JP2017046711A - 改良された顕微操作ならびに保管装置および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、生体物質の顕微操作用の改良された装置を提供することにある。
【解決手段】生体物質の顕微操作用の装置であって、前記装置は、貯蔵槽（２）を有する容器（１）を備え、前記容器は、前記貯蔵槽の一部に形成されたチャネル（３）を有し、前記チャネルは、前記生体物質の通過を妨害するが液体処理液の通過を可能にするように寸法が決められている中間リストリクション（４）を含んでいる。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、内容が参照により本明細書に組み込まれている米国仮特許出願第６１／３４９，２９６号の優先権を主張する。

本発明は、生体物質の顕微操作用の装置および方法に関し、特に、ヒトおよびヒト以外の卵母細胞、胚、精子、幹細胞および胚盤胞を含む生体物質の凍結保存に用いられる装置および方法に関する。

本発明は、さまざまな生体物質を用いる広範囲の顕微操作状況および技法において開発されかつ用途があるが、体外受精（ＩＶＦ）処置等の間に適用されるように、ガラス化によるヒトの卵母細胞、胚、桑実胚、精子および幹細胞の凍結保存での使用に特に適用される。

ヒトおよび動物の胚の凍結保存に関与しかつ適用される技術は十分に確立され、適当な技能およびノウハウを適用することにより、現行の技術は、体外受精処置において信頼性の大幅な向上を達成しかつ成功を収めてきた。

本明細書の目的で、「凍結」および「ガラス化」という用語は、以下の定義を有するように解釈される。

「凍結」は、結晶化を含む場合がある液体状態から固体状態への冷却である。

「ガラス化」は、結晶化のない液体状態から固体状態への冷却である。

理解され適用される技法は、胚の採取および凍結保存を含み、卵母細胞の採取および抽出と、その体外受精と、こうした受精卵ならびに結果として得られる胚および／または後期胚盤胞の後続する凍結および保管を含む、複数のステップを伴う。必要な多数のステップおよび処理段階は、専門的な作業者を介する高水準のノウハウおよび技能に大きく依存する。そして、一旦凍結した胚または胚盤胞は、必要に応じて利用可能となり、解凍されて被移植者に移植することが可能であり、それにより、子宮にうまく着床することによって正常に胎児が発育し結果として妊娠をもたらすことができる。

より最近では、こうした凍結保存技法は、未受精卵および卵母細胞にうまく適用されている。卵母細胞の凍結保存は、未受精状態の提供者のメスから卵子または卵母細胞を採取し、それを凍結し、保管することを含む。こうした凍結卵子を、保管バンクから引き出し、解凍し、受精に利用できるようにし、要求があり次第提供者に移植することができる。

受精卵および胚ではなく卵母細胞に適用される凍結保存の技法には、いくつかの倫理的かつ医療的利点があり、それら技法に対して、関連する技法を改善するためにますます研究および実験がなされてきた。

特に「生きている」生体物質に適用される場合の凍結保存のプロセスは、特に現行の技法に従って必要な複数の処理ステップを考慮して、当該生体物質に対し高い率の外傷を伴う。物理的処理の結果としてこうむる外傷に加えて、生体物質はまた、凍結プロセス中、複数の処理化学溶液を通して移動中にこうむる浸透圧ショックおよび中毒性ショックに加えて氷晶が形成される可能性もある。

凍結した生体物質を調製する従来の方法は、生体物質自体から離れて氷晶の形成を意図的に開始する目的で、物質およびその周囲の溶液を保管温度まで緩慢冷却することを含む。従来の方法は、氷晶が連続的に形成されるため最適ではない。氷晶形成問題に対処するために、別の「ガラス化」法が開発されたが、ガラス化には、うまく行われるために相当な専門技術が必要である。ガラス化では、処理溶液を、いかなる結晶構造もないガラス状の非結晶固体に転換し、次いで極めて高速に冷却することを含む。極めて高速の冷却が、溶液がガラス状の非結晶状態を達成するのを可能にする。

従来の凍結方法またはガラス化方法のいずれかの適用には、凍結プロセス中の細胞損傷を最小限にするように生体物質に追加される、化学化合物および溶液の使用が必要である。化学化合物および溶液は、凍結保護物質として知られており、浸透性の溶液および非浸透性の溶液を含む。浸透性の凍結保護物質は、生体物質の氷晶化を防止する目的で生体物質の水分子に対する水素結合を形成して、生体物質の膜に容易に浸透する小分子である。
こうした浸透性の凍結保護物質の例としては、エチレングリコール（ＥＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびグリセロールが挙げられる。水において低濃度では、結果としての溶液の凍結温度より低いこうした浸透性の凍結保護物質は、氷結晶化を防止し最小限にするのに役立つことができる。異なる冷却速度で異なる可能性があるより高い濃度では、こうした浸透性の凍結保護物質は、典型的な氷晶の形成を抑制し、水が結晶化または膨張の前に凝固する、固体ガラス状状態またはガラス化状態の発生をもたらす可能性がある。こうした浸透性の凍結保護物質の毒性は、濃度が上昇するに従って増大し、当該生体物質に対して毒性である可能性があり、したがって、生体物質は、浸透性の凍結保護物質に対する露出が、非常に短い期間、最小限でなければならず、または代替的に、低温でなければならず、それにより、当該生体物質の代謝速度が低減する。

浸透性の凍結保護物質とは対照的に、非浸透性の凍結保護物質は細胞外にあり続ける。非浸透性の凍結保護物質のいくつかの例としては、二糖類、トレハロースおよびスクロースが挙げられる。二糖類の凍結保護物質は、生体物質内から自由水を引き出し、細胞内空間を脱水することによって作用する。結果としての脱水により、非浸透性の凍結保護物質は浸透性の凍結保護物質と組み合わせて使用することができ、それにより、浸透性の凍結保護物質の正味濃度を細胞内空間で増大させることができる。これらの技法は、浸透性の凍結保護物質が氷晶形成を防止するかまたは最小限にするのにさらに役立つ。

ガラス化プロセス中、浸透性の凍結保護物質を高濃度で追加することができ、一方で、生体物質の温度は、凍結を超える所定レベルで制御される。しかしながら、こうした高濃度の浸透性の凍結保護物質の毒性が実質的であり得るため、長期間、生体物質をこうした温度で保持することができない。代替的に、平衡のために時間の縮小を可能にすることができ、平衡の後、卵母細胞または胚を含む可能性がある生体物質が、凍結を行うために液体窒素内に直接投入される。極めて高速な冷却により生体物質に対する凍結保護物質の悪影響が最小限になり、また、ガラス化を促進することにより氷晶形成が最小限になる。

ガラス化プロセスは、生体物質を少なくとも３つのガラス化液に晒すことを含む。ガラス化液は、通常、マルチウェル培養皿において連続したウェルに追加され、そこで、皿および溶液は、当該生体物質の要件に従って確定された所定温度まで加温される。

典型的なプロトコルでは、生体物質は、第１のウェルの第１の溶液に物理的に移され、その後、生体物質または細胞を、細胞ピペット操作装置を用いて当該溶液内を物理的に移動させることによって、洗浄される。洗浄プロセスは、生体物質または細胞が凍結保存の用意ができているとみなされるまで、所定期間にわたって第２のウェル、第３のウェルおよび第４のウェルで繰り返される。その後、生体物質は、ピペットまたは他の処理装置を用いて、所定量のガラス化液とともに物理的に引き上げられる。そして、ガラス化する生体物質または細胞を含む液滴は、ガラス化装置の上にピペットで分注される。その後、ガラス化装置は、液滴および生体物質が付着した状態で物理的に移送され、液体窒素内に直接投入されるか、または液体窒素で事前に冷却されているガラス化ブロックの表面上に配置される。その後、生体物質および担持する流体がガラス化すると、ガラス化装置は、予備冷蔵されたストローまたは他の保管装置内に挿入され、ストローまたは他の保管装置は、液体窒素または液体窒素蒸気のいずれかで長期冷蔵のために後に移送されるように、ガラス化ブロックのスロット（slot）内に位置している。

凍結保存プロセス中に試料を操作するために、さまざまなガラス化装置が使用される。いくつかのガラス化装置は、ピペット方式の装置を提供し、そこでは、試料は中空チューブ内に吸引され、その後、中空チューブが溶液または液体窒素内に直接投入される。こうした装置は、Ｉｒｖｉｎｅ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって市場に出されＣｒｙｏｔｉｐ（登録商標）として販売されている。

他のガラス化装置は、軸の端部に付着したプラスチックまたは金属ワイヤからなる閉鎖ループまたは開放ループを有するループ／フック方式の装置を使用し、生体試料を拾い上げるために使用される。こうした装置は、特許文献１に定義されているようにｆｉｂｅｒｐｌｕｇまたはＣｒｙｏｌｏｏｐの商標名でＣｒｙｏｌｏｇｉｃによって販売されている。

特許文献２に開示されているような他の器具は「Ｃｒｙｏｔｏｐ」であり、それは、一片のプラスチックに取り付けられた可撓性ストリップである。そこでは、試料がストリップに配置され、液体窒素内に直接投入される。

現時点での従来技術では、複数の装置を用いて多くの胚処理ステップが必要であり、すべての処理ステップにより、胚を喪失する機会が増大する。喪失する胚の１％〜２％が、ガラス化ステップ中に処理することが一因となっていることが推定される。

国際公開第００／２１３６５号 国際公開第０２／０８５１１０号

上述したプロセスに関連する外傷、特に、卵子、細胞、胚および胚盤胞を含む極めて繊細な生体物質を繰り返し物理的に処理し操作することによって与えられる外傷は、生存率、したがって上述したプロセスおよび方法の成功に影響を与える。さらに、生きている胚の物理的動態により、胚の形状に対して迅速な成長および変形がもたらされ、それはさらに、こうした生体物質のあらゆる処理、特に自動化処理に対してさらに難題となる。あらゆる自動化には、こうした動態を管理するとともに、広範囲の流体粘度とともにさまざまな異なる胚のタイプ、高速流体移動を管理する必要がある。明らかに、成功の機会を最大限にし、処理されている物質に対して加えられる外傷を最小限にするために、生体物質に加えられる種々の洗浄溶液の数および程度を最小限にすることに加えて、こうした繊細な物質の物理的処理を絶対最小限にまで低減することが非常に望ましい。

培養は、移植のために最高品質の胚を選択するのに役立つように、受精後４日、５日または６日まで成長させる技法である。長期間の培養により、妊娠が成功する確率が増大する可能性がある。

本発明の１つの目的は、限定されないが生体物質の培養および凍結保存を含む、生体物質の顕微操作および保管用の改良された装置および方法を提供することである。

本発明の別の目的は、自動化を用いて洗浄プロトコルの回数を制御すること、および胚の処理を低減し、したがって完全な自動化を可能にすることである。

第１の態様では、本発明は、１つまたは複数の生体物質の顕微操作用の装置を提供し、前記装置は、貯蔵槽を有する容器を備え、前記容器が前記貯蔵槽の一部に形成されたチャネル（channel）を有し、前記チャネルが、前記生体物質の通過を妨害するが液体処理液の通過を可能にするように寸法が決められている中間リストリクション（restriction）を含む。リストリクションは、略垂直の通路または略水平のプラットフォームを含むことができる。中間リストリクションは、通路の物理的に狭くすること、チャネルを部分的に閉塞するオリフィス、または１つもしくは複数の窪み（divot）、または他の部分的閉塞手段を含むことができる。液体処理液は、培養培地、凍結保護培地、解凍培地、ガラス化培地、受精培地または緩衝液を含むことができる。

容器は、好ましくは開放頂部を備え、容器の底部にチャネルが形成されている。チャネルは、最も好ましくは、リストリクションの両端にサブ貯蔵槽（sub-reservoir）を備えている。容器は、好ましくは、熱伝導率および熱拡散率が高い材料から形成され、特に好ましくはサブ貯蔵槽およびチャネル領域において伝導率が高い。容器は、好ましくは、キャップまたは蓋を備え、キャップまたは蓋は、別個の蓋または一体型の蝶番で取り付けられた蓋のいずれかとして、開放頂部を封止するように適合されている。

本装置は、前記容器用のホルダを備えることができる。

容器またはホルダは、好ましくは、バーコードまたは他のしるしを受け取るように適合されている部分を含んでいる。

容器材料は、好ましくは滅菌することができる材料から選択され、１つまたは複数の生体物質に対していかなる汚染の脅威を与えることがないように生物学的に不活性である。
容器材料は、好ましくは熱拡散率が高く、最も好ましくは１ｍｍと０．０５ｍｍとの間の厚さである。

別の態様では、本発明は、上述したような１つまたは複数の容器を提供することを含む自動化凍結保存装置である装置を提供し、本装置は、捕捉されている生体物質をガラス化液および／または他の処理液で洗浄する手段と、捕捉されている生体物質をガラス化させる手段とをさらに備えている。

別の態様では、本発明は、上述したような１つまたは複数の容器を提供することを含む半自動化装置を提供し、本装置は、捕捉されている生体物質をガラス化前処理液またはガラス化処理液ならびにフルイディクスにより洗浄して、捕捉されている生体物質をガラス化のために調製する手段を備えている。

別の態様では、本発明は、生体物質の凍結保存の方法であって、
・生体物質を、上述した容器の一方の下位貯蔵槽領域内に導入するステップと、
・生体物質を、他方のサブ貯蔵槽（胚が導入されるチャネルの他方の端部にある）内に導入されかつそこから取り除かれる一連のガラス化液で洗浄し排液するステップと、
・容器から前記洗浄溶液を最終的に排出するステップと、
・容器および捕捉されている生体物質をガラス化させるステップと、
を含む方法を提供する。

別の態様では、本発明は、生体物質の凍結保存の方法であって、
・生体物質を、上述した容器の一方のサブ貯蔵槽領域内に導入するステップと、
・生体物質を、他方のサブ貯蔵槽（胚が導入されるチャネルの他方の端部にある）内に導入されかつそこから取り除かれる一連のガラス化液で洗浄し排液するステップと、
・最小限の最終的なガラス化液を分配するステップと、
・容器および捕捉されている生体物質をガラス化させるステップと、
を含む方法を提供する。

一連のガラス化液は、好ましくは、ガラス化または凍結の前に洗浄溶液の最大限の排出および最小限の洗浄溶液の保持を可能にするように、前記生体物質の前記サブ貯蔵槽領域の底部への沈下を促進する、エチレングリコール（ＥＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、二糖類、トレハロースおよびスクロースから選択された、徐々に増加する非浸透性の凍結保護物質および浸透性の凍結保護物質を含む。

別の態様では、本発明は、生体物質のガラス化前処理の方法であって、
・前記生体物質を、上述した装置の貯蔵槽領域内に、前記容器のチャネル領域に捕捉されるように導入するステップと、
・前記生体物質を、培養液またはガラス化前処理液ならびにフルイディクスにより洗浄し排液するステップと、
を含む方法を提供する。

別の態様では、本発明は、ガラス化した生体物質を解凍する方法であって、
・上述した装置においてガラス化した生体物質を冷却液から引き抜くステップと、
・容器および捕捉されている生体物質を、加熱液内で加熱することにより解凍するステップであって、熱を容器の表面または周囲空気に加えることも可能である、ステップと、
・前記捕捉されている生体物質を、前記容器の貯蔵槽領域に導入されかつそこから取り除かれる一連の解凍液により洗浄し排液するステップと、
・前記洗浄液を排出するステップと、
・前記容器から解凍された生体物質を回収するステップと、
を含む方法を提供する。

別の態様では、本発明は、凍結保存生体物質を保管する方法であって、
・前記生体物質を、上述した装置の貯蔵槽領域内に、前記容器のチャネル領域に捕捉されるように導入するステップと、
・前記生体物質を、他方のサブ貯蔵槽（胚が導入されるチャネルの他方の端部にある）に導入されかつそこから取り除かれる一連のガラス化液により洗浄し排液するステップと、
・前記容器から前記洗浄液を最終的に排出するステップと、
・前記容器および前記捕捉されている生体物質をガラス化させるステップと、
・生体物質がガラス状態から戻される（devitrified）まで、前記容器および前記捕捉されている生体物質を保管設備に保管するステップと、
を含む方法を提供する。

別の態様では、本発明は、解凍液を用いることにより、上述した方法を逆転させることを含む、凍結またはガラス化した生体試料を解凍する方法を提供する。

本明細書に含まれている文献、行為、材料、装置、物品等のいかなる説明も、単に、本発明に対する状況を提供する目的のためのものである。これらの物のいずれかまたはすべてが従来技術の基礎の一部を形成するか、または本発明に関連する分野において、本出願の各請求項の優先日の前に存在したために共通の一般知識であったと認めることとして、解釈されるべきではない。

本明細書を通して「備える（comprise）」という語または「備える（comprises）」または「備えている（comprising）」という変形は、述べられている要素、完全体もしくはステップ、または要素、完全体もしくはステップ群を包含すること意味するものであって、他のあらゆる要素、完全体もしくはステップ、または要素、完全体もしくはステップ群を排除することを意味するものではないことが理解されよう。

容器の斜視図である。 開放した容器の上面図である。 容器の側面図である。 容器の端面図である。 窪みを備えた容器の斜視図である。 窪みを備えた開放した容器の上面図である。 窪みを備えた容器の側面図である。 窪みを備えた容器の端面図である。 容器およびホルダを示す図である。 代替的なホルダおよびキャップを示す図である。 ホルダ内で容器に取り付けられたキャップを示す図である。 一体型キャップを備えた容器ホルダを示す図である。 キャップが閉鎖しているホルダを示す図である。 代替的なキャップまたは蓋を示す図である。 ハンドルを備えたキャップまたは蓋を示す図である。 剥離可能な開口部を備えたキャップまたは蓋を示す図である。 ホルダおよび容器カセットを示す図である。 保管ローダを示す図である。 代替的な保管ローダを示す図である。 積み重ねられたローダを示す図である。 デュワー（Dewar）保管ローダを示す図である。 タンク保管システムを示す図である。

ここで、ヒトの体外受精と受精したヒト胚である生体物質の処理に関連して、符号の説明および図を参照して本発明について説明するが、本発明の範囲は、広範囲の生体物質の顕微操作技法にまで広く広がり、そこでは、当該生体物質に対し、本発明の装置を用いて好都合に処理し管理することができ、かつ本発明の装置によって提供される範囲および保護から物理的に移動することなく、複数の処理ステップおよび手続きを行うことができる。

本発明は、その最も広い態様において、ヒト胚または生体物質の他の試料を受け取りかつ安全に保持する好都合な保持容器を提供する。容器１は、内部貯蔵槽２を有する一体型中空体容器として形成されている。容器は、好ましくは、貯蔵槽が容器の大部分を占有するように小型の寸法になっている。容器の好ましい小さいサイズは、生体物質の処理およびガラス化に必要な処理液の縮小および最小化を可能にすることによって特に有利である。
処理液に対して好ましい体積は、０．１μｌ〜１００μｌの間、より好ましくは０．５μｌ〜１０μｌである。容器は、好ましくは開放頂部５を有し、開放頂部による貯蔵槽２への直接アクセスを可能にし、胚または他の生体物質の導入のための容易なアクセスと、使用されている処理液の導入および流込みのための容易なアクセスとを可能にする。

容器は、好ましくは形状が楕円形であり、その底部領域６にチャネル（channel）部３が形成されている。チャネル領域は、好ましくは、容器の底部領域６の二重隆起部を含み、それらは、長手方向に延在し、その中心に向かってリストリクション（restriction）４が形成されている。このように、一体的に形成されたチャネルは、貯蔵槽に導入することができかつチャネルに沿って一方の端部８から他方の端部８まで流し込むことができる導入された処理液に対して、予備流路を提供する。貯蔵槽内にさらに処理液が導入されるに従い、流路は、チャネルにわたって貯蔵槽の大部分内に移動する。チャネルを設けることにより、容器の両端に２つのサブ貯蔵槽（sub-reservoir）７が生成され、それらは、チャネルと連通しかつチャネルと一体的に形成されている。チャネルは、その中間もしくは中心にもしくはその近くにリストリクション４を有し、それは、ヒト胚の通過を妨害するように、または使用されるように意図されているいかなる生体物質の通過も妨害するように寸法が決められている。リストリクションは、最も好ましくは、ヒト胚の通過を妨害するように、但し完全には通過を妨げないように寸法が決められているが、ヒト胚がサブ貯蔵槽の一方に残るのを促進するように寸法が決められており、そこでは、表面張力および流体力学の作用により、処理液が貯蔵槽内にチャネルを通って流し込まれる際に、胚が、一方のサブ貯蔵槽から他方のサブ貯蔵槽に移動するのではなく、サブ貯蔵槽の一方または他方に残るように促進される。

流体が、胚を収容しているサブ貯蔵槽からチャネル内に引き出される際、チャネルの寸法および断面が、「デッドポケット」のように特定の領域において流体移動を制限する。この領域は、容器の基部の、広いサブ貯蔵槽から狭いチャネルへ徐々に遷移する部分の付近にある。この形態により、捕捉されている胚を一端に保持することができ、胚を流し込むために必要な処理液が最小限になる。

貯蔵槽は、好ましくは対称であり、すなわち、流体引込み位置が、上述した制限された流れ領域よりチャネルの中心線から離れている（すなわち、実際にはサブ貯蔵槽にある）場合、チャネル内に流体を保持する表面張力は、引込み位置が遠いために、流体をその引込み位置に結合する表面張力に打ち勝つ。流体は最終的に「破断し」、チャネル内に、胚を収容する残留体積を残す。残留体積は、胚の迅速なガラス化に対して十分に小さい。

保持容器の形状は、流体移動の流れ特性に寄与し、かつ胚の制御および操作に役立つ。たとえば、流体の引込みがチャネルに近すぎる場合、チャネルを完全に空にし、胚を喪失する危険がある。逆に、流体の引込みがチャネルから遠すぎる場合、後に残る流体が多すぎる可能性があり、迅速なガラス化を危うくする可能性がある。さらに、流体引込みの速度は、「デッドポケット」があることを確実にするためには重要である。

サブ貯蔵槽の床は、好ましくはチャネルに向かって傾斜しており、それにより、重力が胚を「デッドポケット」内に配置するのに役立つことができる。傾斜は、好ましくはチャネル内には延びているべきではなく、最も好ましくは、胚がチャネル本体に入らないようにより平坦な基部を有している。

図５〜図８を参照すると、特に好ましい実施形態では、中間リストリクション４に形成された１つまたは複数の窪み１４を設けることによって、「デッドポケット」を提供することができ、その場合、窪み１４は、１つまたは複数のより小さい圧痕を備え、それらは、中間リストリクション４内の小さいポケット内に生体物質または胚を捕捉するように寸法が決められている。このように、窪み１４は、最終使用者が本発明の装置内に挿入された生体物質を位置決めするための固定かつ特定の位置を提供することを含む、多数の利点を提供する。窪み１４は、特定の位置を提供し、流体取替えの操作中に生体物質が最終的に非常に特定の位置に配置されるのを確実にするのに役立つ。窪み１４はさらに、胚または生体物質がさらに吸い込まれないように障壁を提供する。２つの窪みを設けることにより、非対称な位置決めが可能になり、そこでは、第１の窪みはリストリクションの開始に位置決めされ、第２の窪みはリストリクションの中間に位置決めされる。

さらに、窪み１４を設けることにより、先の洗浄液を最大限に除去することができ、特に、窪み１４により、捕捉された生体物質または胚を包囲している残りの溶液の体積を高度に制御することが可能であり、したがって、装置内の生体物質の胚の正確な位置を知りながら、最小限の量のガラス化液の確実な分配が可能になる。

引込み先端の直径は、サブ貯蔵槽の側面の間の流体の橋渡しに寄与することができ、流体除去および流れパターンに役立つことができる。

このように、本発明の容器は、ヒト胚等の高度に制御された処理および操作を可能にし、そこでは、ヒト胚を、容器内のサブ貯蔵槽７のうちの一方または他方にまたは窪み内に直接注意深く配置することができる。胚がサブ貯蔵槽または窪みに注意深く配置されると、処理流体を、生体物質で占有されていない空のサブ貯蔵槽に注意深く導入することができ、占有されていない、すなわち空のサブ貯蔵槽からチャネルを通して占有されているサブ貯蔵槽に流体を緩やかに流し込むことにより、処理液を引き抜くことができ、その後、後続する処理流体が、占有されていないサブ貯蔵槽内に導入され、占有されているサブ貯蔵槽に緩やかに流し込まれる。このように、流体を追加するかまたは引き抜くために空のサブ貯蔵槽を使用して、占有されているサブ貯蔵槽または窪みに捕捉されて保持されている胚のかく乱を最小限にして、複数の流込み操作を行うことができる。

特に好ましい実施形態では、第１のサブ貯蔵槽に捕捉されて保持されている胚に対する外傷および中毒性ショックを最小限にするように、１回の連続的な流込み操作を段階的な処理流体を用いて行うことができるように、処理流体を段階的に提供することができる。
このように、胚に対して１回のみの物理的流込みの行為が行われ、それにより、胚のあらゆるかく乱が大幅に最小限になる。チャネルおよびリストリクションの形態は、そこを通る流体の流込みを促進する一方で、第１のサブ貯蔵槽に捕捉されて保持されている胚に打撃を与えかつ物理的に損傷を与える可能性があるいかなる不要な乱れも最小限にするように適合されている。

処理流体は、好ましくは、胚または生体物質の容器の底部への沈下を増大させまたは促進するように特に適合されている、エチレングリコール（ＥＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、二糖類、トレハロースおよびスクロースから選択された、徐々に増大する非浸透性の凍結保護物質および浸透性の凍結保護物質を含んでいる。これにより、ガラス化または凍結の前に容器からの最大限の洗浄液の排出および最小限の洗浄液の保持が促進され、それにより、ガラス化ステップまたは凍結ステップが促進される。さらに、生体試料または胚が容器の底部に迅速に沈下することを確実にすることにより、生体物質または胚が容器から不注意に漏れる可能性が最小限になる。

容器は、好ましくは、高速な冷却速度を確保するために高度な熱拡散率を有する材料から形成されている。さらに、容器を形成する材料は、好ましくは、生体物質のあらゆるあり得る汚染も最小限にするように、生物学的に不活性である。処理液がすべて除去されると、容器は、液体窒素等に配置されることによってガラス化するように適合されており、それにより、捕捉されている胚自体が、容器材料の高い熱伝導率および熱拡散率によって迅速にガラス化する。このように、容器の底部にあるサブ貯蔵槽に胚を配置することにより、容器を液体窒素に配置することができ、それにより、胚を、液体窒素または他のガラス化培地とのいかなる直接接触からも本質的に隔離しながら、液体窒素は、胚に対して直接、最大限熱を伝導する。ガラス化プロセスが達成されると、容器および捕捉されている（この時はガラス化した）胚を液体窒素から取り除くことができ、容器を、捕捉されている胚または別の生体物質の解凍および使用を待って、ガラス化状態で保管することができる。

本発明の容器、特に任意選択的に窪みが提供され冷却プロセスに最小限のガラス化流体が使用される容器のさらなる利点は、解凍に関与し、そこでは、小さい１つまたは複数の窪みを設けることによって達成されるように、生体物質を包囲する溶液の量が最小限であるために、本発明の容器内の凍結した生体物質の解凍を最小限の乱れで迅速に達成することができる。本発明の封止された容器を、加温液内に直接配置することにより、生体試料の最大限の生存能力を維持しながら、迅速かつ制御された解凍を達成することができる。

容器に、図９〜図１３に示すような専用ホルダ１５を設けることができる。

本発明の容器および装置の汎用性を最大限にするために、容器および／またはホルダに、好ましくはキャップまたは蓋９が設けられ、キャップまたは蓋の変形を図１４〜図１６に示す。蓋を、別個の物品として形成するか、または直接蝶番で取り付けることができ、蓋は、容器１の開放頂部５領域に滑り嵌合するように適合され、最も好ましくは、貯蔵槽にスナップ嵌合してそれを閉鎖し、かつ閉鎖した容器内に最小限の開放空間を提供するように、チャネル形成と協働するように適合されている。蓋を設けることは、特に、容器が液体窒素内に配置され、その後ガラス化し、後に使用されるために保管される場合、容器の処理および操作に役立つ。蓋はまた、ガラス化した胚を、ガラス化状態にある間に汚染および損傷から保護する。

蓋は、好ましくは、図１２および図１３に示すように、容器１の本体またはホルダ１５と蓋９との間に形成された一体型ヒンジ１３により、容器ホルダと一体的に形成される。このように、容器は、一体型物品として形成され、それにより、容器に対する別個のシールを配置し提供する必要が最小限になり、かつ、容器を封止し閉鎖する容易な手段を迅速に手近に提供する。

封止は、上述したような機械的シールであるか、または図１０および図１１に示すような化学的ヒートシールであり得る。

本発明の装置はまた、バーコードまたは他の識別するしるしを提供するための物理的領域も有し、それにより、しるしプラットフォーム１０が、ガラス化した胚または生体物質の他の物品の容易かつ安全確実な識別を可能にする。それにより、容器は、所与のヒト胚に対して最大限の安全および識別を提供し、それは特に、当該生体物質が、採取後からガラス化および解凍までのプロセス全体の間に、１回の処理ステップのみが有効に行われるためである。このように、胚は、処理が開始すると容器の境界から決して離れないため、調製およびガラス化に必要な複数のステップおよびプロセス中に間違ったラベルが与えられるかまたは誤認される可能性がほとんどまたはまったくない。

別の態様では、本発明は凍結保存装置を提供し、図１７〜図２１を参照して、複数の封止された容器を保持するように適合された、カセット１２を設けることができる本発明の容器１の適合が詳述されている。カセットは、好ましくは、開放した容器を受け入れ、かつ開始から終了までガラス化プロセスを通して使用されるように設計されている。処理する前に、カセットに最大４つの容器を配置することができ、生体物質がガラス化液で洗浄されると、蓋を閉鎖／ヒートシールし、液体窒素内に投入することができる。別の態様では、上述したように、胚が処理されガラス化し、その後閉鎖した容器内に封止されると、カセットは封止された容器を受け取るように設計されている。カセットにおける複数の容器は、その後キャニスタ内に配置され、次いで、キャニスタは、図２１に詳細に示すようなデュワー保管設備または別の保管場所に保管される。カセットは、好ましくは、バーコードまたは他のしるし１０を受け取るように適合された部分を含む。

カセットは、図１８〜図２０に示すようにローダ１６に配置されるように適合されており、図２１に現行の保管システムを示す。

図２２に、タンク保管構想である代替的な保管を示す。

タンク保管構想には、
・保管することができる試料の容量を増大させることと、
・カセットと容器との両方に位置する広い識別領域によるより容易な引出しと、
・カセットおよび容器をともに固定位置に配置することができるように分断されていることと、
により、現行のシステムに対して利点がある。

本装置、特に本発明の容器構成要素は自動化に役立ち、そこでは、容器を適当な自動化装置によって自動的に処理することができ、それにより、本発明の自動化例で提供される容器のアレイは、胚が容器内に注意深く配置されると、ガラス化／凍結調製およびガラス化／凍結ステップ、ならびに後続する複数の胚のガラス化／凍結および保管を、胚を移動させる必要も、後続するステップのいかなる間の個々の監視または処理の必要もなしに、完全に自動化することができる。

別の態様では、本発明は、上述した１つまたは複数の容器を提供することを含む半自動化装置を提供し、そこでは、装置は、ガラス化のために捕捉されている生体物質を調製するように、捕捉されている生体物質を予備凍結処理液またはガラス化処理液ならびにフルイディクスで洗浄する手段を含む。

本発明の容器には、
・前記生体物質の培養培地での洗浄（培養）
・前記生体物質のガラス化液での洗浄、
・前記容器および捕捉されている生体物質のガラス化
・保管、
・前記容器の解凍、
・前記生体物質の解凍液での洗浄
を含む、さまざまな他の用途もある。

ガラス化した胚の体外受精の調製の完全自動化は、提供された胚の生存能力を実質的に向上させるように予測され、それにより、解凍された胚の生存能力を最大限にし、したがって、本発明の装置および方法によって提供される胚の被移植者に対する成功および妊娠の可能性が最大限になる。

装置に加えて、本発明はまた、上述した生体物質を処理するあらゆる方法も提供する。

別の態様では、本発明は、生体物質の凍結保存の方法であって、選択された生体物質を上述したような容器の一方のサブ貯蔵槽領域内に、そのチャネル領域に捕捉されるように導入するステップと、
・前記生体物質を、他方のサブ貯蔵槽（胚が導入されるチャネルの他方の端部にある）に導入されそこから取り除かれる一連のガラス化液で洗浄し排液するステップと、
・前記容器から前記洗浄液を最終的に排出するステップと、
・前記容器および前記捕捉されている生体物質をガラス化させるステップと、
を含む方法を提供する。

装置が、中間リストリクション内に配置された１つまたは複数の窪みの任意選択的な提供を含む、最も特に好ましい実施形態では、典型的なプロトコルは、生体物質の胚を一連のガラス化培地から最終的な最も活性化している溶液に移動させることからなる。培地組成および各溶液内における時間は以下のようであり得る。

以下、上述した装置を用いる生体物質の凍結保存のプロトコルの変形の例を列挙する。

プロトコル例１
生体物質の凍結保存のプロトコルは、以下からなる。
１．前記生体物質をｃｒｙｏｂａｓｅとともに容器の貯蔵槽領域内に導入する。
２．ｃｒｙｏｂａｓｅが吸引／分配位置から排出される。
３．ガラス化液１がチャネル全体を充填して分配される。
４．その後、生体物質は、ガラス化液１において平衡に達することができる。
５．ガラス化液１が、最小限の量を残して吸引／分配位置から排出される。
６．ガラス化液２がチャネル全体を充填して分配される。
７．その後、生体物質は、非常に短時間平衡に達する。
８．ガラス化液２が、最小限の量を残して吸引／分配位置から排出される。
９．その後、容器および生体物質は液体窒素でガラス化する。

プロトコル例２
以下のように、ガラス化液２を取り除くことなく別のプロトコルが提供される。
１．生体物質が、ｃｒｙｏｂａｓｅとともに容器内の窪み内に直接配置される。
２．ｃｒｙｏｂａｓｅが吸引／分配位置から排出される。
３．ガラス化液１がチャネル内に分配されチャネル全体を充填する。
４．その後、生体物質はガラス化液１において平衡に達することができ、容器は、生体物質が窪み内に押し戻されないように寸法が決められている。
５．ガラス化液１が、窪み内に最小限の量を残して吸引／分配位置から排出される。
６．わずかな体積のガラス化液２（０．５μｌ〜２．５μｌの間）がチャネル内に分配され、窪みおよび生体物質両方を覆う。
７．その後、生体物質は非常に短期間平衡に達する。
８．その後、容器および生体物質は液体窒素でガラス化する。

プロトコル例３
さらに、ｃｒｙｏｂａｓｅ／ガラス化液１に非浸透性の凍結保護物質を追加することを含むプロトコルが、以下のように提供される。
１．生体物質が、ｃｒｙｏｂａｓｅとともに容器内の窪み内に直接配置される。
２．ｃｒｙｏｂａｓｅが吸引／分配位置から排出される。
３．ガラス化液１がチャネル内に分配されチャネル全体を充填する。
４．その後、生体物質はガラス化液１において平衡に達することができ、容器は、生体物質が窪み内に押し戻されないように寸法が決められている。
５．ガラス化液１が、窪み内に最小限の量を残して吸引／分配位置から排出される。
６．ガラス化液２がチャネル内に分配され、チャネル全体を覆う。
７．その後、生体物質は非常に短期間平衡に達する。
８．ガラス化液２が、最小限の量を残して吸引／分配位置から排出される。
９．その後、容器および生体物質は液体窒素でガラス化する。

プロトコル例４
さらに、単一のガラス化液が徐々に追加されるプロトコルが、以下のように提供される。
１．生体物質が、ｃｒｙｏｂａｓｅとともに容器内の窪み内に直接配置される。
２．ｃｒｙｏｂａｓｅが吸引／分配位置から排出される。
３．単一のガラス化液が、サブ貯蔵槽内に徐々に導入され、チャネル全体を充填する。
４．その後、生体物質はガラス化液内で平衡に達することができ、生体物質が底部に沈下して窪みまたは中間リストリクションに残ることが確実になる。
５．ガラス化液が、窪み内に最小限の量を残して吸引／分配位置から排出される。
６．その後、容器および生体物質は液体窒素でガラス化する。

別の態様では、本発明は、生体物質のガラス化前処理の方法を提供し、前記方法は、
・前記生体物質を、上述したような装置の貯蔵槽領域内に、前記容器のチャネル領域に捕捉されるように導入するステップと、
・前記生体物質を、培養液またはガラス化前処理液ならびにフルイディクスにより洗浄し排液するステップと、
を含む。

別の態様では、本発明は、ガラス化した生体物質を解凍する方法を提供し、前記方法は、
・上述したような装置においてガラス化した生体物質を冷却液から引き抜くステップと、・前記装置の容器および前記生体物質を、加熱液内で熱を加えるか、容器の表面に熱を加えるか、または前記容器の周囲領域に熱を加えることにより解凍するステップと、
・前記捕捉されている生体物質を、前記容器の貯蔵槽領域に導入されそこから取り除かれる一連の解凍液により洗浄し排液するステップと、
・前記洗浄液を排出するステップと、
・前記容器から解凍された生体物質を回収するステップと、
を含む。

さらなる態様では、本発明は、凍結保存生体物質を保管する方法であって、
・前記生体物質を、上述したような装置の貯蔵槽容器内に、前記容器のチャネル領域に捕捉されるように導入するステップと、
・前記生体物質を、前記サブ貯蔵槽のうちの第１のサブ貯蔵槽内に導入され前記サブ貯蔵槽のうちの第２のサブ貯蔵槽から取り除かれる一連のガラス化液により洗浄し排液するステップと、
・前記容器から前記洗浄液を最終的に排出するステップと、
・前記容器および捕捉されている生体物質をガラス化させるステップと、
・生体物質がガラス状態から戻されるまで、前記容器および捕捉されている生体物質を保管設備に保管するステップと、
を含む方法を提供する。

本発明の方法は高度な自動化に役立ち、そこでは、複数の胚または他の生体物質を同時に処理することができるように、本方法を、自動化装置および機器において実行することができる。本発明の特定の特徴により、多数の胚または他の生体物質試料を、本発明に容器内に手動で導入することができる。

生体物質の個々の試料が上述したような自動化装置に取り付けられた専用の１つまたは複数の容器内に導入されると、ガラス化のための調製のプロセス全体を、多数の生体試料を、継目のない単一ステップ操作で十分に処理しガラス化させることができるように、完全に自動化し監視することができる。

当業者により、広く説明した本発明の範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示すような本発明に対して、多数の変形および／または変更を行うことができることが理解されよう。したがって、本実施形態は、すべての点において限定するものとしてではなく例示するものとしてみなされるべきである。

１ 容器
２ 貯蔵槽
３ チャネル
４ リストリクション
５ 開放頂部
６ 底部
７ サブ貯蔵槽
８ チャネル端部
９ キャップまたは蓋
１０ しるしプラットフォーム
１１ 支持枠
１２ カセット
１３ ヒンジ
１４ 窪み
１５ ホルダ
１６ ローダ

Claims (21)

1. １つまたは複数の生体物質の顕微操作用の装置であって、貯蔵槽を有する容器を備え、前記容器が前記貯蔵槽の一部に形成されたチャネルを有し、前記チャネルが、前記生体物質の通過を妨害するが液体処理液の通過を可能にするように寸法が決められている中間リストリクションを含む、装置。
2. 前記中間リストリクションが、通路を物理的に狭くすること、前記チャネルを部分的に閉塞するオリフィス、または１つもしくは複数の窪み、または上記のいずれかの組合せを含むことができる、請求項１に記載の装置。
3. 前記容器が開放頂部を備え、前記容器の底部に前記チャネルが形成されている、請求項２に記載の装置。
4. 前記チャネルが、前記中間リストリクションの両端にサブ貯蔵槽を備えている、請求項３に記載の装置。
5. 前記容器が、熱拡散率の高い材料から形成されている、請求項４に記載の装置。
6. 前記容器が、前記サブ貯蔵槽および前記チャネルの領域において熱伝達を最適化する、請求項５に記載の装置。
7. 前記容器の前記開放頂部を封止するように適合されたキャップまたは蓋を備えている、請求項３に記載の装置。
8. バーコードまたは他のしるしを受け取るように適合されている部分を含んでいる、請求項６に記載の装置。
9. １つまたは複数の前記容器を提供することを含み、かつ捕捉されている生体物質を培養液およびガラス化液および／または他の処理液で洗浄する手段と、前記捕捉されている生体物質をガラス化させる手段とを備えている自動化可能凍結保存装置である、請求項１に記載の装置。
10. １つまたは複数の前記容器を提供することを含み、捕捉されている生体物質をガラス化前処理液またはガラス化液ならびにフルイディクスにより洗浄して、ガラス化のために前記捕捉されている物質を調製する手段を備えている半自動化可能装置である、請求項１に記載の装置。
11. 生体物質の凍結保存の方法であって、
    前記生体物質を、請求項４から８のいずれか一項に記載の装置の貯蔵槽領域内に、容器のチャネル領域に捕捉されるように導入するステップと、
    前記生体物質を、サブ貯蔵槽のうちの第１のサブ貯蔵槽内に導入されかつ前記サブ貯蔵槽のうちの第２のサブ貯蔵槽から取り除かれる一連のガラス化液で洗浄し排液するステップと、
    前記容器から洗浄液を最終的に排出するステップと、
    前記容器および捕捉されている生体物質をガラス化させるステップと、
    を含む方法。
12. 前記ガラス化液が、トレハロース、スクロースおよび他の二糖類の溶液から選択された非浸透性の凍結保護物質を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 生体物質の凍結保存の方法であって、
    前記生体物質を、請求項４から８のいずれか一項に記載の装置の貯蔵槽領域内に、容器のチャネル領域に捕捉されるように導入するステップと、
    前記生体物質を、サブ貯蔵槽のうちの第１のサブ貯蔵槽内に徐々に導入されかつ前記サブ貯蔵槽のうちの第２のサブ貯蔵槽から取り除かれる単一のガラス化液で洗浄し排液するステップと、
    前記容器および捕捉されている生体物質をガラス化させるステップと、
    を含む方法。
14. 前記ガラス化液が、エチレングリコール（ＥＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、トレハロース、スクロースおよび他の二糖類の溶液から選択された非浸透性の凍結保護物質および浸透性の凍結保護物質を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ガラス化液が、前記生体物質のサブ貯蔵槽領域の底部への沈下を促進する速度で徐々に導入される、請求項１３に記載の方法。
16. 生体物質のガラス化前処理の方法であって、
    ・前記生体物質を、請求項１から８のいずれか一項に記載の装置の貯蔵槽領域内に、容器のチャネル領域に捕捉されるように導入するステップと、
    ・前記生体物質を、培養液またはガラス化前処理液ならびにフルイディクスにより洗浄し排液するステップと、
    を含む方法。
17. ガラス化した生体物質を解凍する方法であって、
    請求項１に記載の装置においてガラス化した生体物質を冷却液から引き抜くステップと、
    前記装置の容器および生体物質を、加熱液内で熱を加えるか、前記容器の表面または前記容器の周囲空気に熱を加えることにより解凍するステップと、
    捕捉されている生体物質を、前記容器の貯蔵槽領域に導入されかつそこから取り除かれる一連の解凍液により洗浄し排液するステップと、
    洗浄液を排出するステップと、
    前記容器から解凍された生体物質を回収するステップと、
    を含む方法。
18. 凍結保存生体物質を保管する方法であって、
    生体物質を、請求項４から８のいずれか一項に記載の装置の貯蔵槽領域内に、容器のチャネル領域に捕捉されるように導入するステップと、
    前記生体物質を、サブ貯蔵槽のうちの第１のサブ貯蔵槽内に導入され前記サブ貯蔵槽のうちの第２のサブ貯蔵槽から取り除かれる一連のガラス化液により洗浄し排液するステップと、
    前記容器から洗浄液を最終的に排出するステップと、
    前記容器および捕捉されている生体物質をガラス化させるステップと、
    前記生体物質がガラス状態から戻されるまで、前記容器および捕捉されている生体物質を保管設備に保管するステップと、
    を含む方法。
19. 前記ガラス化液が、エチレングリコール（ＥＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、トレハロース、スクロースおよび他の二糖類の溶液から選択された非浸透性の凍結保護物質および浸透性の凍結保護物質を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 実質的に、図を参照して上述した請求項１から１０のいずれか一項に記載の装置。
21. 実質的に、例で上述した請求項１１から１９のいずれか一項に記載の方法。

Images