastoimi- 20 seksi käyttäen kylmältä suojaavaa ainetta, 15 % glyserolia ja 10 % FCS, väliaineessa 199. Siirrännäisiä ja . kylmältä suojaavaa ainetta inkuboitiin 37°C:ssa kahden tunnin ajan ja jäädytettiin sitten -1°C minuutissa -70°C:een ja varastoitiin sitten nestemäisessä types- i i t l·'· : 25 sä. Siirrännäisten nopean sulatuksen jälkeen niiden ·'.*·: elinkelpoisuus määritettiin viljelemällä kahden viikon • ’*· ajan ja siirtämällä karvattomiin hiiriin. Lopullinen : arviointi tehtiin siirtämällä niitä kolmelle potilaal le, joille suoritetaan tatuoinnin poistoleikkaus.

30 Johnstonen et al:n "Kaniinin ja kissan sar- • 1 ,···. veiskalvojen kylmäsäilytys -18- -24°C:ssa", Cornea, • · ”·’ 11(3), ss. 211-220 (1992), on suunnattu yksinkertai- seen menetelmään kaniinin ja kissan sarveiskalvojen ί,,/ kylmäsäilyttämiseksi, joka käyttää hyväksi kotipakas- > 35 tinta mieluummin kuin nestemäistä typpeä tai hyvin ai- • a · haisen lämpötilan pakastimia. Kylmäsäilytysaineen per- • · fuusio saadaan aikaan asettamalla sarveiskalvot peräk- 8 113694 käisiin liuoksiin, 50 % sikiövasikanseerumi ja McCa-rey-Kaufman-väliaine, kasvattaen glyseroli- ja glukoosipa toi suut ta .

Käyttäen tunnetun tekniikan menetelmiä ei ole 5 mahdollista kylmäsäilyttää viljeltyjä kudosekvivalent-teja, osittain koska ne ovat suhteellisen paksuja ja heterogeenisistä solukerroksista. Eräs näiden kudosten toiminnoista in vivo on tuottaa läpäisevyyttä estävä kerros. Kudostoimintoja on tarkasteltava kylmäsäily-10 tysmenetelmän kehityksen valossa.

Tämän keksinnöt tekijät ovat keksineet kyl-mäsäilytysmenetelmän ja erityisesti pakkausrakenteen, joka on käyttökelpoinen useille viljellyille kudose-kvivalenteille ja nisäkkään iholle, joka on hämmästyt-15 tävän toimiva ja kaupallisesti käytännöllinen pakkaus viljeltyjen kudosekvivalenttien kylmäsäilytystä varten.

Keksintö aikaansaa menetelmän viljeltyjen kudosekvivalenttien kylmäsäilytystä hyvin matalissa läm-20 pötiloissa varten, joka estää vahingollisten solun sisäisten jääkiteiden muodostumisen, minimoi mahdollisesti vaarallisten kemikaalien vaikuttavan pitoisuuden * 1 · • ’,· ja sallii kylmältä suojaavien aineiden nopean syöttä- misen ja poiston toteutuskelpoisissa lämpötiloissa : 25 käyttäen ohjelmoitavaa jäädytyslaitteistoa.

« · » ·

Keksintö tuottaa myös viljeltyjen kudosekvi- • · valenttien kylmäsäilytystä, varastointia ja jakelua varten kehitetyn uuden pakkausrakenteen. Uusi rakenne • * tarjoaa monia etuja olemassa oleviin pakkausrakentei-, 30 siin nähden. Nykyään ei ole kaupallisesti saatavia • kylmäsäilytettyjä viljeltyjä kudosekvivalentteja, jo- '·.* ten ei ole saatavana hyllytavarana pakkausrakenteita.

; *: Uuden pakkauksen rakenne mahdollistaa pakkauksen sisä- osan paremman lämpötilan seurannan yhdessä jäädytys-35 kammion ulkopuolen lämpötilan kanssa tehokkaamman läm-‘ ‘ mönsiirron ansiosta. Parantunut lämmönsiirtonopeus ‘ * sallii hallitumman prosessin; siten viljeltyjen ku- 9 113694 dosekvivalenttien tasaiset jäähdytys- ja lämmitysno-peudet, sen avulla alentaen solun elinkelpoisuuden vaihtelua.

Keksijät ovat keksineet menetelmän in vitro -5 menetelmillä tehtyjen viljeltyjen kudosekvivalenttien kylmäsäilyttämiseksi niin, että kudokset säilyttävät elinkelpoisuutensa ja hyödyllisyytensä ihmiskudosten vastikkeina. Keksintöön kuuluu sekoituksen käyttö kylmältä tehokkaasti suojaavan ainemäärän läpitunkeutumi- 10 sen lisäämiseksi. Esillä oleva menetelmä aikaansaa sekä kerätyn kudoksen että viljellyn kudosekvivalentin kylmäsäilytyksen tavalla, joka suojaa rakenteellista eheyttä ja solun elinkelpoisuutta.

Keksinnön menetelmä käsittää seuraavat vai- 15 heet: 1) Kerätty kudos tai viljelty kudosekvivalentti upotetaan kylmältä suojaavaan liuokseen ja kylmältä suojaavaa liuosta ja upotettua kudosta sekoitetaan kylmältä suojaavan liuoksen saamiseksi tunkeutumaan 20 tehokkaasti kudokseen (kudoksen perfuusio); ja 2) Kylmältä suojaavan liuoksen kudoksen perfuusion jälkeen jäähdytetään kylmältä suojaavan liuoksen kiin- . ,·. toaine/nestefaasin tasapainolämpötila-alueelle; solun : ulkopuolinen jää ympätään liuokseen ja jäähdytetään • » · '·“ 25 kylmäsäilytystilaan jäädyttämällä kudos hitaalla jää- * » · ’ dytysnopeudella vähintään n. -70°C:een tai sen alapuo- *t>>" lelle, edullisemmin -120°C:een tai sen alapuolelle, • · · '·* ’ vielä edullisemmin -140°C:een ja edullisimmin -196°C:een.

• · > : 30 Jäädytyksen jälkeen kylmäsäilytettyä kudosta ·*,.. voidaan varastoida rajoittamattomia ajanjaksoja lämpö- . |·. tilojen n. -120°C ja -196°C välillä, joka on nestemäi- » » · sen typen lämpötila.

• »

Kylmäsäilytetyn kudoksen sulattaminen suori-V : 35 tetaan lämmittämällä jäätynyt kudos suurella nopeudel- i *:"! la, joka tehdään n. 1-2 minuutin kuluessa. Jäätynyt kudos voidaan sulattaa käyttämällä suoraan lämmitettyä 10 113694 viljelyväliainetta tai fysiologista puskuroitua liuosta tai muuta nopeaa lammitysmenetelmää. Pakkauksen rakenne sallii kudoksen sulattamisen upottamalla pakkaus vesihauteeseen pakkauksen rakenteen varmistaessa sekä 5 nopean lämmitysnopeuden että hallitun lämmön tasaisuuden samalla säilyttäen steriiliyden kriittisen sula-tusmenettelyn aikana.

Ennen käyttöä ihmiskudoksen ekvivalenttina kudoksensiirtoa tai laboratoriokokeita varten, sula-10 tettu viljelty kudosekvivalentti huuhdellaan kylmältä suojaavan liuoksen poistamiseksi. Kylmältä suojaava liuos voidaan poistaa huuhtelemalla esim. fysiologisessa pH:ssa olevalla isotoonisella puskuriliuoksella. Viljeltyjä kudosekvivalentteja voidaan sitten varas-15 toida väliaikaisesti tällaisessa puskuriliuoksessa tai viljellä uudelleen sopivassa soluväliaineessa ennen käyttöä.

Seuraavassa kuvataan lyhyesti liitteenä olevia piirroksia, joissa 20 kuvat IA ja IB esittävät kantta, kuva 2 esittää tiivistettä ylhäältä katsottuna, kuvat 3A ja 3B esittävät kanteen asennettua tii-vistettä, kuvat 4A ja 4B esittävät kantoalustaa, j : : 25 kuvat 5A ja 5B esittävät maljaa, kuvat 6A ja 6B esittävät kokonaisuutta sivulta • · j*. katsottuna, osiinsa hajotettuna ja koottuna, kuva 7 kokonaisuuden osan lähikuvaa, i t | kuva 8 esittää koottua kokonaisuutta ylhäältä kat- .. , 30 sottuna, • ♦ · kuva 9 esittää kylmäsäilytettyjen viljeltyjen ku- » · dosten elinkelpoisuuden kuvaajaa verrattuna kylmäsäi-: lyttämättömien viljeltyjen kudosten elinkelpoisuuden j"’; kuvaajaan. Kylmäsäilytettyjen viljeltyjen kudosten I * » 35 elinkelpoisuus on esitetty MTT:n avulla määritettynä.

» i » [ LSE määritettiin lisäksi LDH-analyysin avulla. Kaikkia viljeltyjä kudoksia on verrattu vanhennettuihin kyl- 113694 11 mäsäilyttämättömiin vertailunäytteisiin ja tulokset ilmaistu prosenttina vertailunäytteestä.

Kudosrakentaminen on esiin noussut ala, joka käyttää hyväksi viljeltyjä kudossoluja kudosekviva-5 lenttien rakentamiseksi, joita voidaan käyttää vamman aiheuttaman reaktion tutkimiseen kemiallisten aineiden tai farmaseuttisten yhdisteiden avulla. Viljeltyä kudosta voidaan käyttää myös siirrettävän ihmiskudoksen muodostamiseen.

10 Kudosekvivalentteja on kuvattu laajasti mo nissa patenteissa, mukaan lukien U.S. 4,485,096; 4,485,097; 4,539,716; 4,546,500; 4,604,346; 4,837,379; ja 5,374,515, jotka kaikki sisällytetään tähän hakemukseen tällä viittauksella. Erästä kudosekvivalentin 15 menestyksellistä sovellutusta kutsutaan "eläväksi ihoekvivalentiksi", jonka morfologia on ihmisihoa vastaava. Elävä ihoekvivalentti (LSE, living skin equivalent) koostuu kahdesta kerroksesta: yläosa on tehty erotetuista ja kerrostetuista ihmisen orvaskeden kera-20 tinosyyteistä, jotka peittävät kollageenimassassa olevan alemman ihmisihon sidekudossolukerroksen. Parente-au et ai., "Laboratoriossa kehitetty orvaskesi: Käy- : ".· tännön tutkimuksia ja sovellutuksia", J. of Cellular ν,ί Biochemistry, 45:245-251 (1991); Parenteau et ai., ; 25 "Ihmisihon keratinosyyttien ja sidekudossolujen elin- tyyppinen viljely mallin ja toiminnan saamiseksi ai- • · kaan", Cytotechnology, 9:163-171 (1992); ja Bell et ai., "Elävä ihoekvivalentti: Sen valmistus, sen elin- * * · tyyppiset ominaisuudet ja sen reaktiot ärsykkeisiin", ... 30 Toxic, in Vitro, 5:591-596 (1991). LSE on tutkimuksen * · t 'm;' alaisena kudoksensiirtoa varten kliinisissä kokeissa '··· hoidonaiheita varten, jotka liittyvät osa- ja täysi- ; paksuisen ihon haavoihin: poistoleikkauskirurgia, pa- lovammat, laskimosalpaushaavaumat, sokeritautihaa- » · » 35 vaumat, makuuhaavat ja krooniset tulehdukselliset haa- • · · ’·* [ vat. LSE on täysipaksuinen, kaksikerroksinen laborato riossa rakennettu ihokudos.

12 113694

On kehitetty patentissa U.S. 5,374,515, joka sisällytetään tähän hakemukseen tällä viittauksella, kuvatun kaltainen silmän sarveiskalvon in vitro elinekvivalentti. Sarveiskalvokudosekvivalentissa on 5 kolme erillistä solukerrosta; ulkokerros, kerrostettu suomuinen epiteeli; kollageenikuitujen ja peruskudos-solujen välikerros; ja sisäkerros, yksinkertainen suomuinen epiteeli, jota kutsutaan myös sarveiskalvoendo-teeliksi. In vitro -sarveiskalvoekvivalenttia voidaan 10 käyttää in vitro -myrkyllisyysanalyyseihin, jotka toimivat in vivo okulaari- ja ihoärsytysmahdollisuuden tarkkoina ja halpoina ei-eläin ennustemalleina monen tyyppisille tuotteille ja raaka-aineille.

Kylmäsäilytyksen päämäärä on säilyttää biolo-15 gisten materiaalien rakenteellinen eheys ja elinkelpoisuus rajoittamattoman ajanjakson ajan siten, että näitä materiaaleja on tarvittaessa saatavilla ja käytettävissä. Elinkaareltaan rajalliset monimutkaiset kudokset vaativat kylmäsäilytystä tuotteen saatavuuden 20 ja käyttökelpoisuuden pidentämiseksi. Biologisen materiaalin kylmäsäilytyksen historia on kuitenkin osoittanut, että kylmäsäilytysmenettelyn optimointi tiettyä l solua varten ei välttämättä anna hyviä tuloksia käy- : tettäessä toisen solutyypin yhteydessä tai kudoksessa j 25 olevien muiden solujen kanssa. Erikoistuneempien mene- » - · : telmien kehittämistä tarvittiin solutiheyden, vesipi- j’ ’ toisuuden ja täysipaksuisten kudosekvivalenttien ra- • i · . kenteellisen järjestymistason erojen vuoksi. Tämän ’* ’ keksinnön kylmäsäilytysmenetelmät ovat hämmästyttävän 30 käyttökelpoisia yksikerroksiselle orvaskesi- ja iho- * · : .* kerroksille yksinään, kaksikerroksisille kudosekviva- lenteille, kolmikerroksisille sarveiskalvoekvivalen-, teille ja kerätylle nisäkkään iholle. Pakkausrakenteen ,···, kehittäminen tekee näiden kudosten kylmäsäilytyksen 35 käytännölliseksi tuotantomittakaavaisia prosesseja · ajatellen.

ti l * » 13 113694

Hakemuksessa käytetty termi "viljellyt ku-dosekvivalentit" tarkoittaa nisäkäskudosten kudosekvi-valentteja, joissa kudosekvivalentit valmistetaan in vitro -menetelmillä ja niihin on tarkoitettu kuuluvik-5 si yksikerroksiset ihoekvivalentit, joko ihoekviva-lentti tai orvaskesikalvo; kaksikerroksiset ihoekvivalentit, erityisesti LSE; ja kolmikerroksiset sarveis-kalvoekvivalentit ja ihoekvivalentit. Viljeltyjen ku-dosekvivalenttien morfologia on samanlainen kuin in 10 vivo nisäkkään elimen, tavallisesti ihmisen elimen. Selvyyden vuoksi, LSE:n morfologiassa on monia yhtäläisyyksiä ihmisen ihon kanssa. Aineenvaihdunnallises-ti ja mitoottisesti aktiivisia ihmisihon kudossoluja (HDF, human dermal fibroblast) on löydetty kaikkialta 15 rakenteen ihokerroksesta ja niiden on osoitettu erittävän kollageenia ja muita massan komponentteja verkostoon. Orvaskesi koostuu pohjakerroksesta, jonka on osoitettu jakautuvan ihmisen ihoa vastaavalla mitoot-tisella nopeudella. Peruskerroksen yläpuolinen orvas-20 kesi osoittaa saman kerroksen kuin iho in vivo hyvin rajattujen oka- ja jyväiskerrosten sisältäessä kerato-hyaliinia ja jyväsiä, joita peittää sarveiskerros. Im-munohistokemia osoittaa rutiininomaisesti ihon- : orvaskeden liitoskohdassa havaitun solun ulkopuolisen • · · : 25 massan komponenttien, kuten lamiinin, tyypin IV kolia- • · » · .·. : geenin ja kalaniinin (GB3) , läsnäolon normaalissa ih- ’ misen ihossa.

* »·

Elintyyppisillä viljelymenetelmillä saadut * * · ’·* ’ viljellyt kudosekvivalentit, kuten elävä ihoekviva- 30 lentti (LSE) , käyttävät kantoalustaa tukivaruksena, : jolle muodostaa ekvivalentteja. Viljeltyjä kudosekvi- :..,ϊ valentteja valmistetaan kantoalustalla, joka sallii . rakenteen käsittelyn valmistuksen, kuljetuksen ja lop- * » · ,···. pukäytön aikana koskettamatta suoraan rakennetta. Me- » · 35 netelmiä viljeltyjen kudosekvivalenttien valmistami-

' I I

v * seksi kantoalustalla on julkistettu patenttijul- * ♦ » · * • · 14 113694 kaisuissa U.S. 5,374,515 ja U.S. 08/193,809 ja 08/337,830.

Kantoalustaan kuuluu tasainen läpäisevä kalvo, joka on kiinnitetty pääosin putken muotoisen tu-5 kiosan toiseen päähän. Putken muotoisen tukiosan toiseen päähän kuuluu ulospäin laajeneva laippa, joka puolestaan kannattaa reunaa, joka voi riippua kudos-viljelymaljassa ja keksinnön pakkausrakenteessa olevan altaan yläreunalla. Kalvo-tukirakenne on mitoitettu 10 käytettäväksi viljelymaljan kanssa, jossa on ainakin yksi määrätyn kokoinen allas siten oikean välyksen tuottamiseksi tukiosan ympärille ja altaan yläpään kytkemiseksi. Kalvo-tukirakenne voidaan tehdä eri kokoiseksi käytettäväksi siten sekä eri kokoisten vilje-15 lymaljojen että kylmäsäilytys- ja varastointipakkaus-ten kanssa. Esimerkki näistä kantoalustoista on patentissa U.S. 5,466,602 kuvattu TRANSWELL® (Costar). Ammattitaitoinen preparaattori voi tehdä modifikaatioita pakkauksen rakenteeseen vastaavien kantoalustojen va-20 rustamiseksi, jotka käyttävät erilaisia viljelyasti-oissa olevia tuki- ja kytkentälaitteita. Vastaavia kantoalustoja ovat patenteissa U.S. 5,358,871 ja 5,366,893 kuvatut tai patentissa U.S 4,871,674 kuva- » · • *. tut.

• * · I » · : 25 Tämän keksinnön edullinen pakkaus rakenne yh- • > · ,·, ; distää kokonaisuuteen kantoalustan tukivaruksen ja ‘ määrittää ympäristön kudosekvivalentin ympärillä, joka ·,,, kyetään säätämään ennalta määrättyihin ohjearvoihin.

• · · *·’ ’ Keksintö käyttää materiaaleja, jotka ovat edullisesti 30 lääkeainekelpoisia ja kestävät lämpötiloja laaja- »* t • *,· alaisesti. Näitä materiaaleja työstetään maljan ja kannen muodostamiseksi, jotka kyetään sulkemaan yhteen , ,·. saumauslaitteen avulla. Uusi pakkaus on suunniteltu * f * yhdistämään kokonaisuuteen kantoalustan tukiosan, jon-35 ka päälle kudosekvivalentit muodostetaan.

·,· : Uusi pakkausrakenne käsittää maljan, kannen ’ja niiden välisen pitävän tiivisteen. Malja ja kansi 15 113694 on suunniteltu sopimaan olemassa olemaan kantoalus-taan, joka sisältää kiinnitetyn kudosekvivalentin. Kantoalusta kiinnitetyn kudosekvivalentin kanssa asetetaan maljaan ja lisätään kylmältä suojaava liuos.

5 Sitten asetetaan kansi maljaan ja nämä kaksi osaa saumataan yhteen tiiviin sulun muodostamiseksi pakkauksen sisäisen ja ulkoisen ympäristön välille.

Pakkausrakenne mahdollistaa kylmältä suojaavan aineen tasaisen jakautumisen kantoalustan alapuo-10 lelle ja kudosekvivalentin pinnan yläpuolelle samalla ylläpitäen kylmältä suojaavan aineen kosketuksen ku-dosekvivalenttiin ja sekä maljaan että kanteen. Pakkauksen rakenne perustuu ajatukseen, että hallittu jäähdytys- ja jäätymisnopeus voidaan ylläpitää järjestä-15 mälli yhtä suuri kylmältä suojaavan aineen tilavuus samalla geometrialla kylmäsäilytettävän viljellyn kudoksen ala- ja yläpuolelle. Tämä järjestely tuottaa yhtenäisen etäisyyden mitattuna sekä viljellyn kudosekvivalentin ylä- että alapinnasta pakkauksen ulkosei-20 nään (edellyttäen, että pakkauksen paksuus on yhtenäi nen) . Tämän yhtenäisyyden pitäisi tuottaa tasainen lämmönsiirto kudosekvivalentista jäädytyskammioon jäähdytettäessä; ja ulkopuolen ympäristöstä kudosekvi- . .·. valenttiin sulatettaessa.

• · • · · : ,·, 25 Malja käsittää alapinnan, joka on yhtenäinen *1’ ! sivuseinän ja laipan kanssa. Laippa tuottaa tasopinnan • » ♦ * maljan saumaamiseksi kanteen. Maljan sivuseinässä on \ ’’ yksi yhtäjaksoinen tai useita epäjatkuvia tukiosia, * · '·' * jotka ulottuvat sivuseinästä sisäänpäin ja ovat yhte- 30 näisiä sen kanssa. Maljaan sijoitettuna kudosekviva-; ’/ lentin sisältävän kantoalustan yläreuna on tuettu va- päästi maljan sivuseinän tuottamiin tukiosiin. Vapaas-ti tuetun kantoalustan ja maljan alapinnan väliin on > · !!! rajattu tila, joka on paksuudeltaan n. 1,0 mm, pinta- < · ;·’ 35 alan ollessa suunnilleen kudosekvivalentin kokoinen.

: Kansi käsittää sivuseinän ja laipan kanssa ;··; yhtenäisen tasomaisen alapinnan. Kannen laipan hai- 16 113694 kaisija on hieman pienempi kuin maljan laipan halkaisija. Asetettaessa kannen laippa kantoalustan sisältävälle maljalle se nojaa kantoalustaan siten, että sekä maljan laipan että kannen laipan yläpinnat ovat 5 kosketuksessa suunnattuna samaan tai suunnilleen samaan tasoon. Toisen tilan rajaavat kansi ja viljellyn kudosekvivalentin pinta, joka on myös paksuudeltaan n.

1,0 mm, pinta-alan ollessa suunnilleen kudosekvivalentin kokoinen.

10 Rakenne jättää yhteensä n. 1 mm maljan ja kantoalustan pohjan, joka sisältää sille sijoitetun kudosekvivalentin, väliin ja n. 1 mm kannen ja kudosekvivalentin väliin kylmältä suojaavan aineen ollessa kosketuksessa kudosekvivalentin ylä- ja alapuolella 15 sekä kannen että maljan kanssa. Kun kansi asetetaan väliainetta sisältävään maljaan, kansi syrjäyttää pakkauksessa olevan ilman ulkokehällä olevaan tilaan, joka sisältää kantoalustan putkimaisen tukiosan.

Kansi suljetaan maljaan pitkin maljan ja kan- 20 nen laippojen yläpintojen muodostamaan paljaana olevaa tasoa. Tiivistäminen voidaan suorittaa lämmön, liiman tai muiden alalla tunnettujen keinojen avulla. Kannen ja maljan välinen tiiviste estää kylmältä suoj aavan , .·. aineen vuotamisen ja säilyttää yksikön sisäpuolen ste- : 25 riiliyden. Kuumasaumattavan kannen kantaosan renkaan • * · Ί' muotoinen levy kuumasaumataan edullisesti sekä maljaan • * · m[ * että sillä oleviin kannen laippoihin. Kannen kanta- : " osassa on edullisesti kuorimalla poistettava ja siten « « « · kannen maljasta irrottava repäisynauha kudosekvivalen- 30 tin esiin saamiseksi. Toisessa suoritusmuodossa lai-

* · I

: *.* palla, jonka halkaisija on suunnilleen sama kuin mal- jän laippa, varustettu kansi asetetaan maljaan, jonka sisään on sijoitettu kantoalusta, siten, että kannen * · · * t · ;;; laipan alapinta koskettaa tiiviisti maljan laipan ylä- * · *·;·’ 35 pintaa. Laipat suljetaan sitten yhteen saumauslaitteen avulla.

• · 17 113694

Kuvat IA ja IB esittävät kantta 10; kannen laippaa 11; kannen sivuseinää 12; ja alapintaa 13. Kannen laippa 11, kannen sivuseinä 12 ja alapinta 13 muodostavat yhtenäisen pinnan.

5 Kuva 2 esittää rengastiivistettä 20 ja vedin- tä 21.

Kuvat 3A ja 3B esittävät tiivistettä 20; kantta 10; kannen laippaa 11. Tiiviste 20 on asennettu kannen 10 kansilaippaan 11 ennen käyttöä tiivisteen 10 suuntaamisen helpottamiseksi saumausprosessin aikana.

Kuvat 4A ja 4B esittävät kantoalustaa 30; kantoalustan reunaa 31; läpäisevää kalvoa 32; ja putken muotoista tukiosaa 33. Läpäisevä kalvo 32 sisältää sille sijoitetun viljellyn kudosekvivalentin, joka on 15 sidottu putken muotoisen tukiosan 33 avulla. Kanto-alusta 30 sallii kudosekvivalentin siirron sitä koskettamatta tai irrottamatta koko kylmäsäilytysproses-sin ajan.

Kuvat 5A ja 5B esittävät maljaa 40; maljan 20 alapintaa 41; maljan sivuseinää 42; maljan laippaa 43; ja kantoalustan tukiosia 44. Maljan alapinta 41, maljan sivuseinä 42, maljan laippa 43 ja kantoalustan tu- j *. kiosat 44 muodostavat yhtenäisen pinnan. Kantoalustan • · . ·, tukiosat 44 koskettavat ja tukevat maljan sisällä ole- i · ·’ ’ 25 vaa kantoalustaa.

• · * · ‘I ! Kuvat 6A ja 6B esittävät tiivistettä 20; « · ’· kantta 10; kantoalustaa 30; ja maljaa 40. Päällään ku- • t • '* dosekvivalentin sisältävä kantoalusta 30 sijoitetaan

I ( I

V · maljaan 40 ja tuetaan vapaasti maljan sisään. Tiivis- 30 teellä 20 varustettu kansi 10 asetetaan kantoalustan • · » | · : 30 päälle ja tuetaan vapaasti kantoalustan päälle.

Kuva 7 esittää tiivistettä 20; kannen laippaa

• · I

20; kantta 10; kantoalustaa 30; kantoalustan reunaa * · · * I * ;;; 31; kantoalustan tukiosia 44; ja maljaa 40. Päällään * » 35 kudosekvivalentin sisältävä kantoalusta 30 sijoitetaan ! : : maljaan 40 ja tuetaan vapaasti maljan sisään kanto- *;·; alustan reunan 31 alapinnan ollessa kosketuksessa kan- 18 113694 toalusta tukiosien 44 yläpintojen kanssa. Kansi 10 yhdessä tiivisteen 20 kanssa asetetaan kantoalustan 30 päälle ja tuetaan vapaasti kantoalustan päällä kannen laipan 11 alapinnan ollessa kosketuksessa kantoalustan 5 reunan 31 yläpinnan kanssa. Sekä kannen laipan 11 että maljan laipan 43 yläpinnat muodostavat tasomaisen pinnan tiivistettä 20 varten.

Kuva 8 esittää laitekokonaisuutta ylhäältä katsottuna.

10 Materiaalit, joista maljat ja kannet voidaan valmistaa, ovat jäykkiä tai puolijäykkiä kestomuovima-teriaaleja, kuten polytetrafluorieteeni (PTFE) tai po-lyeteenitereftalaattiglykoli (PETG), jotka lämmitettynä muovataan tyhjömuovaarnalla tai ruiskupuristamalla. 15 Pakkauksen maljat ja kannet steriloidaan edullisesti ennen käyttöä menetelmillä, jotka ovat tunnettuja steriloinnin alueella. Maljan ja kannen valmistukseen käytetyt materiaalit määräävät sterilointimenetelmän, jota voidaan käyttää. PTFE:n tai PETG:n sterilointiin 20 on edullinen 2,5-3,0 megaradin gammasäteily. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää alan asiantuntijoiden tuntemia sähköisiä ja kemiallisia sterilointimenetelmiä.

Viljellyt kudosekvivalentit sisältävät erään . aineen, edullisesti sidekudossoluja, sitomasta hydra- : 25 toidusta kollageeniristikosta olevan ihoekvivalentin.

! Eräässä suoritusmuodossa kerrostettua orvaskesisolu- .1 ’ kerrosta viljellään ihoekvivalentin pinnalla. Toisessa • · suoritusmuodossa hydratoitu sidottu kollageeniristik- ti» '·' * ko, joka on sidottu keratosyyttien avulla, sijoitetaan 30 sarveiskalvon endoteelisolukerrokselle yhdessä risti-j V kon pinnalla viljellyn kerrostetun sarveiskalvon epi- teelisolukerroksen kanssa. Vaihtoehtoisesti orvas-kesisoluja voidaan viljellä yksinään ja saada ne kerii! rostumaan orvaskesikalvon muodostamiseksi. Viljelty '1' 35 kudosekvivalentti muodostetaan joko kantoalustan huo- ,·* ' koiselle kalvolle tai kollageenigeelille, joka on kas- .··; vettunut kantoalustan alapinnan huokoiseen kalvoon.

19 113694

Lisäksi muita viljeltyjä kudosekvivalentteja voidaan kylmäsäilyttää keksinnön menetelmien mukaisesti, mukaanlukien mutta ei niitä rajoittaen, kaikki viljellyt orvaskesikalvot, viljellyt ihoekvivalentit, viljellyt 5 sarveiskalvoekvivalentit tai kerätty nisäkkään iho.

Keksintöä kuvataan nyt käyttäen kudosekvivalentteja ja edullisia pakkausrakenteita valaisevana esimerkkinä. Alan asiantuntijoille on selvää, että kuvattuun menetelmään voidaan tehdä modifikaatioita ja 10 se on yhä tämän keksinnön suojapiirissä.

Menetelmä kudosekvivalentin perfusoimiseksi kylmältä suojaavalla liuoksella tapahtuu upottamalla kudosekvivalentti ja siihen kiinnitetty kantoalusta tiettyyn tilavuuteen kylmältä suojaavaa liuosta, joka 15 riittää hautaamaan näytteen ja jossa on sama määrä kylmältä suojaavaa liuosta kudosekvivalentin ylä- ja alapuolella. Halkaisijaltaan 100 mm petrimaljaan, joka sisältää kudosekvivalentin ja kantoalustan, lisätään 25 ml 2M glyserolia DMEM:ssä ajanjakson, edullisesti 20 yhden ja kahden tunnin välillä, mutta edullisimmin n.

yhden tunnin, aikana, joka riittää täysin perfusoimaan näytteen. Pidennetyt ajanjaksot kylmältä suojaavassa : ’ liuoksessa johtavat alentuneeseen solun elinkelpoisuu- : ; ; teen kudoksessa, kun taas liian lyhyt aika ei takaa : . . 25 kylmältä suojaavan aineen täydellistä tunkeutumista » * * · ,·, ; kudokseen. Yksikerrosrakenteet vaativat tavallisesti * vähemmän aikaa perfuusiota varten, koska niissä on vä-• · hemmän solukerroksia ja alentunut estovaikutus. Tämän * ♦ ’·’ ‘ tunnin aikana kylmältä suojaavan liuoksen tunkeutumis- 30 ta parannetaan sekoittamalla näytettä ja kylmältä suo-: ,· jaavaa liuosta, tavallisesti ravistelemalla petrimal- • · t • jaa 70 rpm ympyrärataa kiertävässä pöytäravistimessa . (Bellco orbital shaker) 10 % C02:11a kaasutetussa kam- * t · miossa. 10 % C02-ympäristö, sama kuin viljely-ympäris-35 to, jossa kudosekvivalentti valmistettiin, estää väli- · aineen kaasuuntumisen, siten säilyttäen kylmältä suo-jaavan aineen perusväliainekomponentin pH:n. Sekoitus 20 113694 mahdollistaa kylmältä suojaavan aineen nopeamman ja täydellisemmän perfuusion ja paremman jäätyneiden ku-dosekvivalenttien välisten tulosten toistettavuuden. Ympyrärataa kiertävä ravistelija voidaan korvata lait-5 teella, joka suorittaa sekoitusliikkeen muissa tasoissa. Lisäksi muihin mekaanisesti tehostettuihin per-fuusiomenetelmiin kuuluvat, mutta eivät rajoita niitä, rakenteen yhdessä kylmältä suojaavan aineen kanssa täry ttäminen pöydällä olevassa astiassa tai rakenteen 10 yhdessä kylmältä suojaavan aineen kanssa sentrifugoin-ti ja kylmältä suojaavan aineen perfusointi ympäri rakennetta käyttäen pumppua.

Kantoalusta ja kiinnitetty kudosekvivalentti asetetaan maljaan ja lisätään yhteensä n. 16,0 ml kyl-15 mältä suojaavaa ainetta. Pakkauksen rakenne mahdollistaa kylmältä suojaavan aineen tasaisen jakautumisen: n. 8,0 ml kantoalustan alapuolella ja n. 8,0 ml ku-dosekvivalentin pinnalla. Sitten asetetaan kansi maljaan ja nämä kaksi osaa kuumasaumataan, edullisesti 20 kannen kantaosaan.

Pakatut kudosekvivalentit asetetaan sitten ohjelmoitavaan pakastimeen (Cryomed tai Planer) lähtö- : ' : lämpötilan ollessa suunnilleen huoneenlämpötila, edul- : lisesti 20,0°C. Pakatut kudosekvivalentit sisältävää * · » • 25 pakastinkammiota jäähdytetään -10,0°C minuutissa kyl- .·. : mältä suoj aavan aineen kiintoaine-nestefaasin tasapai- • * · ;·# ’ nolämpötila-alueelle, joka on tyypillisesti 2,0 M gly- serolille DMEM:ssa -5,3°C:een ja -6,0°C:een välillä.

* Kiintoaine-nestefaasin tasapainolämpötila on jään ymp- 30 päämiseen kylmältä suojaavaan aineeseen tarvittava : lämpötila. Kammion lämpötila pidetään paikallaan het- ·...· ken ajan, joka on tarkoitettu pakattujen kudosekviva- . lenttien sisälämpötilan tasaamiseen kammion lämpötilan ,···, kanssa. Ymppäyslämpötilan saavuttamiseen käytetty • · 35 jäähdytysnopeus ei ole kriittinen. N. 40 minuutin pi-*.* * toaika on riittävä varmistamaan lämpötasapaino, mutta aika vaihtelee riippuen kammion koosta, ilman kierros- 21 113694 ta kammiossa ja jäädytettävien pakkausten lukumäärästä. Vaikka tavallisesti tarvitaan 30 minuuttia, voidaan käyttää yhtä tuntia tasapainon varmistamiseksi. Pitoajan jälkeen solun ulkopuolinen jään muodostus 5 käynnistetään ymppäämällä.

Jään ymppääminen määritetään menetelmäksi käynnistää jään muodostus solun ulkopuolisessa kylmältä suojaavassa aineessa. Eräs edullinen jään ymppää-mismenetelmä on kudosta sisältävän maljan puolen kos-10 kettaminen jäähdytetyllä puikolla, kuten nestemäisellä typellä jäähdytetyllä (-196°C) terässauvalla. Sauvan pakkaukseen kosketuskohdan täytyy olla pakkauksessa olevan kylmältä suojaavan jäähdytysväliaineen pinnan alapuolella. Toinen edullinen menetelmä on vapauttaa 15 suoraan ponnekaasuja, kuten freon tai C02, pakkauksen ulkosivuun. Jään muodostus voidaan käynnistää kammiossa olevan piikin avulla siellä, missä kammion lämpötilaa on alennettu ja nostettu alueen sisällä, joka on riittävä jääkiteen muodostamiseen. Muita alalla tun-20 nettuja jään ymppäysmenetelmiä voidaan käyttää näiden sijaan.

Kun kaikki kudosekvivalentit on ympätty jää-kiteillä, yksiköt pidetään paikallaan vielä yhden tun-. nin ajan termodynaamisen tasapainon mahdollistamiseksi * · i : 25 ja jään ymppäyskiteen levittämiseksi kaikkialle kyl-

I · I

’·] j mältä suoj aavaan aineeseen. Jäähdytykseen ryhdytään .! 1 sitten uudelleen edullisesti nopeudella, joka on vä- • · *iti' Iillä n. -0,05- -0,l°C/min; ja edullisimmin n.

• · · '·’ 0,07°C/min, lopulliseen lämpötilaan, joka on edulli- 30 sesti vähintään -70,0°C tai sen alapuolella, edulli-; ' semmin -120°C:ssa; vielä edullisemmin -140°C:ssa; tai edullisimmin -196°C:ssa. Lopullisen jäädytyslämpötilan ’·, lähestyessä veden lasittumislämpötilaa -120°C sitä vä- • · · !!! hemmän todennäköisesti esiintyy haitallisia lämpötilan • · 35 vaihteluita siirtojen aikana lopullisiin varastointi- * 1 · ·.· · paikkoihin.

· 22 113694

Kylmäsäilytetyt kudosekvivalentit siirretään ohjelmoitavasta pakastimesta varastoitavaksi nestemäisen typen kaasufaasivarastosäiliössä (Dewar) lämpötilassa, joka on välillä n. -120- -150°C, tai -196°C:ssa 5 olevassa nestemäisessä typessä käyttöön asti.

Kylmäsäilytettyjen viljeltyjen kudosekviva-lenttien sulattamiseksi ne poistetaan nestemäisen typen kaasufaasivarastosäiliöstä ja siirretään hiilihap-pojäähän lämmitettäväksi n. -75°C:een. Kun tasapaino -10 75°C:ssa on saavutettu, sitten viljellyt kudosekvivalentit siirretään edullisesti 37°C:een säädettyyn; tai edullisemmin 4°C:een säädettyyn; tai edullisimmin huoneenlämpötilaan säädettyyn ympäristöön, edullisesti vesihauteeseen. Kun on nähtävissä, että kaikki kylmäl-15 tä suojaava väliaine on muuttunut nestefaasiksi, viljellyt kudosekvivalenttipakkausyksiköt siirretään edullisesti biologiseen suojakoteloon tai muulle aseptiselle alueelle ja puhdistetaan etanolilla. Maljojen kansi irrotetaan kuorimalla tai leikkaamalla kannen 20 kantaosa yksikön alaosasta. Viljeltyjä kudosekviva-lentteja sisältävät kantoalustat siirretään sitten kukin petrimaljoihin samalla kaataen pois ylimääräinen • · * : '1 kylmältä suojaava aine. Viljellyn kudosekvivalentin : huuhtelemiseksi jäljellä olevasta kylmältä suoj aavasta «li j 25 aineesta petrimal jaan, joka sisältää viljeltyä kudose- .·. : kvivalenttia, lisätään sitten 25 ml huuhteluliuosta, • » · ;·. edullisesti huoneenlämpötilassa oleva DMEM, n. 30 mi- nuutin ajaksi. Muita tyydyttäviä huuhteluaineita, ‘ edullisesti fysiologisia lujittavaa liuoksia, kuten 30 soluviljelyväliaine tai fosfaattipuskuroitu suolaliu- • * · : os, voi määrittää ammattitaitoinen preparaattori.

·,,,· Huuhteluliuos vaihdetaan toisen kerran 30 lisäminuutin . .·. ajaksi. Huuhtelukertojen määrä voi vaihdella riippuen « i » ,···, kudoksen monimutkaisuudesta.

> · 35 Viljelty kudosekvivalenttiyksikkö voidaan '.· * siirtää sitten takaisin alkuperäiseen viljelymaljaansa ja viljellä uudelleen viljelmän elatusväliaineessa 23 113694 37°C/10 % C02:ssa. Vaihtoehtoisesti ekvivalentti voidaan siirtää potilaaseen tai testata reaktion osalta koskettamalla sitä patentin U.S. 4,835,102 kuvaamalla aineella.

5 Seuraavat esimerkit on tuotettu keksinnön va laisemiseksi paremmin, eikä niitä pitäisi tulkita millään tavalla keksinnön suojapiiriä rajoittaviksi. Alan asiantuntijat havaitsevat, että erilaisia modifikaatioita voidaan tehdä hakemuksessa kuvattuihin menetel-10 miin erkanematta keksinnön hengestä ja suojapiiristä.

ESIMERKKEJÄ Esimerkit 1-3

Esimerkit 1-3 kuvaavat keksinnön kylmäsäily-15 tys- ja sulatusmenetelmiä yhdessä edullisen pakkausra-kenteen kanssa.

Esimerkki 1: Elävän ihoekvivalentin (LSE) kylmäsäilön-tä pakkausrakenteeseen

Eläviä ihoekvivalenttirakenteita (LSE) val-20 mistettiin patenttijulkaisun U.S. 08/193,809 mukaisesti. LSE:t ja kiinnitetyt 75 mm kantoalustaupotteet ,· · * (TRANSWELL®, Costar, Cambridge) asetettiin 9-10 päivää ilmanosteen jälkeen 100 mm petrimaljoihin (Costar) .

,5 · LSE-rakenteet perfusoitiin kylmältä suojaavalla ai- ;’\i 25 neella upottamalla rakenteet ja siirtoallas 25 ml:aan kylmältä suojaavaa väliainetta, 2M glyserolia DMEM:ssa, 100 mm petrimaljaan yhden tunnin ajaksi.

Perfuusion aikana rakenteita sekoitettiin yhden tunnin .. . ajan 70 rpm ympyrärataa kiertävässä ravistelijassa • · 30 (Bellco) 10 % C02:lla kaasutetussa kammiossa. Sekoitus • · •y* mahdollistaa täydellisemmän perfuusion ja paremman : :y kylmäsäilytysmenetelmän toistettavuuden. LSE:n per- fuusion jälkeen LSE:n, kantoalustaupotteet ja solun * · * ulkopuolisen jäädytysvällaineen (2M glyseroli ja DMEM) ‘ , 35 sisältävät petrimaljat asetettiin kylmäsäilytyspakka- 24 113694 ukseen ja kuumasaumattiin. Kylmäsäilytyspakkauksia on kuvattu rinnakkaisessa patenttihakemuksessa U.S. --/---,---/ joka on kirjattu samana päivänä kuin tämä hake mus .

5 Ohjelmoitava pakastin (Planer) varusteltiin hakemuksessa kuvatun keksinnön mukaiseksi. Pakastin säädettiin 20,0°C alkulämpötilaan. Putkiston linjoja huuhdeltiin freonilla yksittäin yhden sekunnin välein linjoissa olevan ilman poistamiseksi. Pakatut LSE-10 yksiköt kiinnitettiin lujasti telineisiin, joihin kuhunkin sopii kahdeksan LSE-yksikköä. Kohdistustappien ohjaamat telineet asetettiin suihkukiskojen viereen. Pakastimen kammion ovi suljettiin kammion eristämiseksi ulkoisesta ympäristöstä.

15 LSE-yksiköitä jäähdytettiin -10°C minuutissa -6°C:een ja kammion lämpötila pidettiin -6°C:ssa 40 minuutin ajan kylmältä suojaavan aineen ja perfusoitu-jen rakenteiden tasaamiseksi kammion lämpötilaan. 40 minuutin paikallaan pidon jälkeen solun ulkopuolinen 20 jäittäminen käynnistettiin syöttämällä suoraan freonia yhden sekunnin ajan pakkauksen sivun välittömään läheisyyteen. Haihtuessaan pakkauksen pinnasta freon sai * · ! j ‘ : freonin kontaktialueen lämpötilan laskemaan kylliksi : : ; solun ulkopuolisen jään muodostuksen käynnistämiseksi.

j j j 25 Kun kaikki LSE-yksiköt oli ympätty jääkiteil- • * · · .·. : lä, yksikköjen annettiin tasapainottua yhden tunnin • · » ;·. ajan -6°C:ssa. Sitten kammion lämpötilaa jäähdytettiin *... -0,07°C minuutissa loppulämpötilaan -20°C. Sitten kam- * miota jäähdytettiin -0,5°C minuutissa loppulämpötilaan 30 -70°C. Kun LSE-yksiköt oli kylmäsäilötty, ne siirret- • · · .* tiin -120- -150°C lämpötilassa olevaan kaasufaasiva- · < rastosäiliöön (Dewar) .

• s * • · · I I %

Esimerkki 2: Kylmäsäilytetyn LSE:n sulatus • · * 35 Kylmäsäilytetty LSE poistettiin nestemäisen typen kaasufaasivarastosta ja siirrettiin hiilihappo- 25 113694 jäähän lämmitettäväksi n. -75°C:een. Tasaannuttuaan -75°C:Ssa viljellyt kudosekvivalentit siirretään sitten edullisesti 37°C:een; tai edullisemmin 4°C:een; tai edullisimmin huoneenlämpötilaan säädettyyn vesi-5 hauteeseen. Kun on nähtävissä, että kaikki kylmältä suojaava väliaine on muuttunut nestefaasiksi, viljellyt kudosekvivalenttipakkausyksiköt siirretään edullisesti biologiseen suojakoteloon tai muulle aseptiselle alueelle ja puhdistetaan etanolilla. Maljojen kansi 10 irrotetaan kuorimalla tai leikkaamalla kannen kantaosa irti yksikön alaosasta. Viljeltyjä kudosekvivalentteja sisältävät kantoalustat siirretään sitten kukin petri-maljoihin samalla kaataen pois ylimääräinen kylmältä suojaava aine. Viljellyn kudosekvivalentin huuhtelemi-15 seksi jäljellä olevasta kylmältä suojaavasta aineesta viljeltyä kudosekvivalenttia sisältävään petrimaljaan lisätään sitten 25 ml (huoneenlämpö-tilassa olevaa) huuhteluliuosta, edullisesti DMEM, n. 30 minuutin ajaksi. Muita tyydyttäviä huuhteluaineita, edullisesti 20 fysiologisia lujittavia liuoksia, kuten soluviljelyvä-liaine tai fosfaattipuskuroitu suolaliuos, voi määrittää ammattitaitoinen preparaattori. Huuhteluliuos > ·’ vaihdetaan toisen kerran 30 lisäminuutin ajaksi.

Sulatettuja kylmäsäilytettyj ä näytteitä ja • * ·,· f 25 vertailunäytteitä käsiteltiin histologisilla menetel- : millä ja ne arvioitiin valomikroskopian avulla morfo- ·*·.. logisen järjestäytymisen ja elinkelpoisuuden osalta ja ne omasivat lähes 100 % elinkelpoisuuden ja oli lähes « mahdotonta erottaa ne vertailunäytteestä.

30

Esimerkki 3: Kylmäsäilytyspakkauksen rakenteen arvi ointi lämmitysnopeuden ja termisen yhtenäisyyden osal-ta > · ’** Keksinnön kylmäsäilytyspakkaus arvioitiin ta- *.* · 35 saisen lämmönsiirron osalta. Kantoalustakalvoon ilman *'·"· viljeltyä kudosekvivalenttia asennettiin viisi ter- 26 113694 moelementtiä, yksi keskelle ja neljä tasaisin välein 1,0 mm etäisyydelle kantoalustan ulkoseinästä. Termoelementti liittää ulosjohdettuna pakkauksen kannen ja maljan laippojen väliseltä sivulta automaattiseen 5 lämpötilapiirturiin (Azonix Scanner Plus). Pakkaus täytettiin 17 ml :11a kylmältä suojaavaa ainetta ja pakkaus kuumasaumattiin. Pakkauksen annettiin tasaantua -70°C:een ja siirrettiin sitten 20°C:een säädettyyn 10 vesihauteeseen. Lämpötilapiirturi rekisteröi lämpötilan kullakin termoelementillä 1-2 sekunnin välein lämmityksen aikana. Pakkaus lämpeni aluksi nopeudella 700°C/min ja hidastui sen lähestyessä kylmältä suojaa-van liuoksen sulamispistettä. Terminen yhtenäisyys oli 15 2°C ja 6°C välillä termoelementtien keskilämpötilasta nopeimpien lämmitysnopeuksien aikana ja lähestyi 8°C sen saavuttaessa liuoksen sulamispisteen.

Esimerkit 4-12 kuvaavat keksinnön kylmäsäily-tysmenetelmää erilaisilla kudoksilla.

20

Esimerkki 4: Orvaskesikalvojen kylmäsäilytys

Orvaskesikalvot valmistettiin valmiista . LSE:sta 12 päivää ilmanosteen jälkeen. Orvaskesikalvon i i t : , . irrottaminen suoritettiin kuorimalla ihon aluskerros • * · V 25 orvaskesikerroksesta pihdeillä ja jättämällä ihokerros * > » .1 ‘ pois. Kukin kalvo leikattiin kolmeen yhtä suureen * * • " osaan. Yksi osa kustakin kalvosta kiinnitettiin ver-

Iti • t · ‘ tailunäytteeksi. Jäljelle jääneet kaksi osaa kustakin kalvosta asetettiin 75 mm polykarbonaattisiirtoallas- : 30 kalvon (Costar) päälle 100 mm viljelymaljoihin (Cos- tar) . Kutakin osaa perfusoitiin 25 ml :11a DMEM ja 2 molaarisella glyserolilla yhden tunnin ajan. Rakenteet ! sisältävät maljat asetettiin 70 rpm ympyrärataa kier- > tävään ravistelijaan (Bellco) yhden tunnin ajaksi 10 % v · 35 C02:lla kaasutetussa kammiossa. Orvaskesikalvon per- *:·*! fuusion jälkeen orvaskesikalvon, siirtoaltaan ja solun 27 113694 ulkopuolisen jäädytysväliaineen (2M glyserolia ja DMEM) sisältävä petrimalja asetettiin pussiin ja suljettiin tyhjötiiviisti (Audiovox) ohjelmoituna 5 sekunnin vakuumi- ja 3,9 sekunnin saumausajalle.

5 Pakatut orvaskesikalvot asetettiin ohjelmoi tavaan pakastimeen (Planer) lähtölämpötilan ollessa 20,0°C. Orvaskesikalvoja jäähdytettiin -10,0°C minuutissa -6,0°C:een. Lämpötilan annettiin olla paikallaan 20 minuuttia -6,0°C:ssa kammion lämpötilan tasaamisek-10 si. 20 minuutin pitoajan jälkeen solun ulkopuolinen jäittäminen käynnistettiin koskettamalla pussin ulkopuolta jäätymisväliaineen pinnan alapuolella nestemäisellä typellä jäähdytetyllä puikolla. Sen jälkeen kun kaikki orvaskesikalvot oli ympätty jääkiteillä, lämpö-15 tila pidettiin vielä 5 minuuttia -6,0°C:ssa. Sitten kammiota jäähdytettiin -1,0°C minuutissa -8,0°C:een. Sitten lämpötilan annettiin olla paikallaan -8,0°C:ssa 30 minuutin ajan jään tasaisen jakaantumisen mahdollistamiseksi kaikkialle näytteeseen. Sitten kammiota 20 jäähdytettiin -0,1°C minuutissa loppulämpötilaan -70,0°C.

Kylmäsäilytetyt orvaskesikalvot poistettiin i ',· pakastimesta ja pussit leikattiin irti petrimaljoista .* ja kannet irrotettiin. Sulatusta varten 40 ml lämmi- : 25 tettyä (37°C) DMEM kaadettiin aseptisesti kuhunkin j*· j petrimaljaan. 45 sekunnin kuluttua kaikki neste pois- :·. tettiin maljoista ja vielä 40 ml osa lisättiin kuhun- • t * kin maljaan kahden minuutin ajaksi. Kun kaikki jää oli sulanut, orvaskesikalvoja huuhdeltiin 25 ml :11a DMEM , 30 30 minuutin ajan. Väliaine vaihdettiin toisen kerran • ;* 30 lisäminuutin ajaksi. Sitten orvaskesikalvoja inku- • a '···’ boitiin viljelmän elatusaineessa 37°C-.ssa/10 % Olissa ; 24 tuntia ennen analysointia. Inkubointiajan annettiin pitää huolta tyypillisesti jäätyneillä soluilla tava-35 tusta viiveestä vakiotilan olosuhteiden muodostamisek-’·* * si uudelleen. Toistettuna, inkubointiajan annettiin ’ ‘ pitää huolta tyypillisesti jäätyneillä soluilla tava- 28 113694 tusta viiveestä vakiotilan olosuhteiden muodostamiseksi uudelleen.

Kahdesta kunkin orvaskesikalvon jäljelle jääneestä osasta toinen kustakin työstettiin histologiaa 5 varten ja toinen osa kustakin kalvosta analysoitiin noudattaen MTT-analyysimenettelyä. Esimerkin 4 kyl-mäsäilyttämättömän ja kylmäsäilytetyn orvaskesikalvon mikrovalokuvien vertailu osoitti, että orvaskeden kolme perusmuotoa: orvaskeden pohjakerros, orvaskeden 10 ylemmät peruskerrokset ja orvaskeden sarveiskerros olivat kaikki säilyneet tällä menetelmällä. Kaikki kerrokset olivat vahingoittumattomia ja kylmäsäilytetyn orvaskesikalvon kokonaismorfologia oli samanlainen kuin kylmäsäilyttämättömän orvaskesikalvon.

15

Esimerkki 5: Ihoekvivalentin kylmäsäilytys Tässä tutkimuksessa käytetyt ihoekvivalentit olivat LSE:n komponentti, josta ei erotettu orvas-kesiosaa. Ihoekvivalentit jäädytettiin 8 päivää luomi-20 sen jälkeen. Ihoekvivalentteja perfusoitiin kylmältä suojaavalla aineella upottamalla 75 mm siirtoaltaisiin (Costar) kiinnitetyt 100 mm petrimal joihin (Costar) . asetetut ihoekvivalentit 25 ml:aan DMEM ja 2 molaari- seen glyseroliin yhden tunnin ajaksi. Petrimaljat ase- • · · T ! 25 tettiin 70 rpm ympyrärataa kiertävään ravistelijaan • · · [· * (Bellco) yhden tunnin ajaksi 10 % C02:lla kaasutetussa • · ; “ kammiossa. Ihoekvivalenttien perfuusion jälkeen petri- *.* ’ maljat, ihoekvivalentit, siirtoaltaat ja solun ulko puolinen jäädytysväliaine asetettiin ohjelmoitavaan : · : 30 pakastimeen (Planer) lähtölämpötilan ollessa 20,0°C.

Kammiota jäähdytettiin sitten -10,0°C minuutissa \ -6,0°C:een. Lämpötila pidettiin paikallaan 20 minuut- ;;; tia kammion lämpötilan tasaamiseksi. 20 minuutin pito- ’*y‘ ajan jälkeen solun ulkopuolinen jäittäminen käynnis- 35 tettiin koskettamalla maljojen ulkopuolta jäätymisvä-·:·· liaineen pinnan alapuolella nestemäisellä typellä 113694 29 jäähdytetyllä puikolla. Sen jälkeen kun kaikki ihoe-kvivalentit oli ympätty jääkiteillä, lämpötila pidettiin vielä 5 minuuttia -6,0°C:ssa. Sitten kammiota jäähdytettiin -1,0°C minuutissa -8,0°C:een. Kammion 5 lämpötila pidettiin jälleen paikallaan -8,0°C:ssa 30 minuutin ajan jään tasaisen jakaantumisen mahdollistamiseksi kaikkialle näytteeseen. Sitten ihoekvivalent-teja jäähdytettiin -0,1°C minuutissa loppulämpötilaan -70,0°C.

10 Kylmäsäilytetyt ihoekvivalentit poistettiin pakastimesta ja maljan kansi irrotettiin. Sulatusta varten 40 ml lämmitettyä (37°C) DMEM kaadettiin aseptisesti kuhunkin petrimaljaan. 45 sekunnin kuluttua kaikki neste poistettiin maljoista ja vielä 40 ml osa 15 lisättiin kuhunkin maljaan kahden minuutin ajaksi. Kun kaikki jää oli sulanut, ihoekvivalentteja huuhdeltiin 25 ml :11a DMEM 30 minuutin ajan. Väliaine vaihdettiin toisen kerran 30 lisäminuutin ajaksi. Sitten yhä siir-toaltaisiin kiinnitetyt ihoekvivalentit siirrettiin 20 takaisin viljelymaljoihin ja niitä inkuboitiin viljelmän elatusväliaineessa 37°C:ssa/10 % C02:ssa 24 tuntia ennen analysointia. Inkubointiajan annettiin pitää • huolta tyypillisesti jäätyneillä soluilla tavatusta : : : viiveestä vakiotilan olosuhteiden muodostamiseksi uu- • 25 delleen. Näytteet analysoitiin käyttäen MTT-analyysi- menettelyä.

• • · • «·

Esimerkki 6: Sarveiskalvoekvivalenttien kylmäsäilytys

Viljelysiirtoaltaisiin (Costar) kiinnitetyt ’_·* 30 sarveiskalvoekvivalentit asetettiin 9 päivää kostean ilmanosteen jälkeen kuuden allasryhmän maljoihin (Costar) . Menetelmä sarveiskalvoekvivalenttien perfusoimi-;; seksi kylmältä suojaavalla aineella oli upottaa kukin sarveiskalvoekvivalentti ja siirtoallas 4 ml:aan solun v' : 35 ulkopuolista jäädytysväliainetta (2M glyserolia *: · DMEM:ssa) kuuden allasryhmän maljoissa yhden tunnin ·&*> 30 113694 ajaksi. Sarveiskalvorakenteita sisältäviä kuuden al-lasryhmän maljoja ravisteltiin yhden tunnin ajan 70 rpm ympyrärataa kiertävässä ravistelijassa (Bellco) 10 % C02:lla kaasutetussa kammiossa. Sarveiskalvoekviva-5 lenttien perfuusion jälkeen sarveiskalvoekvivalentit, siirtoaltaat ja solun ulkopuolisen jäädytysväliaineen sisältävät petrimaljat asetettiin ohjelmoitavaan pakastimeen (Planer) lähtölämpötilan ollessa 20,0°C. Sarveiskalvoekvivalentteja jäähdytettiin sitten 10 -10,0°C minuutissa -6,0°C:een. Lämpötila pidettiin paikallaan 20 minuuttia kammion lämpötilan tasaamiseksi. 20 minuutin pitoajan jälkeen solun ulkopuolinen jäittäminen käynnistettiin koskettamalla kunkin ryhmä-levyssä olevan maljan ulkopuolta jäätymisväliaineen 15 pinnan alapuolella nestemäisellä typellä jäähdytetyllä puikolla. Sen jälkeen kun kaikki ihoekvivalentit oli ympätty jääkiteillä, lämpötila pidettiin vielä 5 minuuttia -6,0°C:ssa ennen jäähdyttämistä -1,0°C minuutissa -8,0°C:een. Lämpötila pidettiin jälleen paikal-20 laan -8,0°C:ssa 30 minuuttia jään tasaisen jakaantumi sen mahdollistamiseksi kaikkialle näytteeseen. Sarveiskalvoekvivalentit jäähdytettiin -0,1°C minuutissa ; '.· loppulämpötilaan -70,0°C.

• .1 Kylmäsäilytetyt sarveiskalvoekvivalentit 25 poistettiin pakastimesta. Maljan kansi irrotettiin.

,· Sulatusta varten 6 ml lämmitettyä (37°C) DMEM kaadet- » tiin aseptisesti kuhunkin ryhmälevyn altaaseen. 45 se-·, kunnin kuluttua kaikki neste poistettiin maljasta ja vielä 6 ml osa lisättiin maljaan kahden minuutin ajak-30 si. Käyttäen steriloituja pihtejä sarveiskalvoekviva- lentit ja kiinnitetyt siirtoaltaat siirrettiin uuteen ryhmämaljaan. Huuhtelua varten lisättiin 4 ml DMEM ku-; hunkin altaaseen 30 minuutin ajaksi. Väliaine vaihdet- tiin toisen kerran 30 lisäminuutin ajaksi. Sarveiskal-35 voekvivalentit siirrettiin sitten takaisin/samaan vil- » » · *·1 ’ jelymaljaan ja niitä inkuboitiin sarveiskalvon elatus- · väliaineessa 37°C:ssa/10 % C02:ssa 24 tuntia ennen 31 113694 analysointia. Inkubointiajan annettiin pitää huolta tyypillisesti jäätyneillä soluilla tavatusta viiveestä vakiotilan olosuhteiden muodostamiseksi uudelleen. Näytteet analysoitiin käyttäen MTT-analyysimenettelyä.

5

Esimerkki 7: Kerätyn hiiren ihon kylmäsäilytys

Villejä hiiriä, syntyperältään B6CB6YF1, lopetettiin kivuttomasti Nembutal-yliannoksella. Ihoa kerättiin talteen aseptisesti. Ylimääräiset verisuo-10 net, rasva ja sidekudos poistettiin ihosta. Hiiren iho leikattiin säännölliseksi suorakulmaiseksi 1 cm x 2 cm palaksi. Hiiren ihonpalaset asetettiin sitten 75 mm siirtoaltaalla (Costar) 100 mm petrimaljoihin (Cos-tar). Hiiren iho perfusoitiin kylmältä suojaavalla ai-15 neella upottamalla 25 ml:aan 2M glyserolia DMEM:ssa 100 mm petrimaljoissa yhden tunnin ajaksi. Perfuusion aikana hiiren ihon ja siirtoaltaan sisältäviä petri-maljoja ravisteltiin yhden tunnin ajan 70 rpm ympyrä-rataa kiertävässä ravistelijassa (Bellco) 10 % C02:lla 20 kaasutetussa kammiossa. Vertailunäytettä, kylmäsäilyt-tämätöntä hiiren ihoa pidettiin ravintoväliaineessa 4°C:ssa kylmäsäilytys- ja sulatusprosessin kestoaika , *. (2 päivää) ennen ihonsiirtoa.

» t l *, Hiiren ihon perfuusion jälkeen hiiren ihon, • · ! 25 siirtoaltaat ja solun ulkopuolisen jäädytysvällaineen • ¥ ► .* * sisältävät petrimaljät asetetaan ohjelmoitavaan Pia- t : “ ner-pakastimeen lähtölämpötilan ollessa 20,0°C. Hiiren * · » *.* * ihoa jäähdytettiin -10,0°C minuutissa -6,0°C:een ja annettiin pysyä paikallaan 20 minuuttia kammion lämpö-“ 30 tilan tasaamiseksi. 20 minuutin pitoajan jälkeen solun ulkopuolinen jäittäminen käynnistettiin koskettamalla maljan ulkopuolta nestemäisellä typellä jäähdytetyllä il) puikolla. Kosketuskohdan täytyy olla jäädytysväliai- ·;·* neen pinnan alapuolella. Sen jälkeen kun koko hiiren il l 35 iho oli ympätty jääkiteillä, lämpötila pidettiin vielä ·;·’· 5 minuuttia -6,0°C:ssa ennen jäähdyttämistä -1,0°C mi- 32 113694 nuutissa -8,0°C:een. Lämpötila pidettiin jälleen paikallaan -8,0°C:ssa 30 minuuttia jään tasaisen jakaantumisen mahdollistamiseksi kaikkialle näytteeseen. Yksiköitä jäähdytettiin sitten -0,1°C minuutissa loppu-5 lämpötilaan -70,0°C.

Kylmäsäilytetty hiiren iho poistettiin pakastimesta ja maljan kansi irrotettiin. Sulatusta varten 40 ml lämmitettyä (37°C) DMEM kaadettiin aseptisesti petrimaljoihin. 45 sekunnin kuluttua kaikki neste 10 poistettiin maljoista ja vielä 40 ml osa lisättiin maljoihin kahden minuutin ajaksi. Kun kaikki jää oli sulanut, hiiren ihoa huuhdeltiin maljoissa 25 ml :11a DMEM 30 minuutin ajan. Väliaine vaihdettiin toisen kerran 30 lisäminuutin ajaksi.

15 Sulatettuja kylmäsäilytettyjä näytteitä ja vertailunäytteitä käsiteltiin histologiaa varten tai ne siirrettiin hiiriin. Kylmäsäilyttämättömän hiiren ihon mikrovalokuvat verrattuna kylmäsäilytetyn hiiren ihoon osoittivat, että hiiren ihon neljä perusmuotoa, 20 kudossolut käsittävä iho, orvaskeden pohjakerros, orvaskeden ylemmät peruskerrokset ja orvaskeden sarveis-kerros olivat säilyneet tällä menetelmällä. Kaikki ; kerrokset olivat vahingoittumattomia ja kylmäsäilyte- tyn hiiren ihon kokonaismorfologia oli samanlainen • · :: 25 kuin kylmäsäilyttämättömän hiiren ihon.

• · * 1 l » *" Esimerkki 8: ATS SKIN2™:n kylmäsäilytys • · · • · · SKIN2™, tyyppi ZK 1300 (Advanced Tissue .. , Sciences, La Jolla, CA) poistettiin pakkauksesta kul- • · i • ;1 30 jetusohjeiden mukaisesti niiden saapuessa ja asetet- • · tiin viljelymaljoihin (Costar) . Siirtoallasupotteet : asetettiin SKIN2™:n yläpuolelle ihorakenteen pitämi- t I ) .···. seksi upotettuna. SKIN2™ perfusoitiin kylmältä suojaa-

Il · #;t valla aineella upottamalla SKIN2™ viljelymajoissa ole- • · · '·' ' 35 vaan 2M glyseroliin DMEM:ssa yhden tunnin ajaksi. Per- 1 fuusion aikana rakenteen ja siirtoaltaan sisältäviä 112694 33 viljelymaljoja ravisteltiin yhden tunnin ajan 70 rpm ympyrärataa kiertävässä ravistelijassa (Bellco) 10 % C02:11a kaasutetussa kammiossa.

SKIN2™:n perfuusion jälkeen yksiköt asetet-5 tiin ohjelmoitavaan pakastimeen (Planer) lähtölämpöti-lan ollessa 20,0°C. SKIN2™-yksiköitä jäähdytettiin -10,0°C minuutissa -6,0°C:een ja annettiin olla 6,0°C:ssa 20 minuuttia kammion lämpötilan tasaamiseksi. 20 minuutin pitoajan jälkeen solun ulkopuolinen 10 jäittäminen käynnistettiin koskettamalla maljojen ulkopuolta jäädytysväliaineen pinnan alapuolella nestemäisellä typellä jäähdytetyllä puikolla. Sen jälkeen kun SKIN2™-yksiköt oli ympätty jääkiteillä, lämpötila pidettiin vielä 5 minuuttia -6,0°C:ssa. Sitten kammion 15 lämpötilaa jäähdytettiin -1,0°C minuutissa -8,0°C:een. SKIN2™-yksiköiden annettiin olla 30 minuuttia 8,0°C:ssa jään tasaisen jakaantumisen mahdollistamiseksi kaikkialle näytteeseen. SKIN2tM-yksiköitä jäähdytettiin sitten -0,1°C minuutissa loppulämpötilaan -20 70,0°C.

Kylmäsäilytetty SKIN2™ poistettiin pakasti-.. . mesta, maljojen kannet irrotettiin ja lämmitettyä ;* (37°C) DMEM kaadettiin aseptisesti kuhunkin viljely- maljaan. 45 sekunnin kuluttua kaikki neste poistettiin : ! 25 maljoista ja tehtiin toinen DMEM-lisäys kuhunkin mal- : jaan kahden minuutin ajaksi. Sulatuksen jälkeen SKIN2™-yksikkö ja kiinnitetty siirtoallas siirrettiin uusiin viljelymaljoihin käyttäen steriloituja pihtejä. SKIN2™:n huuhtelemiseksi kylmältä suojaavasta aineesta 30 kuhunkin SKIN2w:ta sisältävään viljelymal jaan lisät- ♦ · tiin DMEM 30 minuutin ajaksi. Väliaine vaihdettiin T toisen kerran 30 lisäminuutin ajaksi. Sitten SKIN2™- yksikkö siirrettiin takaisin saman tyyppiseen viljely- ‘."l maljaan ja inkuboitiin viljelyn elatusaineessa #.j*t 35 37°C:ssa/10 % C02:ssa 24 tuntia ennen analysointia.

• · ·

Toistettuna, inkubointiajan annettiin pitää huolta t k 34 113694 tyypillisesti jäätyneillä soluilla tavatusta viiveestä vakiotilan olosuhteiden muodostamiseksi uudelleen.

Kylmäsäilytetyt ja vertailunäytteet analysoitiin noudattaen MTT-analyysimenettelyä tuotteeseen 5 suljettua SKIN2™, mallia ZK1300, varten ja myös histo-logisesti arvioimalla. Kylmäsäilyttämättömän SKIN2™:n mikrovalokuvat verrattuna kylmäsäilytettyyn SKIN2™:een osoittivat, että SKIN2™:n neljä perusmuotoa, kudosso-lut käsittävä kollageeniristikko, orvaskeden pohjaker-10 ros, orvaskeden ylemmät peruskerrokset ja orvaskeden sarveiskerros olivat säilyneet tällä menetelmällä. Kaikki kerrokset olivat vahingoittumattomia ja kyl-mäsäilytetyn SKIN2™-.n kokonaismorfologia oli samanlainen kuin kylmäsäilyttämättömän SKIN2™:n.

15

Esimerkki 9: Metabolisen mitokondriovaikutuksen analysointi (MTT, metabolic mitochondrial activity assay) Jäädytetty ja jäädyttämätön (vertailu) LSE, orvaskesikalvo, ihoekvivalentit ja sarveiskalvoekviva-20 lentit testattiin käyttäen MTT-analyysiä. [SKIN2™-rakenteet analysoitiin "MTT-analyysimenettely käytet-.· täväksi tyypin ZK1300 yhteydessä" mukaisesti, joka si sältyi kuljetusohjeisiin.] Rakenteiden solun elinkel-! poisuus määritettiin käyttäen MTT-analyysiä, solujen ;*,· 25 kasvun ja elinkelpoisuuden määrittämiseen kehitettyä kolorimetrista MTT-konversioanalyysia. Tätä analyysia • » · on kuvattu yksityiskohtaisesti Gay et al.-n artikkelis- • * · sa "Elävä ihoekvivalentti laboratoriomallina luokitel- ... taessa ihoärsykkeiden mahdollista myrkyllisyyttä", To- • * * 30 xic. in Vitro, 6:303-315 (1992). Liukoisen tetrazo- • · liumsuolan metabolinen reduktio siniseksi formazan-: saostumaksi riippuu elävien solujen läsnäolosta, joi- .*·*. den mitokondriotoiminta on vahingoittumaton. Tätä ana- lyysiä käytetään solumyrkyn isyyden kvantitatiiviseen '·* ’ 35 määritykseen erilaisissa solutyypeissä, mukaanlukien ' * viljellyt ihmisen kerätinosyytit.

35 113694 LSE:n, orvaskesikalvon ja ihoekvivalentin sisältäviin viljelymaljoihin lisättiin 40 ml analyysivä-liainetta ja sarveiskalvoekvivalentteja sisältäviin altaisiin lisättiin 1,5 ml analyysiväliainetta, joka 5 sisältää 0,33 mg/ml MTT (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Kudosekvivalentteja inkuboitiin MTT-ana-lyysiväliaineessa 3-4 tunnin ajan. Konversiojakson lopussa kudosekvivalentista otettiin koepala käyttäen halkaisijaltaan 8 mm ihokoepalan otinta. Stanssattuja 10 koepaloja uutettiin sitten 2-3 tunnin ajan huoneenlämpötilassa 0,3 ml:ssa isopropanolia, joka oli tehty happamaksi 0,04-N HCl:lla. Uuttojakson lopussa 0,2 ml kutakin uutosta siirrettiin 96-paikkaiseen allaslevy-altaaseen. Absorbanssit luettiin levyjen lukulait-15 teella (Dynatech) aallonpituudella 570 nm isopro- panoliuutosväliaineen ollessa sokea koe. Sulatetuista kylmäsäilytetyistä näytteistä saatuja MTT-arvoja verrattiin vastaaviin vertailunäytteisiin ja tulokset ilmaistiin vertailuprosentin avulla (kuva 4).

20

Esimerkki 10: Laktaattidehydrogenaasianalyysi (LDH, lactose dehydrogenase assay) LDH on tyypillisesti elävässä solussa havait-I I tu entsyymi. Solun vaurioituminen saa aikaan entsyymin 25 vapautumisen ja vastaavan tämän analyysin ilmaiseman ;\t entsyymitoiminnan vähenemisen.

Sulatetut kylmäsäilytetyt ja vertailu-LSE- näytteet stanssattiin halkaisijaltaan 8 mm ihokoepalan .. , ottimellä. Kustakin LSE-yksiköstä otettiin kolme näy- • · · • · 30 tettä. Stanssatut näytteet asetettiin 15 mm putkiin, • · ’···’ joissa oli 1 ml 0,1M trietanoliamiinipuskuria (jäissä) : ja homogenoitiin sähköisellä kudoshomogenoijalla yhden minuutin ajan. Sitten näytteitä sentrifugoitiin 1000g:n voimalla 4,0°C:ssa. Sitten analysoitiin sakan • « » ’·" * 35 yläpuolinen neste. LDH-seosreagenssi valmistettiin se- * · · * · koittamalla yhteen seuraavaa: 3,00 ml fosfaattipusku- 36 113694 ria (0,1 mol/1; pH 7,0), 0,1 ml palorypälehapon Na- suolaa (2,5 mg/ml) ja 0,05 ml NADH:n Na-suolaa (10 mg/ml). Sakan yläpuolisesta näytenesteestä 100 μΐ lisättiin 900 pl:aan reagensseja ja annettiin reagoida 5 kahden minuutin ajan. Absorbanssin muutos kahden minuutin kuluessa merkittiin muistiin. Kolmen näytteen keskiarvoa/kylmäsäilytetty LSE-yksikkö verrattiin jäädyt tämät torni in vertailunäytteisiin. Näytteiden arvoja verrattiin vastaaviin vertailuarvoihin ja tulokset il-10 maistiin vertailuprosentin avulla (kuva 4).

Esimerkki 11: Kylmäsäilytetyn LSE:n biologinen vastaavuus verrattuna kylmäsäilyttämättömään LSE-.iin

Kylmäsäilytetyn ja kylmäsäilyttämättömän 15 LSE:n biologisen vastaavuuden osoittamiseksi suoritet tiin kudoksensiirtotutkimus hiiriin, joilta puuttui kateenkorva.

LSE-yksiköt, jotka on kylmäsäilytetty esimerkissä 1 kuvatun menetelmän mukaisesti, sulatettiin 20 päivää ennen kudoksensiirtoa ja palautettiin elatusvä-1laineeseen 24 tunnin ajaksi.

. Suoritettiin neljä koetta, joissa yhteensä 66 , .: suvun B6CB6YF1/J-nu (Jackson Harbor Labs) hiireen, lt\ l joilta puuttui kateenkorva, siirrettiin joko kylmäsäi- 25 lytetty LSE (n=43) tai kylmäsäilyttämätön (vertailu) LSE (n=23). Eläimet nukutettiin Nembutalilla. 2x2 • ♦ · cm:n täysipaksuinen ihon osa poistettiin leikkaamalla • « 1 kunkin hiiren selästä säästäen iholihaskerros. LSE-.. . siirrännäiset, joko vertailunäyte tai kylmäsäilytetty, • i · •>i(1 30 asetettiin haavalle ja leikattiin siihen sopiviksi.

'··’ Kaikki siirrännäiset sidottiin yhdellä kerroksella va- ; seliinilla impregnoitua sideharsoa (vendor) ja peitet- tiin kahdella liimasiteellä (vendor). Siteet poistet-tiin 7 päivää siirron jälkeen.

• · · ’·1 | 35 14 päivää siirron jälkeen kaikki eläimet lo- ’ petettiin kivuttomasti ja valokuvattiin. Sitten siir- 37 113694 rännäisen kohta poistettiin leikkaamalla histologista analyysiä ja arviointia varten. Yleisvalokuvat ja mik-rovalokuvat eivät osoittaneet mitään eroa siirrännäisen yhteenliittymisessä vertailu-LSE:n tai sulatetun, 5 kylmäsäilytetyn LSE:n välillä. Mitään huomattavaa eroa ei havaittu haavan arpikudostumisnopeuksissa vertailu-siirrännäisten tai kylmäsäilytettyjen siirrännäisten välillä.

10 Esimerkki 12: Kylmäsäilytetyn hiiren ihon ja vertailu-näytteen syngenainen (syngenaic) ihonsiirto

Kylmäsäilytetyn ja kylmäsäilyttämättömän hiiren ihon biologisen vastaavuuden osoittamiseksi suoritettiin syngenainen (syngenaic) ihonsiirtotutkimus.

15 Villejä hiiriä, suku B6CB6YF1, lopetettiin kivuttomasti Nembutalin yliannoksen avulla. Ihoa kerättiin talteen aseptisesti. Ylimääräiset verisuonet, rasva ja sidekudos poistettiin ihosta valmisteltaessa ihonsiirtoa. Hiiren iho kylmäsäilytettiin ja sulatet-20 tiin noudattaen esimerkin 7 menetelmää. Vertailunäy- tettä, kylmäsäilyttämätöntä hiiren ihoa pidettiin ra- * vintoväliaineessa 4°C:ssa kylmäsäilytys- ja sulatus- : prosessin kestoaika, yhteensä 2 päivää, ennen ihon- siirtoa.

* 25 Kuusi samansukuista hiirtä vastaanotti iho- ;' siirrännäisiä, kaksi vertailunäytteen, kylmäsäilyttä- , mättömän hiiren ihoa ja neljä vastaanotti sulatettua, t t » kylmäsäilytettyä hiiren ihoa. Hiiret nukutettiin , Nembutalilla. 2 x 2 cm:n täysipaksuinen ihon osa pois- * * * 30 tettiin leikkaamalla kunkin hiiren selästä säästäen • * ’·;·* iholihaskerros. Hiiren ihosiirrännäiset, joko vertai- : lunäyte tai kylmäsäilytetty, asetettiin haavoille ja leikattiin niihin sopiviksi. Kaikki siirrännäiset si- • · > dottiin yhdellä kerroksella vaseliinilla impregnoitua ’·* | 35 sideharsoa peitettynä kahdella liimasiteellä. Nämä si- 1 t « t t teet poistettiin 7 päivää siirron jälkeen.

38 113694 30 päivää siirron jälkeen kaikki eläimet lopetettiin kivuttomasti ja valokuvattiin. Sitten siirrännäisen kohta poistettiin leikkaamalla histologista analysointia ja arviointia varten. Yleisvalokuvat ja 5 mikrovalokuvat osoittivat, ettei siirrännäisen yhteenliittymisessä ollut mitään eroa vertailuhiiren ihon tai sulatetun, kylmäsäilytetyn hiiren ihon välillä. Mitään huomattavaa eroa ei havaittu haavan arpikudos -tumisnopeuksissa vertailusiirrännäisten tai kylmäsäilö lytettyjen siirrännäisten välillä.

Vaikka edellä olevaa keksintöä on kuvattu jonkin verran yksityiskohtaisesti valaisevan kuvauksen ja esimerkin avulla sen ymmärtämiseksi paremmin, on alan asiantuntijalle ilmeistä, että tiettyjä muutoksia 15 ja modifikaatioita voidaan ottaa käyttöön liitteenä olevien patenttivaatimusten suojapiirin sisäpuolella.

t > · 1 * · • ·

* I

t

• I

Claims (11)

39 113 6 9 4

1. Menetelmä kerätyn nisäkkään kudoksen tai viljellyn kudosekviValentin kylmäsäilyttämiseksi, tunnettu siitä, että: 5 (a) upotetaan kudos kylmältä suojaavaan liuokseen, sekoitetaan kylmältä suojaavaa liuosta ja upotettua kudosta kylmältä suojaavan liuoksen saamiseksi tunkeutumaan tehokkaasti kudokseen ja saamaan aikaan perfu-soitu kudos; 10 (b) ympätään solun ulkopuolista jäätä kylmältä suojaavaan liuokseen ja perfusoituun kudokseen; (c) jäähdytetään perfusoitu kudos vaiheesta (b) kylmäsäilytystilaan jäädyttämällä kudos hitaalla jää-dytysnopeudella vähintään lämpötilaan n. -70°C tai sen 15 alapuolelle kylmäsäilötyn kudoksen tuottamiseksi, ja (d) varastoidaan kylmäsäilöttyä kudosta vähintään n. -70°C:een lämpötilassa tai sen alapuolella.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (a) upotus suo- 20 ritetaan lähtölämpötilan ollessa n. 20°C ja jäähdytetään sitten perfuusion aikana nopeudella n. -10°C/min n. -6°C:een lämpötilaan.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (c) jäädytys ta- : 25 pahtuu nopeudella -l°C/min n. -8°C:een lämpötilaan ja t · pidetään siinä riittävä aika kudoksessa olevan kylmäl- • I · tä suojaavan liuoksen fysikaalisen ja biologisen tasapainon saavuttamiseksi.

... 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, • · · ;>t;’ 30 tunnettu siitä, että vaiheessa (c) lämpötila • · *··*’ pidetään vakiona riittävä aika kudoksessa olevan kyl- ; mältä suojaavan liuoksen fysikaalisen ja biologisen tasapainon saavuttamiseksi. # » *

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että jäähdytystä jatketaan no- * * · * * peudella n. -0,3- -0,02°C/min lämpötilaan n. -70°C tai sen alapuolelle. 40 113694

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kerätty nisäkkään kudos on kerättyä nisäkkään ihoa.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että viljelty kudosekvivalentti valitaan ryhmästä, joka sisältää viljellyn orvaskesie-kvivalentin, viljellyn ihoekvivalentin ja viljellyn sarve i skalvoekvivalent in.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että kylmäsäilytystilan lämpötila on -120°C tai sen alapuolella - -196°C tai sen alapuolella.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kylmältä suojaava liuos on 15 1,5 - 2,5M glyseroli DMEM-pohjassa (Dulbecco's Modi fied Eagle's Medium).

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, joka käsittää lisäksi lasittuneen kudoksen sulattami-sen, tunnettu siitä, että kudos sulatetaan n. 1 20 - 2 minuutin kuluessa.

11. Laitteisto kerätyn nisäkkään kudoksen tai viljellyn kudosekvivalentin kylmäsäilyttämiseksi, vaatimuksen 1 mukaisesti tunnettu siitä, että siihen kuuluu: . j 25 malja (40), joka käsittää sivuseinän (42) ja lai- I · ; ’ pan (43) kanssa yhtenäisen alapinnan (41), jossa sivu- ’’ seinässä on sisäänpäin ulottuvia sivuseinästä laajene- '· * via ja sen kanssa yhtenäisiä tukiosia (44) ; kantoalusta (30), joka sisältää pääosin putken ; ,·’ 30 muotoisen tukiosan toiseen päähän kiinnitetyn tasaisen läpäisevän kalvon (32) ja putken muotoisen tukiosan (33) vastakkaisessa päässä reunan (31), jossa reunaa i (31) tukevat maljan sisäänpäin ulottuvat tukiosat; ;·’ kansi (10), joka käsittää sivuseinän (12) ja lai- *. 35 pan (11) kanssa yhtenäisen tasomaisen alapinnan (13) , ;·*: jossa laippa (11) on tiiviissä kosketuksessa maljan laipan kanssa; ja 41 113694 tiiviste (20) maljan ja kannen välissä. * i · • * # · * • t I * » tl» 42 113694