ES2459893A2

ES2459893A2 - Procedimiento y dispositivo de vitrificación de material biológico mediante microcapilares de polímeros termoplásticos cerrados utilizando un recalentamiento ultra-rápido

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Publication number: ES2459893A2
Application number: ES201201020A
Authority: ES
Inventors: Ramón Jesús RISCO DELGADO
Original assignee: Universidad de Sevilla
Current assignee: Universidad de Sevilla
Priority date: 2012-10-10
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2014-05-12
Anticipated expiration: 2032-10-10
Also published as: ES2459893B2; ES2459893R2; WO2014057148A2; WO2014057148A3

Abstract

El dispositivo de vitrificación de material biológico mediante microcapilares de polímeros termoplásticos cerrados utilizando un recalentamiento ultra-rápido, objeto de la presente invención, consiste en un contenedor compuesto por varias partes, fabricado en polímero termoplástico, optimizado como sistema cerrado para los procedimientos de criopreservación, para obtener, junto con el procedimiento reivindicado, velocidades de recalentamiento ultra-altas.

Description

Procedimiento y dispositivo de vitrificación de material biológico mediante microcapilares de polímeros termoplásticos cerrados utilizando un recalentamiento ultra-rápido.

OBJETO DE LA INVENCiÓN

El dispositivo objeto de la presente invención consiste en un contenedor compuesto por varias partes, fabricado en polímero termoplástico, optimizado como sistema cerrado para los procedimientos de criopreservación, para obtener, junto con el procedimiento reivindicado, velocidades de recalentamiento ultra-altas.

El procedimiento y el dispositivo se encuadran en el sector de la técnica dedicado a la biotecnología y a la biomedicina. Es de aplicación en todos los procesos relacionados con la manipulación y tratamiento de material biológico a nivel celular. Y más en concreto, en los procesos relacionados con la conservación de este material biológico en condiciones que permitan su uso posterior tras un tiempo indefinido de almacenamiento a temperaturas criogénicas. En particular, este procedimiento y dispositivo son de especial utilidad para la criopreservación de ovocitos humanos en condiciones de máxima seguridad biológica (dispositivo cerrado) y máxima tasa de supervivencia de los ovocitos, similar a la de los dispositivos abiertos actuales, tras el recalentamiento (velocidad de recalentamiento ultra-alta).

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las principales técnicas empleadas para conseguir la conservación celular se basan en la utilización de bajas temperaturas para ralentizar y detener las reacciones bioquímicas responsables del envejecimiento y deterioro del material biológico. Dentro de estas técnicas, las más ampliamente utilizadas son las llamadas de enfriamiento lento y las de vitrificación, con un gran número de variantes en ambos casos.

El enfriamiento lento es hasta ahora el procedimiento más usado [15,17]. Se basa en el control de la velocidad de enfriamiento con el fin de crear un delicado equilibrio entre los distintos factores que causan daño celular, entre los que se encuentran la formación de hielo, fracturas y una excesiva deshidratación. Es sin embargo la otra técnica, la vitrificación, descrita a continuación y desarrollada en detalle a lo largo del resto de este apartado, la tecnología que ahora nos ocupa.

La vitrificación es un proceso mediante el cual un líquido se solidifica en una fase no cristalina (fase vítrea) [6]. Para conseguirla, en el caso de la vitrificación celular, se obliga a: i) un aumento en la viscosidad (mediante la sustitución del agua por agentes vitrificantes) y, sobre todo, ii) usando un rápido descenso de la temperatura de la célula (generalmente sumergiendo la muestra en nitrógeno liquido). Este enfriamiento rápido de la muestra impide que las moléculas de agua tengan tiempo de ordenarse para crear la estructura cristalina del hielo, formando por lo tanto un sólido amorfo. La mayoría de las sustancias que se mantienen en estado líquido en un amplio rango de temperaturas vitrifican al ser enfriadas, y el resto de sustancias también vitrifican si el enfriamiento es suficientemente rápido. La vitrificación elimina completamente la aparición de cristales de hielo, los cuales suponen el mayor obstáculo para la criopreservación de células vivas [34]. Esta técnica ha mejorado en gran medida los resultados obtenidos por el enfriamiento lento, aunque todavía es insuficiente para la criopreservación en contenedores cerrados de determinados tipos celulares, como es el caso de los ovocitos [7], o de las células madre [8], en donde la sensibilidad celular exige una mejora de los métodos utilizados en la actualidad.

i) Para aumentar la viscosidad se han probado distintas combinaciones de agentes vitrificantes, también llamados crioprotectores. No es objeto de la presente invención la optimización o propuesta de alguna forma de agente vitrificante en concreto. En general, en el caso de ovocitos, los mejores se resultados hasta la fecha parecen obtenerse mediante el uso de dimetilsulfóxido (DMSO) y el etilenglicol (EG) [24].

ii) Par conseguir una alta velocidad de enfriamiento de la célula, esta se suele sumergir en nitrógeno líquido. Del dispositivo y procedimiento utilizado para enfriar la muestra depende críticamente la velocidad de enfriamiento, habiéndose probado el uso de mezclas criogénicas distintas al nitrógeno liquido [16], la vitrificación sobre superficies sólidas[2, 5], etc... Hay dos grandes grupos de dispositivos y procedimientos: a) los que se basan en contenedores cerrados y b) los que se basan en contenedores abiertos.

a) Los que se basan en contenedores cerrados no permiten obtener, hasta la

fecha, altas tasas de supervivencia en el caso particular de ovocitos. Sin

embargo, sí son empleados con frecuencia para otros tipos celulares, como

embriones, donde aquí los resultados sí son satisfactorios. La filosofía tras

estos contenedores es la utilización de altas concentraciones de agentes

vitrificantes y la utilización de un enfriamiento rápido de la muestra [3, 35].

b) Los que se basan en contenedores abiertos sí consiguen una alta tasa de supervivencia de ovocitos. Son los que de hecho se están utilizando en la actualidad para la conservación de óvulos [2, 4, 5, 10, 12, 13, 14, 20, 32, 33, 35]. En estos contenedores el ovocito se coloca sobre una superficie generalmente plana y siempre abierta. El ovocito queda unido a esta plataforma gracias al uso de un medio muy viscoso, usualmente rico en azucares que, a modo de melaza, lo mantiene físicamente pegado a esta. Tras ello, y para conseguir la máxima velocidad de enfriamiento, se retira todo el medio sobrante que pueda recubrir el ovocito, quedando el ovocito al descubierto; por ello estas técnicas se llaman técnicas de mínimo volumen, pues la filosofía tras ella es la de minimizar el volumen de la muestra a vitrificar. Como es mínimo el volumen de muestra que está en contacto con el nitrógeno líquido, ello hace que la velocidad de enfriamiento sea muy alta. Sin embargo estos contenedores abiertos, que sí permiten la vitrificación de ovocitos, generan un doble problema, por su naturaleza de abiertos: a) Por un lado, al estar abierto, la muestra corre riesgo de pérdida en su manipulación (en la entrada en el nitrógeno liquido, durante el tiempo de almacenamiento en la cántara de almacenaje o durante el recalentamiento posterior cuando se procede a su introducción dentro de de una gota de medio de recalentamiento; b) Pero, sobre todo, el mayor problema asociado al uso de contenedores abiertos es el riesgo potencial de contaminación [9, 19] (al entrar la muestra en contacto con el nitrógeno líquido), ya sea contaminación vírica, bacteriana, o de cualquier otro tipo.

Sin embargo, recientemente ha habido un cambio de paradigma en la vitrificación de ovocitos: no es cuestión de mínimo volumen ni de maximizar la velocidad de enfriamiento; se trata, realmente, de maximizar la velocidad de recalentamiento. Se ha probado cómo velocidades de enfriamiento muy bajas (95 °C/min) pueden dar tasas de recuperación de ovocitos muy altas SIEMPRE Y CUANDO la velocidad de RECALENTAMIENTO sea suficientemente alta [18,28,29,30,31]

La presente invención no está basada en una técnica de mínimo volumen o en una alta velocidad de enfriamiento, sino en una velocidad de recalentamiento ultra-alta. La combinación del dispositivo y procedimiento reinvindicados consigue velocidades de recalentamiento por encima de 200.000 °C/min (Fig. 9). Obviamente, la ventaja del uso de un contenedor cerrado con la misma tasa de recuperación de ovocitos que la de los contenedores abiertos es doble: a) por un lado evita la eventual pérdida del ovocitos, pero, b) sobre todo, elimina la posibilidad de contaminación (vírica, bacteriana o de cualquier otro tipo) de la muestra, al no estar nunca en contacto con el nitrógeno liquido.

Por tanto, y en resumen, la patente de invención objeto de la presente memoria se refiere a un nuevo procedimiento y dispositivo de criopreservación de material biológico en general y de ovocitos en particular, con las siguientes dos particularidades:

1) El almacenamiento del ovocito se produce en un contenedor cerrado que consigue la vitrificación de las muestras con unas tasas de recuperación iguales o superiores a las de cualquier dispositivo abierto. El procedimiento se basa en el uso de un microcapilar de polímeros termoplásticos de reducidas dimensiones y cerrado por ambos extremos, llamado SafeSpeed.

2) la principal característica de este procedimiento y dispositivo es que, siendo cerrado, garantiza una velocidad de recalentamiento por encima de 200.000 °C/min (Fig. 9). Es la velocidad de recalentamiento, y no la velocidad de enfriamiento o el volumen mínimo de la muestra, como ocurre en los dispositivos o procedimientos citados anteriormente, lo que determina el éxito del presente método. Esta es la diferencia fundamental con el resto de sistemas cerrados para la conservación de ovocitos.

la patente de invención objeto de la presente memoria es una continuación del desarrollo de la técnica del propio autor [11, 21, 22, 23, 25, 26, 27].

DOCUMENTOS RELEVANTES

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DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

1.: Esquema representativo del dispositivo. La figura se aprecian sus tres partes principales: A) El microcapilar; B) La pajuela de conexión al sistema de aspiración; C) El protector del microcapilar.

2.: Representación detallada del dispositivo. En la figura se aprecian sus distintas partes: el microcapilar, la pajuela principal, la pajuela exterior, el protector, la hendidura, la zona de escritura y el postizo. El microcapilar tiene un acabado cónico en sus extremos. El protector también tiene acabado cónico, en este caso para impedir el desplazamiento del mismo cuando son alcanzadas sus posiciones extremas.

3.: Procedimiento de carga del agente vitrificante dentro del ovocito. El protocolo está basado en dos pasos: El primero consiste en el paso del ovocito desde el medio de cultivo hasta la primera solución de vitrificación (baja concentración en crioprotectores). El segundo consiste

en el paso desde la primera solución de vitrificación hasta la segunda solución de vitrificación (alta concentración de crioprotectores).

4. Procedimiento de introducción y protección del ovocito dentro del dispositivo.

Fig 4A) El dispositivo se conecta al sistema de aspiración. Este sistema de aspiración actuará haciendo un vacío (presión negativa) obligando a la entrada del ovocito dentro del microcapilar. Para esta conexión se hace necesario un adaptador flexible (cilindro hueco de goma abierto por sus bases) que deje estancas la unión del dispositivo con el adaptador y del adaptador con el sistema de aspiración.

Fig 48) Una vez conectado el sistema de aspiración, el microcapilar es dejado al descubierto. Para ello se desliza el proctector (descrito en la Fig. 2) hacia arriba, exponiendo el microcapilar.

Fig 4C) Con el microcapilar descubierto, se posiciona la punta del microcapilar sobre el ovocito, introduciendo dicha punta a través de la gota de la segunda solución de vitrificación en el que está contenido. Para ello se aspira suavente el ovocito. Para facilitar dicha entrada el capilar tiene su extremo distal más ancho que el resto (forma de cono, tal como se explica en la figura 2). Finalmente el ovocito se posiciona, siguiendo la aspiración, entre las marcas 2 y 3 del microcapilar.

Fig 4D) Finalmente se procede al sellado de ambos extremos del dispositivo. Conviene, aunque no es imprescindible, seguir el siguiente orden. Primero conviene (aunque no es imprescindible) sellar el microcapilar. Después se desconecta el sistema de aspiración. Finalmente se sella la parte trasera del dispositivo (postizo). El ovocito queda así totalmente aislado del medio exterior, encerrado en un contenedor estanco y libre de las eventuales contaminaciones a las que pueden estar sujetos en caso de usar contenedores abiertos.

5. Fig 5A) El microcapilar es introducido en un recipiente con nitrógeno líquido. Una vez dentro, el ovocito estará vitrificado.

Fig 58) Para evitar un eventual daño del microcapilar en su manipulación posterior, dado la fragilidad de este, se procede seguidamente a correr el protector sobre el capilar, quedando este finalmente el dispositivo (con el ovocito en su interior) listo para su almacenamiento indefinido.

6.: Para llevar el ovocito vitrificado al lugar de almacenamiento definitivo, el dispositivo es movido, siempre dentro del recipiente con nitrógeno líquido, hasta una posición donde previamente se ha colocado un cáliz de transporte (visotubo), también relleno con nitrógeno líquido. El dispositivo es introducido en el visotubo. Seguidamente el visotubo, lleno de nitrégeno liquido y conteniendo el dispositivo, se trasnporta hasta el lugar donde se encuentre la cántara definitiva de almacenamiento, introduciendo el visotubo, con el dispositivo en su intererior, dentro de dicha cántara.

7.: Procedimiento de recalentamiento. Para el recalentamiento de la muestra, el primer paso es la preparación de la taza. Esta es un recipiente de material térmicamente aislante (poliestireno expandido, por ejemplo) con dos depósitos lSeparados no más de 2 cm. Uno de ellos estará relleno de nitrógeno líquido y será destinado a la recepción del visotubo conteniendo el dispositvo con el óvulo en su interior. El otro contiene un vaso con agua (o cualquier fluido con alta capacidad calorífica) a 37°C. Las profundidad de este segundo recipiente debe de ser tal que si el dispositivo está sujeto por su parte superior, este no pueda tocar el fondo. Ello evitará un eventual contacto del microcapilar con el fondo del recipiente que contiene el agua a 37 oC en el proceso de recalentamiento.

8.: Fig 8A) Para el recalentamiento de la muestra se ha de seguir un proceso inverso al de la vitrificación. Tras la preparación de la taza, se pasa a la extracción de la cántara de almacenamiento del visotubo conteniendo el dispositivo que encierra el óvulo seleccionado. Seguidamente el conjunto es introducido en el depósito de la taza que contiene nitrógeno líquido. Seguidamente el dispositivo es sacado del visotubo sin que el microcapilar pierda nunca el contacto con el nitrógeno líquido. Finalmente se corre el protector del microcapilar hacia

arriba, dejando dicho microcapilar en contacto directo con el nitrógeno líquido. Ello permitirá que la futura velocidad de recalentamiento aumente sensiblemente (en comparación con el caso en el que el protector no hubiera sido desplazado para dejar el microcapilar libre).

Fig 88) La parte superior sellada del dispositivo (postizo) es cortada, dejando abierto el dispositivo por la parte superior. El realizar el corte del postizo en este paso del procedimiento hace ganar tiempo en las etapas posteriores, lo que evitará una sobreexposición del ovocito a la solución segunda de vitrificación cuando pase al baño de agua a 37 oC en el recalentamiento.

Fig 8C) El dispositivo es trasladado, en posición vertical y sujeto por su parte superior, desde el baño de nitrógeno líquido hasta al baño de agua, entrando el microcapilar rápidamente en contacto con el baño caliente. La proximidad de las tazas, menos de 2 cm y el paso rápido, y el tener el microcapilar descubierto, hace que la velocidad de recalentamiento sea altísima: en torno a 250.000 oC/mino

9.: Representación de la velocidad de recalentamiento (eje vertical, en °C/min) en función del tiempo de vuelo, o sea, el tiempo transcurrido desde que sale el microcapilar del nitrógeno líquido hasta que entra en el baño a 37°C (eje horizontal, en segundos). Se ve cómo claramente hay una dependencia exponencial de la velocidad de recalentamiento con la inversa del tiempo de vuelo entre las tazas. Por ello es crítico seguir este procedimiento: sólo una velocidad de recalentamiento ultraalta garantiza un tasa cercana al 100% en la recuperación de los ovocitos tras la criopreservación (descrito en el texto principal).

10.: Fig. 10A) Una vez recalentado el ovocito dentro del microcapilar se procede a la conexión del sistema de aspiración al dispositivo. Este sistema de aspiración servirá en este caso para expulsar el ovocito y depositarlo sobre la solución de recalentamiento. Para establecer dicha conexión se utiliza de nuevo el sistema de conector de goma.

Fig. 108) Tras la conexión del sistema de aspiración/expulsión al dispositivo se procede a cortar la punta del microcapilar, dejando el extremo libre y permitiendo la posterior salida del ovocito.

11. El ovocito es empujado hacia fuera usando el sistema de aspiración/expulsión y es depositado sobre una gota de la primera solución de recalentamiento. Posteriormente el ovocito se pasa a la segunda solución de recalentamiento y de allí al medio de cultivo. El ovocito está listo para ser introducido en la incubadora de CO2 donde permanecerá dos horas antes de su uso.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

En primer lugar explicaremos los tres componentes fundamentales que constituyen el dispositivo. En segundo lugar describiremos en detalle cada una de las sub-partes en las que se divide el dispositivo, que permiten, de una forma práctica, su implementación y uso en el laboratorio.

Componentes fundamentales:

Los componentes fundamentales son tres (Fig. 1): Un microcapilar de polímero termoplástico con un diámetro interior del orden o inferior a los 200 micrómetros y una pared del orden o inferior a los 15 micrómetros. Una pajuela termoplástica unida al microcapilar con un diámetro interior superior a los 230 micrómetros y un diámetro exterior tal que permita un fácil manejo con las manos y su conexión a un sistema de aspiración/expulsión. Esta pajuela va unida al microcapilar mediante un pegamento capaz de soportar temperaturas criogénicas (epoxy, por ejemplo).

Un protector del microcapilar que desliza sobre la pajuela y que se usa para cubrir (o descubrir) el microcapilar.

El papel de cada uno de estos tres componentes es imprescindible y bien diferenciado: -El microcapilar es el sitio donde se albergará el ovocito. Sus dimensiones específicas y el material del que está constituido (preferentemente policarbonato, aunque puede ser cualquier otro material termo plástico con una conductividad térmica similar o

5 superior) permitirán, junto con el procedimiento reivindicado, conseguir las velocidades de recalentamiento ultra-altas, conducentes a una alta recuperación de los ovocitos tras su almacenamiento criogénico. Por otra parte, al estar fabricado con material termofusible, permite un sellado fácil mediante la aplicación de un pulso de calor en su extremo.

lO-La pajuela unida al microcapilar tiene por misión capacitar el manejo manual del microcapilar y permitir la conexión del microcapilar a un sistema de aspiración/expulsión. Al ser, tanto el microcapilar como la pajuela, materiales termoplásticos, esto posibilita el cierre del dispositivo por ambos extremos, quedando el ovocito aislado del exterior y no entrando nunca en contacto con el nitrógeno líquido.

15 -El protector del microcapilar permite el almacenamiento de la muestra sin que el microcapilar corra riesgo de rotura o deformación, ya que dadas las reducidas dimensiones de éste (diámetro ligeramente superior al del ovocito que contendrá), dicho riesgo sería muy alto sin la existencia de este protector.

20 Detalle de cada una de las partes del dispositivo (Fig. 2): El dispositivo está formado por una serie de elementos (sub-partes) que permiten el desarrollo y la implementación de las ideas contenidas en los tres componentes anteriores de manera práctica en el laboratorio.

25 El dispositivo reivindicado consta de las siguientes partes (Fig. 2): Un microcapilar de plástico (del orden o inferior a los 200 micrómetros de diámetro interior y de unos 15 micrómetros de pared) que albergará en su interior la(s) muestra(s) biológica(s) en general, y los ovocitos en particular. La longitud de este microcapilar esta acotada inferiormente por el número de

30 ovocitos que se deseen almacenar en él (generalmente no más de cuatro) y sobretodo porque debe de dejar un espacio de al menos 1 cm entre la posición final de los ovocitos dentro del microcapilar y la punta del microcapilar, lugar que se ha de sellar (cerrar): como unas de las opciones preferible de sellado es un pulso de calor (termosellado) y este pulso de calor no debe de afectar al

35 ovocito, de aquí este centímetro de seguridad. En principio no existe cota superior para la longitud del capilar. Dado que por su material y diámetro es extremadamente flexible, admite no sólo la posibilidad de una geometría recta, sino que puede ser enrollado, por ejemplo en espiral, pudiendo compactarse y así contener un número mucho mayor de muestras (distintas de ovocitos, que como decimos, no suelen almacenarse más de cuatro en el mismo dispositivo); por ello este dispositivo no está basado en técnicas de mínimo volumen, como otros dispositivos. En el caso de la aplicación para ovocitos, y reivindicado de forma especial en esta patente, la geometría preferible es la recta y el tamaño preferible del microcapilar es de aproximadamente 5 cm. La geometría recta permitirá una colocación fácil de un protector (descrito a continuación) sobre este. 5 cm es un tamaño que permite posicionar los ovocitos suficientemente lejos de la punta termosellable del microcapilar y, por otro lado, no es tan largo como para dificultar su manejo. El microcapilar tiene tres marcas sobre su superficie: 1) zona de sellado, 2) y 3) marcas entre las cuales se colocarán los ovocitos. La punta del microcapilar tiene forma de cono para para facilitar la entrada de los ovocitos y evitar un eventual daño de estos por roce con dicha punta. Una pajuela principal conectada al microcapilar, que aporta rigidez y permite que la muestra pueda fluir dentro del microcapilar mediante la succión por la parte trasera (parte de esta no unida al microcapilar). Esta pajuela principal tiene un diámetro interior ligeramente superior al del microcapilar, de manera que este puede insertarse dentro de aquella con facilidad, y una pared (y por tanto un diámetro exterior) suficientemente grande como para aportarle rigidez al dispositivo, vertebrándolo hasta su extremo superior. El material plástico del que está fabricado debe también ser tal que le confiera esta rigidez. Este material no necesita ser termofungible, sino rígido y de pared gruesa, dado que su objetivo es vertebrar el dispositivo. Esta pajuela principal va unida en su parte trasera a lo que hemos llamado postizo (descrito a continuación), que sí es delgado y termofungible, lo que permite el cierre trasero del dispositivo. El diámetro exterior, a su vez, debe de ser lo suficientemente pequeño como para maximizar el número de dispositivos que pueden ser almacenados en una cántara de almacenamiento de nitrógeno líquido. Un diámetro exterior típico de la pajuela principal está en torno a 1 mm. Una pajuela exterior, que recubre parte de la pajuela principal. Su misión es de nuevo aportarle la rigidez definitiva al dispositivo, facilitar su manipulación, y sobretodo permitir el deslizamiento sobre esta pajuela exterior del protector del microcapilar, descrito a continuación. Un tramo de pajuela plana por su cara exterior, que también recubre parte de la

pajuela principal (al ser plana, el protector no puede deslizar sobre ella) que

permite anotar los datos identificativos de cada paciente (nombre, código, etc ... ). Un tramo final (postizo) trasero de pajuela de pared delgada y de material termoplástico de pared delgada. Parte de este postizo recubre el último tramo de la pajuela principal (para así poder hacer unión entre ambos elementos), pero la otra parte no recubre la pajuela principal, sino que al ser de material termoplástico y de pared delgada, este postizo puede ser termosellado con facilidad, garantizando que todo el dispositivo queda cerrado y estanco. El postizo es también la parte del dispositivo que permite su conexión a un sistema de aspiración/expulsión estándar. Lleva una cuarta marca (4» en la zona donde ha de realizarse el termosellado de esta parte trasera del dispositivo. Un protector del microcapilar, de plástico, que desliza sobre la pajuela exterior, con dos posiciones de uso. Una primera posición, que permite dejar al descubierto el microcapilar para el momento de la aspiración/expulsión de la muestra biológica y para la introducción en nitrógeno líquido. Una segunda posición, en la que recubre el microcapilar y así impide que éste colisione con otros objetos y pudiera dañarse el ovocito, y que garantiza el almacenamiento sin estos riesgos una vez que la muestra se encuentra vitrificada. Uno de los extremos de este protector (el más cercano al microcapilar) acaba en forma de tronco de cono, lo le permite entrar en la hendidura (descrita a continuación), y evitar el deslizamiento del capilar mediante un click de bloqueo. El otro extremo (delantero) también acaba en forma de cono, de manera que esta geometría le sirve de tope cuando en su posición de descubierto alcanza la pajuela exterior. Una hendidura a lo largo del dispositivo, que consigue un click de bloqueo del protector del microcapilar y evita la salida de dicho protector del dispositivo. Esta hendidura se implementa de forma práctica mediante una separación cercana a un milímetro, entre las dos partes de la pajuela exterior. El click se consigue mediante un acabado en forma de tronco de cono del extremo del protector más cercano al microcapilar, como indicamos anteriormente.

La longitud total del dispositivo completo será de unos 80-140 mm, lo que se adapta a los estándares de almacenamiento, ajustándose a las prácticas al uso en reproducción asistida, permitiendo una cómoda manipulación y minimización del espacio que ocupan en los stocks.

PROCEDIMIENTO DE VITRIFICACION y RECALENTAMIENTO

• Para la vitrificación

Preparar la(s) célula(s) en el medio de enfriamiento de vitrificación elegido (Fig. 3) (agentes crioprotectores). Como dijimos anteriormente, los agentes vitrificantes no son objeto de esta invención. Los más recomendables, a fecha de hoy, están basados en etilenglicol (EG) y dimetilsulfóxido (DMSO).

Fijar el extremo ancho (parte trasera) de SafeSpeed a un dispositivo de aspiración (por ejemplo, una jeringa Hamilton, una pipeta automática, un stripper, una pipeta de boca o cualquier otro sistema de aspiración y manipulación de ovocitos), bien directamente o bien con un conector-acoplador adecuado (Fig. 4A).

Cuando las muestras están listas para cargar en el SafeSpeed, deslizar la funda plástica protectora a lo largo de la pajuela hasta exponer el microcapilar (Fig. 48).

Con ayuda del microscopio o la lupa binocular, cargar suavemente las muestras en el SafeSpeed y ubicarlas entre la 28 y 38 marcas del microcapilar por aspiración (Fig. 4C), controlando la absorción de las muestras y medio. Estas 28 y 38 marcas del microcapilar han sido calculadas al efecto de manera que la velocidad de recalentamiento en dicha área esa la óptima. Este detalle es crítico. Confirmar que la/s muestra/s estáln situadals entre la frontera de la marca de 28 y 38. Precaución: El fallo en la confirmación de la ubicación de la muestra, podría dañar la muestra.

Sellar térmicamente el microcapilar por debajo de la marca 1. A continuación, la parte trasera del dispositivo se sella también con el mismo termosellador en la marca 48, de manera que la muestra se encuentra aislada completamente dentro del dispositivo (Fig.4D).

Sujetando el dispositivo por la parte trasera, sumergir verticalmente el microcapilar en el depósito de nitrógeno líquido (LN2), o cualquier otro medio que permita una enfriamiento rápido (Fig. 5A).

Deslizar la funda protectora de plástico cuidadosamente a lo largo de la pajuela hacia abajo para proteger el microcapilar (Fig. 58). Asegurarse de que durante este movimiento el microcapilar está siempre completamente cubierto por el nitrógeno líquido.

Para el transporte, guardar la el dispositivo Safespeed en un visotubo (cáliz, canister o cryocane: tubo de ensayo metálico o de plástico, que podrá adaptarse a los estándares utilizados en las clínicas) y llevar al tanque de nitrógeno líquido donde será finalmente almacenado (Fig. 6).

• Para el recalentamiento

Es un paso crítico del procedimiento, donde se obtiene una velocidad de recalentamiento ultra-alta. Para ello se hace necesario la disposición de un baño con nitrógeno líquido y un baño con agua a 37 oC a una distancia entre ellos de orden de 1cm y unas dimensiones recomendables de las que se hablará seguidamente. Esta configuración se consigue fácilmente con el uso del dispositivo al que hemos llamado taza, y que facilita la puesta en práctica y consecución de este paso del procedimiento. Describimos la taza a continuación:

La taza (Fig. 7), conveniente para el recalentamiento, se compone de un material aislante térmico (poliestireno expandido, por ejemplo), con dos orificios: Uno estará dedicado al nitrógeno líquido; el otro, a agua a 37 oC. Estos orificios han de ser lo suficientemente grandes, en diámetro y profundidad, como para minimizar la probabilidad de colisión del microcapilar con sus paredes o fondo cuando el dispositivo es introducido en ellos. El recipiente para nitrógeno líquido albergará un soporte que permite la colocación del visotubo que contiene las pajuelas. El recipiente para agua a 37 oC consiste sólo en un orificio que permite meter y sacar un vaso con agua a 37 oC.

El uso de esta taza y el dispositivo reivindicado, junto con el procedimiento, garantiza una velocidad de recalentamiento ultra-alta. Para estudiar, usando nuestro dispositivo y una solución de vitrificación típica (15% EG, 15% DMSO, 1 M sacarosa), la dependencia de la velocidad de recalentamiento respecto al tiempo transcurrido entre la salida del dispositivo del orificio de la taza que contiene nitrógeno líquido y la entrada en el orificio de la taza que contiene el vaso con agua a 37 oC, se procedió de la siguiente forma. Se emplazó un termopar tipo T (Omega) con la unión entre el cobre y el constantan justo en la posción que ocuparía el ovocito dentro de SafeSpeed (entre las marcas 2 y 3). Este termopar se conectó a un amplificador operacional (OP741), y su salida a un conversor analógico-digital (Measurement Computing 1208LS) unido a un PC mediante el puerto USB. Con un software de adquisición (Labview 6.1) se midió la temperatura entre las marcas en todo instante, obteniendo de esta forma la velocidad de recalentamiento de la muestra (eje vertical de la Fig. 9). Para medir el tiempo transcurrido entre la salida del nitrógeno líquido y la entrada en el agua a 37 oC se uso una cámara ultrarrápida (Casio EX -F1 a 1200 frames/segundo; eje horizontal de la Fig. 9).

Los pasos a seguir en el recalentamiento son los siguientes:

Preparar una placa de Petri medio de calentamiento preferido de recalentamiento (agente eliminador de crioprotector; no es objeto la presente invención el uso de uno concreto; generalmente se trata de poner concentraciones decreciente del mismo medio que se utilizó para la vitrificación).

Meter un vaso con agua a 37 oC en la taza. Llenar el otro depósito de la taza con nitrógeno líquido (Fig. 8A).

Sacar el visotubo, con el dispositivo que contiene los ovocitos, del tanque de almacenamiento y colocarlo en la taza, sumergiéndolo en la zona que contiene nitrógeno líquido.

Deslizar cuidadosamente la funda protectora de plástico a lo largo y hacía arriba de la pajuela asegurando que en todo momento el microcapilar está completamente sumergido en el nitrógeno líquido, quedando así el microcapilar al descubierto. Cortar el postizo, dejando abierto este extremo (parte trasera) del dispositivo (Fig. 8B).

Aproximar el dispositivo, siempre con el microcapilar dentro del nitrógeno líquido, al borde más cercano al vaso con agua a 37° C. Extremadamente rápido (menos de 1 segundo), sumergir verticalmente cara abajo el microcapilar sellado de SafeSpeed, en el recipiente de agua, agitando a mano durante dos segundos para una mejor transferencia de calor (Fig. 8C).

Inmediatamente después, sacar SafeSpeed del agua y secar suavemente su exterior (con papel absorbente estéril, por ejemplo). Conectar el dispositivo de aspiración/expulsión (convenientemente acoplado) al extremo ancho de SafeSpeed (Fig. 10A). Cortar el microcapilar justo por encima de la 1a marca (Fig. 10B).

Descargar cuidadosamente y expulsar la muestra dentro del medio de recalentamiento usado (Fig. 11).

MODO DE REALIZACiÓN DE LA INVENCiÓN

Ejemplo 1. Procedimiento de conservación celular de ovocitos

Este ejemplo muestra la aplicación práctica del método para la criopreservación de ovo citos de ratona.

Se emplearon ratonas vírgenes C57BL/6 x CBA/Ca (4-8 semanas) mantenidas bajo condiciones controladas (12 horas luz: 12 horas oscuridad) y alimentadas ad libitum. Fueron superovuladas por inyección intraperitoneal con 0.1 mi de PMSG (5 UI). Tras 48-56 horas, se les administró 0.1 mi de HCG (5 UI). Se sacrificaron 14 horas después por dislocación cervical y se extrajeron los oviductos.

Los ovocitos fueron liberados del cúmulo por acción de la hialuronidasa (SIGMA Ref. H4272-30 mg). Tras esto, los ovocitos se lavaron en medio M2 para eliminar los restos de hialuronidasa. Los ovocitos en metafase 11 previamente denudados se transfirieron entonces a una solución de equilibrio, y después a la solución de vitrificación. La solución de equilibrio consistió en 7.5% EG, 7.5% DMSO (cinco minutos). La solución de vitrificación consistió en 15% EG, 15% DMSO y 1M sacarosa (un minuto). Todas las soluciones usadas llevan como disolvente PBS (Buffer salino de fosfato).

Los ovocitos se introdujeron en el microcapilar, que fue termosellado, con la muestra biológica en interior. Seguidamente se selló la parte trasera. El microcapilar se introdujo en el recipiente de nitrógeno líquido de forma manual.

Una vez la muestra con el capilar alcanzó temperaturas criogénicas, el microcapilar fue puesto en posición de almacenamiento recubierto por el capuchón, y fue transportado en un canister de plástico hasta un tanque de almacenamiento con nitrógeno líquido, donde permaneció 24 horas.

En el proceso de recalentamiento, el canister con el dispositivo conteniendo el ovocito fue extraído del tanque de almacenamiento. El canister se emplazó en la taza, en el lugar que contiene nitrógeno líquido. Se sacó el dispositivo del canister, siempre con el microcapilar sumergido en nitrógeno líquido. El postizo del microcapilar fue cortado (parte trasera del dispositivo). El protector del microcapilar fue desplazado hacia arriba, dejando este al descubierto. El microcapilar se pasó, rápidamente (menos de 0.5 segundos), del nitrógeno líquido al vaso anejo con agua a 37 oC, de forma manual (siempre en posición de uso, o sea, sin protector).

Se secó la punta del capilar con papel secante estéril. Se conectó la parte trasera (postizo) a al sistema de aspiración/expulsión. Se cortó la punta del microcapilar y se procedió a su descarga del dispositivo sobre una gota de medio de recalentamiento. Tras tres lavados, se puso en cultivo en una incubadora con CO2 durante cuatro horas. El primer lavado se hizo con una solución 1 M de sacarosa (1 min). El segundo lavado con una solución 0.5 M de sacarosa (3 minutos) y el tercer lavado con una solución

0.25 M de sacarosa (3 minutos).

Después de cuatro horas, se estudió la viabilidad de los ovocitos, mediante una gama amplia de valoraciones morfologicas y la técnicas de tinción para ver compromiso de la membrana (trypan blue).

Siguiendo dicho procedimiento se criopreservaron y recalentaron 620 ovocitos de ratona, de los cuales sobrevivieron 595, obteniendose una supervivencia de ovo citos de un 96%, mucho mayor a otras técnicas de vitrificación que utilizan dispositivos cerrados.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Procedimiento de criopreservación de material biológico mediante vitrificación, caracterizado por el uso de microcapilares poliméricos termoplásticos como contenedores del material biológico, introducidos en fluidos criogénicos para conseguir la vitrificación de la muestra biológica.
2.

Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1, caracterizado por la utilización de microcapilares poliméricos termoplásticos fabricados con policarbonato, o con cualquier otro material termosellable, con una conductividad térmica similar o superior.
3.

Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1, caracterizado por la utilización de microcapilares poliméricos termoplásticos termosellables, para evitar la contaminación cruzada de la muestra y que éste quede completamente aislada del exterior.
4.

Procedimiento de criopreservación celular según las reivindicaciones 1-3 en las cuales las células a criopreservar son ovo citos , para los que se necesita una alta velocidad de recalentamiento para asegurar su viabilidad posterior.
5.

Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra celular se introduce previamente bañada en agentes crioprotectores en el interior del microcapilar, a distintas concentraciones dependiendo del tipo celular a criopreservar.
6.

Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1, en el que el microcapilar polimérico termoplástico está ensamblado sobre un conjunto de pajuelas que le proporcionan rigidez y facilidad en el uso, no desmontables
7.

Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1 y 5, en el que una de las pajuelas actúa de protector del microcapilar en su posición de almacenamiento, móvil pero no desmontable.
8.

Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1 y 5, en el que una de las pajuelas es plana para facilitar la escritura e identificación de los datos del paciente.
9.

Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1, en el que el microcapilar es introducido en fluidos criogénicos con la parte inferior del microcapilar conteniendo la muestra biológica sin el protector del capilar exterior, para optimizar el proceso de enfriamiento.
10.

Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1, caracterizado por la utilización de un baño de recalentamiento para el proceso de recalentamiento, en el que el microcapilar polimérico termoplástico termosellado, es introducido con la parte inferior conteniendo la muestra biológica, sin el protector del capilar exterior, para optimizar el proceso de recalentamiento.
11.

Procedimiento de criopreservación celular según la reivindicación 1, caracterizado por la utilización de agua a 37 oC o de un fluido similar para el baño de recalentamiento.
12.

Procedimiento de criopreservación celular según las reivindicaciones 1, 3,5 Y 11 en la que, durante el recalentamiento, la distancia entre el baño de nitrógeno líquido y el baño con agua a 37 oC es del orden o menor a 1 cm.
13.

Procedimiento de criopreservacion celular según la reivindicación 12 en la que si el tiempo de vuelo entre la salida del baño de nitrógeno liquido y la entrada en el baño de agua a 37 oC es inferior a 0.5 segundos, la velocidad de recalentamiento alcanza fácilmente el valor de 200.000 °C/min, lo que garantiza la viabilidad celular en el caso de ovocitos.

FIGURA 1

PAJUELA PRINCIPAL

ZONA DE

MICROCAPILAR

ESCRITURA

HENDIDURA

I ,

/14 (;/7 (31211.

POSTIZO

PAJUELA

PROTECTOR

EXTERIOR

FIGURA 2

FIGURA 3

FIGURA4A

FIGURA4B

FIGURA4C

::n

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FIGURA4D

FIGURA5A

-

-

FIGURA 58

STOCK

FIGURA 6

.0 LN2

FIGURA 7

FIGURA8A

~~

-

~-----

FIGURA 88

FIGURA8e

TiI!mpo(s)

FIGURA 9

FIGURA 10A

/

FIGURA 10B

Su pervivencia

FIGURA 11