ES2948493T3 - Aparatos y métodos mejorados de micromanipulación y de almacenamiento - Google Patents
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Abstract
Un aparato para micromanipulación de material biológico, incluyendo dicho aparato un recipiente (1) que tiene un depósito (2) en el que dicho recipiente tiene un canal (3) formado en una porción de dicho depósito, incluyendo dicho canal una restricción intermedia (4) dimensionada para resistir el paso de dicho material biológico pero permitir el paso de soluciones de tratamiento líquidas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Aparatos y métodos mejorados de micromanipulación y de almacenamiento
Introducción a la invención
La presente invención se refiere a aparatos y métodos para la micromanipulación de materiales biológicos y, en particular, a aparatos y metodologías para su uso en la criopreservación de materiales biológicos, entre los que se incluyen ovocitos humanos y no humanos, embriones, semen, células madre y blastocitos.
Si bien la invención se ha desarrollado y tiene aplicación en un amplio intervalo de situaciones y técnicas de micromanipulación con una gama de materiales biológicos, tiende a aplicarse particularmente para su uso en la criopreservación de ovocitos humanos, embriones, mórula, esperma y células madre mediante vitrificación, según lo aplicado durante los procedimientos de fecundación in vitro (FIV) y similares.
Antecedentes de la invención
Las tecnologías implicadas y aplicadas para la criopreservación de embriones humanos y animales están bien establecidas y con la aplicación de la habilidad y los conocimientos técnicos adecuados, las tecnologías actuales han logrado una gran mejora en la fiabilidad y el éxito de los procedimientos de fecundación in vitro.
Para los fines de esta memoria descriptiva, los términos "congelación" y "vitrificación" se consideran que tienen la siguiente definición:
"Congelación" es el enfriamiento de un líquido hasta un estado sólido que puede incluir la cristalización.
"Vitrificación" es el enfriamiento de un líquido hasta un estado sólido sin cristalización.
Las técnicas, tal y como se entienden y aplican, implican la recolección y criopreservación de embriones, con una pluralidad de etapas que implican la recolección y extracción de ovocitos, la fecundación in vitro de los mismos y la posterior congelación y almacenamiento de dichos óvulos fecundados y de los embriones resultantes y/o de los blastocistos en fase tardía. La multitud de etapas y fases de manipulación requeridas dependen en gran medida de un alto nivel de conocimientos técnicos y habilidad por parte de los operadores técnicos. Una vez congelados, los embriones o los blastocistos, se ponen posteriormente a disposición según sea necesario y pueden descongelarse y transferirse a la receptora, por lo que la implantación satisfactoria en el útero puede dar como resultado el desarrollo normal de un feto y el embarazo resultante.
Más recientemente, estas técnicas de criopreservación se han aplicado de forma satisfactoria a óvulos y ovocitos no fecundados. La criopreservación de ovocitos conlleva la recolección, congelación y almacenamiento de óvulos u ovocitos de una donante en estado no fecundado. Estos óvulos congelados pueden extraerse posteriormente de un banco de almacenamiento, descongelarse y ponerse a disposición para su fecundación y transferencia a la donante que lo solicite.
Las técnicas de criopreservación aplicadas a los ovocitos en lugar de a los óvulos y embriones fecundados, tienen ciertas ventajas éticas y médicas y han sido objeto de una creciente investigación y experimentación para mejorar las técnicas implicadas.
El proceso de criopreservación, especialmente cuando se aplica a materiales biológicos "vivos", entraña un alto grado de traumatismo para el material biológico en cuestión, sobre todo debido a las múltiples etapas de manipulación requeridas de acuerdo con las técnicas actuales. Además del traumatismo experimentado como resultado de la manipulación física, el material biológico también está sujeto a la posible formación de cristales de hielo durante el proceso de congelación, además del choque osmótico y del choque tóxico experimentados durante el movimiento a través de una pluralidad de soluciones químicas de procesamiento.
El método tradicional de preparación de material biológico congelado incluye el lento enfriamiento del material y de su solución circundante hasta la temperatura de almacenamiento, con la intención de iniciar deliberadamente la formación de cristales de hielo de forma remota del material biológico per se. El método tradicional no es óptimo debido a la formación continua de cristales de hielo. Se han desarrollado métodos alternativos de "vitrificación" para abordar los problemas de formación de cristales de hielo, sin embargo, la vitrificación requiere una habilidad técnica considerable para su ejecución satisfactoria. La vitrificación implica la transformación de la solución de procesamiento en un sólido amorfo similar al vidrio que carece de estructura cristalina, seguido de un enfriamiento extremadamente rápido. El enfriamiento extremadamente rápido es lo que permite a la solución alcanzar el estado amorfo similar al vidrio
La aplicación del método tradicional de congelación o vitrificación implica el uso de compuestos y soluciones químicos, que se añaden al material biológico para minimizar el daño celular durante los procesos de congelación. Los compuestos y soluciones químicos son conocidos como crioprotectores e incluyen soluciones permeables y no permeables. Los crioprotectores permeables son pequeñas moléculas que penetran fácilmente en las membranas del
material biológico mediante la formación de enlaces de hidrógeno con las moléculas de agua del material biológico a fin de evitar su cristalización de hielo. Los ejemplos de estos crioprotectores permeables son etilenglicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO) y glicerol. A bajas concentraciones en agua, estos crioprotectores permeables reducen la temperatura de congelación de la solución resultante y pueden ayudar a prevenir y minimizar la cristalización del hielo. A concentraciones más elevadas, que pueden diferir a diferentes velocidades de enfriamiento, dichos crioprotectores permeables inhiben la formación de cristales de hielo típicos y pueden provocar el desarrollo de un estado similar al vidrio sólido o vitrificado en el que el agua se solidifica antes de la cristalización o expansión. La toxicidad de tales crioprotectores permeables aumenta con el incremento de sus concentraciones y son potencialmente tóxicos para el material biológico en cuestión y, en consecuencia, el material biológico debe tener una exposición mínima a los crioprotectores permeables durante un período de tiempo muy corto, o alternativamente, exposición a baja temperatura, mediante la cual se reduce la tasa metabólica del material biológico en cuestión.
A diferencia de los crioprotectores permeables, los crioprotectores no permeables permanecen extracelulares. Algunos ejemplos de crioprotectores no permeables incluyen disacáridos, trehalosa y sacarosa. Los crioprotectores disacáridos actúan extrayendo agua libre del interior del material biológico y deshidratando los espacios intracelulares. La deshidratación resultante permite usarlos en combinación con crioprotectores permeables, de manera que la concentración neta del crioprotector permeable puede aumentarse en el espacio intracelular. Estas técnicas ayudan además al crioprotector permeable a prevenir o minimizar la formación de cristales de hielo.
Durante el proceso de vitrificación, los crioprotectores permeables pueden añadirse a una concentración elevada mientras la temperatura del material biológico se controla a un nivel predeterminado por encima de la congelación. Sin embargo, debido a que la toxicidad de tales concentraciones tan altas de crioprotector permeable puede ser sustancial, no es posible retener el material biológico a tales temperaturas durante períodos prolongados. Como alternativa, puede dejarse un tiempo reducido para el equilibrio, tras el cual el material biológico, que puede incluir ovocitos o embriones, se sumerge directamente en nitrógeno líquido para efectuar la congelación. La velocidad extremadamente rápida de enfriamiento, minimiza los efectos negativos del crioprotector en el material biológico y también, minimiza la formación de cristales de hielo al favorecer la vitrificación.
El proceso de vitrificación conlleva exponer el material biológico a al menos tres soluciones de vitrificación. Las soluciones de vitrificación normalmente se añaden a pocillos sucesivos de una placa de cultivo multipocillo, donde la placa y las soluciones se calientan a una temperatura predeterminada, determinada de acuerdo con los requisitos del material biológico en cuestión.
En un protocolo típico, el material biológico se transfiere físicamente a una primera solución en un primer pocillo y luego se lava moviendo físicamente el material biológico o la célula a través de la solución en cuestión con un dispositivo de pipeteo de células. El proceso de lavado se repite en un segundo, tercer y cuarto pocillo durante períodos de tiempo predeterminados hasta que el material biológico o la célula se consideran listos para la criopreservación. A continuación, el material biológico se extrae físicamente con una cantidad predeterminada de solución de vitrificación usando una pipeta u otro dispositivo de manipulación. A continuación, se pipetea en el dispositivo de vitrificación una gota que contiene el material biológico o célula que se va a vitrificar. A continuación, el dispositivo de vitrificación se transfiere físicamente con la gota y el material biológico adheridos y se sumerge directamente en nitrógeno líquido o se coloca sobre la superficie de un bloque de vitrificación que se ha enfriado previamente con nitrógeno líquido. Una vez que el material biológico y el fluido portador se han vitrificado, el dispositivo de vitrificación se inserta luego en una pajita preenfriada u otro dispositivo de almacenamiento, situado en una ranura del bloque de vitrificación para su posterior transferencia a un almacenamiento en frío a largo plazo, ya sea en nitrógeno líquido o en vapor de nitrógeno líquido.
Se usan varios dispositivos de vitrificación para manipular la muestra durante los procesos de criopreservación. Algunos proponen un dispositivo tipo pipeta en el que la muestra se aspira en un tubo hueco que se sumerge directamente en la solución o en nitrógeno líquido. Este dispositivo lo comercializa Irvine scientific y se vende con el nombre de Cryotip®.
Otros usan un dispositivo tipo bucle/gancho que tendrá un bucle cerrado o un gancho abierto hecho de alambre de plástico o metal adherido al extremo de un vástago y que se usa para recoger la muestra biológica. Tales dispositivos son comercializados por Cryologic con el nombre comercial de Fibreplug o Cryoloop como se define en el documento WO00/21365.
Otras herramientas como las divulgadas en la solicitud internacional WO 02/085110 "Cryotop" que es una tira flexible fijada a una pieza de plástico. En la que la muestra se coloca en la tira y se sumerge directamente en nitrógeno líquido.
Otras herramientas para la micromanipulación de materiales biológicos que comprenden un recipiente que tiene un depósito y un canal que incluye una restricción intermedia dimensionada para resistir el paso de dicho material biológico pero permitir el paso de soluciones líquidas de tratamiento son conocidas por los documentos US 2010/015697 A1 y WO 2006/097749 A1.
La técnica anterior actual requiere muchas etapas de manipulación de embriones usando múltiples aparatos; cada
etapa de manipulación aumenta la posibilidad de perder el embrión. Se estima que el 1-2 % de los embriones perdidos se deben a la manipulación durante la etapa de vitrificación.
El traumatismo asociado a los procesos descritos anteriormente y, en particular, el traumatismo impuesto por el manejo y la manipulación física repetidos de material biológico extremadamente delicado, incluyendo los óvulos, células, embriones y blastocistos, repercute en la tasa de supervivencia y, por tanto, en el éxito, de los procesos y métodos descritos anteriormente. Asimismo, la dinámica física de un embrión vivo introduce un crecimiento rápido y cambios en la forma del embrión que dificultan aún más cualquier manipulación y, en particular, la manipulación automatizada de estos materiales biológicos. Cualquier automatización necesita gestionar dicha dinámica, así como gestionar una gama de diferentes tipos de embriones, un rápido movimiento de fluidos junto con una amplia gama de viscosidades de fluidos. Claramente, con el fin de maximizar las posibilidades de éxito y minimizar el traumatismo impuesto a los materiales manipulados, es muy conveniente reducir al mínimo la manipulación física de materiales tan delicados, además de minimizar el número y el grado de las diferentes soluciones de lavado aplicadas al material biológico.
El cultivo es una técnica que permite cultivar embriones hasta el día 4, 5 o 6 después de la fecundación para ayudar a seleccionar los embriones de mejor calidad para la transferencia. Un cultivo prolongado puede aumentar la probabilidad de éxito del embarazo.
Un objeto de la invención es proporcionar aparatos y métodos mejorados para la micromanipulación y almacenamiento de materiales biológicos, incluyendo, aunque sin limitación, el cultivo y la criopreservación de dichos materiales.
Otro objeto de la invención es controlar los tiempos del protocolo de lavado usando la automatización y reducir la manipulación del embrión, permitiendo así la automatización completa.
Declaraciones de la invención
En un primer aspecto, la invención proporciona un aparato para micromanipulación de uno o más materiales biológicos, incluyendo dicho aparato un recipiente que tiene un depósito, en donde dicho recipiente tiene un canal formado en una parte de dicho depósito, incluyendo dicho canal una restricción intermedia dimensionada para resistir el paso de dicho material biológico pero permitir el paso de soluciones líquidas de tratamiento. La restricción puede incluir un paso generalmente vertical o una plataforma generalmente horizontal. La restricción intermedia puede incluir un estrechamiento físico del paso, un orificio que bloquea parcialmente el canal o uno o más rebajes u otros medios de bloqueo parcial. La solución líquida de tratamiento puede incluir medio de cultivo, medio de criopreservación, medio de descongelación, medio de vitrificación, medio de fecundación o solución tampón.
El recipiente tiene una parte superior abierta con el canal formado en el fondo del mismo. El canal incluye subdepósitos en cada extremo de la restricción. El recipiente está formado por un material con conductividad térmica y difusividad elevadas, con una preferencia particular por la alta conductividad en las regiones de subdepósito y de canal. El recipiente incluye preferentemente un tapón o tapa adaptado para sellar la parte superior abierta, ya sea como una tapa separada o como una tapa integral con bisagras.
El aparato puede incluir un soporte para dicho recipiente.
El recipiente o soporte incluye preferentemente una parte adaptada para recibir un código de barras u otros indicadores.
El material del recipiente se elige preferentemente de un material esterilizable y biológicamente inerte, de modo que no suponga una amenaza de contaminación para el material o materiales biológicos. El material del recipiente tiene preferentemente una alta difusión térmica y, más preferentemente, tiene un espesor de 1 mm y 0,05 mm.
En otro aspecto, la invención proporciona un aparato que es un dispositivo de criopreservación automatizado que incluye la disposición de uno o una pluralidad de los recipientes descritos anteriormente, en donde el aparato incluye además medios para irrigar el material biológico cautivo con soluciones de vitrificación y/u otras soluciones de tratamiento y medios para vitrificar el material biológico cautivo.
En otro aspecto, la invención proporciona un dispositivo semiautomatizado que incluye la disposición de uno o una pluralidad de los recipientes descritos anteriormente, en donde el aparato incluye medios para irrigar el material biológico cautivo con soluciones de tratamiento de previtrificación o vitrificación y fluídica para preparar el material biológico cautivo para una vitrificación.
En otro aspecto, la invención proporciona un método de criopreservación de material biológico que comprende las etapas de:
• introducción del material biológico en una región de subdepósito del recipiente descrito anteriormente; irrigando el material biológico con una serie de soluciones de vitrificación introducidas y retiradas del otro subdepósito (en el otro extremo del canal desde el que se introduce el material biológico)
• drenaje final de dichas soluciones de irrigación del recipiente; y
• vitrificación de dicho material biológico cautivo en dicho recipiente.
En otro aspecto, la invención proporciona un método de criopreservación de material biológico que comprende las etapas de:
• introducción del material biológico en una región de subdepósito del recipiente descrito anteriormente; irrigando el material biológico con una serie de soluciones de vitrificación introducidas y retiradas del otro subdepósito (en el otro extremo del canal desde el que se introduce el material biológico)
• drenaje final de dichas soluciones de vitrificación de dicho recipiente; y
• vitrificación de dicho material biológico cautivo en dicho recipiente.
La serie de soluciones de vitrificación incluye preferentemente crioprotectores no permeables y permeables de aumento gradual seleccionados de etilenglicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, disacáridos, trehalosa y sacarosa para mejorar el hundimiento de dicho material biológico hasta el fondo de dicha región de subdepósito, a fin de permitir el máximo drenaje y retención de una solución de irrigación mínima antes de la vitrificación o congelación.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento de previtrificación de un material biológico, comprendiendo dicho método las etapas de:
• introducción de dicho material biológico en la región de depósito de un aparato como se ha descrito anteriormente para su captura en la región de canal de dicho recipiente; e
• irrigación de dicho material biológico con soluciones de cultivo o de previtrificación y fluídica.
En otro aspecto, la invención proporciona un método de descongelación de un material biológico vitrificado, comprendiendo el método las etapas de:
• retirada del material biológico vitrificado en un aparato como se describe en el presente documento de la solución de enfriamiento;
• descongelación del recipiente de dicho aparato y dicho material biológico por aplicación de calor en una solución calentada.
• aplicación de calor a la superficie de dicho recipiente o al aire ambiente de dicho recipiente;
• irrigación de dicho material biológico con una serie de soluciones de descongelación introducidas y retiradas de la región de depósito de dicho recipiente;
• drenaje de dichas soluciones de irrigación de dicho recipiente; y
• recuperación del material biológico descongelado de dicho recipiente.
El método de criopreservación de material biológico puede comprender además la etapa de:
• almacenamiento de dicho recipiente y del material biológico cautivo en una instalación de almacenamiento hasta que el material biológico sea desvitrificado.
En otro aspecto, la invención proporciona un método de descongelación de una muestra biológica congelada o vitrificada que comprende invertir el método descrito anteriormente usando soluciones de descongelación.
Cualquier análisis de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares que se ha incluido en la presente memoria descriptiva tiene como única finalidad proporcionar un contexto para la presente invención. No debe considerarse como una admisión de que alguno o todos estas materias forman parte de la base del estado de la técnica o eran de conocimiento general habitual en el campo relevante para la presente invención tal y como existía antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de la presente solicitud.
A lo largo de la presente memoria descriptiva, el término "comprende" o las variaciones tales como "comprendido/a" o "que comprende", debe interpretarse como implicaciones de la inclusión de un elemento, elemento integrante o etapa, o grupo de elementos, elementos integrantes o etapas indicados, pero no la exclusión de ningún otro elemento, elemento integrante o etapa, o grupo de elementos, elementos integrantes o etapas.
Leyenda
1. Recipiente
2. Depósito
3. Canal
4. Restricción
5. Parte superior abierta
6. Fondo
7. Subdepósitos
8. Extremos de canal
9. Tapón o tapa
10. Plataforma de indicadores
11. Bastidor de soporte
12. Casete
13. Bisagra
14. Rebaje
15. Soporte
16. Cargador
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una vista en perspectiva del recipiente;
La Figura 2 muestra una vista superior del recipiente abierto;
La Figura 3 muestra una vista lateral del recipiente;
La Figura 4 muestra una vista de extremo del recipiente;
La Figura 5 muestra una vista en perspectiva del recipiente con rebajes;
La Figura 6 muestra una vista superior del recipiente abierto con rebajes;
La Figura 7 muestra una vista lateral del recipiente con rebajes;
La Figura 8 muestra una vista de extremo del recipiente con rebajes;
La Figura 9 muestra el recipiente y un soporte;
La Figura 10 muestra un soporte y una tapa alternativos;
La Figura 11 muestra el tapón montado en el recipiente en el soporte;
La Figura 12 muestra el soporte del recipiente con el tapón integral;
La Figura 13 muestra el soporte con el tapón cerrado;
La Figura 14 muestra un tapón o tapa alternativo;
La Figura 15 muestra un tapón o tapa con asidero;
La Figura 16 muestra un tapón o tapa con una abertura removible;
La Figura 17 muestra un soporte y un casete de recipiente;
La Figura 18 muestra un cargador de almacenamiento;
La Figura 19 muestra un cargador de almacenamiento alternativo;
La Figura 20 muestra un cargador apilado;
La Figura 21 muestra un cargador de almacenamiento Dewar;
La Figura 22 muestra un sistema de almacenamiento en tanque.
Descripción detallada de la invención
La invención se describirá ahora con referencia a la Leyenda y a las Figuras en el contexto de la fecundación humana in vitro y la manipulación de material biológico, siendo éste un embrión humano fecundado, pero el alcance de la invención se extiende ampliamente a una amplia gama de técnicas de micromanipulación de material biológico donde el material biológico en cuestión puede manipularse y manejarse convenientemente usando el aparato de la invención y someterse a una serie de etapas y procedimientos de procesamiento sin ser movido físicamente de los límites y la seguridad proporcionada por el aparato de la invención.
En su aspecto más amplio, la invención proporciona un recipiente de retención conveniente para recibir y retener con seguridad un embrión humano u otra muestra de material biológico. El recipiente 1 está formado como un recipiente unitario de cuerpo hueco que tiene un depósito 2 interno. El recipiente está dimensionado preferentemente a pequeña escala, con el depósito ocupando la mayor parte del recipiente. El tamaño pequeño preferido del recipiente es particularmente ventajoso al permitir la miniaturización y minimización de las soluciones de tratamiento necesarias para el procesamiento y vitrificación del material biológico. El volumen preferido para las soluciones de tratamiento está comprendido entre 0,1 ul-100 ul, más preferentemente 0,5 ul-10 ul. El recipiente tiene una parte superior abierta 5, que da acceso directo al depósito 2 con la parte superior abierta facilitando el acceso para introducir el embrión u otro material biológico, así como para facilitar el acceso para introducir y lavar las soluciones de tratamiento que se están usando.
El recipiente tiene preferentemente forma ovalada e incluye una parte de canal 3 formada en la región 6 de fondo del mismo. La región de canal incluye preferentemente partes elevadas dobles de la región 6 de fondo del recipiente que se extienden longitudinalmente e incluyen una restricción 4 formada en el centro del mismo. De esta forma, el canal formado integralmente proporciona una trayectoria de flujo preliminar para las soluciones de tratamiento introducidas, que pueden introducirse en el depósito y lavarse a lo largo del canal desde un extremo 8 hasta el otro extremo 8. A medida que se introduce más solución de tratamiento en el depósito, la trayectoria del flujo se desplaza por el canal hacia la mayor parte del depósito. La disposición del canal crea dos subdepósitos 7 en cada extremo del recipiente, que se comunican con el canal y están formados integralmente con el mismo. El canal tiene una restricción 4 en o cerca de la mitad o centro del mismo, que está dimensionada para resistir el paso de un embrión humano o resistir el paso de cualquier material biológico destinado a ser usado. La restricción está dimensionada lo más preferentemente para resistir, pero no prohibir totalmente el paso de un embrión humano, pero dimensionada para facilitar al embrión humano a permanecer dentro de uno de los subdepósitos, donde la acción de la tensión superficial y la dinámica de
fluidos facilita al embrión a permanecer en uno u otro de los subdepósitos, en lugar de desplazarse de un subdepósito a otro a medida que los líquidos de tratamiento se lavan en el depósito y atraviesan el canal.
A medida que el fluido es arrastrado por el canal lejos del subdepósito que contiene el embrión, las dimensiones y la sección transversal del canal restringen el movimiento del fluido en una región concreta a modo de "zona muerta". Esta región se encuentra en la base del recipiente, en las proximidades de la transición gradual de un subdepósito más ancho a un canal más estrecho. Esta configuración permite retener el embrión cautivo en un extremo y minimiza la solución de tratamiento necesaria para lavar el embrión.
El depósito es preferentemente simétrico, cuando la posición de retirada de fluido está más alejada de la línea central del canal que la región de flujo restringido descrita anteriormente (es decir, realmente en el subdepósito), la tensión superficial que retiene el fluido en el canal supera la tensión superficial que une el fluido a la posición de retirada a medida que se aleja. El fluido acaba por "romperse", dejando un volumen residual en el canal, que contiene el embrión. El volumen residual es lo suficientemente pequeño como para permitir una vitrificación rápida del embrión.
La geometría del recipiente de retención contribuye a las características de flujo del movimiento del fluido y contribuye al control y a la manipulación del embrión. Por ejemplo, la retirada de fluido demasiado cerca del canal, conllevará el riesgo de drenar el canal totalmente y perder el embrión. Por el contrario, si el fluido se retira demasiado lejos del canal, puede quedar demasiado líquido, lo que puede comprometer la vitrificación rápida. Por otra parte, la velocidad de retirada del líquido es importante para garantizar la existencia de una "zona muerta".
Es preferible que el suelo de los subdepósitos esté inclinado hacia el canal para que la gravedad ayude a situar el embrión en la "zona muerta". Es preferible que la pendiente no continúe en el canal, sino que es preferible que tenga una base más plana para evitar que el embrión entre en el canal propiamente dicho.
En referencia a las Figuras 5 a 8, en una realización particularmente preferida, la "zona muerta" puede proporcionarse mediante la disposición de uno o más rebajes 14 formados en la restricción intermedia 4, en donde los rebajes 14 comprenden una o más indentaciones menores, dimensionadas para capturar el material biológico o embrión dentro de una pequeña bolsa dentro de la restricción intermedia 4. De esta forma, los rebajes 14 proporcionan una serie de ventajas, incluyendo la disposición de una ubicación fija y específica para que el usuario final coloque el material biológico insertado en el aparato de la invención. El rebaje 14 proporciona una ubicación específica y ayuda a garantizar que el material biológico acabe siendo colocado en una ubicación altamente específica durante la operación de intercambio de fluidos. El rebaje 14 proporciona además una barrera para evitar que el embrión o el material biológico sean aspirados. La disposición de dos rebajes permite un posicionamiento asimétrico donde un primer rebaje se posiciona al principio de la restricción y un segundo rebaje se posiciona en el centro de la restricción.
De forma adicional, la disposición de un rebaje 14 permite una mayor retirada de soluciones de irrigación anteriores y, en particular, el rebaje 14 permite un volumen muy controlado de solución sobrante alrededor del material biológico o embrión capturado y, por lo tanto, permite la distribución fiable de una cantidad mínima de solución de vitrificación, conociendo al mismo tiempo la posición precisa del embrión o material biológico dentro del aparato.
El diámetro de la punta de extracción puede contribuir a la formación de puentes de fluido entre los lados del subdepósito y ayudar a la retirada de fluido y a los patrones de flujo.
De esta forma, el recipiente de la invención proporciona un manejo y manipulación altamente controlados de embriones humanos y similares, donde el embrión humano puede colocarse cuidadosamente en el recipiente en uno u otro de los subdepósitos 7 o directamente en el rebaje. Una vez que el embrión se ha posicionado cuidadosamente en el subdepósito o en el rebaje, los fluidos de tratamiento pueden entonces introducirse cuidadosamente en el subdepósito vacío que no está ocupado por el material biológico y con el ligero lavado del fluido desde un subdepósito desocupado o vacío a través del canal hasta el subdepósito ocupado, los fluidos de tratamiento pueden ser retirados y los fluidos de tratamiento subsiguientes son entonces introducidos en el subdepósito desocupado y ligeramente lavados a través del subdepósito ocupado. De esta forma, una pluralidad de operaciones de lavado pueden ser llevadas a cabo con una perturbación mínima del embrión que es mantenido cautivo en el subdepósito o rebaje ocupado que usa el subdepósito vacío para añadir o extraer fluidos.
En una realización particularmente preferida, los fluidos de tratamiento pueden graduarse de tal manera que una operación continua de lavado puede llevarse a cabo usando una gradación de fluidos de tratamiento para minimizar el traumatismo y el choque tóxico al embrión cautivo en un primer subdepósito. De esta manera, el embrión sólo se somete a un acto de lavado físico, minimizando así cualquier perturbación del embrión. La configuración del canal y las restricciones están adaptadas para favorecer el lavado de fluidos a través del mismo, al tiempo que se minimizan las turbulencias innecesarias que podrían dañar físicamente al embrión cautivo en el primer subdepósito.
Los fluidos de tratamiento contienen preferentemente crioprotectores no permeables y crioprotectores permeables de aumento gradual seleccionados de etilenglicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, disacáridos, trehalosa y sacarosa que están específicamente adaptados para mejorar o favorecer el hundimiento del embrión o material biológico en el fondo del recipiente. Esto mejora el drenaje máximo del recipiente y la retención de una cantidad mínima
de solución de irrigación antes de la vitrificación o congelación, mejorando así la etapa de vitrificación o congelación. De forma adicional, al garantizar que la muestra biológica o el embrión se hundan rápidamente hasta el fondo del recipiente, se reducen al mínimo las posibilidades de que el material biológico o el embrión escapen inadvertidamente del recipiente.
Preferentemente, el recipiente está constituido por un material con un alto grado de difusividad térmica para garantizar una velocidad de enfriamiento rápida. De forma adicional, el material que forma el recipiente es de manera preferente biológicamente inerte para minimizar cualquier posible contaminación del material biológico. Cuando se hayan eliminado todos los líquidos de tratamiento, el recipiente se adapta para una vitrificación mediante la colocación en nitrógeno líquido o similares, de forma que el embrión cautivo sea vitrificado rápidamente por la conductividad térmica y difusividad elevadas de los materiales del recipiente. De esta manera, el posicionamiento del embrión en el subdepósito en el fondo del recipiente, permite colocar el recipiente en nitrógeno líquido, de modo que el nitrógeno líquido tenga la máxima transmisión térmica directamente al embrión, al tiempo que se pone en cuarentena al embrión de cualquier contacto directo con el nitrógeno líquido u otro medio de vitrificación per se. Una vez realizado el proceso de vitrificación, el recipiente y el embrión cautivo (ahora vitrificado), pueden ser retirados del nitrógeno líquido y del recipiente almacenado en un estado vitrificado a la espera de la descongelación y el uso del embrión cautivo, o material biológico alternativo.
Una ventaja adicional del recipiente de la invención, particularmente el recipiente que incluye la disposición opcional de rebajes y el fluido de vitrificación mínimo usado en el proceso de enfriamiento implica la descongelación, donde la descongelación del material biológico congelado dentro del recipiente de la invención puede llevarse a cabo rápidamente con una perturbación mínima, debido a la cantidad mínima de solución que rodea el material biológico, tal como se consigue mediante la disposición del rebaje o de los rebajes pequeños. El recipiente sellado de la invención puede colocarse directamente en una solución caliente para lograr una descongelación rápida y controlada, manteniendo al mismo tiempo la máxima viabilidad de la muestra biológica.
El recipiente puede estar provisto de un soporte 15 dedicado como se muestra en las Figuras 9 a 13.
Con el fin de maximizar la versatilidad del recipiente y del aparato de la invención, el recipiente y/o el soporte están provistos preferentemente de un tapón o tapa 9, en las Figuras 14 a 16 se muestran variaciones del tapón o tapa. La tapa puede estar formada como un elemento separado o articulado directamente y está adaptada para un ajuste sin holgura a la región 5 superior abierta del recipiente 1 y está preferentemente adaptada para cooperar con la formación del canal de manera que se ajuste a presión y cierre el depósito y proporcione un espacio abierto mínimo dentro del recipiente cerrado. La disposición de una tapa facilita el manejo y la manipulación del recipiente, especialmente cuando se coloca en nitrógeno líquido y posteriormente se vitrifica y almacena para su uso futuro. La tapa también protege al embrión vitrificado de la contaminación y los daños mientras se encuentra en estado vitrificado.
Preferentemente, la tapa está formada de manera integral en el soporte del recipiente, como se muestra en las Figuras 12 y 13, mediante una bisagra integrada 13 formada entre el cuerpo del recipiente 1 o soporte 15 y la tapa 9. De esta forma, el recipiente se forma como un elemento de una sola pieza, minimizando así la necesidad de localizar y proporcionar un sello separado para el recipiente y proporciona un medio listo para sellar y cerrar el recipiente inmediatamente a mano.
El sellado puede ser un sello mecánico, como se ha descrito anteriormente, o un termosellado químico, como se muestra en las Figuras 10 y 11.
El aparato de la invención también incluye una región física del mismo para la disposición de un código de barras u otros indicadores de identificación mediante el cual la plataforma de indicadores 10 permite la identificación rápida y segura del embrión vitrificado u otro elemento de material biológico. El recipiente proporciona así la máxima seguridad e identificación para un embrión humano determinado, sobre todo porque el material biológico en cuestión se somete efectivamente a una sola etapa de manipulación durante todo el proceso posterior a la recolección, hasta la vitrificación y descongelación. De esta forma, el embrión tiene poca o ninguna posibilidad de ser etiquetado o identificado erróneamente durante las múltiples etapas y procesos necesarios para la preparación y vitrificación, ya que el embrión nunca abandona los confines del recipiente una vez que comienza el tratamiento.
En otro aspecto, la invención proporciona un aparato de criopreservación donde, haciendo referencia a las Figuras 17 a 21, se detalla la adaptación del recipiente 1 de la invención, que puede estar provisto de un casete 12, adaptado para contener una pluralidad de recipientes sellados. El casete está diseñado preferentemente para aceptar recipientes abiertos y para ser usado durante todo el proceso de vitrificación, desde el principio hasta el final. Pueden colocarse hasta 4 recipientes en el casete antes del proceso, una vez irrigado el material biológico con la solución de vitrificación, la tapa puede cerrarse/termosellarse y sumergirse en nitrógeno líquido. En otro aspecto, el casete está diseñado para recibir recipientes sellados una vez que los embriones han sido procesados y vitrificados y posteriormente sellados en los recipientes cerrados como se ha descrito anteriormente. Una pluralidad de recipientes en el casete se colocan posteriormente en un contenedor que luego se almacena en una instalación de almacenamiento Dewar como se detalla en la Figura 21 o almacenamiento alternativo. El casete incluye preferentemente una parte adaptada para recibir un código de barras u otros indicadores 10.
Los casetes están adaptados para su colocación en un cargador 16 como se muestra en las Figuras 18 a 20 con el sistema de almacenamiento actual que se muestra en la Figura 21.
En la Figura 22 se muestra un almacenamiento alternativo, siendo un concepto de almacenamiento en tanque.
El concepto de almacenamiento en tanque presenta ventajas sobre los sistemas actuales por:
• Mayor capacidad de almacenamiento de muestras
• Mayor facilidad de recuperación gracias a las amplias áreas de identificación situadas tanto en el casete como en el recipiente
• Separación para permitir que tanto los casetes como los recipientes se sitúen en una posición fija
El aparato y, en particular, el componente de recipiente de la invención se presta a la automatización donde los recipientes pueden ser manipulados automáticamente por aparatos automatizados adecuados de tal manera que el conjunto de recipientes proporcionado en un ejemplo automatizado de la invención, puede, una vez que los embriones han sido cuidadosamente colocados en el recipiente, entonces permitir la automatización completa de las preparaciones de vitrificación/congelación y las etapas de vitrificación/congelación y la subsiguiente vitrificación/congelación y almacenamiento de una pluralidad de embriones para ser completamente automatizados sin el requisito de que el embrión sea movido, o el requisito de supervisión o manipulación individual durante cualquiera de las etapas subsiguientes.
En otro aspecto, la invención proporciona un aparato semiautomatizado que incluye la disposición de uno o una pluralidad de los recipientes descritos anteriormente, en donde el aparato incluye un medio para irrigar el material biológico cautivo con soluciones de tratamiento de precongelación o vitrificación y fluídica para preparar el material biológico cautivo para una vitrificación.
El recipiente de la invención también encuentra varios otros usos incluyendo:
• irrigación de dicho material biológico con medios de cultivo (cultivo);
• irrigación de dicho material biológico con soluciones de vitrificación;
• vitrificación de dicho recipiente y del material biológico cautivo;
• almacenamiento;
• descongelación de dicho recipiente;
• irrigación de dicho material biológico con solución de descongelación.
Se espera que la automatización total proporcione mejoras sustanciales en la viabilidad de los embriones renderizados, maximizando así la viabilidad de los embriones una vez descongelados y, en consecuencia, maximizando las posibilidades de éxito y de embarazo para las receptoras de los embriones proporcionados mediante el aparato y los métodos de la invención.
Además del aparato, la invención también proporciona una serie de métodos para la manipulación de materiales biológicos como se ha descrito.
En otro aspecto, la invención proporciona un método de criopreservación de materiales biológicos que comprende las etapas de introducción de un material biológico seleccionado en la región de depósito de un recipiente como se ha descrito anteriormente para su captura en la región de canal del mismo;
• irrigación y drenaje de dicho material biológico con una serie de soluciones de vitrificación introducidas y retiradas del otro subdepósito (en el otro extremo del canal desde donde se introduce el embrión);
• drenaje final de dichas soluciones de irrigación de dicho recipiente;
• vitrificación de dicho recipiente y del material biológico cautivo;
En la realización más particularmente preferida, donde el aparato incluye la disposición opcional de uno o una pluralidad de rebajes colocados dentro de la restricción intermedia, un protocolo típico consistiría en mover el embrión del material biológico de una serie de medios de vitrificación a la solución final y más activa. La composición de los medios y el tiempo de permanencia en cada solución pueden ser los siguientes:
A continuación se enumeran ejemplos de variaciones en el protocolo de criopreservación de material biológico usando el aparato descrito.
Ejemplo de protocolo 1
Protocolo de criopreservación de material biológico que comprende:
1. La introducción de dicho material biológico en la región de depósito de recipiente con criobase.
2. La criobase se drena desde la posición de aspiración/distribución.
3. La solución de vitrificación 1 se distribuye llenando todo el canal.
4. A continuación, se deja que el material biológico se equilibre en la solución de vitrificación 1.
5. La solución de vitrificación 1 se drena desde la posición de aspiración/distribución, dejando una cantidad mínima de solución de vitrificación 1.
6. La solución de vitrificación 2 se distribuye llenando todo el canal.
7. El material biológico se equilibra durante un tiempo muy corto.
8. La solución de vitrificación 2 se drena desde la posición de aspiración/distribución dejando una cantidad mínima de solución de vitrificación 2.
9. A continuación, el recipiente y el material biológico se vitrifican en nitrógeno líquido.
Ejemplo de protocolo 2
Se presenta un protocolo alternativo sin la retirada de la solución de vitrificación 2 de la siguiente manera:
1. El material biológico se coloca en el recipiente directamente en el rebaje con criobase.
2. La criobase se drena desde la posición de aspiración/distribución.
3. La solución de vitrificación 1 se distribuye por todo el canal y se llena el mismo.
4. Se deja que el material biológico se equilibre en la solución de vitrificación 1, el recipiente está dimensionado de forma que el material biológico se reduce en el rebaje.
5. La solución de vitrificación 1 se drena desde la posición de aspiración/distribución, dejando una cantidad mínima de solución de vitrificación 1 en el rebaje.
6. Un pequeño volumen de solución de vitrificación 2 (entre 0,5 ul y 2,5 ul) se distribuye en el canal que abarca tanto el rebaje como el material biológico.
7. El material biológico se equilibra durante un tiempo muy corto.
8. A continuación, el recipiente y el material biológico se vitrifican en nitrógeno líquido.
Ejemplo de protocolo 3
De forma adicional, un protocolo que implica la adición de crioprotector no permeable a la solución de criobase/vitrificación 1, se proporciona de la siguiente manera:
1. El material biológico se coloca en el recipiente directamente en el rebaje con criobase.
2. La criobase se drena desde la posición de aspiración/distribución.
3. La solución de vitrificación 1 se distribuye por todo el canal y se llena el mismo.
4. Se deja que el material biológico se equilibre en la solución de vitrificación 1, el recipiente está dimensionado de forma que el material biológico se reduce en el rebaje.
5. La solución de vitrificación 1 se drena desde la posición de aspiración/distribución, dejando una cantidad mínima de solución de vitrificación 1 en el rebaje.
6. La solución de vitrificación 2 se distribuye en el canal, cubriendo todo el canal.
7. El material biológico se equilibra durante un tiempo muy corto.
8. La solución de vitrificación 2 se drena desde la posición de aspiración/distribución, dejando una cantidad mínima de solución de vitrificación 2 en el rebaje.
9. A continuación, el recipiente y el material biológico se vitrifican en nitrógeno líquido.
Ejemplo de protocolo 4
De forma adicional, un protocolo que implica que se añade gradualmente una solución de vitrificación única, se proporciona de la siguiente manera:
1. El material biológico se coloca en el recipiente directamente en el rebaje con criobase.
2. La criobase se drena desde la posición de aspiración/distribución.
3. La solución de vitrificación única se introduce gradualmente en los subdepósitos y llenando todo el canal. 4. Se deja que el material biológico se equilibre en la solución de vitrificación, asegurando que el material biológico se hunda hasta el fondo y permanezca en el rebaje o en la restricción intermedia.
5. La solución de vitrificación se drena de la posición de aspiración/distribución, dejando una cantidad mínima de solución de vitrificación.
6. A continuación, el recipiente y el material biológico se vitrifican en nitrógeno líquido.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento de previtrificación de un material biológico, comprendiendo dicho método las etapas de:
• introducción de dicho material biológico en la región de depósito del aparato como se ha descrito anteriormente para su captura en la región de canal de dicho recipiente;
• irrigación y drenaje de dicho material biológico con soluciones de cultivo o de previtrificación y fluídica.
En otro aspecto, la invención proporciona un método de descongelación de un material biológico vitrificado, comprendiendo dicho método las etapas de:
• retirada del material biológico vitrificado en un aparato como se ha descrito anteriormente de la solución de enfriamiento;
• descongelación del recipiente de dicho aparato y dicho material biológico por aplicación de calor en una solución calentada, aplicando calor a la superficie del recipiente o aplicando calor al área circundante de dicho recipiente;
• irrigación y drenaje de dicho material biológico cautivo con una serie de soluciones de descongelación introducidas y retiradas de la región de depósito de dicho recipiente;
• drenaje de dichas soluciones de irrigación;
• recuperación del material biológico descongelado de dicho recipiente.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un método de almacenamiento de un material biológico de criopreservación que comprende las etapas de:
• introducción de dicho material biológico en la región de depósito de un aparato como se ha descrito anteriormente para su captura en la región de canal de dicho recipiente;
• irrigación y drenaje de dicho material biológico con una serie de soluciones de vitrificación introducidas en el primero de dichos subdepósitos y retiradas del segundo de dichos subdepósitos;
• drenaje final de dichas soluciones de irrigación de dicho recipiente;
• vitrificación de dicho recipiente y del material biológico cautivo;
• almacenamiento de dicho recipiente y del material biológico cautivo en una instalación de almacenamiento hasta que el material biológico sea desvitrificado.
Los métodos de la invención se prestan a un alto grado de automatización donde los métodos pueden ser llevados a cabo en aparatos y dispositivos automatizados de tal manera que una pluralidad de embriones u otro material biológico puedan ser procesados simultáneamente. Las características particulares de la invención permiten introducir manualmente un elevado número de embriones u otras muestras de material biológico en los recipientes de la invención.
Una vez que las muestras individuales de material biológico han sido introducidas en un recipiente dedicado y los recipientes instalados en el aparato automatizado como se ha descrito anteriormente, todo el proceso de preparación para la vitrificación puede ser totalmente automatizado y supervisado de tal manera que un gran número de muestras biológicas pueden ser procesadas y vitrificadas de manera competente en una operación de una sola etapa sin fisuras.
Los expertos en la materia apreciarán que pueden realizarse numerosas variaciones y/o modificaciones a la invención tal como se muestra en las realizaciones específicas sin apartarse del alcance de la invención tal como se describe a grandes rasgos. Las presentes realizaciones deben, por lo tanto, considerarse, en todos los aspectos, como ilustrativas y no limitantes.
Claims (18)
1. Un aparato para micromanipulación, vitrificación y almacenamiento de material biológico, incluyendo el aparato:
un recipiente (1) que tiene un depósito (2), una parte superior abierta (5) y un canal (3) formado en un fondo (6) del depósito (2), incluyendo el canal (3) una restricción intermedia (4) dimensionada para resistir a un paso de dicho material biológico pero permitir el paso de soluciones líquidas de tratamiento, y un subdepósito (7) en cada extremo de la restricción,
en donde el recipiente (1) está formado por un material con una conductividad térmica y una difusividad elevadas en las regiones de subdepósito y de canal para permitir una vitrificación del material biológico en el recipiente (1).
2. Un aparato según la reivindicación 1, en donde dicha restricción intermedia (4) puede incluir un estrechamiento físico del paso, un orificio que bloquea parcialmente el canal (3) o uno o más rebajes (14) o una combinación de cualquiera de lo anterior.
3. Un aparato según la reivindicación 1 o 2, en donde un fondo de cada uno de los subdepósitos (7) está inclinado hacia el canal (3).
4. Un aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho canal (3) incluye una o más indentaciones, dimensionadas para capturar el material biológico.
5. Un aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el espesor del material de recipiente está comprendido entre 1 mm y 0,05 mm.
6. Un aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho recipiente optimiza una transferencia de calor en la región de dichos subdepósitos (7) y canal (3).
7. Un aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que incluye un tapón o tapa (9) adaptado para sellar la parte superior abierta (5) de dicho recipiente (1) y que incluye además una parte adaptada para recibir un código de barras u otros indicadores (10).
8. Un aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es un dispositivo de criopreservación automatizable que incluye un casete adaptado para contener uno o una pluralidad de dichos recipientes (1) y que incluye medios para irrigar dicho material biológico con soluciones de cultivo y vitrificación y/u otras soluciones y medios de tratamiento para vitrificar dicho material biológico.
9. Un aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es un dispositivo semiautomatizable que incluye un casete adaptado para contener uno o una pluralidad de dichos recipientes (1) y que incluye medios para irrigar dicho material biológico con soluciones de previtrificación o vitrificación y fluídica para preparar dicho material para una vitrificación.
10. Un método de criopreservación de material biológico, comprendiendo el método las etapas de:
• introducción de dicho material biológico en uno primero de los subdepósitos (7) de un aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para una captura en la región de canal de dicho recipiente;
• irrigación de dicho material biológico con una serie de soluciones de vitrificación introducidas en el primero de dichos subdepósitos (7) y retiradas del segundo de dichos subdepósitos (7);
• drenaje final de dichas soluciones de irrigación de dicho recipiente (1); y
• vitrificación de dicho material biológico cautivo en dicho recipiente (1).
11. Un método según la reivindicación 10, que comprende además la etapa de:
• almacenamiento de dicho recipiente (1) y del material biológico cautivo en una instalación de almacenamiento hasta que el material biológico sea desvitrificado.
12. Un método de criopreservación de material biológico, comprendiendo el método las etapas de:
• introducción de un material biológico seleccionado en uno de los subdepósitos (7) de un recipiente (1) de un aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para una captura en la región de canal del mismo; • irrigación de dicho material biológico con una serie de soluciones de vitrificación introducidas y retiradas del otro subdepósito (7);
• drenaje final de dichas soluciones de vitrificación de dicho recipiente (1); y
• vitrificación de dicho material biológico cautivo en dicho recipiente (1).
13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde dichas soluciones de vitrificación incluyen crioprotectores no permeables seleccionados de soluciones de trehalosa, sacarosa y de otros disacáridos.
14. Un método de criopreservación de material biológico, comprendiendo el método las etapas de:
• introducción de dicho material biológico en la región de depósito de un aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para una captura en la región de canal de dicho recipiente (1);
• irrigación de dicho material biológico con una solución de vitrificación única introducida gradualmente en el primero de dichos subdepósitos (7) y retirada del segundo de dichos subdepósitos (7); y
• vitrificación de dicho material biológico cautivo en dicho recipiente (1).
15. Un método según la reivindicación 14, en donde dicha solución de vitrificación incluye crioprotectores no permeables y permeables seleccionados de soluciones de etilenglicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, trehalosa, sacarosa y de otros disacáridos.
16. Un método según la reivindicación 14 o 15, en donde dicha solución de vitrificación se introduce gradualmente a una velocidad para mejorar el hundimiento de dicho material biológico hasta el fondo de dicha región de subdepósito.
17. Un método para el tratamiento de previtrificación de un material biológico, comprendiendo el método las etapas de:
• introducción de dicho material biológico en la región de depósito de un aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para una captura en la región de canal de dicho recipiente (1); e
• irrigación de dicho material biológico con soluciones de cultivo o de previtrificación y fluídica.
18. Un método de descongelación de material biológico vitrificado, comprendiendo el método las etapas de:
• retirada del material biológico vitrificado en un aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 de una solución de enfriamiento;
• descongelación del recipiente (1) de dicho aparato y dicho material biológico por aplicación de calor en una solución calentada, aplicando calor a la superficie de dicho recipiente (1) o al aire ambiente de dicho recipiente (1);
• irrigación de dicho material biológico con una serie de soluciones de descongelación introducidas y retiradas de la región de depósito de dicho recipiente (1);
• drenaje de dichas soluciones de irrigación de dicho recipiente (1); y
• recuperación del material biológico descongelado de dicho recipiente (1).
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