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QUERBEZUG ZU VERWANDTEN
ANMELDUNGEN
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Diese
Anmeldung beansprucht die Priorität der am 12. Juni 2000 eingereichten
provisorischen US-Patenanmeldung Nr. 60/210,913 mit dem Titel "CRYOGENIC PRESERVATION
OF BIOLOGICALLY ACTIVE MATERIAL USING HIGH TEMPERATURE FREEZING".
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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine kryogene Konservierung,
und insbesondere eine kryogene Konservierung von biologisch aktivem Material
mittels Vitrifikationstechniken.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
kryogene Konservierung (Kryokonservierung) kann definiert werden
als das Absenken der Temperatur von lebenden Strukturen und biochemischen
Molekülen
auf den Gefrierpunkt und darunter zu den Zwecken der Lagerung und
zukünftigen
Wiedergewinnung des Materials in seinem lebensfähigen Zustand vor dem Einfrieren.
Experimente mit Hundesperma in den 1700ern zeigten zuerst, dass
einzelne Zellen eingefroren und später aufgetaut werden können und
dass eine kleine Prozentzahl der Zellen zu ihrer normalen physiologischen
Funktion zurückkehrt.
Später
wurde in den 1900ern herausgefunden, dass die Zellenwiedergewinnungsraten
verbessert werden können,
falls die Zellen unter Verwendung von Verbindungen, die insgesamt
als Kryoprotektoren bezeichnet werden, chemisch präpariert
werden, um dem Einfrierprozess standzuhalten. Selbst mit der Verwendung
von Kryoprotektoren betragen jedoch die Wiedergewinnungsraten aus
der Kryokonservierung routinemäßig 50%
oder weniger.
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Bisherige
Versuche zum Verbessern der Kryokonservierungs-Wiedergewinnungsraten
haben sich im Allgemeinen auf neue Kryoprotektoren zum Behandeln
des biologi schen Materials vor dem Einfrieren und auf extrem langsame
oder schnelle Einfriertechniken fokussiert. Beide Techniken sind
allgemein auf das Reduzieren einer Zellschädigung gerichtet, die verursacht
wird, wenn sich das Wasser in den Zellen während des Gefrierprozesses
aufgrund der Bildung von Eiskristallen ausdehnt. In der Theorie reduziert
oder beseitigt ein extrem langsames oder schnelles Einfrieren die
Bildung von Eiskristallen in einer Zelle. Mechanismen für extrem
langsame Einfrierraten enthielten das kontrollierte Absenken durch Stickstoffdämpfe in
flüssigem
Stickstoff oder das Bewegen der Proben durch unterkühlte Alkoholverbindungen
gefolgt von einem Eintauchen in flüssigen Stickstoff. Das Einfrieren
in dieser Weise erlaubt kein weiteres Wachstum der Eiskristallgröße während des Einfrierprozesses,
aber erlaubt nach wie vor die Eiskristallbildung.
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Eine
weitere Technik, die häufig
als Vitrifikation bezeichnet wird, taucht Proben direkt in flüssigen Stickstoff
ein in einem Versuch, das Wasser in der Zelle so schnell einzufrieren,
dass eine Eiskristallbildung verhindert wird. Die Vitrifikation
nimmt Zellen schnell von Raumtemperatur auf –196°C, der Temperatur von flüssigem Stickstoff.
Ein derart extremer Temperaturabfall in einer derart kurzen Zeit
verursacht häufig
Spannungsbrüche
in der Zellmembran. Kryoprotektoren werden in Verbindung mit der
Vitrifikation und verschiedenen weiteren Einfriertechniken verwendet.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Deshalb
wird ein verbesserter Weg zum kryogenen Konservieren von lebensfähigen einzelnen Zellen,
Geweben, Organen, Nukleinsäuren
oder anderen biologisch aktiven Molekülen benötigt, der wenigstens einige
der Probleme bei den derzeit verfügbaren Verfahren vermeidet.
Demgemäß sieht
wenigstens ein Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung ein Verfahren der Kryokonservierung mit dem
Eintauchen von biologisch aktivem Material in ein Kühlfluid
und dem Zirkulieren des Kühlfluids
entlang dem Material vor. Das Material kann in Abhängigkeit
von der Art des kryogen zu konservierenden Materials vor dem Eintauchen
einer chemischen Präparation
unterzogen werden oder nicht. Das Kühlfluid wird entlang dem Material
mit einer im Wesentlichen konstanten vorbestimmten Geschwindigkeit
und Temperatur zirkuliert, um das Material so einzufrieren, dass
das Material vitrifiziert wird und die Bildung von Spannungsbrüchen in
Zellmembranen minimiert wird. In wenigstens einem Aus führungsbeispiel
wird das Kühlfluid
auf einer Temperatur zwischen etwa –20°C und -30°C gehalten, und die Geschwindigkeit des
Kühlfluids
entlang dem Material beträgt
etwa 115 Liter pro Minute pro Meter (35 Liter pro Minute pro Fuß) des Kühlfluids
durch einen Bereich nicht größer als
etwa 0,61 Meter (24 Inch) breit und 1,22 m (48 Inch) tief. Außerdem friert
wenigstens ein Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung das Material direkt auf eine Temperatur
höher als
etwa –30°C ein. Ein
noch weiteres Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung sieht ein biologisches Material vor,
das einem solchen Kryokonservierungsprozess unterzogen worden ist.
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Es
ist eine Aufgabe wenigstens eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden
Erfindung, ein biologisches Material so einzufrieren, dass die Bildung von
Eiskristallen und Spannungsbrüchen
vermieden wird.
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Ein
Vorteil wenigstens eines Ausführungsbeispiels
der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Kryokonservierungs-Wiedergewinnungsraten
deutlich erhöht
sind, weil das biologische Material während des Einfrierens vitrifiziert
wird.
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Ein
weiterer Vorteil wenigstens eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden
Erfindung besteht darin, dass die Kryokonservierungs-Wiedergewinnungsraten
verbessert sind, weil das biologische Material bei einer Temperatur
vitrifiziert wird, die hoch genug ist, um die Bildung von Spannungsbrüchen in den
Zellmembranen zu verhindern.
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Ein
weiterer Vorteil wenigstens eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden
Erfindung ist, dass derzeitige Kryokonservierungs-Lageranlagen und
-mechanismen verwendet werden können,
um das gefrorene biologische Material zu lagern, wenn es einmal
eingefroren ist.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Weitere
Aufgaben, Vorteile, Merkmale und Eigenschaften der vorliegenden
Erfindung sowie Verfahren, Funktionsweisen und Funktionen zugehöriger Bauelemente
und die Kombination von Teilen und Einsparungen bei der Herstellung
werden bei Betrachtung der folgenden Beschreibung und Ansprüche unter
Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen offensichtlich, die alle
einen Teil dieser Beschreibung bilden, wobei gleiche Bezugsziffern
entsprechende Teile in den verschiedenen Figuren bezeichnen. Es zeigen:
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1 eine
Seitenansicht einer Kühlvorrichtung,
die zum Ausüben
eines Verfahrens gemäß wenigstens
einem Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung geeignet ist;
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2 eine
Endansicht eines Querschnitts der in 1 dargestellten
Kühlvorrichtung;
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3 ein
Flussdiagramm eines Verfahrens gemäß wenigstens einem Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung;
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4 ein
Balkendiagramm der Ergebnisse von experimentellen Vergleichen einer
Zellschädigung
in Schnitten von ganzen kernlosen Trauben, die ohne chemische Präparation
eingefroren wurden, zwischen verschiedenen herkömmlichen Gefriervorrichtungen
(von denen nicht alle zur Kryokonservierung und Lagerung benutzt
werden) und einem Einfrierverfahren gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung;
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5 ein
Balkendiagramm der Ergebnisse von experimentellen Vergleichen des Überlebens von
Zellen und der Funktion nach dem Auftauen von menschlichen Spermien
zwischen einem Einfrierverfahren des Standes der Technik und einem
Einfrierverfahren gemäß einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung;
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6 ein
Balkendiagramm der Ergebnisse von experimentellen Vergleichen des Überlebens von
Zellen nach dem Auftauen von schweineähnlichen Muskelzellen zwischen
einem Einfrierverfahren des Standes der Technik und einem Einfrierverfahren gemäß einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung; und
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7 ein
Balkendiagramm der Ergebnisse von experimentellen Vergleichen des Überlebens von
Zellen von Mäuseembryos
zwischen einem Einfrierverfahren des Standes der Technik und einem Einfrierverfahren
gemäß einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
EINES BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELS
DER ERFINDUNG
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Bezug
nehmend zuerst auf 1 und 2 wird eine
Kühlvorrichtung
erläutert,
die zum Ausüben eines
Verfahrens gemäß wenigstens
einem Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung geeignet ist und allgemein als Kühleinheit 100 bezeichnet
wird. Die Kühleinheit 100 weist
vorzugsweise einen Behälter 110 auf,
der ein Kühlfluid 140 enthält. Untergetaucht
in das Kühlfluid 140 sind
Zirkulatoren 134 wie beispielsweise Motoren 130 mit
Flügelrädern 132, eine
Wärmetauschspule 120 und
ein Gestell 150, das in einem Ausführungsbeispiel Fächer 155 zum
Tragen von einzufrierendem biologischen Material aufweist. Das biologische
Material kann, ohne darauf beschränkt zu sein, lebensfähige einzelne
Zellen, Gewebe und Organe, Nukleinsäuren und andere biologisch
aktive Moleküle
enthalten. Außerhalb
des Behälters 110 und
verbunden mit der Wärmetauschspule 120 ist
eine Kälteeinheit 190.
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Der
Behälter 110 kann
von beliebigen Dimensionen sein, die zum Eintauchen des einzufrierenden
biologischen Materials in ein Volumen des Kühlfluids 140 notwendig
sind, wobei die Abmessungen gestaffelte Vielfache von 0,31 m × 0,61 m × 1,22 m
(12 Inch × 24
Inch × 48
Inch) sind. Behälter
anderer Größen können im
Einklang mit den hier erläuterten Lehren
eingesetzt werden. Zum Beispiel ist in einem Ausführungsbeispiel
(nicht dargestellt) der Behälter 110 so
bemessen, um gerade genug Kühlfluid 140 zu halten,
sodass Behälter
wie beispielsweise Fläschchen,
Teströhren,
Becher, Messzylinder oder dergleichen in den Behälter 110 zum schnellen
Einfrieren von Suspensionen mit biologischen Materialien und Kryoprotektoren
gesetzt werden können.
In weiteren Ausführungsbeispielen
ist der Behälter 110 groß genug,
um ganze Organe und/oder Organismen zum schnellen Einfrieren vollständig einzutauchen.
Es ist selbstverständlich,
dass der Behälter 110 gegebenenfalls
größer oder
kleiner gemacht werden kann, um effizient verschiedene Größen und
Mengen von einzufrierendem biologischem Material aufzunehmen. Wie
nachfolgend erläutert, wird
das biologische Material vor dem Eintauchen in den Behälter 110 mit einem
Kryoprotektor behandelt.
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Der
Behälter 110 hält das Kühlfluid 140.
In einem Ausführungsbeispiel
ist das Kühlfluid
eine lebensmittelverträgliche
gelöste
Substanz. Gute Beispiele von lebensmittelverträglichen Fluiden sind jene,
die auf Propylenglykol, Natriumchloridlösungen oder dergleichen basieren.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel
ist das Kühlfluid
selbst ein Kryoprotektor, wie beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO), Ethylenglykol,
Propylenglykol, Polyethylenglykol oder dergleichen. Man beachte,
dass in manchen Fällen
der Kryoprotektor selbst ein lebensmittelverträgliches Fluid ist. In weiteren
Ausführungsbeispielen
werden weitere Fluide und bevorzugt gelöste Substanzen als Kühlfluide
verwendet. Während
verschiedene Behälter
benutzt werden können,
um das biologische Material zu halten, sehen einige Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung vor, das biologische Material zum schnellen
und effektiven Einfrieren direkt in das Kühlfluid einzutauchen. Ein solches
direktes Eintauchen kann die Kryokonservierung mancher Gewebe und
Organe vereinfachen.
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Um
das biologische Material unter Vermeidung der Bildung von Eiskristallen
einzufrieren, zirkuliert ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung das Kühlfluid 140 entlang
dem einzufrierenden biologischen Material mit einer relativ konstanten Rate
von 115 Litern pro Minute pro Meter (35 Liter pro Minute pro Fuß) des Kühlfluids,
das in einem Bereich von nicht mehr als 0,61 m (24 Inch) breit auf
1,22 m (48 Inch) tief enthalten ist. Die notwendige Zirkulation wird
durch einen oder mehrere Zirkulatoren 134 wie beispielsweise
Motoren 130 bereitgestellt. In wenigstens einem Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung treiben die untergetauchten Motoren 130 Flügelräder 132 an,
um das Kühlfluid 140 entlang
dem einzufrierenden biologischen Material zu zirkulieren. Weitere
Zirkulatoren 134, einschließlich verschiedener Pumpen
(nicht dargestellt), können
im Einklang mit den Aufgaben der vorliegenden Erfindung eingesetzt
werden. Wenigstens ein Ausführungsbeispiel der
vorliegenden Erfindung erhöht
den Bereich und das Volumen, durch den das Kühlfluid zirkuliert wird, indem
wenigstens ein Zirkulator 134 zusätzlich zu den Motoren 130 eingesetzt
wird. In Ausführungsbeispielen
mit mehreren Zirkulatoren 134 werden die Fläche und
das Volumen der Kühlfluidzirkulation
in direktem Verhältnis
zu jedem zusätzlich
eingesetzten Zirkulator erhöht.
Zum Beispiel werden in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel drei zusätzliche
Zirkulatoren für
jeden Meter des Kühlfluids
(ein zusätzlicher
Zirkulator pro Fuß)
verwendet, das durch eine Fläche
von nicht mehr als 0,61 m (24 Inch) Breite auf 1,22 m (48 Inch)
Tiefe zirkuliert werden soll.
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Vorzugsweise
können
die Motoren 130 gesteuert werden, um eine konstante vorbestimmte
Geschwindigkeit des Kühlfluidstroms
entlang dem zu konservierenden biologischen Material beizubehalten,
während
gleichzeitig eine gleichmäßige Verteilung
der Kühlfluidtemperatur
innerhalb ±5°C an allen Punkten
in dem Behälter 110 gehalten
wird. Die im Wesentlichen konstante vorbestimmte Geschwindigkeit
des entlang dem biologischen Material zirkulierenden Fluids sieht
ein konstantes, gleichmäßiges Entziehen
von Wärme
vor, was die Vitrifikation des biologischen Materials während des
Einfrierens erlaubt. In einem Ausführungsbeispiel werden die Kühlfluideigenschaften,
wie beispielsweise Viskosität, Temperatur
usw., gemessen und verarbeitet, und Steuersignale werden zu den
Motoren 130 geschickt, um die Drehzahl oder das Drehmoment
der Flügelräder 132 zu
erhöhen
oder zu verringern, falls erforderlich. In anderen Ausführungsbeispielen
sind die Motoren 130 so konstruiert, dass sie eine gegebene Drehgeschwindigkeit über einen
Bereich von Fluidzuständen
halten. In einem solchen Fall wird das Drehmoment oder die Drehzahl
der Flügelräder 132, die
durch die Motoren 130 vermittelt werden, nicht extern gesteuert.
Zu beachten ist die Tatsache, dass keine externen Pumpen, Wellen
oder Riemenscheiben benötigt
werden, um ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung zu realisieren. Motoren 130 oder
weitere Zirkulatoren 134 sind direkt in das Kühlfluid 140 eingetaucht.
Als Ergebnis friert das Kühlfluid 140 nicht
nur das in den Tank 110 gesetzte biologische Material ein,
sondern das Kühlfluid 140 sieht
auch eine Kühlung
für die
Motoren 130 vor.
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Die
Wärmetauschspule 120 ist
vorzugsweise eine „Mehrpfad-Spule", die es im Gegensatz
zu herkömmlichen
Kältespulen,
in denen das Kältemittel
im Allgemeinen auf einen oder zwei kontinuierliche Pfade beschränkt ist,
dem Kältemittel
erlaubt, durch mehrere Pfade (d.h. drei oder mehr Pfade) zu strömen. Außerdem ist
die Spulengröße in direkter
Beziehung zur Querschnittsfläche,
die die gemessene Menge des Kühlfluids 140 enthält. Zum
Beispiel ist in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Behälter 110 0,31
m (1 Fuß)
lang, 0,61 m (2 Fuß)
tief und 1,22 m (4 Fuß)
breit und verwendet eine Wärmetauschspule 120,
die 0,31 m (1 Fuß)
auf 0,61 m (2 Fuß)
ist. Falls die Länge
des Behälters 110 auf
6,10 m (20 Fuß)
erhöht
ist, dann wird auch die Länge
der Wärmetauschspule 120 auf
6,10 m (20 Fuß)
erhöht.
Als Ergebnis kann die Wärmetauschspule 120 zu
etwa 50% der Größe einer
herkömmlichen
Spule gemacht werden, die zum Bewältigen der gleichen Wärmelast erforderlich
ist. Die Zirkulatoren 134 wie beispielsweise Motoren 130 zirkulieren
das abgekühlte
Kühlfluid 140 über das
einzufrierende biologische Material und transportieren dann das
wärmere
Kühlfluid
zur Wärmetauschspule 120,
die in das Kühlfluid 140 untergetaucht
ist. In wenigstens einem Ausführungsbeispiel ist
die Wärmetauschspule 120 so
konstruiert, dass sie nicht weniger als die gleiche Wärmemenge
von dem Kühlfluid 140 entfernt,
wie dieses dem einfrierenden biologischen Material entzieht, wodurch
die Temperatur des Kühlfluids 140 in
einem vorbestimmten Bereich gehalten wird. Die Wärmetauschspule 120 ist
mit der Kälteeinheit 190 verbunden,
die die Wärme
aus der Wärmetauschspule 120 und
dem System entfernt.
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In
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist
die Kälteeinheit 190 so
konstruiert, dass sie zu der Lastanforderung der Wärmetauschspule 120 passt, sodass
die Wärme
dem System in einer ausgeglichenen und effizienten Weise entzogen
wird, was in einem kontrollierten, schnellen Einfrieren eines Materials
resultiert. Die Effizienz der Kälteeinheit 190 steht direkt
mit dem Verfahren in Zusammenhang, das zum Steuern von Saugdrücken durch
das effiziente Versorgen der Wärmetauschspule 120 und
die effiziente Ausgabe der in der Kälteeinheit 190 verwendeten
Kompressoren eingesetzt wird.
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Diese
Methodik erfordert die Einhaltung sehr enger Toleranzen zwischen
den Temperaturen des Kältemittels
und des Kühlfluids 140 und
zwischen der Kondensationstemperatur und der Umgebungstemperatur.
Diese Temperaturkriterien erlauben zusammen mit der Konstruktion
der Wärmetauschspule 120 ein
effizienteres Beschicken der Wärmetauschspule 120,
was seinerseits ein Beschicken des Kompressors in einer ausgeglichenen
und eng gesteuerten Weise erlaubt, um über 25% mehr Leistung aus den Kompressoren
zu erzielen, als jene, die als Standardauslegung der Kompressorhersteller
akzeptiert wird.
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Man
beachte, dass in dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel
die Kälteeinheit 190 ein
externes, entfernt positioniertes Kältesystem ist. In einem weiteren
Ausführungsbeispiel
(nicht dargestellt) ist jedoch die Kälteeinheit 190 in
einem weiteren Abschnitt des Behälters 110 integriert.
Es ist selbstverständlich,
dass verschiedene Konfigurationen für die Kälteeinheit 190 für gewisse
Konfigurationen der Kühleinheit 100 mehr
oder weniger geeignet sein können.
Falls zum Beispiel der Behälter 110 extrem groß ist, ist
eine separate Kälteeinheit 190 erwünscht, während ein
tragbares Ausführungsbeispiel von
einer integrierten Kälteeinheit 190 profitieren kann.
Eine solche Integration ist nur durch die Wirksamkeiten möglich gemacht,
die durch Realisieren der hier erläuterten Grundsätze und
insbesondere die Verwendung einer kleineren Wärmetauschspule erzielt werden.
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Aufgrund
der Kälteeinheit 190 und
der Wärmetauschspule 120 wird
in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
das Kühlfluid
auf eine Temperatur zwischen –20°C und -30°C gekühlt, mit
einer Temperaturdifferenz im Kühlfluid
von weniger als etwa ±5°C. In weiteren
Ausführungsbeispielen
wird das Kühlfluid auf
Temperaturen außerhalb
des Bereichs von –20°C bis –30°C gekühlt, um
die Rate zu steuern, mit welcher eine Substanz eingefroren werden
soll. Weitere Ausführungsbeispiele
steuern die Zirkulationsrate des Kühlfluids, um gewünschte Einfrierraten
zu erzielen. Alternativ kann das Volumen des Kühlfluids verändert werden,
um eine spezielle Einfrierrate zu erleichtern. Es ist selbstverständlich,
dass verschiedene Kombinationen der Kühlfluid-Zirkulationsrate, des Kühlfluidvolumens
und der Kühlfluidtemperatur
benutzt werden können,
um gewünschte
Einfrierraten zu erzielen.
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Bezug
nehmend nun auf 2 wird ein Ausführungsbeispiel
des Kühlsystems 100 erläutert, das zum
Einfrieren relativ großer
Mengen von biologischem Material geeignet ist. Die Bezugsziffern
in 2, die gleich, ähnlich oder identisch zu den
Bezugsziffern in 1 sind, geben gleiche, ähnliche oder
identische Merkmale an. Der Behälter 110 enthält das Kühlfluid 140,
in das das Gestell 150 abgesenkt werden kann. Das Gestell 150 ist
mit einem Gestellträger 210 bewegbar
verbunden, sodass das Gestell 150 angehoben oder abgesenkt
werden kann, um die Platzierung der Substanzen in den Behälter 110 zu
erleichtern.
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In
Gebrauch wird das einzufrierende biologische Material in Fächer 155 des
Gestells 150 gesetzt. Vorzugsweise sind die Fächer 155 aus
Draht, Maschen oder dergleichen konstruiert, sodass das Kühlfluid 140 frei über, unter
und/oder um darauf gesetzte Gegenstände zirkulieren kann. Vorzugsweise senkt
der Gestellträger 210 das
Gestell 150 in den Behälter 110 ab,
wenn das Kühlfluid
einmal auf eine gewünschte
Temperatur abgekühlt
ist, um die Fächer in
das Kühlfluid 140 unterzutauchen.
Das Absenken des Gestells 150 kann manuell oder unter Verwendung
verschiedener, dem Fachmann bekannter Zahnrad-, Ketten- und/oder
Riemenscheibenkonstruktionen erreicht werden. Die Zirkulatoren 134 zirkulieren
das Kühlfluid 140 über die
in den Fächern 155 gesetzten
Substanzen, um ein schnelles und kontrolliertes Einfrieren vorzusehen.
Es ist selbstverständlich,
dass weitere Anordnungen zum Eintauchen des biologischen Materials
in den Behälter 110 eingesetzt
werden können,
und dass die Verwendung eines automatischen Absenksystems nicht
notwendigerweise zum Gebrauch in allen Fällen bevorzugt ist.
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Bezug
nehmend nun auf 3 ist ein Verfahren gemäß einem
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung veranschaulicht und allgemein durch die
Bezugsziffer 300 bezeichnet. Das dargestellte Verfahren
beginnt bei Schritt 310, wo das Kühlfluid entlang einer Wärmetauschspule
zirkuliert wird. Die Wärmetauschspule
ist wie oben erläutert
mit einem Kältesystem
wirkverbunden und wird benutzt, um die Temperatur des Kühlfluids
zu verringern, wenn das Kühlfluid
entlang der Wärmetauschspule zirkuliert
wird. In Schritt 320 wird die Temperatur des Kühlfluids
gemessen, und das Verfahren geht weiter zu Schritt 330,
wo bestimmt wird, ob die Temperatur des Kühlfluids in einem optimalen
Temperaturbereich liegt. Dieser optimale Kühlfluid-Temperaturbereich kann für verschiedene
Anwendungen unterschiedlich sein, jedoch liegt ein bevorzugter optimaler
Temperaturbereich für
viele Anwendungen zwischen –20°C und –30°C.
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Falls
bestimmt wird, dass die Kühlfluidtemperatur
nicht in einem optimalen vorbestimmten Temperaturbereich liegt,
wird Schritt 335 durchgeführt. In Schritt 335 wird
die Wärmetauschspule
durch eine Kälteeinheit
gekühlt,
und das Verfahren kehrt zu Schritt 310 zurück, in dem
das Kühlfluid
entlang der Wärmetauschspule
zirkuliert wird, um die Temperatur des Kühlfluids zu verringern. Vorzugsweise
werden die Schritte 310, 320, 330 und 335 fortlaufend
durchgeführt,
bis das Kühlfluid
den optimalen Temperaturbereich erreicht.
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Die
Temperatur des zum Einfrieren des biologischen Materials benutzten
Kühlfluids
ist ein wichtiges Element wenigstens eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden
Erfindung. Um eine Vitrifikation mittels herkömmlicher Prozesse zu erreichen, wird
das biologische Material im Allgemeinen in flüssigem Stickstoff mit einer
Temperatur von –196°C abgeschreckt.
Eine derart drastische Temperaturänderung über eine sehr kurze Zeitdauer
gefriert das Wasser in den Zellstrukturen so schnell, dass Eiskristalle keine
Chance haben, sich zu bilden. Jedoch kann das Einfrieren von biologischem
Material durch Abschrecken in flüssigem
Stickstoff Spannungsbrüche in
Zellmembranen verursachen, wodurch die Brauchbarkeit des Abschreckens
in flüssigem
Stickstoff zur Kryokonservierung beschränkt ist. Da die in einem bevorzugten
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung benutzten Temperaturen zwischen –20°C und –30°C liegen,
werden Spannungsbrüche
aufgrund Temperaturveränderung
minimiert und die Vitrifikation kann mit viel weniger Schädigung der
Zellmembranen erreicht werden.
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Während das
Kühlfluid
auf die geeignete Temperatur gekühlt
wird, werden die einzufrierenden biologischen Materialien in Schritt 305 zum
Einfrieren präpariert.
Wie oben erwähnt,
enthält
das biologische Material, ohne darauf beschränkt zu sein, lebensfähige einzelne
Zellen, Gewebe und Organe, Nukleinsäuren und andere biologisch
aktive Moleküle.
Gegebenenfalls werden die Materialien einer chemischen Präparation
vor dem Einfrieren unterzogen. Das chemische Präparieren des biologischen Materials
kann eine Vorbehandlung des biologischen Materials mit Mitteln (Stabilisatoren)
enthalten, die die Lebensfähigkeit
der Zellen erhöhen,
indem schädliche
Substanzen entfernt werden, die von den Zellen während des Wachstums oder Zellensterbens
abgeschieden werden. Brauchbare Stabilisatoren enthalten solche Chemikalien
und chemischen Verbindungen, von denen viele dem Fachmann bekannt
sind, die hochreaktive und schädliche
Moleküle
wie beispielsweise Sauerstoffradikale maskieren.
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Das
chemische Präparieren
des biologischen Materials kann auch einen Akklimatisierungsschritt
enthalten (nicht dargestellt). Während
der oder eine gewisse Zeit nach der Vorbehandlung kann das zu konservierende
biologische Material auf eine Temperatur akklimatisiert werden,
die gegenüber
Kultivierungstemperaturen reduziert ist, aber noch über dem Einfrieren
liegt. Dies kann helfen, das biologische Material für den Kryokonservierungsprozess
zu reduzieren, indem der zellulare Stoffwechsel verlangsamt und
der Schock des schnellen Temperaturübergangs reduziert werden.
Man beachte jedoch, dass ein Akklimatisierungsschritt nicht immer
erforderlich ist, um die vorliegende Erfindung auszuüben.
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In
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel enthält das chemische
Präparieren
des biologischen Materials zum Einfrieren ein Füllen des biologischen Materials
mit einem Kryoprotektor. Das Füllen
beinhaltet im Allgemeinen die Gleichgewichtseinstellung des biologischen
Materials in einer Lösung
eines oder mehrerer Kryoprotektoren. Während des Füllens verwendete Substanzen
können
als Sättigungsmittel
bezeichnet werden. Brauchbare Sättigungsmittel
können
ein oder mehrere Dehydratisierungsmittel, Imprägnierungs- und Nichtimprägnierungsmittel
sowie osmotische Mittel enthalten. Sowohl Imprägnierungsmittel wie beispielsweise
DMSO und Ethylenglykol als auch eine Kombination von imprägnierenden
und nicht-imprägnierenden
osmotischen Mitteln wie beispielsweise Fruktose, Sukrose oder Glukose und
Sorbitol, Manitol oder Glycerol können verwendet werden. Es ist
selbstverständlich,
dass weitere geeignete Kryoprotektoren im Einklang mit den Aufgaben
der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
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Nachdem
das Kühlfluid
eine geeignete Temperatur erreicht, wird Schritt 315 durchgeführt, in
dem das chemisch präparierte
biologische Material in das Kühlfluid
eingetaucht wird. Wie früher
erwähnt,
kann das biologische Material in einem Behälter gehalten oder direkt in
das Kühlfluid
gesetzt werden. Das Verfahren geht dann weiter zu Schritt 337,
in dem ein Zirkulator wie beispielsweise eine untergetauchte Motor/Flügelradanordnung
oder Pumpe verwendet wird, um das Kühlfluid mit der zuvor erläuterten
Geschwindigkeit entlang dem eingetauchten biologischen Material
zu zirkulieren. Da das Kühlfluid
durch das biologische Material strömt, wird Wärme aus dem Material entfernt,
das auf einer höheren
Temperatur als der Temperatur des Kühlfluids liegt, und auf das
Kühlfluid übertragen,
welches die Wärme
von dem einzufrierenden biologischen Material wegtransportiert.
Gemäß wenigstens
einem Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung sollte eine im Wesentlichen konstante Zirkulation
des Kühlfluids
entlang dem einzufrierenden biologischen Material beibehalten werden, um
das präparierte
biologische Material so einzufrieren, dass das präparierte
Material vitrifiziert wird.
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Nachdem
das Kühlfluid
entlang dem einzufrierenden biologischen Material zirkuliert ist,
wird Schritt 339 durchgeführt. Schritt 339 stellt
die Geschwindigkeit des Kühlfluids
notwendigenfalls ein, um Veränderungen
der Viskosität,
Temperatur und dergleichen des Kühlfluids
zu berücksichtigen.
Vorzugsweise wird die Geschwindigkeit des Kühlfluids durch Einstellen der
durch einen oder mehrere Zirkulatoren bereitgestellten Kraft konstant
gehalten.
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Die
in 3 veranschaulichten Schritte sind in einer fortlaufenden
Reihenfolge gezeigt und erläutert.
Das dargestellte Verfahren ist jedoch von einer Natur, bei welcher
einige oder alle Schritte fortlaufend durchgeführt werden und in einer anderen
Reihenfolge durchgeführt
werden können.
Zum Beispiel verwendet wenigstens ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung einen einzelnen Umlaufmotor, um das Kühlfluid zu zirkulieren. In
einem solchen Ausführungsbeispiel
wird das Kühlfluid
in Schritt 310 entlang einer Wärmetauschspule zirkuliert und
in Schritt 337 gleichzeitig entlang dem zu konservierenden
biologischen Material. Außerdem
misst ein Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung die Temperaturen, Viskositäten des
Kühlfluids
und weitere Fluideigenschaften kontinuierlich und an mehreren Stellen
in dem System.
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In
einem noch weiteren Ausführungsbeispiel werden
einige Eigenschaften des Kühlfluids
nicht direkt gemessen. Stattdessen wird die Veränderung der Kühlfluideigenschaften
indirekt aus der Drehzahl eines Zirkulationsmotors bestimmt. Falls
der Motor langsamer dreht, dann kann dem Motor zusätzliche Energie
zugeführt
werden, um den Motor mit der gewünschten
Drehzahl zu drehen, wodurch die Veränderung der Kühlfluideigenschaften
kompensiert wird. In wenigstens einem Ausführungsbeispiel ist ein Motor
so konstruiert, dass er eine im Wesentlichen konstante Drehzahl
beibehält.
Diese im Wesentlichen konstante Motordrehzahl resultiert in einer
im Wesentlichen konstanten Zirkulationsrate des Kühlfluids.
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Ein
Test eines Ausführungsbeispiels
der vorliegenden Erfindung wurde durchgeführt, in dem 5 ml Wasser in
einem Messbehälter
eingefroren wurden. Beim Einfrieren gab es weniger als 1 % Anstieg
des Gesamtvolumens, viel weniger als beim herkömmlichen Einfrieren erwartet.
In einem weiteren Test wurde Eis in einer herkömmlichen Gefriervorrichtung
sowie in einem Kühlsystem
gemäß einem
bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung eingefroren. Nach
dem Einfrieren wurde das Eis unter einem Dunkelfeldmikroskop untersucht.
Wie erwartet, zeigte das herkömmliche
Eis ein kristallines Muster, wohingegen das gemäß den Grundsätzen der
vorliegenden Erfindung eingefrorene Eis keine leichte Verschiebung
zeigte, was wenig bis keine Eiskristallbildung anzeigt.
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Siehe
nun 4, in welcher Versuchsergebnisse gezeigt sind,
die eine Zellschädigung
nach einem Einfrieren von nicht präpariertem Pflanzengewebe (ganze,
kernlose Trauben) unter Verwendung einer Anzahl von Einfrierverfahren
vergleichen. Das Balkendiagramm 400 vergleicht die Anzahl
der einzelnen Zellen, die mittels der Verfahren B, C, D und E geschädigt wurden,
gegenüber
einer Kontrollgruppe A. Das Verfahren A war eine frische, niemals
eingefrorene Kontrolle, das Verfahren B benutzte eine herkömmliche
Gefriervorrichtung, um auf eine Temperatur von –20°C einzufrieren, das Verfahren
C verwendete eine ultralangsame Gefriervorrichtung, um Zellen auf
eine Temperatur von –80°C einzufrieren, Verfahren
D benutze flüssigen
Stickstoff, um Zellen auf eine Temperatur von –196°C einzufrieren, und Verfahren
E benutzte ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung, um Zellen auf eine Temperatur von –25°C einzufrieren.
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Das
Experiment, dessen Ergebnisse in dem Balkendiagramm 400 gezeigt
sind, verwendete Daten von nicht-präpariertem, nicht mit Kryoprotektoren behandeltem
Pflanzengewebe. Die Ergebnisse zeigen klar, wie in 4 veranschaulicht,
die Überlegenheit
des gemäß einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung durchgeführten Verfahrens. Keine der
aus der Kontrolle untersuchten Zellen, Verfahren A, zeigte eine
Schädigung,
sodass die in den anderen Verfahren zu sehende Schädigung allein
auf der Einfriermethodik beruhte. Gemäß dem Test wurden 40% der mittels
Verfahren B (herkömmliches
Einfrieren) eingefrorenen Zellen nach dem Auftauen geschädigt, etwa
50% der Zellen waren nach dem Einfrieren und Auftauen mit dem Verfahren
C (ultralangsame Gefriervorrichtung) geschädigt, und etwa 60% der Zellen
waren nach dem Einfrieren und Auftauen mit dem Verfahren D (flüssiger Stickstoff)
geschädigt.
Signifikant waren nur 20% der mit dem Verfahren E (ein bevorzugtes
Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung) eingefrorenen Zellen beim Auftauen geschädigt. Man
beachte, dass die Schädigung
durch Prüfen
der Pflanzenzellwand unter Vergrößerung beurteilt
wurde.
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Siehe
nun 5, in der Versuchsergebnisse des Überlebens
von Zellen (Lebensfähigkeit)
und der Zellfunktion, gemessen als Zellbeweglichkeit, nach einem
Einfrieren von chemisch präparierten, menschlichen
Spermazellen als Vergleich eines herkömmlichen Einfrierverfahrens
und eines Einfrierverfahrens gemäß einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung gezeigt sind. Zellen für beide
Verfahren wurden zum Einfrieren mittels einer Standard-Industrietechnik
chemisch präpariert. Das
Balkendiagramm 500 vergleicht die Zellenlebensfähigkeit
und -beweglichkeit nach dem Einfrieren unter Verwendung der zwei
Verfahren. Das Verfahren A benutzte ein herkömmliches Verfahren des Aufhängens der
Zellen in Stickstoffnebel für
30 Minuten und dann Eintauchen der Zellen in flüssigen Stickstoff. Das Verfahren
B benutzte ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung, um die Zellen auf eine Temperatur von –25°C einzufrieren.
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Das
Experiment, dessen Ergebnisse in dem Balkendiagramm 500 gezeigt
sind, benutzte chemisch präparierte
menschliche Spermien. Die durch das Balkendiagramm 500 veranschaulichten
Ergebnisse zeigen klar die Überlegenheit
des gemäß einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung durchgeführten Verfahrens. Gemäß dem Test
blieben nur 40 Prozent der mit dem Verfahren A (herkömmliches
Verfahren) eingefrorenen Zellen beim Auftauen lebensfähig und
nur etwa 20 Prozent der Zellen behielten ihre Beweglichkeit. Jedoch waren
75 Prozent der mit dem Verfahren B eingefrorenen Zellen beim Auftauen
lebensfähig,
und etwa 45 Prozent der Zellen waren noch beweglich. Man beachte,
dass die Lebensfähigkeit
der Zellen mittels eines Lebend/Tot-Färbens beim Auftauen beurteilt
und die Beweglichkeit durch direkte Beobachtung der Zellen unter
Vergrößerung bestimmt
wurde.
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Siehe
nun 6, in der Versuchsergebnisse des Überlebens
von Zellen (Lebensfähigkeit)
nach dem Einfrieren von chemisch präparierten schweineähnlichen
Muskel zellen als Vergleich eines herkömmlichen Einfrierverfahrens
und eines Einfrierverfahrens gemäß einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung gezeigt sind. Zellen für beide
Verfahren wurden zum Einfrieren mit zwei Konzentrationen von Kryoprotektoren
chemisch präpariert.
Das Balkendiagramm 600 vergleicht die Lebensfähigkeit
der Zellen nach dem Einfrieren für
jedes der Verfahren. Das Verfahren A verwendet eine 10-prozentige
Konzentration des Kryoprotektors, verbunden mit dem herkömmlichen
Verfahren des Eintauchens der Zellen in flüssigen Stickstoffs, das Verfahren
B verwendet eine 1-prozentige Konzentration des Kryoprotektors,
verbunden mit dem herkömmlichen
Verfahren des Eintauchens der Zellen in flüssigen Stickstoff. Das Verfahren
C verwendet eine 10-prozentige Konzentration des Kryoprotektors,
verbunden mit einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung, um die Zellen auf eine Temperatur von –25°C einzufrieren,
und das Verfahren D verwendet eine 1-prozentige Konzentration des
Kryoprotektors, verbunden mit einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung, um die Zellen auf eine Temperatur von –25°C einzufrieren.
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Das
Experiment, dessen Ergebnisse in dem Balkendiagramm 600 gezeigt
sind, benutzte chemisch präparierte
schweineähnliche
Muskelzellen. Die Ergebnisse des Experiments zeigen klar, wie in 6 veranschaulicht,
die Überlegenheit
des gemäß einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung durchgeführten Verfahrens. Gemäß dem Test
blieben etwa 40% der Zellen, die mittels entweder der Verfahren
A (herkömmliches
Verfahren mit 10 Prozent Kryoprotektor) oder B (herkömmliches
Verfahren mit 1 Prozent Kryoprotektor) eingefroren wurden, beim
Auftauen lebensfähig
blieben. Jedoch blieben über
80% der mit beiden Verfahren C (ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung mit 10 Prozent Kryoprotektor) oder D
(ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung mit 1 Prozent Kryoprotektor) eingefrorenen
Zellen beim Auftauen lebensfähig. Man
beachte, dass die Lebensfähigkeit
der Zellen mittels eines Lebend/Tot-Einfärbens beim Auftauen beurteilt
wurde.
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Siehe
nun 7, in welcher Versuchsergebnisse des Überlebens
von Zellen (Lebensfähigkeit) nach
dem Einfrieren chemisch präparierter
Mäuseembryos
als Vergleich eines Einfrierverfahrens des Standes der Technik und
eines Einfrierverfahrens gemäß einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung gezeigt sind.
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Zellen
für beide
Verfahren wurden zum Einfrieren unter Verwendung einer Standard-Industrietechnik
chemisch präpariert.
Das Balkendiagramm 700 vergleicht die Embryo-Lebensfähigkeit
nach dem Einfrieren mittels der zwei Verfahren. Das Verfahren A
benutzte ein herkömmliches
Verfahren einer kontrollierten Einfrierrate in Stickstoffnebel gefolgt
durch das Eintauchen der Embryos in flüssigen Stickstoff. Das Verfahren
B benutzte ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung, um die Zellen auf eine Temperatur von –25°C einzufrieren, gefolgt
von dem Eintauchen in flüssigen
Stickstoff.
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Das
Experiment, dessen Ergebnisse in dem Balkendiagramm 700 gezeigt
sind, benutzte Daten von chemisch präparierten Mäuseembryos. Die Ergebnisse,
wie sie in 7 veranschaulicht sind, zeigen
klar die Überlegenheit
des gemäß einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung durchgeführten Verfahrens. Gemäß dem Test blieben
nur etwa 50% der mit Verfahren A (herkömmliches Verfahren) eingefrorenen
Embryos beim Auftauen lebensfähig.
Jedoch blieben über
90% der mit Verfahren B eingefrorenen Embryos beim Auftauen lebensfähig. Man
beachte, dass die Lebensfähigkeit der
Embryos beim Auftauen mittels Lebend/Tot-Einfärbens
beurteilt wurde.
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Weil
die vorliegende Erfindung biologisches Material so einfrieren kann,
dass das Material vitrifiziert wird und die Bildung von Spannungsbrüchen in den
Zellmembranen minimiert ist, können
verschiedene Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung in medizinischen Bereichen wie beispielsweise Hauttransplantation,
Hornhautlagerung, Kreislaufgefäßeinlagerung,
Einfrieren von Transplantationsgeweben, Unfruchtbarkeitsbehandlung
sowie die Untersuchung einer molekularen Regenerationskrankheit (Krebs)
Anwendung finden. Alternativ kann die vorliegende Erfindung in der
Viehwirtschaft zur Kryokonservierung von Samen, Oozyten und Embryos
Verwendung finden.
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In
der vorherigen detaillierten Beschreibung wurde Bezug genommen auf
die beiliegenden Zeichnungen, die einen Teil hiervon bilden und
in denen beispielhaft spezielle Ausführungsbeispiele gezeigt sind,
in denen die Erfindung ausgeübt
werden kann.