DE3822589A1 - Verfahren und vorrichtung zur abkuehlung und zum einfrieren von biologischen objekten - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur abkuehlung und zum einfrieren von biologischen objekten

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Valerij Fridrichovic Tarasov
Sergej Evgenevic Galcenko
Jurij Vladimirovic Kalugin
Jurij Stepanovic Parascuk
Nina Antonovna Lucko
Elena Nikolaevna Cernys
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Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Kryobiologie und Kryo­ medizin und betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Abkühlung und zum Einfrieren von biologischen Objek­ ten.
Der zunehmende Bedarf an qualitativ hochwertigen kryo­ konservierten Biomaterialien in der Volkswirtschaft und insbesondere im Gesundheitswesen machte es erforderlich, Verfahren zur Kryokonservierung durch eine Erhöhung der Wirksamkeit der Gefrieranlagen und Vereinfachung ihrer Konstruktion zu vervollkommnen. Da die Kryokonservierung von biologischen Objekten durch schnelles Abkühlen durch direktes Eintauchen in flüssigen Stickstoff aufgrund des Leidenfrostschen Phänomens nicht ausreichend ist, und das Einfrieren in herkömmlichen Gefrieranlagen, die auf der Kristallisation beruhen, zu einer erheblichen Zellschä­ digung führt, bestand ein Bedürfnis nach wirksamen, ein­ fachen Vorrichtungen zur Abkühlung und zum Gefrieren, die eine Vitrifikation biologischer Objekte zu erzielen ge­ statten.
Alle Verfahren zur Tieftemperatureinfrierung von biolo­ gischen Objekten beruhen praktisch auf dem Prinzip der programmierten Abkühlung. Zur Vermeidung bzw. Verringerung von Gefrierschäden durch den Kristallisationsprozeß wird dabei das Gefrieren in einem Kryokonservierungsmittel vor­ genommen, das Gefrierschutzmittel enthält, die gegenüber den biologischen Strukturen biologisch nicht indifferent sind. Sie sind in einem bestimmten Maße toxisch und be­ schädigen biologische Makromoleküle, insbesondere in höheren Konzentrationen, bedingt durch Auskristallisieren des Wassers in Form von reinem Eis. Die eutektischen Kon­ zentrationen der Gefrierschutzmittel erreichen dabei 60 bis 70 Masse-%.
Das Gefrieren von tierischen Embryonen wird mit einer hohen Genauigkeit mit einer Vorrichtung zum programmier­ baren Einfrieren und Auftauen (SU 9 89 272-A) vorgenommen, die einen wärmeisolierten Behälter zur Aufnahme von Con­ tainern mit Embryonen, Träger für die Container, Ein­ richtungen zum Rühren eines Zwischenwärmeträgers sowie ein System zur Steuerung des Gefrierprozesses aufweist. Der Behälter weist einen Deckel auf, und die eigentliche Ein­ richtung zur Aufrechterhaltung der Temperatur des Zwi­ schenwärmeträgers ist in Form einer Rohrschlange ausge­ führt, die an der Innenfläche des Behälters mit einer Ver­ größerung der Steigung der Rohrwindungen in Richtung des Bodens vorgesehen ist, wobei die Träger der Container am Deckel befestigt sind.
Dabei erfolgt der Gefrierschutz der Embryonen bei ihrer Kryokonservierung mit dieser Vorrichtung durch Einleitung der Kristallbildung, deren Fortschreiten zu einer Dehydra­ tisierung der Zellen führt. Dadurch wird es möglich, die Entwicklung der intrazellulären Kristallisation bei der Übertragung der Embryonen in flüssigen Stickstoff zur Lagerung zu vermeiden. Da es notwendig ist, die Zellen zügig zu entwässern, muß man diese langsam unter einer längeren Entwicklung des Kristallisationsprozesses ab­ kühlen. Innerhalb dieser Zeitperiode, die 1,5 bis 2 h beträgt, wirken auf die biologischen Strukturen extremale Einflüsse ein, die mit dem Ausfrieren des Wassers, der dadurch hervorgerufenen Erhöhung der Elektrolytkonzentra­ tion, der Änderung des pH-Wertes, dem Eiskristallwachstum und anderen Vorgängen verbunden sind, die diesen Prozeß begleiten. Unter solchen Bedingungen der Tieftemperatur­ konservierung wird es notwendig, höhere Konzentrationen (1 bis 3 M) an Gefrierschutzmitteln zu verwenden, die bei einer langsamen Kristallisation und folglich einer längeren Verweilzeit der Zellen in flüssiger Phase auf diese eine toxische bzw. pseudotoxische Wirkung ausüben.
Bei der genannten Vorrichtung ist außerdem nur ein schmaler Bereich der Abkühlgeschwindigkeiten von 0,3 bis 1,0°C/min gegeben. Dadurch sind die Anwendungsmöglich­ keiten dieses Verfahrens zur Kryokonservierung beschränkt, wobei man gezwungen ist, hauptsächlich standardisierte Kryokonservierungsmittel zu verwenden, deren Zusammenset­ zung eine Optimierung der bestehenden Verfahren erschwert. Dieser Nachteil ist umso gravierender, als die herkömmli­ chen Verfahren zur Kryokonservierung eine hohe und stabile Lebensfähigkeit von Embryonen nicht gewährleisten können. Das beeinflußt z. B. die Ergebnisse von Transplantationen in der Herdbuchzucht und im Gesundheitswesen bei der Ver­ wendung von Embryonen in der medizinischen Praxis zur Be­ handlung von Sterilität negativ.
Außerdem ist die Vorrichtung kompliziert aufgebaut, ent­ hält teure Bestandteile und ist nicht bedienungsfreund­ lich.
Die Vorrichtung erfordert ferner zu ihrer Bedienung hoch­ qualifizierte Fachkräfte, die nicht nur allgemein die Technik der Kryokonservierung beherrschen, sondern auch apparative Spezialkenntnisse haben müssen.
Es ist bekannt, daß die Abkühlung von verschiedenen Ma­ terialien, z. B. von Nahrungsmitteln, durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff, Freon oder Stickstoffoxid (siehe Große Sowjetische Enzyklopädie, 3. Auflage, Bd. 9, 1972, Verlag Sovietskaya entsiklopedia, Moskau, S. 327) durch­ geführt werden kann, wobei dazu eine Reihe von Vorrich­ tungen vorgeschlagen wurde.
Die Vorrichtungen zur Schnellkühlung von biologischen Strukturen, die auf einem unmittelbaren Eintauchen der Container mit biologischen Materialien in flüssiges Kühlmittel beruhen, gestatten es jedoch nicht, Abküh­ lungsgeschwindigkeiten von mehr als 400 bis 500°C/min zu erreichen, um so Kristallisationsprozesse zu vermeiden und eine Vitrifikation von biologischen Proben zu erzielen, selbst wenn diese sehr klein sind.
Deshalb ist man in diesen Fällen genötigt, dem Kryokon­ servierungsmittel ein Gefrierschutzmittel in hoher Kon­ zentration, die 50 bis 60% erreicht, zuzusetzen. Dadurch wird es möglich, bei der genannten Abkühlgeschwindigkeit eine Vitrifizierung herbeizuführen.
Die Anwendung derartig hoher Konzentrationen an Gefrier­ schutzmitteln führt jedoch zu beträchtlichen Schädigungen der biologischen Strukturen während des Zusetzens von Kryokonservierungsmitteln oder deren Entfernung nach dem Auftauen.
Solche niedrige Abkühlgeschwindigkeiten biologischer Proben beim direkten Eintauchen in flüssigen Stickstoff sind darauf zurückzuführen, daß sich um die Container mit den biologischen Proben herum eine wärmeisolierende Hülle aus Kühlmitteldämpfen (Leidenfrostsches Phänomen), z. B. Stickstoffdampf, bildet, die durch den Temperaturunter­ schied zwischen dem nicht abgekühlten Container und dem flüssigen Stickstoff bei -196°C bedingt ist.
Das Vorhandensein einer solchen Dampfhülle setzt die Ge­ schwindigkeit der Abkühlung biologischer Objekte bis auf ein Niveau herab, bei dem Kristallisation auftritt, was wiederum die Einführung eines Gefrierschutzmittels in einer hohen Konzentration in das Kryokonservierungsmittel zur Unterdrückung dieses Kristallisationsprozesses not­ wendig macht.
Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Abkühlung und zum Einfrieren von biologischen Objekten anzugeben, mit denen eine Vitrifizierung erzielt werden kann.
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Vorteilhafte Aus­ führungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Abkühlung und zum Ein­ frieren von in Containern befindlichen biologischen Objek­ ten beruht auf dem Eintauchen der Container in ein in einem wärmeisolierenden Behälter vorgesehenes Kühlmedium und ist dadurch gekennzeichnet, daß die Container in ein pulverförmiges Material mit hoher Wärmeleitfähigkeit ein­ getaucht werden, das in einem im wärmeisolierenden Behäl­ ter angeordneten Gefäß aus einem Werkstoff mit hoher Wär­ meleitfähigkeit vorgesehen und auf die Temperatur des verwendeten Kühlmittels abgekühlt ist.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Abkühlung und zum Einfrieren von biologischen Objekten weist einen wärmeiso­ lierten Behälter für ein Kühlmittel und mindestens einen Container für biologische Objekte auf und ist dadurch ge­ kennzeichnet, daß sie ein aus einem Werkstoff hoher Wärmeleitfähigkeit bestehendes Gefäß aufweist, das im Be­ hälter vorgesehen und mit einem pulverförmigen Material hoher Wärmeleitfähigkeit gefüllt ist, das zur Aufnahme der Container mit biologischen Objekten dient.
Bevorzugt wird Flüssigstickstoff als Kühlmittel verwendet.
Besonders wirksam kann die vorliegende Erfindung zur Tieftemperaturkonservierung von biologischen Objekten in Form von Suspensionen, flüssigen, dichten Geweben und Organen eingesetzt werden, die in der klinischen Praxis Anwendung finden können, ferner zur Tiefkühlung und zum Gefrieren von biologischen Objekten in der Landwirtschaft, insbesondere in der Viehzucht, sowie auch zur Tieftempera­ turkonservierung von biologischen Objekten beliebiger Art, deren Lebensfähigkeit unter Tieftemperaturbedingungen über längere Zeit zu erhalten ist.
Die Erfindung kann ferner auch überall dort Anwendung finden, wo es erforderlich ist, die Abkühldauer eines Objektes bedeutend zu reduzieren, was mit herkömmlichen Verfahren nicht möglich ist.
Die Konzeption der Erfindung gestattet es, die Bildung einer wärmeisolierenden Hülle aus Kühlmitteldämpfen um den Container mit biologischen Objekten herum zu vermeiden, was wiederum ermöglicht, in Abhängigkeit von der Art des Pulvers, seiner Dispersität und der Teilchenform, die Ge­ schwindigkeit der Abkühlung der Objekte bis auf einige Zehntausend Grad pro Minute zu erhöhen.
Im Ergebnis kommen die Wassermoleküle nicht dazu, sich zu einem Kristallgitter anzuordnen, und das Gefrieren des Wassers erfolgt durch Vitrifikation; dadurch werden die negativen Wirkungen von extremen Faktoren, die mit der Keimbildung und dem Kristallisationsprozeß zusammenhängen, verhindert oder auf ein Minimum reduziert, die in einer mechanischen Schädigung der biologischen Strukturen bzw. Makromoleküle durch Eiskristalle, in einer denaturieren­ den Wirkung von hyperkonzentrierten Salzlösungen, in deren osmotischer Wirkung sowie in einer übermäßigen Dehydrati­ sierung der biologischen Strukturen zum Ausdruck kommen und zu irreversiblen Schädigungen der biologischen Struk­ turen führen.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als pulverförmiges Material mit hoher Wärmeleitfähigkeit ein Metall verwendet. Es ist ferner alternativ auch günstig, als pulverförmiges Material mit hoher Wärmeleit­ fähigkeit ein Metalloxid zu verwenden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird als pulverförmiges Material hoher Wärmeleitfähigkeit eine Metallegierung verwendet.
Im Rahmen der Erfindung können ferner gemäß einer weiteren Ausführungsform als pulverförmige Materialien hoher Wärme­ leitfähigkeit auch Gemische verwendet werden, die aus einem Metall, einem Metalloxid sowie einer Metallegierung bestehen, die in verschiedenen Mengenverhältnissen vorlie­ gen können.
Bei der Auswahl des entsprechenden pulverförmigen Materials richtet man sich nach der Zeit, die für die Vitrifikation des einzufrierenden biologischen Objekts bei Verwendung eines Kryokonservierungsmittels entsprechender Zusammensetzung erforderlich ist.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbei­ spielen unter Bezug auf die Zeichnungen näher erläutert;
Fig. 1 Eine schematische Darstellung der erfindungsge­ mäßen Vorrichtung beim Ergreifen des Containers mit biologischen Objekten;
Fig. 2 die Vorrichtung von Fig. 1 bei der Bewegung des Containers mit biologischen Objekten zum mit einem Kühlmittel gefüllten Behälter hin;
Fig. 3 die Vorrichtung von Fig. 1 beim Eintauchen des Containers mit biologischen Objekten in das Gefäß, das mit einem pulverförmigen Material hoher Wärme­ leitfähigkeit gefüllt ist;
Fig. 4 die Vorrichtung von Fig. 1 beim Herausnehmen des Containers mit biologischen Objekten aus dem Ge­ fäß, das mit dem pulverförmigen Material hoher Wärmeleitfähigkeit gefüllt ist;
Fig. 5 die Vorrichtung von Fig. 1 beim Eintauchen des Containers mit den eingefrorenen biologischen Ob­ jekten in das mit einem Kühlmittel gefüllte Gefäß zur Lagerung.
Die Vorrichtung weist einen Behälter 1 (Fig. 1) auf, der aus einem wärmeisolierenden Material, beispielsweise einem Kunststoffschaum, hergestellt ist und mit einem Kühlmittel 2 gefüllt wird. Im Behälter 1 sind zwei Gefäße 3, 4 aus einem Material hoher Wärmeleitfähigkeit, z.B. aus Metall, untergebracht. Das Gefäß 3 wird mit einem pulverförmigen Material 5 hoher Wärmeleitfähigkeit gefüllt, während das andere Gefäß 4 zur Füllung mit dem Kühlmittel 2 vorgesehen ist. Im Gefäß 3 ist ein Rührwerk 6 mit einem elektrischen Antrieb 7 eingebaut. Der Behälter 1 weist einen Deckel 8 mit zwei durchgehenden Öffnungen 9, 10 auf, die oberhalb der zugehörigen Gefäße 3 bzw. 4 vorgesehen sind.
Die Vorrichtung weist ferner eine Einrichtung 11 zum Grei­ fen eines Containers 12 mit biologischen Objekten sowie Antriebe 13, 14 auf, die geradlinige waagerechte und senk­ rechte Bewegungen des Containers 12 ermöglicht.
Der Container 12 kann z.B. aus Aluminiumfolie bestehen.
Als Materialien 5 hoher Wärmeleitfähigkeit können ein Metall, ein Metalloxid und eine Metallegierung verwendet werden, die sowohl einzeln als auch in Form von Gemischen in verschiedenen Mengenverhältnissen verwendet werden können.
Die Vorrichtung funktioniert folgendermaßen:
Zunächst nimmt man den Deckel 8 ab, und der Behälter 1 und das Gefäß 4 werden mit dem Kühlmittel 2, beispielsweise mit flüssigem Stickstoff von -196°C, gefüllt, während das Gefäß 3 mit dem pulverförmigen Material 5 hoher Wärmeleit­ fähigkeit gefüllt wird; anschließend wird der Antrieb 7 des Rührwerks 6 zum Ausgleich der Temperatur des Materials 5 im Gefäß 3 eingeschaltet, wonach der Behälter 1 mit dem Deckel 8 abgedeckt wird. Nach der Abkühlung des Materials 5 auf die Temperatur des Kühlmittels wird der mit biolo­ gischen Objekten gefüllte Container 12 von der Einrichtung 11 (Fig. 1) ergriffen und mittels der Antriebe 13, 14 über die Öffnungen 9 in das pulverförmige Material 5 einge­ führt, das sich im Gefäß 3 (Fig. 2) befindet. Nach 5 bis 10 s wird der Container 12 mit den gefrorenen biologischen Objekten mittels der Antriebe 13, 14 aus dem Behälter 1 (Fig. 4) herausgenommen und zur anderen Öffnung 10 geführt, wonach er über diese Öffnung in das Gefäß 4 (Fig. 5) zur kurzfristigen Lagerung (für einige Tage) eingeführt wird.
Um die Effektivität der erfindungsgemäßen Vorrichtung nachzuweisen, wurden Wasserproben bis zu einer Temperatur von -50°C abgekühlt und eingefroren. Der Container 12 mit einem Inhalt von 0,1 ml, der aus Nahrungsmittelver­ packungsfolie mit einer Dicke von 0,03 mm bestand, wurde mit Wasser gefüllt und in das Gefäß 3 eingetaucht, das mit einem auf die Temperatur des Kühlmittels 2 abgekühlten Aluminiumoxidpulver (Al2O3) gefüllt war. Dabei wurde eine Temperatur von -50°C innerhalb von 0,95 s erreicht. Fer­ ner wurde eine Probe zu Vergleichszwecken in den mit flüs­ sigem Stickstoff gefüllten Behälter 4 eingeführt, wobei eine Temperatur von -50°C innerhalb von 1,87 s erreicht wurde. Die unter Verwendung auch anderer pulverförmiger Materialien erzielten Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt.
Erstarrungszeit einer Wasserprobe beim Eintauchen des Containers in pulverförmige Materialien hoher Wärmeleitfähigkeit sowie in flüssigen Stickstoff
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß das im Gefäß 3 vor­ gesehene pulverförmige Material 5, das als Kälteträger zur Abkühlung der biologischen Objekte im Container 12 dient, eine 2- bis 15fache Verkürzung der Erstarrungszeit zu er­ zielen erlaubt. Daher können das erfindungsgemäße Verfah­ ren sowie die entsprechende Vorrichtung in der Kryobiolo­ gie und -medizin vorteilhaft angewandt werden.

Claims (15)

1. Verfahren zur Abkühlung und zum Einfrieren von in Con­ tainern befindlichen biologischen Objekten durch Ein­ tauchen der Container in ein in einem wärmeisolierenden Behälter vorgesehenes Kühlmedium, dadurch gekennzeichnet, daß die Container in ein pulverförmiges Material mit hoher Wärmeleitfähigkeit eingetaucht werden, das in einem im wärmeisolierenden Behälter angeordneten Gefäß aus einem Werkstoff mit hoher Wärmeleitfähigkeit vorgesehen und auf die Temperatur des verwendeten Kühlmittels abge­ kühlt ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als pulverförmiges Material mit hoher Wärmeleitfähig­ keit ein Metall verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als pulverförmiges Material mit hoher Wärmeleitfähig­ keit ein Metalloxid verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als pulverförmiges Material mit hoher Wärmeleitfähig­ keit eine Metallegierung verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als pulverförmiges Material mit hoher Wärmeleitfähigkeit ein Gemisch verwendet wird, das aus einem Metall, einem Metalloxid sowie einer Metallegierung besteht.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß als pulverförmiges Material mit hoher Wärmeleitfähigkeit Kupfer, Eisen, Zink, Zinkoxid, Aluminium, Aluminiumoxid, Kupferbronze, Messing, ein Gemisch aus Aluminiumoxid und Zinkoxid im Massenver­ hältnis 50:50, ein Gemisch aus Aluminiumoxid, Zink und Kupferbronze im Massenverhältnis 35:35:30 und/oder ein Gemisch aus Aluminiumoxid, Zink und Kupferbronze im Massenverhältnis 25:50:25 verwendet wird.
7. Vorrichtung zur Abkühlung und zum Einfrieren von bio­ logischen Objekten
mit
  • - einem wärmeisolierten Behälter (1) für ein Kühlmittel (2)
    und
  • - mindestens einem Container (12) für biologische Objekte,
gekennzeichnet durch ein Gefäß (3) aus einem Werkstoff mit hoher Wärmeleit­ fähigkeit, das im Behälter (1) angeordnet, mit einem pulverförmigen Material (5) mit hoher Wärmeleitfähig­ keit gefüllt und zur Aufnahme des Containers (12) mit biologischen Objekten vorgesehen ist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das pulverförmige Material (5) mit hoher Wärmeleitfähigkeit ein Metall ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das pulverförmige Material (5) mit hoher Wärme­ leitfähigkeit ein Metalloxid ist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das pulverförmige Material (5) mit hoher Wärme­ leitfähigkeit eine Metallegierung ist.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das pulverförmige Material (5) mit hoher Wärmeleitfähigkeit ein Gemisch ist, das besteht aus
  • - einem Metall,
  • - einem Metalloxid sowie
  • - einer Metallegierung.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, gekenn­ zeichnet durch ein pulverförmiges Material (5) aus Kupfer, Eisen, Zink, Zinkoxid, Aluminium, Aluminium­ oxid, Kupferbronze, Messing, einem Gemisch aus Alumi­ niumoxid und Zinkoxid im Massenverhältnis 50:50, einem Gemisch aus Aluminiumoxid, Zink und Kupferbronze im Massenverhältnis 35:35:30 und/oder einem Gemisch aus Aluminiumoxid, Zink und Kupferbronze im Massenverhält­ nis 25:50:25.
13. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zum Schnellgefrieren von makromolekularen Lösun­ gen, Zellbestandteilen, Einzellern, Sperma, Geweben, Zellverbänden Zellsuspensionen, Organen und Embryo­ nen.
14. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 12 zum Schnellgefrieren von makromolekularen Lösungen, Zellbestandteilen, Einzellern, Sperma, Gewe­ ben, Zellverbänden, Zellsuspensionen, Organen und Embryonen.
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