DE202006017103U1 - Gefriergutbehälter mit selbsttätiger Auslösung der Kristallisation zur Kryokonservierung von lebenden Zellen - Google Patents

Gefriergutbehälter mit selbsttätiger Auslösung der Kristallisation zur Kryokonservierung von lebenden Zellen Download PDF

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Abstract

Gefriergutbehälter mit selbsttätiger Auslösung der Kristallisation zur Kryokonservierung von lebenden Zellen dadurch gekennzeichnet, dass der Gefriergutbehälter aus einem Behältnis (5) besteht und durch eine darin angebrachte Trennschicht (6) in einen Bereich (7) für die Aufnahme von Schutzlösung und Zellen und einen nur mit Schutzlösung gefüllten Bereich (8) unterteilt wird, wobei die Trennschicht so beschaffen ist, dass sie für die Zellen undurchlässig, für die Gefrierschutzlösung aber durchlässig ist, und dass Eiskristalle der Schutzlösung auf Grund eines Temperaturgradienten hindurchwachsen können, und dass die Trennschicht im Behältnis (5) so angeordnet ist, dass nach einer spontanen Auslösung der Kristallisation nahe des Verschlusses (10) die Temperatur der Schutzlösung an der Seite der Trennschicht, die den Bereich (7) begrenzt, noch über der Kristallisationstemperatur (TK) der Gefrierschutzlösung liegt.

Description

  • Viele lebende Zellen sind bei Temperaturen unter –120°C nahezu unbegrenzt haltbar. Bei dieser sogenannten Kryokonservierung werden die Zellen in einer Gefrierschutzlösung eingefroren und im Dampf über flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Wenn der Einfrierprozess richtig durchgeführt wird, leben die Zellen nach einem geeigneten Auftauvorgang ohne Schädigung weiter. Der Einfrierprozess muss nach speziellen biologisch-verfahrenstechnisch begründeten Temperatur-Zeit-Profilen erfolgen; dabei ist der Phasenübergang der verwendeten Schutzlösung vom flüssigen in den festen Aggregatszustand (Kristallisation) besonders kritisch. Ohne zusätzliche Maßnahmen zur Beeinflussung der Kristallisation ergibt sich bei einem Abkühlvorgang mit konstanter Kühlrate im Prinzip ein Temperaturverlauf (T) in der Gefrierschutzlösung nach 1. Es wird deutlich, dass hierbei eine starke Unterkühlung (Supercooling) der die Zellen enthaltenden Schutzlösung bis zu einer Temperatur (Tu) auftritt, die wesentlich unterhalb der physikalischen Kristallisationstemperatur (TK) der Lösung liegt. Die durch die spontan einsetzende Kristallisation freiwerdende Wärme führt zu einem Temperaturanstieg und damit zu einer unzulässigen Erwärmung mit nachfolgender schneller Abkühlung des Gefriergutes, was mit einer signifikanten Verringerung der Überlebensraten der Zellen verbunden ist. Um diesen schädlichen Effekt zu vermeiden, werden verschiedene Methoden zur gezielten Auslösung der Kristallisation in der Nähe von (TK) angewendet.
  • Für die Kryokonservierung in sogenannten „Offenen Systemen" werden spezielle Gefriergutbehälter nach 2 und 3 mit besonderen Vorrichtungen zur selbsttätigen Auslösung der Kristallisation verwendet (Offenlegungsschrift DE 31 25 345 A1 , Gebrauchsmuster-Rollennummer G 81 18 819.6 ).
  • Gefriergutbehälter nach 2 sind während des Abkühlvorgangs in Richtung des Temperaturgradienten ausgerichtet. Dies ist vorteilhaft, weil dadurch ein gleichmäßiges Kristallwachstum in dem die Zellen enthaltenden Behälterteil (1) erreicht wird. Nachteilig ist dagegen, dass ein Teil der Zellen in die zur Auslösung der Kristallisation benötigten Geißel (2) gelangen können und dort dem oben beschriebenen schädlichen Effekt des Supercoolings ausgesetzt sind. Damit ist diese Ausführung für die Kryokonservierung von Zellen und kleinen Zellverbänden wie z.B. Embryonen, Vorkernstadien oder Biopsieproben, die nur einzeln oder in geringer Anzahl zur Verfügung stehen, nicht geeignet.
  • Für diese Anwendungen werden Gefriergutbehälter nach 3 verwendet. Ein Nachteil dieser Ausführung besteht darin, dass der die Zellen enthaltende Behälterteil (1) senkrecht zum Temperaturgradienten angeordnet werden muss, wodurch das Kristallwachstum nicht gleichmäßig verläuft, so dass Abweichungen vom gewünschten, optimalen Temperatur-Zeit-Profil in dem Gefriervorgang auftreten können. Ein weiterer Nachteil der zur Zeit verwendeten Gefriergutbehälter nach 2 und 3 besteht in der relativ aufwendigen Montage aus Behälter (1), Geißel (2) und Verbindungsstopfen (3).
  • Der im Schutzanspruch 1 angegebenen Erfindung liegt das Problem zu Grunde, einen Gefriergutbehälter zu schaffen,
    • • der sowohl für einzelne Zellen bzw. Zellverbände als auch für Zellmengen wie z. B. Samenzellen verwendet werden kann,
    • • in dem die Kristallisation der Schutzlösung selbsttätig einsetzt,
    • • in dem die Kristallisation der Schutzlösung in dem die Zellen enthaltenden Behälterteil gleichmäßig verläuft, und
    • • der einfach gefertigt werden kann.
  • Dieses Problem wird mit den im Schutzanspruch 1 aufgeführten Merkmalen gelöst.
  • Die Problemlösung wird an Hand eines Ausführungsbeispiels nach 4 erläutert:
    Der Gefriergutbehälter besteht aus dem eigentlichen Behältnis (5), das an den Enden verschlossen werden kann (9) und (10), und ist durch eine Trennschicht (6) in zwei Bereiche (7) und (8) unterteilt. Der obere Bereich (7) dient zur Aufnahme von Schutzlösung und Zellen. Die Länge des unteren Bereichs (8), in den nur Schutzlösung eingebracht wird, ist so gewählt, dass bei sicherer Auslösung der Kristallisation durch Unterkühlung in der Nähe des unteren Verschlusses (10) die Temperatur an der Unterseite der Trennschicht noch über der Kristallisationstemperatur (TK) der Schutzlösung liegt.
  • Die Trennschicht ist dadurch gekennzeichnet, dass
    • • sie für die Zellen undurchlässig ist,
    • • sie für die Gefrierschutzlösung durchlässig ist, und
    • • Eiskristalle der Schutzlösung in Richtung des Temperaturgradienten hindurchwachsen können.
  • Damit ist Folgendes erreicht: Nach der spontanen Auslösung der Kristallisation im unteren Bereich (8) des Behälters, in dem sich keine Zellen befinden, wächst die Kristallfront schnell bis unterhalb der Trennschicht, wo die Schutzlösung gerade die Kristallisationstemperatur (TK) erreicht hat. Beim weiteren Abkühlen durch geregeltes Absenken der Gefriergutbehälter wandert die Kristallfront zunächst durch die Trennschicht und dann gleichmäßig weiter durch den Bereich (7), in dem sich die Zellen in der Gefrierschutzlösung befinden. Das gleichmäßige Kristallwachstum im Bereich (7) wird dadurch erreicht, dass die Gefriergutbehälter während des Gefriervorgangs vertikal, d.h. in Richtung des Temperaturgradienten angeordnet sind.
  • Damit stellen sich die wesentlichen Vorteile der Erfindung im Vergleich zu den bestehenden Gefriergutbehältern mit selbsttätiger Auslösung der Kristallisation wie folgt dar:
    • • Die Kristallisation der Schutzlösung in der Umgebung der Zellen erfolgt immer bei der optimalen Temperatur, nämlich der Kristallisationstemperatur (TK) der Schutzlösung ohne jegliche Unterkühlung. Dadurch wird sichergestellt, dass die Gefriervorgänge exakt nach den vorgegebenen Temperatur-Zeit-Profilen ablaufen.
    • • Der Gefriergutbehälter kann sowohl für einzelne Zellen bzw. Zellverbände als auch für Zellmengen verwendet werden.
    • • Das Füllen des Gefriergutbehälters ist einfach und unkritisch.
    • • Die Herstellung des Gefriergutbehälters ist einfach und kostengünstig.

Claims (5)

  1. Gefriergutbehälter mit selbsttätiger Auslösung der Kristallisation zur Kryokonservierung von lebenden Zellen dadurch gekennzeichnet, dass der Gefriergutbehälter aus einem Behältnis (5) besteht und durch eine darin angebrachte Trennschicht (6) in einen Bereich (7) für die Aufnahme von Schutzlösung und Zellen und einen nur mit Schutzlösung gefüllten Bereich (8) unterteilt wird, wobei die Trennschicht so beschaffen ist, dass sie für die Zellen undurchlässig, für die Gefrierschutzlösung aber durchlässig ist, und dass Eiskristalle der Schutzlösung auf Grund eines Temperaturgradienten hindurchwachsen können, und dass die Trennschicht im Behältnis (5) so angeordnet ist, dass nach einer spontanen Auslösung der Kristallisation nahe des Verschlusses (10) die Temperatur der Schutzlösung an der Seite der Trennschicht, die den Bereich (7) begrenzt, noch über der Kristallisationstemperatur (TK) der Gefrierschutzlösung liegt.
  2. Gefriergutbehälter nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Trennschicht (6) aus bestimmten Materialien oder Mischungen besteht, z. B. Textilien, Kunststoff, Keramik, Metall.
  3. Gefriergutbehälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Verschlüsse (9) und (10) in einer bestimmten Form ausgeführt werden, z. B. durch Verschweißen (thermisch, Ultraschall) oder mechanisch (Kugel, Stopfen, Verschraubung).
  4. Gefriergutbehälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Behältnisse (5) durch Beschriften, Etikettieren oder durch Einfügen von farbigen oder anderweitig markierten, z. B. Strichcode, Teilen in den zellfreien Bereich (8) gekennzeichnet werden.
  5. Gefriergutbehälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass sie sterilisiert werden.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2575442A4 (de) * 2010-05-28 2017-08-23 Genea Ip Holdings Pty Limited Verbesserte mikromanipulations- und speichervorrichtung sowie verfahren dafür

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP2575442A4 (de) * 2010-05-28 2017-08-23 Genea Ip Holdings Pty Limited Verbesserte mikromanipulations- und speichervorrichtung sowie verfahren dafür
US10244749B2 (en) 2010-05-28 2019-04-02 Genea Ip Holdings Pty Limited Micromanipulation and storage apparatus and methods
US11033022B2 (en) 2010-05-28 2021-06-15 Genea Ip Holdings Pty Limited Micromanipulation and storage apparatus and methods

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