KR20230123955A - 주변 온도 지질 입자 저장 시스템 및 방법 - Google Patents

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Abstract

입자, 지질 입자, 지질 입자 조성물 및 지질 입자를 포함하는 mRNA 백신 조성물의 비-극저온 유리화 방법이 개시되며, 공정은 모세관 네트워크 상의 유리화 매질 내의 지질 입자를 데시케이션 챔버 내에 제공하는 단계 및 열 에너지 및 낮춰진 대기압 둘 다를 제공하여 유리화 매질 또는 지질 입자가 낮춰진 대기압의 결과로서 비등 또는 극저온 온도를 겪지 않으면서 급속 유리화를 제공하는 단계를 포함한다. 지질 입자는 추후에 주변 또는 보다 고온에서 장기간 저장 후에 재구성되고 여전히 구조적 온전성 및 활성을 유지할 수 있다.

Description

주변 온도 지질 입자 저장 시스템 및 방법
관련 출원
본 출원은 2020년 11월 19일에 출원된 미국 가출원 63/115,943, 및 2020년 12월 8일에 출원된 미국 가특허출원 63/122,792를 우선권 주장하며, 이들 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 개시내용은, 콜드-체인 저장 온도에 대한 요건 없이, 임의로 하나 이상의 리보핵산 내에서의 것을 포함한, 지질 입자의 제조 및 저장 방법에 관한 것이다.
리보핵산, 또는 RNA는 염색체에서 코딩된 유전자가 발현된 단백질에 대해 작동화되는 도구를 제공하며 생물학에서 중요한 핵심 역할을 한다. 아마도 가장 중요한 리보핵산은, 부모 DNA 염색체로부터 복제물로서 조립되고, 엑손에 대하여 절제되고, 번역 기계로 이동되어 발현된 단백질로서 판독되고 출력되는 메신저 RNA (mRNA)일 것이다.
단백질 출력 제어에 있어 이 핵심 역할은 mRNA를 세포 또는 실로 유기체 내의 전체 시스템을 조작하기 위한 흥미롭고 강렬한 지점으로 만들었다. 특히 흥미로운 것은, 세포 내 및 궁극적으로 특정 조직 또는 기관 내에서 신호화 경로에 영향을 미치기 위해 RNA를 증명하거나 돌연변이 및/또는 과발현된 형태의 내인성 단백질을 생성하여 외인성 유전자를 발현하도록 세포를 조작하는 것이다.
세포에 외인성 유전자에 대한 mRNA, 또는 그의 일부 또는 단편을 제공하는 것은 또한, 유기체의 면역 시스템을 프라이밍하기 위한 강렬한 수단이다. 세포가 생체 내에서 외래 mRNA를 번역하도록 강제하면 이물질 또는 항원으로서 인식되고 항체 및 기억 세포를 준비하도록 면역 시스템의 세포에 의해 프로세싱될 수 있다. 외인성 유전자 또는 그의 단편이 번역될 때 기능적으로 불활성이지만 추후 시점에 시스템에 도입될 때 병원체의 인식을 제공하는 경우, mRNA는 약독화된 또는 살아 있는 접종물을 필요로 하거나 요구하지 않으면서 유기체를 효과적으로 백신화하였다. mRNA는 비-감염성, 비-통합 플랫폼이고 정상적인 세포 과정에 의해 분해될 것이기 때문에 또한 비교적 안전하다. 광범위하게, mRNA는 백신 개발, 유전자 요법 및 단백질 대체 요법의 최전선에 있다.
mRNA의 역할 및 매력은 분명하지만, 이를 대상체에게 제공하는 것은 도전을 제시하였다. 초기에는, 생체내 세포에 mRNA를 효과적으로 전달하는 데 중점을 두었다. 대부분의 경우, 그 장애물이 해결되었고, 추가의 진보가 예상될 수 있으며, 생체내 세포로의 전달의 도전은 더 적다 (예를 들어 하기 문헌 참조: Pardi et al. Nat. Rev. Drug Discov. 17: 261-279 (2018)). 하나의 핵심 개발은 표적 세포로의 트랜스펙션 전에 mRNA의 보호이다. 이는, 종종 mRNA를 캡슐화하고 이를 분해로부터 보호하는 지질 입자의 형태로, 하나 이상의 트랜스펙션 작용제와 mRNA를 복합체화함으로써 대부분 해결되었다.
이제, 동결 초과의 온도에서 전달 벡터에서의 mRNA 또는 mRNA의 전반적인 급속한 분해 및 활성 손실로 인해 모집단의 한 부분에 mRNA를 제공할 수 있도록 하는 실용성 장애물이 그 자체로 나타난다. 제조 시점부터 투여 시점까지, 현재의 기술은 지질 입자로 패키징된 것들을 포함한 mRNA 백신을 냉장 온도 및 종종 0 훨씬 미만에서 유지할 것을 필요로 한다.
이러한 시스템을 저장하는 이전의 방법은 내용물 분해가 감소되도록 지질 입자를 데시케이션시키는 건조에 의존한다. 이는, 특히 이들 입자를 동결 데시케이션하는 데 필요한 대규모 시간척도로 인해, 임의의 급속 또는 방대 적용을 좌절시키는 상당한 비용 및 부담을 제시한다. 따라서, 효과적이지만 부담이 적은 지질 입자의 저장 방식을 확인하는 것에 대한 필요성이 관련 기술분야에 존재한다.
도면은 반드시 축척에 따른 것은 아니다; 일부 특징은 특정 구성요소의 세부사항을 나타내기 위해 과장되거나 최소화될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 특정 구조적 및 기능적 세부사항은 제한적인 것으로 해석되어서는 안 되며, 단지 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 개시내용을 다양하게 사용하도록 교시하기 위한 대표적인 근거로서 해석되어야 한다. 예시적 측면은 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 보다 완전히 이해될 것이며, 도면은 하기와 같다:
도 1a는 모세관력이 점성력보다 현저히 더 높은 상단에 배치된 액체(20)의 박막과 함께 친수성 베드(10)를 나타낸다. 이는 데시케이션될 수 있는 액체(21)의 양을 제한한다.
도 1b는 윤곽이 있는 모세관 베드를 나타내며, 여기서 데시케이션은 윤곽(30)의 피크에서 우선적으로 발생할 수 있으며, 여기서 데시케이션 동안 트로프로부터 피크를 향한 모세관 현상은 전체 유리화율을 향상시키고 도 1a에 비해 큰 샘플 부피의 유리화를 가능하게 할 수 있다.
도 1c는 윤곽이 있는 모세관(40) 내에 과도한 유체가 존재할 때 표면 패턴을 충전시키는 액체를 나타내며, 이는 감압 하에 버블 핵형성 및 비등이 지배적이 되게 하며, 이는 민감한 분자의 손상을 초래할 수 있다.
도 2a는 본원에 제공된 바와 같은 일부 측면에 따른 유리화의 일반화된 개략도를 나타낸다. 극저온 유리화는 액체 (생물학적 또는 기타 물질 함유)를 동결 대역을 우회하여 유리 전이 온도 미만으로 빠르게 냉각시킴으로써 (경로 1-2-3) 역사적으로 달성된다. 물질의 총 질량은 공정을 통해 보존된다. 유사하게, 물질의 유리화는 결정화 공정을 우회하는 빠른 데시케이션에 의해 (경로 1-5-6) 달성될 수 있다. 이 경우, 현저한 질량 손실 (주로 물)이 발생한다. 다량 물질의 극저온 유리화는 열 전달 한계로 인해 어려울 수 있고, 따라서 일반적으로 현저한 표면/부피 비율을 제공하는 바이알 내에서 수행될 수 있다. 유사하게, 빠른 데시케이션은 큰 표면/부피 비율에 의해, 또한 구체적으로 감압에서 용이해진다. 압력의 감소는 또한 액체의 비점을 감소시키고, 이는 민감한 생체분자 또는 물질을 유리화하는 동안 액체의 바람직하지 않은 비등의 위험이 있다. 1-4-6의 경로는 본 개시내용의 일부 유리화 측면의 개략도를 나타내며, 여기서 열 및 낮은 대기압의 적용은 동결 온도 노출을 피하면서 빠른 유리화를 가능하게 한다.
도 2b는 삼중점 및 그에 따라 유리화 동안 동결을 피하는 표적화된 샘플 온도 T1을 갖는 물의 삼중점의 개략도를 나타낸다.
도 3은 유리화된 유리질 물질을 형성하기 위해 진공 하에 보다 큰 부피의 액체의 빠른 데시케이션을 용이하게 하는 예시적 모세관 멤브레인을 나타낸다.
도 4는 (A)에서 모세관 멤브레인의 표면 상에 과도한 액체가 축적될 때 모세관 효과가 실현되지 않아 진공 하에 축적된 액체에서 여전히 비등이 발생할 수 있으며 이는 바람직하지 않음을 보여준다. 모세관 효과를 실현하기 위해 액체는 멤브레인의 기공 내에 수용되어 메니스커스를 형성할 수 있다. 기복이 있는 표면 상에서의 이러한 국소화는 유사하며 물질의 피크 및 트로프에 의해 형상화된다. 모세관 계면에서의 액체 분율 (ξ), 즉 액체가 차지하는 면적 (2차원 도식에서)은 모세관 증발의 최적화를 가능하게 하는 하나의 파라미터이다. 모세관 구동 증발은 액체의 점성 압력 강하가 액체-증기 계면에서 최대 모세관 압력을 능가할 때 발생한다. 액체 분율 ξ는 벌크로부터 액체-증기 계면까지의 전체 압력 강하와 관련된다. 대기압 및 열 유속 (B) 비-적용 하에 액체는 넓은 영역을 커버링하여, 액체 분율, ξ→1이 된다. 이들 조건 하에 모세관 구동 증발률은 최소이다. (C)에 나타낸 바와 같이 주변 압력의 감소는 ξ를 감소시키고, 또한 증발률을 증가시킨다. 그러나, 특정 임계 압력 강하를 넘어서면, 바람직하지 않은 핵형성 비등이 발생할 수 있다. (D)에 나타낸 바와 같이 적용된 열 유속 Q는 또한 증발률을 향상시킬 수 있지만, 액체의 공급 측면으로부터 모세관 채널로 열이 적용될 때 바람직하지 않은 필름 비등의 위험이 존재한다. (E)에 나타낸 바와 같이 모세관 메니스커스의 표면으로부터의 열 유속의 적용은, 필름 비등의 위험을 현저히 감소시킨다. (F)에 나타낸 바와 같이 카운터 구배 방식으로 적용되는 큰 ΔP 및 Q는 기공에 한정된 액체 메니스커스, 즉 액체 분율 ξ << 1 (예를 들어 ~.25)로 이어져, 비등을 피하면서 최고 증발률을 제공한다. 따라서, 표면과 벌크 액체 사이의 온도 구배의 유지는, 빠른 증발이 달성될 수 있는, (F)에 예시된 바와 같은 모세관 증발로 이어진다. 액체 수준이 모세관 멤브레인 내로 후퇴함에 따라, 압력 구배 및 온도 구배가 유지되는 한 모세관 증발 현상이 여전히 실현된다.
도 5는 4% BSA, 15% 트레할로스 이수화물, 0.75% 글리세롤, 2% 트윈(Tween)-20, 및 물을 함유하는 액체로 로딩된 다양한 치수의 유리 멤브레인에 대한 유리화 결과를 나타낸다. 멤브레인의 mm2 당 액체 로딩은 모든 경우에 0.316 ml에서 유지되었다. 케이스 1의 경우, 멤브레인을 0.25 인치 직경 원으로 절단하고, 각각에 10 μl 액체를 로딩하였다. 480 μl를 함유하는 총 48개의 샘플을 진공 챔버 내부의 가열된 (37℃) 와이어 메쉬 상에 로딩하였다. 케이스 2의 경우, 각각 470 μl 액체를 함유하는 3개의 긴 멤브레인 스트립 (240 mm x 6.23 mm)을 가열된 와이어 메쉬 상에 로딩하였다. 케이스 3의 경우, 1700 μl 액체를 함유하는 단일 스트립 (240 mm x 22 mm)을 활용하였다. 챔버를 29.5 mmHg로 비웠다. 온도-시간 플롯은 유리화 공정의 스테이지를 나타낸다. 비우기 공정 개시시, 멤브레인의 스캐폴드가 대부분 액체를 함유하면서 압력이 빠르게 강하하고 예상과 같이 압력 강하와 함께 온도가 떨어진다. 와이어 메쉬/베드로부터의 공급된 열 유속은 동결 체제로의 스캐폴드 온도의 추가 강하를 막는다. 동결점은 유리화 부형제/액체의 제제화에 따라 영하의 온도까지 확장될 수 있음을 인지해야 한다. 동결을 막는 것 이외에도, 베드로부터의 공급된 열 유속은 또한 상기에 예시된 바와 같이 (도 4F) 감압 하에 액체의 비등을 막으면서 모세관 증발을 용이하게 한다. 스캐폴드로부터 수분이 증발함에 따라, 온도가 베드 온도에 도달할 때까지 상승한다. 열 유속은 스캐폴드 온도가 세트 온도, 통상적으로 베드 온도를 초과하지 않도록 제어된다. 도 5로부터 보이는 바와 같이, 멤브레인 스캐폴드 온도가 베드 온도에 도달하는 데 걸리는 시간은 스캐폴드 구성 뿐만 아니라 그에 로딩된 액체의 양에 따라 달라진다. 베드 온도에 도달하는 데 걸리는 시간은 1차 유리화 시간의 척도이며, 이는 대부분의 액체가 이 기간 동안 증발됨을 의미한다. 그러나, 데시케이션 공정은 일부 잔류 수분을 제거하기 위해 여전히 이 기간을 넘어 연장될 수 있고, 이는 2차 데시케이션이라 불릴 수 있으며, 이는 모세관 현상에 의존하지 않는다. 공정 파라미터 및 스캐폴드 기하구조는 주어진 시간에 1차 데시케이션 공정을 겪을 수 있는 액체의 부피를 최적화하도록 선택된다. 일반적으로, 도 2a에 나타낸 결정 침전 상 경계를 우회하고 유리 형성을 보장하기 위해서는 보다 빠른 데시케이션 속도가 바람직하다. 그러나, 액체의 화학, 친수성, 다공성 및 치수 등의 멤브레인 특징에 따라 달라지는, 유리화가 보장되는 임계 속도가 존재한다.
도 6a는, 데시케이션 장치 자체가 윤곽이 있는 벽을 특징으로 하는 본 개시내용의 하나의 예시적 측면을 나타낸다. 데시케이션 장치는 실린더 형상으로 롤링된 친수성 모세관 멤브레인으로 형성될 수 있다. 실린더는 도 4와 유사한 멤브레인 내에 유리화 매질을 하우징함으로써 개선된 유리화를 촉진할 수 있다.
도 6b는, 다공성 물질 멤브레인이 진공에 작동가능하게 연결되고 멤브레인 상에 배치된 샘플의 유리화를 위해 밀봉될 수 있는 실린더 내에 배치되어 있고, 멤브레인이 유리화를 위한 모세관 기판을 제공하는 것인, 본 개시내용의 추가의 측면을 나타낸다.
도 7a는, 모세관 증발을 촉진하고 스캐폴드 온도가 동결 체제로 떨어지는 것을 막도록 지향성 열 유속을 제공하기 위해 실린더형 데시케이션 장치가 가열된 블록 내에 배치되어 있는, 본 개시내용의 하나의 예시적 측면을 나타낸다. 가열 방법은 성질상 전도성 또는 방사성일 수 있다.
도 7b는, 실린더의 내부로부터 추가의 열 공급원이 제공되어 있는, 본 개시내용의 하나의 예시적 측면을 나타낸다. 가열 방법은 성질상 전도성 또는 방사성일 수 있다. 열 유속은 멤브레인의 단지 하나의 표면 또는 양쪽 표면으로부터 제공될 수 있다.
도 8은 친수성 물질로 제조된 멤브레인을 사용하여 생성된 개선된 유리화를 나타낸다. 원래 소수성인 멤브레인을 친수성으로 만들기 위해 저온 플라즈마로 처리하였다. 멤브레인 상의 약물 제제 현탁시, 액체는 거의 구형의 액적을 형성한 반면 (좌측 상단), 친수성 멤브레인은 액체가 모세관 채널로 유동하는 것을 가능하게 하였다. 유리화 공정 동안 소수성 멤브레인 상의 액체 액적은 먼저 비등되고 이어서 동결된 반면, 친수성 멤브레인 상의 액체는 급속히 유리화되어 유리질 단일체를 형성하였다. 진공의 해제시, 동결된 액적은 다시 액체가 되었지만, 부분적 수분 손실로 인해 크기가 감소하였다. 유리화에 대한 모세관 보조 증발의 효능은 친수성 멤브레인 활용시 명백하다.
도 9는 예시적 2주 연구 과정에서 mRNA 샘플 상의 유리화의 평가에 대한 개요를 나타낸다. mRNA를 유리화하거나 유리화하지 않고 지시된 바와 같이 저장하고 본원에 기재된 바와 같이 0, 1, 3, 7 및 14일 후에 평가하고 이어서 정규화하고 세포로 형질도입한다. 각 시점에, 제조업체의 지침에 따라 구성된 신선한 mRNA를 또한 비교의 대조점으로서 평가한다 (IAWMS = 제조업체의 사양에 따름).
도 10은, 유리화 및 저장 후에 유지되는 항원-코딩 mRNA의 양이 신선한 것과 거의 동일하여 이는 거의 100% 질량 회복을 입증함을 보여준다. 유리화 샘플 당 60 ng/μL (50 μL 중 3 μg)의 mRNA를 로딩하였다. 최대 3일 동안, -20℃ 내지 55℃ 범위의 다양한 환경 온도에서의 저장은 85% 초과의 mRNA 수율을 제공하였다.
도 11은, -20℃ 내지 55℃ 범위의 다양한 환경 온도에서 3일 동안 저장 동안 녹색 형광 단백질-코딩 mRNA 기능이 분해로부터 보호됨을 보여준다. 제시된 데이터는, 지시된 온도에서 저장된, 유리화된 및 유리화되지 않은 mRNA 샘플로의 트랜스펙션 후 녹색 형광 단백질 발현에 대한 상대적 형광 단위를 비교한다. 유리화되지 않은 샘플은 저장 온도 증가에 따라 현저한 형광 손실을 나타내지만, 유리화된 샘플은 55℃에서 저장 후에도 우수한 활성을 유지하였다.
도 12는 도 11에 기재된 바와 같이 저장 개시 3일 후에 얻은 지시된 조건에 대한 대표적인 형광 세포 이미지를 나타낸다.
도 13은 신선한 mRNA 뿐만 아니라 유리화된 및 유리화되지 않은 샘플에 대한 제7일 형광 데이터를 나타낸다. 또한, 유리화는 저장 조건에도 불구하고 우수한 활성을 유지하였지만, 유리화되지 않은 샘플은 현저한 발현 활성 손실을 나타내었다.
도 14는 도 12에 제공된 것과 동일한 배열을 갖는 도 13에 제시된 형광에 대한 대표적인 이미지를 나타낸다.
도 15는 유리화된 및 유리화되지 않은 샘플에 대한 제14일 형광 데이터를 나타낸다. 또한, 유리화는 저장 조건에도 불구하고 우수한 활성을 유지하였지만, 유리화되지 않은 샘플은 연구된 모든 저장 온도에서 현저한 발현 활성 손실을 나타내었다.
도 16은 도 15에 제시된 형광에 대한 대표적인 이미지를 나타내며, 저부 행에 지시된 바와 같이 저장된 유리화되지 않은 샘플, 상단 행에 유리화된 샘플, 또한 좌측에 대조군 샘플이 나타나 있다.
도 17은 신선한 mRNA 뿐만 아니라 리포펙타민 메신저 MAX(Lipofectamine Messenger MAX) (인비트로겐(Invitrogen))를 갖는 유리화된 및 유리화되지 않은 샘플에 대한 제3일 형광 데이터를 나타낸다. 또한, 유리화는 저장 조건에도 불구하고 탁월한 활성의 유지를 가능하게 하였지만, 유리화되지 않은 샘플은 현저한 발현 활성 손실을 나타내었다.
도 18은 도 17에 제시된 형광에 대한 대표적인 이미지를 나타내며, 저부 행에 지시된 바와 같이 저장된 유리화되지 않은 샘플, 상단 행에 유리화된 샘플, 또한 좌측에 대조군 샘플이 나타나 있다.
도 19는 낮은 출발 부피로부터의 유리화된 mRNA의 성공적인 재구성 및 유지된 기능을 나타낸다. (A)는 액체 mRNA (레인 2 및 3), 재구성된 mRNA (레인 4 및 5) 및 동일한 저장 조건에 적용된 유리화되지 않은 mRNA (레인 5 및 6)를 나타내는 아가로스 겔을 나타낸다. (B)는 신선한 mRNA (상단), 유리화되지 않은 mRNA (중앙) 및 재구성된 유리화된 mRNA (저부)로의 트랜스펙션 후 발현된 녹색 형광 단백질 (GFP)을 나타낸다. (C)는 포지티브 대조군에 대한 GFP의 형광의 퍼센트를 나타낸다. 유리화 공정은 회수된 mRNA의 양 또는 그의 기능에 부정적 영향을 주지 않았다.
도 20은 물 세척된 PES 멤브레인 또는 PBS-T 세척된 네이키드(naked) 필터 상에서 유리화된 렌티바이러스를 나타내고, 신선한 액체 렌티바이러스 샘플을 HEK293 세포 상에 형질도입하고 72 h 동안 인큐베이션하였다. (A)는 형질도입 후 형광 현미경검사를 사용하여 얻은 이미지를 나타낸다. (B)는 형광 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 형광 강도를 기반으로 한 형질도입 효율의 백분율을 나타내고, 이는 액체 렌티바이러스 포지티브 대조군에 대한 각각의 형질도입의 백분율을 나타낸다. 세포가 유리화 직후에 형질도입된 경우, 사용된 스캐폴드에 관계없이 (네이키드 필터 또는 PES) -80℃에서 저장된 액체 렌티바이러스와 같이 유리화된 렌티바이러스는 잘 기능하였으며, 이는 유리화 공정이 입자를 손상시키지 않았음을 나타낸다.
도 21은 물 세척된 PES 멤브레인 또는 PBS-T 세척된 네이키드 필터 상에서 유리화된 렌티바이러스를 나타내고, 네가티브 대조군 (유리화되지 않음)을 24℃에서 1주, 2주 또는 3주 동안 저장하였다. 신선한 액체 렌티바이러스, 유리화된 및 유리화되지 않은 네가티브 대조군 샘플을 HEK293 세포 상에 형질도입하고 72 h 동안 인큐베이션하였다. 형질도입 후 형광 현미경검사를 사용하여 이미지를 얻었다. -80℃에서 저장된 액체 렌티바이러스는 "포지티브 대조군"으로 표시된다. 24℃에서 1주 동안 저장된 유리화되지 않은 액체 렌티바이러스는 "네가티브 대조군-I" (바이러스 단독) 및 "네가티브 대조군 II" (바이러스 및 유리화 매질)로 표시된다.
도 22a는 24℃에서 2주 저장시 형광 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 형광 강도를 기반으로 한 형질도입 효율의 백분율을 나타내고, 이는 액체 렌티바이러스 포지티브 대조군에 대한 각각의 형질도입의 백분율을 나타내었다.
도 22b는 24℃에서 3주 저장 후 도 22a로부터의 것과 동일한 것을 나타낸다.
도 23은 물 세척된 PES 멤브레인 또는 PBS-T 세척된 네이키드 필터 상에서 유리화된 렌티바이러스를 나타내고, 네가티브 대조군 (유리화되지 않음)을 37℃에서 1주, 2주 및 3주 동안 저장하였다. 신선한 액체 렌티바이러스, 유리화된 및 유리화되지 않은 네가티브 대조군 샘플을 HEK293 세포 상에 형질도입하고 72 h 동안 인큐베이션하였다. 형질도입 후 형광 현미경검사를 사용하여 이미지를 얻었다. -80℃에서 저장된 액체 렌티바이러스는 "포지티브 대조군"으로 표시된다. 24℃에서 1주 동안 저장된 유리화되지 않은 액체 렌티바이러스는 "네가티브 대조군-I" (바이러스 단독) 및 "네가티브 대조군 II" (바이러스 및 유리화 매질)로 표시된다.
도 24a는 37℃에서 2주 저장시 형광 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 형광 강도를 기반으로 한 형질도입 효율의 백분율을 나타내고, 이는 액체 렌티바이러스 포지티브 대조군에 대한 각각의 형질도입의 백분율을 나타내었다.
도 24b는 37℃에서 3주 저장 후 도 24a로부터의 것과 동일한 것을 나타낸다.
상세한 설명
본 개시내용은 그의 활성을 유지하고/하거나 분해를 피하면서 극저온 온도 초과에서의 저장을 가능하게 하는 전달가능한 백신 조성물에 패키징된 또는 단독의 카고(cargo) 분자 (예를 들어 핵산, 단백질 등)를 포함한 또는 단독의 지질 입자의 제조 방법에 관한 것이다. 방법은 추가로, 샘플 내에서의 동결 또는 다른 결정 형성이 없는 mRNA 백신 조성물의 안정화에 관한 것이다. 명세서는 일반적으로 지질 나노입자 또는 바이러스 구조 내에 함유된 것들과 같은 mRNA에 관한 것이지만, 이는 단지 예시를 위한 것이며 제한되도록 의도되지는 않는다. 본 발명은 일반적으로 구조를 보호하고 지질 입자 내의 또는 지질 입자 상의 임의의 카고를 안정화시키는 데 적용가능하다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 입자의 제조 및/또는 저장을 위한 공정 및 조성물에 관한 것이다. 일부 측면에서, 입자는 지질, 단백질, 탄수화물, 또는 임의의 이들의 조합이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 입자는 폴리뉴클레오티드를 케이싱하거나 둘러쌀 수 있다. 일부 측면에서, 입자는 폴리뉴클레오티드를 케이싱하는 지질, 단백질, 및/또는 탄수화물의 멤브레인을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 입자는 폴리뉴클레오티드를 케이싱하는 세포, 폴리뉴클레오티드 및/또는 지질 나노입자, 지질-유사 나노입자를 케이싱하는 비리온, 또는 폴리뉴클레오티드를 케이싱하는 리포좀을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 일반적으로 멤브레인은 그 안에 분산된 단백질 및/또는 탄수화물과 함께 지질을 포함할 수 있음을 인식할 것이다.
일부 측면에서, 입자는 케이싱을 형성할 수 있는 지질, 단백질, 및/또는 탄수화물의 멤브레인이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 측면에서는, 케이싱 내에 폴리뉴클레오티드가 존재할 수 있다. 추가의 측면에서, 입자는 폴리뉴클레오티드 자체의 것일 수 있다. 일부 측면에서, 멤브레인은 단일 층 또는 이중층일 수 있다. 일부 측면에서, 멤브레인은 지질, 단백질, 및/또는 탄수화물의 합성 멤브레인일 수 있다. 일부 측면에서, 입자는 세포 또는 세포 유래 멤브레인, 예컨대 식물, 박테리아, 또는 동물 세포, 또는 비리온 또는 비리온-유래 멤브레인의 것이다. 멤브레인이 세포 또는 비리온의 것인 특정 측면에서, 세포 또는 비리온은 약독화될 수 있음이 인식될 것이다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 공정 및 조성물은 이온성 지질을 포함한다. 일부 측면에서, 조성물은 그 안에 적어도 하나의 핵산 분자 또는 가닥을 함유하는 지질 나노입자 (LNP) 또는 지질-유사 나노입자 (LLN)를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "입자" 또는 "지질 입자"는 하나 이상의 이온성 지질, 임의로 다른 것들 중에서도 특히 포스파티딜 콜린 (PC), 포스파티딜 세린 (PS), 콜레스테롤, 폴리사카라이드, 중합체, 프로타민 (그러나 이에 제한되지는 않음)을 포함하는 단일 또는 이중 층 입자에 관한 것이다. 일부 측면에서, 핵산, 단백질, 또는 다른 분자는 2개 이상, 예컨대 3, 4, 5개 또는 그 초과의 지질의 LNP 또는 LLN 내에 캡슐화될 수 있다.
일부 측면에서, LNP는 이온성 지질 (통상적으로 아민 헤드, 링커 및 소수성 테일, 예를 들어 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트 (DLin-MC3-DMA 또는 MC3), DLinDMA, 및 DLin-KC2-DMA)의 3개 섹션에 의해 마킹됨)을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, LNP는 이온성 지질, 폴리에틸렌 글리콜 및 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 추가의 측면에서, LNP는 이온성 지질과 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 콜레스테롤 및/또는 디스테아로일 포스포콜린의 조합을 포함할 수 있다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Sabnis et al., Mol. Ther. 26: 1509-1519 (2018); Pardi et al. J. Exp. Med. 215:1571-1588 (2018); 및, Pardi et al. J. Control. Release, 217: 345-351 (2015)). 일부 측면에서, LNP는 콜레스테롤을 배제한다.
일부 측면에서, LNP는 "헬퍼" 지질을 추가로 포함할 수 있다. 헬퍼 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로판 (DOTAP) 및/또는 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE) 및/또는 리포펙타민 및/또는 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC) 및/또는 포스파티딜에탄올아민 (디올레오일 PE) 및/또는 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]-콜레스테롤 (DC-Chol)을 포함할 수 있다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Du et al. Scientific Reports 4: 7107 (2014) 및 Cheng et al. Advanced Drug Delivery Reviews 99(A): 129-137 (2016)).
유리화를 포함하는 방법에 의한 입자 저장은 입자 자체의 성질로 인해 특별한 도전을 제시한다. 먼저, 입자는 전형적으로, 일부 측면에서, 하나 이상의 기능성 분자, 예컨대 mRNA, 단백질 등을 포함하는 수성 환경을 캡슐화한다. 입자의 목적은 카고를 보호하는 것이고, 일부 측면에서는, 카고 분자에 대한 하류 전달, 표적화, 또는 다른 기능을 촉진하는 것이다. 전형적인 이전 건조 저장 방법은 완전한 데시케이션을 달성하기 위해 몇 시간 정도의 시간척도를 필요로 하고 통상적으로 재구성된 생성물의 기능적 성질을 감소시키는 동결데시케이션을 포함한다. 이는 종종 건조 공정 동안 입자 내부로부터 외부로의 물의 수송을 막는 지질 이중층의 결정화를 유발하는 저온의 결과이다.
본원에 제공된 바와 같은 공정은 재구성된 생성물의 기능을 극적으로 개선하면서 몇 분, 임의로 10분 미만 내에 완전 데시케이션을 달성할 수 있고 콜드 체인 저장 조건을 필요로 하지 않는다. 공정은 지질 입자의 이중층의 결정화를 유발하지 않아, 다공성 층을 통한 대류 수송을 촉진하는 액체/겔 상태에서의 멤브레인 유지로 인해 훨씬 더 급속히 멤브레인을 통해 물 분자 및 안정제를 수송할 수 있게 한다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 공정은 캡슐화 층 또는 입자의 멤브레인의 상 전이 온도 (Tc) 근처로 입자의 온도를 유지한다. 리포좀의 투과성은 이중층이 Tc에서 질서화된 겔 상으로부터 무질서한 유체 상으로 변환될 때 증가한다. Tc보다 충분히 낮을 때, 이중층은 온도가 Tc일 때에 비해 유동성이 감소하고 또한 투과성이 감소하는 보다 경질의 겔 상을 형성한다. 유사하게, 온도가 Tc를 충분히 초과할 때, 멤브레인의 유동성은 증가하지만, 투과성이 또한 감소한다. 따라서, Tc 근처에서 데시케이션 공정 동안 지질 입자의 온도를 촉진함으로써, 카고를 안정화시키기 위한 입자 내로의 안정화 성분 (예를 들어 디사카라이드)의 수송 뿐만 아니라 입자 내부로부터의 물 제거가 둘 다 최대화되어 요구되는 데시케이션 시간을 극적으로 감소시키고 후속 기능을 위해 카고 및 지질 이중층 둘 다를 보다 급속하게 효과적으로 안정화시킴으로써 저장 결과를 극적으로 개선한다.
본 개시내용의 대부분은 지질 입자에서 mRNA를 보호하고 저장하는 것에 관한 것이지만, 이는 단지 예로서 제시된다. 본원에 제공된 바와 같은 공정은 다른 카고 분자 또는 카고 분자의 조합을 함유하는 또는 단순히 비어 있는 입자 (특정 카고 분자가 없음)일 수 있는 입자에 동등하게 적용가능하다. 유사하게, 공정은 탄수화물 또는 단백질, 다른 카고 분자 또는 카고 분자의 조합의 입자 또는 비어 있는 입자에 동등하게 적용가능하다. 따라서, mRNA 및 지질 입자에 대한 하기 설명은 다른 카고 분자 또는 비어 있는 지질 입자 또는 다른 입자에 동등하게 적용가능하다. 따라서, "지질 입자"의 언급은 탄수화물, 단백질, 탄수화물 및 지질, 탄수화물 및 단백질, 지질 및 단백질, 및 지질/단백질/탄수화물 조합을 포함하는 입자와 동등하게 해석될 수 있다.
본원에 제공된 바와 같은 "폴리뉴클레오티드"는 핵산과 동의어로 사용될 수 있고 2개 이상의 연합된 뉴클레오티드 (예를 들어, 천연 발생이든 인공적이든, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실, 또는 임의의 이들의 유도체)이다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 등일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "메신저 RNA" 또는 "mRNA"는 프리-mRNA 및 성숙 mRNA, 스플라이싱된 mRNA, 5' 캡핑된 mRNA, 편집된 mRNA 및 폴리아데닐화된 mRNA를 포함한, 유전자의 단일-가닥 리보핵산 카피를 포함할 수 있다. mRNA는 인트론 및 엑손을 갖는 유전자 전사물 또는 완전한 유전자 전사물 또는 인트론-제거된 또는 스플라이싱된 mRNA를 포함할 수 있다. mRNA는 RNA 7-메틸구아노신 캡 또는 RNA m7G 캡과 같은 5' 캡에 의해 마킹된 단일 가닥 RNA 유전자 전사물을 포함할 수 있다. mRNA는 관심 mRNA 세그먼트의 단백질로의 번역 개시를 나타내기 위한 분자의 5' 말단을 향한 염기의 삼량체 ATG 서열의 시작 코돈을 포함할 수 있고, 코딩 영역의 말단 또는 번역이 중단되는 지점을 나타내기 위한 시작 코돈과 프레임 내에 있는 UAA, UAG 또는 UGA의 정지 코돈을 추가로 포함할 수 있다. mRNA는 정지 코돈 다음의 비-번역 영역 (UTR)을 추가로 포함할 수 있고 단일 가닥 분자의 3' 비-번역 영역 (UTR) 후에 폴리아데닐화된 (poly A) 테일을 추가로 포함할 수 있다. polyA 테일은 템플레이트 DNA에 의해 또는 polyA 폴리머라제의 사용에 의해 제공될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 poly A 테일 내의 아데노신의 정확한 길이는 정확할 필요가 없지만 일반적으로 약 100 내지 약 200개 아데노신 잔기 범위 내에 포함될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 측면에서, mRNA는 이중-가닥 2차 또는 3차 구조를 피하도록 최적화되고/거나 임의의 이중-가닥 변이체를 제거하도록 정제될 수 있다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Kariko et al. Nucleic Acids Res. 39: e142 (2011)).
본원에서 사용되는 바와 같이, "관심 세그먼트"는 번역되어야 하거나 세포 내에서 번역될 수 있는 mRNA 내의 핵산의 범위 또는 서열을 지칭할 수 있다. 관심 세그먼트는 시작 코돈으로 개시될 수 있고 정지 코돈에 의해 종료될 수 있으며, 정지 코돈은 동일한 판독 프레임 내에 있다 (즉, 번역된 단백질 또는 펩티드에 추가된 각 코돈 및/ 아미노산에 대한 3개의 핵산). 일부 측면에서, 관심 세그먼트는 희귀 코돈을 보다 풍부한 동족 tRNA를 갖는 동의 코돈으로 대체하여 단백질 생산을 증가시키는 서열 돌연변이를 추가로 특징으로 할 수 있다. 관심 세그먼트는 정상 상태 mRNA 수준을 증가시키기 위해 G:C 함량을 풍부화하도록 추가로 적응될 수 있다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Kudla et al. PLoS Biol. 4: e180 (2006)).
본원에서 사용되는 바와 같이, "캡핑된" 또는 "5' 캡"은 mRNA의 5' 말단에서의 구조 또는 변형을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 캡은 N7-메틸화된 GTP 결합에 의해 또는 역 5'-5' 트리포스페이트 링커를 통해 mRNA의 제1 뉴클레오티드에 연결된 N7-메틸화된 구아노신일 수 있다. 일부 경우에, 제1 뉴클레오티드는 2'O 메틸화된다. 일부 측면에서, 5' 캡은 항-역전 캡 유사체 또는 GpppG 유사체 등의 합성 또는 유사체 캡을 포함할 수 있다. 예를 들어 하기 문헌 참조: Muttach et al. Bellstein J Org Chem 13:2819-2832 (2017); Stepinki et al. RNA 7: 1486-1495 (2001); Schalke et al. RNA Biol. 9:1319-1330 (2012); 및, Malone et al. Proc. Natl. Acad. USA 86: 6077-6081 (1989)). 5' 캡은 또한 관련 기술분야에 공지된 캡, 캡1, 및/또는 캡2 구조를 포함할 수 있다. 5' 캡은 상업적으로 입수가능한 변형, 예컨대 CleanCap을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 5' 캡은 백시니아 바이러스 캡핑 효소의 사용을 통해 전사 후에 적용될 수 있다.
"유리화"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 무정형 물질로의 물질의 전환 과정이다. 무정형 고체는 임의의 결정질 구조를 갖지 않을 수 있다.
"유리화 혼합물"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 생물학적 물질(들) 및/또는 지질 입자 (임의로 지질 입자 내에 패키징된 하나 이상의 생물학적 물질을 함유하는 지질 입자) 및 유리화 작용제를 함유하는 유리화 매질 및 임의로 다른 물질의 불균질 혼합물을 의미한다.
"유리화 작용제"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 유리화 작용제 및 다른 물질(들)의 혼합물이 냉각되거나 데시케이션됨에 따라, 무정형 구조를 형성하는, 또는 다른 물질(들)에서의 결정의 형성을 억제하는 물질이다. 유리화 작용제(들)는 또한 삼투압 보호를 제공하거나 다른 방식으로 탈수 동안 세포 또는 지질 입자 생존을 가능하게 할 수 있다. 일부 측면에서, 유리화 작용제(들)는 생물학적 물질의 저장을 위해 적합한 무정형 구조를 제공하는 임의의 수용성 용액일 수 있다. 다른 측면에서, 유리화 작용제는 지질 입자, 세포, 조직, 또는 기관 내에 흡수될 수 있다.
"저장가능 또는 저장"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 추후에 사용을 위해 보존되고 생존가능하게 유지되는 생물학적 물질의 능력을 지칭한다.
"친수성"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 물 분자를 우선적으로 끌어당기거나 그와 회합됨을 의미한다. 물에 대한 특별한 친화도를 갖는 친수성 물질은 물과의 접촉을 최대화하고 소수성 물질에 비해 물과의 보다 작은 접촉각을 갖는다.
"소수성"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 물에 대한 친화도 부족을 의미한다. 소수성인 물질은 자연적으로 물을 밀어내어 액적 형성을 유발하고 물과의 큰 접촉각을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "극저온" 온도 또는 "극저온발생(cryogenesis)"을 위한 온도 또는 유사어는 생물학적 샘플이 동결 조건에 노출되는 온도를 지칭한다. 일부 측면에서, 극저온 온도는 생물학적 샘플 및/또는 유리화 매질의 동결 온도를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 극저온 온도는 화씨 또는 섭씨 온도의 특정 임계값 또는 값의 범위에 의해 국한되지 않으며, 대신에 관심 유리화 혼합물에 대한 온도, 압력 및 분자 에너지 사이의 관계에 의해 결정될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, "극저온발생" 및 그의 유사 파생어는, 기재된 바와 같은 정의 내에서 확실히 가능하지만, 1 atm 또는 약 -80℃에서 액체 질소와 관련된 온도로 제한되지는 않음을 이해해야 한다.
따라서, "극저온 온도 초과"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 유리화 혼합물의 동결점 초과의 온도를 지칭한다. "극저온 온도 초과"의 지점은 주변 대기 및 분자 에너지와 관련하여 동결 조건이 부재하는 온도 값을 추가로 포함할 수 있다. 실온은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 약 25℃의 온도를 지칭한다.
"동결보존"은 전형적으로, 직접 침지에 의해 소량의 생물학적 물질, 또는 종종 액체 물질을 급속 냉각시킬 액체 질소의 저온으로 인한 액체 질소의 사용을 통한 생물학적 샘플의 급속 냉각을 지칭한다. 냉각 속도는 물질의 분자가 열역학적으로 보다 유리한 결정 상태로 패킹될 수 있기 전에 이들의 이동성을 감소시킨다. 보다 연장된 기간에 걸쳐, 분자는 결정화되도록 배열될 수 있고, 이는 특히 생물학적 샘플에서 해로운 결과를 생성할 수 있다. 물은 이것이 빠르게 결정화될 수 있음에 따라 생물학적 샘플에서 중요한 관심사이며, 살아 있는 조직에서의 그의 풍부성은 결정화가 허용될수록 현저히 손상된다고 증명될 수 있다. 주요 구성성분이 결정화되는 능력을 방해하는, 종종 동결 보호제로서 언급되는 보호 첨가제는 무정형/유리화된 물질을 생성할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비등"은, 종종 주변 대기로 탈출하고 그 안에서 소실될 수 있는 물질 내의 증기 버블의 형성에 의해 마킹되는, 물질이 증기로 전이되는 지점을 지칭할 수 있다.
"유리 전이 온도"는 그 초과에서는 물질이 액체처럼 거동하고 그 미만에서는 물질이 고체 상과 유사한 방식으로 거동하고 무정형/유리질 상태로 진입하는 온도를 의미한다. 이는 온도의 고정된 지점이 아니며, 대신에 관심 유리화 혼합물의 특징에 따라 가변적이다. 일부 측면에서, 유리질 상태는 유리화 혼합물이 그의 유리 전이 온도 미만으로 떨어짐에 따라 진입하는 상태를 지칭할 수 있다.
"무정형" 또는 "유리"는 0.3 이하의 질서 파라미터를 참조하는 원자 위치의 장거리 질서가 존재하지 않는 비-결정질 물질을 지칭한다. 유리질 고체의 고화는 유리 전이 온도 Tg에서 일어난다. 일부 측면에서, 유리화 매질은 무정형 물질일 수 있다.
"결정"은 주기적으로 반복되고 격자 또는 단위 셀이라 불리는 하나의 질서 있는 특정 기하학적 배열로 이루어진 3차원 원자, 이온, 또는 분자 구조를 의미한다.
"결정질"은, 유리질 또는 무정형과 대조적으로, 원자 수준에서 질서화된 구조로 배열된 구성성분으로 구성된 물질의 형태를 의미한다. 결정질 고체의 고화는 결정화 온도 Tc에서 일어난다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 지질 입자, 하나 이상의 생물학적 작용제를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물 및/또는 mRNA 백신 조성물의 연장된 안정성 및/또는 저장을 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용에서, mRNA는 mRNA 및 적어도 하나의 추가 분자를 포함하는 mRNA 조성물, 또는 면역 반응의 유도를 위해 유기체 또는 세포에 투여하기에 적합한 mRNA 또는 mRNA 조성물인 mRNA 백신과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 저장은 약 -80℃ 내지 약 60℃의 온도를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, mRNA는 연장된 또는 무한 기간 동안 또는 일시적으로 약 25℃의 실온 내지 약 60℃에서 저장될 수 있다. 이러한 저장 동안, mRNA는 구조적 온전성 및 물리적 활성 또는 이러한 능력을 둘 다 유지할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 저장 온도가 특히 mRNA의 활성 및 온전성 유지와 관련하여 대체로 무관하도록 하는 mRNA의 제조 및 저장 방법에 관한 것이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 세포 또는 유기체로의 도입 및/또는 세포와의 인큐베이션 전에 mRNA 또는 mRNA 조성물, 예컨대 mRNA 백신 조성물의 안정화, 저장 및/또는 보존 방법에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 개시내용은, 주사가능 조성물 및/또는 전신 투여 조성물 중의 mRNA 또는 mRNA 백신 조성물의 포함과 같은, 대상체에 대한 투여 전에 mRNA 또는 mRNA 백신 조성물의 저장 및/또는 보존 방법에 관한 것이다.
mRNA 및 mRNA 조성물
일부 측면에서, 본 개시내용의 방법은 mRNA 또는 mRNA 조성물의 안정화, 저장 및/또는 보존에 관한 것이다. 일부 측면에서, 방법은 mRNA 또는 mRNA 조성물을 얻음으로써 또는 저장 및/또는 보존될 mRNA를 단리함으로써 개시될 수 있다. 일부 측면에서, 저장 및/또는 보존될 mRNA 또는 mRNA 조성물은 초기에 용액, 예컨대 수용액 중에 있을 수 있다. 일부 측면에서, 수용액은 물일 수 있다. 다른 측면에서, 수용액은 그 안에서의 mRNA의 안정성을 촉진하기 위해 그 안에 염 및/또는 완충제가 첨가되며 주로 물일 수 있다.
일부 측면에서, 방법은 mRNA 또는 mRNA 조성물 또는 mRNA 백신 조성물을 모세관 표면에 제공하는 것을 포함한다. mRNA 또는 mRNA 조성물 또는 mRNA 백신 조성물은, 일부 측면에서, 세포에서 번역되도록 의도된 관심 세그먼트를 특징으로 하는 합성 또는 재조합 mRNA 핵산을 포함할 수 있다 (예를 들어 하기 문헌 참조: Rhodes (ed.) Synthetic mRNA: Production, Introduction Into Cells, and Physiological Consequences, Humana Press, 2016). 일부 측면에서, mRNA 분자는 시험관내 전사 (IVT)에 의해 또는 플라스미드 DNA (pDNA) 구축물의 전사에 의해 제조될 수 있다.
일부 측면에서, mRNA 및/또는 mRNA 조성물은 정제된 mRNA 분자 또는 정제된 mRNA 조성물이다. 특정 측면에서, mRNA는 역상 빠른-단백질 액체 크로마토그래피 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 포함한 크로마토그래피 방법에 의해 정제될 수 있다. 추가의 정제 수단은 고정화된 polyT 또는 polyU와 함께 polyA 테일의 사용을 통한 결합 및 용리를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, mRNA 분자는 슈도우리딘, 1-메틸슈도우리딘, 5-메틸시티딘, N6-메틸 아데노신, 2-티오-우리딘 및 5-메톡시우리딘과 같은 변형된 염기의 혼입을 통해 변형된 뉴클레오시드일 수 있다.
일부 측면에서, mRNA는 캡핑된다. 일부 경우에, mRNA 분자 또는 단일 가닥은 역 5'-5' 트리포스페이트 링커를 통해 또는 N7-메틸화된 GTP 결합에 의해 mRNA의 제1 뉴클레오티드에 연결된 N7-메틸화된 구아노신에 의해 캡핑된다. 일부 경우에, mRNA의 제1 뉴클레오티드는 2'O 메틸화된다. 일부 측면에서, mRNA는 항-역전 캡 유사체 또는 GpppG 유사체 등의 합성 또는 유사체 캡으로 캡핑된다. 추가의 측면에서, mRNA는 관련 기술분야에 공지된 캡, 캡1, 및/또는 캡2 구조로 캡핑된다. 일부 측면에서, mRNA 캡은 백시니아 바이러스 캡핑 효소의 사용을 통해 전사 후에 적용된다. 다른 측면에서, mRNA는 관심 세그먼트, UTR 및/또는 polyA 테일을 특징으로 한다.
일부 측면에서, mRNA 조성물 및/또는 mRNA 백신 조성물은 패키징된 및/또는 캡슐화된 mRNA 분자 또는 단일 가닥, 예컨대 지질 캡슐화된 mRNA를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, mRNA는 이온화성 지질 내에 캡슐화될 수 있다. 일부 측면에서, mRNA 조성물은 그 안에 적어도 하나의 mRNA 분자 또는 가닥을 함유하는 지질 나노입자 (LNP) 또는 지질-유사 나노입자 (LLN)를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, mRNA는 2개 이상, 예컨대 3, 4, 5개 또는 그 초과의 지질의 LNP 또는 LLN 내에 캡슐화될 수 있다.
일부 측면에서, mRNA는 LNP 내에 캡슐화된다. LNP는 이온성 지질 (통상적으로 아민 헤드, 링커 및 소수성 테일, 예를 들어 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트 (DLin-MC3-DMA 또는 MC3), DLinDMA, 및 DLin-KC2-DMA의 3개 섹션에 의해 마킹됨)을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, LNP는 이온성 지질, 폴리에틸렌 글리콜 및 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 추가의 측면에서, LNP는 이온성 지질과 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 콜레스테롤 및/또는 디스테아로일 포스포콜린의 조합을 포함할 수 있다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Sabnis et al., Mol. Ther. 26: 1509-1519 (2018); Pardi et al. J. Exp. Med. 215:1571-1588 (2018); 및, Pardi et al. J. Control. Release 217: 345-351 (2015)). 일부 측면에서, LNP는 (4-히드록시부틸) 아제인디일)비스 (헥산-6,1-디일)비스(2-헥실데카노에이트), 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N 디테트라데실아세트아미드, 디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPSC), 및 콜레스테롤을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 측면에서, 또한 LNP는 (헵타데칸-9-일 8-((2-히드록시에틸) (6-옥소-6-(운데실옥시) 헥실) 아미노) 옥타노에이트), 평균 분자량 2000의 폴리에틸렌 글리콜과 1-모노메톡시폴리에틸렌글리콜-2,3-디미리스틸글리세롤, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3 포스포콜린, 및 콜레스테롤을 포함한다. 임의로, 또한 LNP는 하기 문헌에 제공되어 있는 바와 같다: Schoenmaker, et al., International Journal of Pharmaceutics, Volume 601, 2021, 120586.
일부 측면에서, LNP는 "헬퍼" 지질을 추가로 포함할 수 있다. 헬퍼 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로판 (DOTAP) 및/또는 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE) 및/또는 리포펙타민 및/또는 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC) 및/또는 포스파티딜에탄올아민 (디올레오일 PE) 및/또는 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]-콜레스테롤 (DC-Chol)을 포함할 수 있다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Du et al. Scientific Reports 4: 7107 (2014) 및 Cheng et al. Advanced Drug Delivery Reviews 99(A): 129-137 (2016)).
일부 측면에서, mRNA 조성물 및/또는 mRNA 백신 조성물은 그 안에서 mRNA의 세포 흡취(uptake)를 개선하기 위한 비히클, 예컨대 중합체 또는 지방 사슬로 개질된 중합체 또는 아민-함유 측쇄를 갖는 폴리메타크릴레이트 또는 올리고아미노에틸렌 측쇄를 갖는 폴리아스파르타미드 또는 폴리(베타-아미노) 에스테르 (PBAE)를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, mRNA 조성물의 비히클은 덴드리머, 예컨대 폴리아미도아민 또는 폴리프로필렌이민계 덴드리머를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, mRNA 조성물 및/또는 mRNA 백신 조성물은, 아르기닌-풍부 양친매성 RALA 서열 반복을 갖는 CPP 또는 프로타민 또는 D-이성질체 크센트리(Xentry)-프로타민을 포함한, 세포로의 mRNA 전달을 위한 벡터로서 보조하기 위한 세포-침투 펩티드 (CPP) 또는 담체 단백질을 포함할 수 있다. 추가의 측면에서, mRNA 조성물은 쯔비터이온성 지질 (ZAL) 또는 양이온성 및 쯔비터이온성 지질의 조합을 포함할 수 있다. mRNA에 대한 현재의 전달 비히클의 개요는 하기 문헌에 기재되어 있다: Kowalski et al., Mol. Ther. 27(4): 710-728 (2019). 담체 단백질의 예는 파상풍 톡소이드 (TT), 디프테리아 톡소이드 (DT), CRM197 (씨. 디프테레리아에(C. dipthereriae) C7로부터의 DT 변이체), 수막구균 외부 멤브레인 단백질 복합체 (OMPC), 에이치. 인플루엔자(H. influenza) 단백질 D, 및 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 mRNA 조성물 또는 mRNA 백신 조성물에 관한 것이다. 일부 측면에서, mRNA 분자는 그 안에 외인성 단백질 또는 그의 단편 또는 디자인된 항원을 발현하기 위한 관심 세그먼트를 함유하고, 이로써 관심 세그먼트의 발현은 이러한 세포 번역이 발현된 관심 세그먼트 또는 그의 단편을 면역 세포 및 세포의 숙주 유기체의 시스템에 프로세싱하고/거나 제시하는 것을 가능하게 한다. 일부 측면에서, mRNA는, 임의로 변형되지 않은 mRNA에 비해 면역원성을 증가시키기 위해, 일부 뉴클레오시드가 다른 자연 발생 뉴클레오시드로 또는 합성 뉴클레오시드 유사체에 의해 대체되도록 뉴클레오시드 변형된 mRNA이다. modRNA를 사용하는 COVID-19 백신의 예는 바이오엔테크(BioNTech)/화이자(Pfizer)/포선 인터내쇼날(Fosun International)의 협력에 의해 (BNT162b2), 또한 모더나(Moderna)에 의해 (mRNA-1273) 개발된 것들을 포함하며, 이는 예시적으로 하기 문헌에 기재되어 있다: Krammer F, Nature, 2020; 586 (7830): 516-527 또는 Dolgin, E. Nature Biotechnology, 2020: d41587-020-00022-y. doi:10.1038/d41587-020-00022-y.
관심 세그먼트는 임의로, 요망되는 단백질을 코딩하는 임의의 세그먼트이다. 일부 측면에서, 관심 세그먼트는 SARS-CoV-2 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 또는 다른 바이러스 또는 박테리아 항원의 일부를 코딩한다. 관심 세그먼트에 의해 코딩되는 예시적 단백질은, 예를 들어, SARS-CoV-2 스파이크 (S) 단백질 및 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 (N) 단백질을 포함한다. SARS-CoV-2의 N 및 S 단백질은 서열에 의해 공지되어 있고, 예를 들어 레이바이오텍(RayBiotech) (미국 버지니아주 피치트리 코너스)을 포함한 다양한 판매사를 통해 상업적으로 입수가능하다. 관심 세그먼트는 통상적으로 바이러스 캡시드 외부 환경에 노출되는 바이러스 항원의 일부일 수 있다. 예를 들어, 측면들에서, 관심 세그먼트는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 S의 S1 또는 S2 서브유닛을 코딩할 수 있다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 다른 펩티드 또는 그의 단편, 임의로 임의의 감염성 작용제의 캡시드 또는 멤브레인의 세포외 측면 상의 임의의 이러한 노출 단백질 또는 단백질 부분이 유사하게 코딩될 수 있음을 인식할 것이다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질은 하기 문헌에 의해 특성화되었으며, 이들 문헌 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다: Ou, et al., Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV, Nature Communications, 11, article 1620 (2020); 및 Ibrahim, et al., COVID-19 spike-host cell receptor GFP78 binding site prediction, J. Infect., S0163-4453(20) (March 10, 2020).
일부 측면에서, mRNA 조성물 및/또는 mRNA 백신 조성물은 하나 초과의 관심 세그먼트를 포함하는 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 이해되는 바와 같이, mRNA 백신 조성물은 발현된 항원 및 분자가 자가-증폭될 수 있게 하는 바이러스 복제 기구 또는 바이러스 복제가 억제되거나 제거되도록 보장하는 이러한 필수적 변형 둘 다를 제공할 수 있다. 특정 측면에서, mRNA 또는 mRNA 조성물은, 별도의 mRNA 가닥으로서 또는 단일 가닥 내에 포함된 것으로서, 추가의 RNA 복합체화 작용제를 제공하도록 구조 단백질을 대체하는 관심 항원 세그먼트로 바이러스 RNA 게놈을 활용하는 것과 같이, 바이러스 복제 기구를 코딩하는 관심 세그먼트를 포함할 수 있다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Geall et al. Proc. Natal. Acad. Sci. USA 109: 14606-14609 (2012) 및 Pardi et al., Nat. Rev. Drug Discov. 117:261-279 (2018)). 일부 측면에서, mRNA 백신 조성물은 바이러스 벡터의 부분일 수 있으며, 여기서 바이러스 벡터는 비-병원성이고 숙주 세포가 생체내에서 관심 세그먼트 및/또는 mRNA를 전사할 수 있게 하도록 디자인된 변형된 바이러스 게놈이다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 시토메갈로바이러스의 변형된 버전을 포함한다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Ura et al., Vaccines 2: 624-641 (2014)).
일부 측면에서, mRNA는 mRNA 백신 조성물이다. 일부 측면에서, mRNA 백신 조성물은 지질 또는 지질-유사 나노입자 내에 캡슐화된 mRNA 분자(들)를 포함한다. 이러한 나노입자는 임의로 이온성 지질, 콜레스테롤 (또는 임의로 부재하는 콜레스테롤), 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 헬퍼 지질, 예컨대 DOTAP, DOPE, DOPC 및/또는 디올레오일 PE를 포함할 수 있다.
mRNA 백신 조성물은 네이키드 mRNA 분자, mRNA 및 프로타민, 양이온성 나노에멀젼 중의 mRNA, LNP 중의 mRNA, 덴드리머 나노입자 중의 mRNA, 리포좀 또는 LNP 중의 mRNA 및 프로타민, 양이온성 중합체 (예를 들어 폴리에틸렌이민) 중의 mRNA, 양이온 중합체 리포좀 중의 mRNA, mRNA 및 폴리사카라이드, 양이온성 지질 나노입자 (예를 들어 1,2-디올레오일옥시-3-트리메틸암모늄프로판 또는 디올레오일포스파티딜에탄올아민) 중의 mRNA, 양이온성 지질 및 콜레스테롤 나노입자 중의 mRNA, 및 양이온성 지질, 콜레스테롤 및 폴리-에틸렌 글리콜 (PEG) 나노입자 중의 mRNA를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, mRNA 백신 조성물은 생체외 mRNA 로딩된 수지상 세포를 포함할 수 있다. 이러한 측면에서, 전형적으로 면역화될 대상체로부터의 수지상 세포가 얻어지고, 숙주 대상체 내로의 추후 교체를 위해 그 안에 mRNA가 도입된다. 수지상 세포가 강력한 항원-제시 세포임에 따라, 생체외 mRNA 로딩은 재도입시 면역 시스템을 강력하게 모집하는 메커니즘을 제공한다. 이러한 측면에서, 수지상 세포 자체는 mRNA 도입 전 또는 후에 본원에 개시된 방법에 의해 유리화될 수 있다. 다른 측면에서, 수지상 세포는 본원에 기재된 바와 같은 재구성된 mRNA를 흡취할 수 있다.
추가의 측면에서, mRNA, mRNA 조성물 및/또는 mRNA 백신 조성물은 아주반트를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 일부 측면에서, mRNA가 추가의 조성물에 첨가될 수 있고, 예컨대 지질 혼합물에 mRNA를 첨가하여 mRNA를 LNP 내에 케이싱한다. 다른 측면에서, mRNA는 본원에 제공된 바와 같이 저장되고, 재구성되고 아주반트 첨가될 수 있다. 추가의 측면에서, 아주반트는 유리화 전에 mRNA 또는 mRNA 조성물과 혼합되거나 포함될 수 있다. 아주반트는 알루미늄계 (예를 들어 알루미늄 염) 화합물, 예컨대 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 및 칼륨 알루미늄 술페이트를 포함할 수 있다. 아주반트는 AS04 (모노포스포릴 지질 A 및 알루미늄 염), MF59 (스쿠알렌을 포함하는 수 중 유 에멀젼), AS01B (리포좀 제제 중의 모노포스포릴 지질 A 및 QS-21 (칠레 비누껍질 나무로부터)), 및 CpG 1018 (시토신 포스포구아닌 합성 DNA) 및 TLR 작동제를 추가로 포함할 수 있다. 추가의 아주반트는 더 나은 mRNA의 세포 흡취 및/또는 관심 세그먼트의 세포 발현을 가능하게 하도록 CD70, CD40L 및 TLR4 (임의로 구성적으로 활성임)를 코딩하는 다른 mRNA의 존재를 포함할 수 있다.
유리화 혼합물
일부 측면에서, 본 개시내용은 유리화 혼합물 내의 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물을 모세관 또는 모세관 베드 상에 배치하는 것에 관한 것이다. mRNA는 본원에 기재된 바와 같은 네이키드 mRNA, mRNA 조성물 또는 mRNA 백신 조성물일 수 있다. mRNA는 추가로 모세관 또는 모세관 베드 상에 배치된 유리화 혼합물의 부분일 수 있다. 유리화 혼합물은 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물, 및 유리화 매질을 포함할 수 있다. 추가의 측면에서, 유리화 매질이 모세관 베드에 첨가된 후, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물이 그에 첨가되어 모세관 베드 상에 유리화 혼합물을 제공할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 분자와 접촉할 가능성이 있는 모든 성분은 RNAse의 임의의 잠재적인 또는 가능성 있는 공급원을 포함한 mRNA에 대한 분해 효소가 없거나 실질적으로 없도록 제조 및/또는 처리된다는 것이 관련 분야에서 인식될 것이다.
유리화 매질은 유리 형성 작용제를 포함할 수 있다. 유리 형성 작용제의 식별은 생물학적 분자, 세포 또는 조직의 성공적인 보존에 대한 기회를 열었다. 적절한 유리 형성 작용제의 존재 하에, 본원에 제공된 바와 같은 탈수에 의해 달성된 유리화로 극저온 온도 초과에서 유리화된 매트릭스 내에서 생물학적 물질을 저장하는 것이 가능하다. 건조 상태 (무수생물태(anhydrobiosis))에서 생존하는 능력은 여러 복잡한 세포내 물리화학적 및 유전적 메커니즘에 따라 달라진다. 이들 메커니즘 중에는 데시케이션 동안 보호제로서 작용하는 당 (예를 들어, 사카라이드, 디사카라이드, 올리고사카라이드)의 세포내 축적이 있다. 트레할로스는 데시케이션 내성 유기체에서 자연적으로 생성되는 디사카라이드의 일례이다. 풀룰란은 유사하게 데시케이션시 적용하기에 적합화된 폴리사카라이드의 예이다. 트레할로스 및 풀룰란 등의 당은 여러 상이한 방식으로 보호를 제공할 수 있다. 트레할로스 분자는 트레할로스 분자 상의 히드록실 기의 독특한 배치로 인해 그의 입체형태적 기하구조 및 폴딩의 변화 없이 분자의 표면으로부터 수소-결합 물 분자를 효과적으로 대체할 수 있다. 또한, 많은 당은 높은 유리 전이 온도를 가져서, 이들이 극저온 온도 초과 유리 또는 실온 유리를 낮은 물 함량으로 형성할 수 있게 한다. 고도로 점성인 '유리질' 상태는 분자 이동성을 감소시키고, 이는 또한 기능 열화를 초래하는 분해적 생화학 반응을 막는다.
유리화 매질 중의 적절한 유리화 작용제의 존재는, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물이 본원에 기재된 바와 같이 주변 조건 하에 데시케이션됨에 따라, 필수적일 수 있다. 빠른 데시케이션 방법은 그 자체로 본원에 제공된 바와 같은 다른 고려사항 없이 데시케이션 후 세포 또는 다른 유리화된 생물학적 물질의 생존가능성의 성공을 반드시 보장하지는 않는다. 유리를 형성하고/거나 다른 물질에서의 결정의 형성을 억제하는 유리화 매질이 요구될 수 있다. 유리화 매질은 또한 삼투압 보호를 제공하거나 다른 방식으로 mRNA 또는 그의 조성물의 탈수 동안 세포 생존을 가능하게 할 수 있다. 유리화 매질 중에 포함될 작용제의 예시적 예는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 디메틸술폭시드, 글리세롤, 당 (예를 들어, 디사카라이드, 예를 들어 트레할로스), 폴리알콜, 메틸아민, 베틴, 동결방지 단백질, 합성 핵형성 방지 작용제, 폴리비닐 알콜, 시클로헥산트리올, 시클로헥산디올, 무기 염, 유기 염, 이온성 액체, 또는 이들의 조합. 일부 측면에서, 유리화 매질은 임의로 1, 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 유리화 작용제를 함유한다.
일부 측면에서, 유리화 매질은 유리화 작용제의 정체에 따라 달라지는 농도로 유리화 작용제를 포함할 수 있다. 임의로, 유리화 작용제의 농도는 유리화되는 mRNA 또는 그의 조성물에게 독성이 될 농도 미만인 농도이며, 여기서 독성은 후속 샘플 사용시 기능적 또는 생물학적 생존가능성이 달성되지 않도록 한다. 유리화 작용제의 농도는 임의로 약 500 마이크로몰 (μM) 내지 약 6 몰 (M), 또는 이들 사이의 값 또는 범위이며, 이는 약 1, 2, 3, 4, 또는 5 M을 포함한다. 유리화 작용제 트레할로스의 경우, 농도는 임의로 약 1 M 내지 약 6 M이며, 이는 2, 3, 4, 또는 5 M을 포함한다. 임의로, 조합시 모든 유리화 작용제의 총 농도는 임의로 약 1 M 내지 약 6 M이며, 이는 2, 3, 4, 또는 5 M을 포함한다.
유리 형성 당인 트레할로스는 무수 유리화에서 사용되었고, 여러 방식으로 데시케이션 내성을 제공할 수 있다. 그러나, 물 중의 유리화된 1.8 M 트레할로스는 -15.43℃의 유리 전이 온도를 갖는다. 0℃ 초과에서의 유리화를 달성하기 위해, 보다 높은 농도 (6-8 M)가 요구되며, 이는 mRNA 또는 그의 조성물을 손상시킬 수 있다. 대안적으로, 유리화 매질은 VM의 Tg 값을 증가시키기 위해 완충 작용제 및/또는 염을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 유리화 매질은 임의로 물 또는 용매 및/또는 완충 작용제 및/또는 하나 이상의 염 및/또는 다른 성분을 포함할 수 있다. 완충 작용제는 25℃에서 약 6 내지 약 8.5의 pKa를 갖는 임의의 작용제일 수 있다. 완충 작용제의 예시적 예는 다른 것들 중에서도 특히 HEPES, TRIS, PIPES, MOPS를 포함할 수 있다. 완충 작용제는 유리화 매질의 pH를 요망되는 수준으로 안정화시키기에 적합한 농도로 제공될 수 있다.
1.8 M 트레할로스, 20 밀리몰 (mM) HEPES, 120 mM ChCl, 및 60 mM 베틴을 포함하는 유리화된 매질은 +9℃의 유리 전이 온도를 제공한다. 본원에 개시된 모세관 보조 유리화 방법을 위한 예시적 유리화 매질은 트레할로스, 및 큰 유기 이온 (>120 kDa)을 함유하는 하나 이상의 완충 작용제, 예컨대 콜린 또는 베틴 또는 HEPES 뿐만 아니라 K 또는 Na 또는 Cl 등의 작은 이온을 함유하는 완충 작용제(들)를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 유리화 매질은 트레할로스, 글리세롤 및 인산염-완충 식염수를 포함할 수 있다. 유리화 매질은, 열 처리를 통한 또는 여과에 의한, 예컨대 0.2 ㎛ 멤브레인 필터를 통한 것과 같이 추가로 멸균될 수 있다. 추가의 측면에서, 유리화 매질은 일정 부피의 mRNA, mRNA 조성물 또는 mRNA 조성물과 혼합될 수 있다. 일부 측면에서, 유리화 매질은 mRNA, mRNA 조성물 또는 mRNA 조성물과 약 10;1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10의 비율로 혼합된다.
압력 및 열
일부 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물 및 유리화 매질의 유리화 혼합물은 유리화 매질 및 mRNA 내의 임의의 유체의 증발을 향상시키기 위해 모세관 네트워크 또는 연속 모세관 네트워크 상에 배치된다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 방법은 모세관 네트워크 상의 유리화 혼합물에 낮은 대기압을 적용하는 것에 관한 것이다. 일부 측면에서, 저압은 VM이 결정화 또는 동결되는 것을 막기 위해 열을 추가로 제공하면서 적용된다. 본 개시내용은, 유리화 혼합물 중의 mRNA의 급속 유리화를 달성하기 위해, 낮은 대기압 및 열 에너지, 임의로 멤브레인에 대하여 특정 방향 또는 위치로부터의 열 에너지를 조합하는 유리화 공정을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은, 유리화가 감소된 대기압 하에 일어남에 따라 유리화 혼합물에 대한 열 에너지의 적용에 관한 것이다. 일부 측면에서는, 유리화 혼합물 및 그 안의 내용물, 예컨대 mRNA 또는 mRNA 조성물의 결정화를 막기 위해 유리화 혼합물에 열 에너지가 적용된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 낮은 대기압에서의 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물의 유리화에 관한 것이다. 일부 측면에서, 데시케이션은 데시케이션 챔버 내에서 일어날 수 있고, 이로써 유리화 혼합물이 그 안에 배치되어 낮은 대기압에 노출될 수 있다. 이러한 데시케이션 챔버는 낮은 대기압을 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물에 적용하기 위해 진공 공급원에 연결될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 유리화 혼합물은 유리화 매질 또는 동결보존제, 예컨대 트레할로스와 함께 제조되고, 진공 적용을 통한 것과 같이, 낮은 대기압에 적용될 수 있다. 일부 측면에서, 낮은 대기압은 약 0.9 기압 (atm) 내지 약 0.005 atm이며, 이는 0.85, 0.8, 0.75, 0.7, 0.65, 0.6, 0.55, 0.5, 0.45, 0.4, 0.35, 0.3, 0.255, 0.25, 0245, 0.24, 0.235, 0.23, 0.225, 0.22, 0.215, 0.21, 0.205, 0.2, 0.195, 0.19, 0.185, 0.18, 0.175, 0.17, 0.165, 0.16, 0.155, 0.15, 0.145, 0.14, 0.135, 0.13, 0.125, 0.12, 0.115, 0.11, 0.105, 0.1, 0.095, 0.09, 0.085, 0.08, 0.075, 0.07, 0.065, 0.06, 0.055, 0.05, 0.045, 0.04, 0.035, 0.03, 0.025, 0.02, 0.015, 및 0.01 atm을 포함한다.
다른 측면에서, 데시케이션 챔버 내의 압력은 유리화 혼합물의 삼중점 초과의 지점으로 낮아진다. 다른 측면에서, 압력은 물의 삼중점 초과의 지점, 예컨대 0.006 atm 초과로 낮아진다. 본원에 기재된 바와 같이, 낮아진 대기압은 유리화 혼합물의 온도를 낮추면서 또한 그의 비점을 감소시킨다. 일부 측면에서, 데시케이션 챔버 내의 압력은 약 0.04 atm 또는 약 29 mmHg로 낮아진다.
추가의 측면에서, 유리화 혼합물의 온도는 데시케이션 및/또는 유리화 동안 제어된다. 예를 들어, 유리화 혼합물이 데시케이션 챔버 내에 배치되고, 유리화 혼합물이 극저온 온도를 겪는 것을 제한하거나 막기 위해 유리화 혼합물에 열 에너지가 적용된다. 일부 측면에서는, 그 안에서의 결정화를 막기 위해 유리화 혼합물에 열 에너지가 전달된다.
일부 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물의 온도는 적용된 진공 또는 유리화 혼합물 주위의 대기압 감소 내에서, 임의로 Tc로부터 30℃ 이내로, 임의로 Tc로부터 20℃ 이내로, 임의로 Tc로부터 10℃ 이내로, 임의로 Tc로부터 5℃ 이내로, 임의로 Tc로부터 4℃ 이내로, 임의로 Tc로부터 3℃ 이내로, 임의로 Tc로부터 2℃ 이내로, 임의로 Tc로부터 ℃ 이내로, 임의로 Tc로부터 1℃ 이내로 제어된다. 본원에서 논의된 바와 같이, 낮은 대기압의 적용은 유리화 혼합물의 온도를 현저히 낮추어 유리화 혼합물의 결정화를 유발할 수 있다. mRNA 또는 주변 매질이 결정화되면, 돌이킬 수 없는 손상이 그 안에서 일어날 수 있고, 이는 재구성시 임의의 요망되는 활성 또는 사용에 부정적 영향을 줄 수 있다. 또한 본원에서 식별되는 바와 같이, 유리화 혼합물 주위의 대기압 감소는 유리화 혼합물 내의 분자 활성을 변경할 수 있고, 그에 따라 비점이 감소한다. 극저온발생과 유사하게, mRNA 및/또는 유리화 매질의 비등 또는 과열은 해로울 수 있다. 유리화 혼합물의 비등은 3차 구조의 손실, 그 안의 mRNA 성분의 가교 및 분해를 초래하여, 재구성시 임의의 활성이 손상될 수 있다. 특정 측면에서, 본 개시내용의 공정은 진공, 부분 진공과 같이 낮은 대기압에 또는 일반적으로 감압 분위기에 있으면서 극저온 온도 초과의 온도에서 유리화 혼합물을 유지하는 것에 관한 것이다.
특정 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물 및 유리화 매질을 포함하는 유리화 혼합물은 데시케이션 동안 이들의 온도를 제어하기 위해 직접 가열될 수 있다. 다른 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물 및 유리화 매질을 포함하는 유리화 혼합물은 전도, 대류 및/또는 방사 수단에 의해 제어된 이러한 온도를 가질 수 있다. 다른 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물 및 유리화 매질을 포함하는 유리화 혼합물은 유리화 혼합물의 온도를 제어하기 위해 데시케이션 챔버 외부의 온도를 제어하고 데시케이션 챔버 또는 그의 부분을 통한 전도에 의존함으로써 제어된 그의 온도를 가질 수 있다. 이러한 경우, 데시케이션 챔버의 벽의 물리적 특성을 고려할 필요가 있을 것임이 인식될 것이다. 예를 들어, 데시케이션 챔버의 낮은 전도성 물질은 유리화 혼합물이 적절한 열 에너지를 수용할 수 있도록 하기 위해 유리화 혼합물에 의해 요구되는 것과 상이한 적용 온도를 필요로 할 수 있다. 이러한 필수적 적응은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 인식될 것이다. 일부 측면에서, 열은 가열 패드, 가열 배쓰, 화염, 가열 베드, 예컨대 유리 비드, 가열된 블록 등을 통해 적용될 수 있다. 일부 경우에, 열 에너지는 생성된 열의 전기 공급원 및/또는 연소에 의해 방출된 열 에너지 및/또는 전기 저항에 의해 생성된 열 에너지로부터 유래될 수 있다.
일부 측면에서, 열 에너지는 기저에 있는 지지 기판을 통해 유리화 혼합물에 제공될 수 있다. 연속 모세관 네트워크의 다공성 물질이 또한 유리화 혼합물에 열 에너지를 제공할 수 있지만, 일부 경우에 다공성 물질은 유리 또는 중합체와 같은 낮은 전도성 물질이다. 그러나, 기저에 있는 기판은 금속 또는 유사하게 효율적인 전도성 물질의 것이고 데시케이션 챔버 외부의 열 공급원 또는 전기 공급원에 용이하게 연결되고 그 안에서 생성된 저항에 의해 열을 제공할 수 있다. 고체 지지체로부터의 열 에너지의 적용은 모세관 증발을 보조하기 위한 온도 구배를 추가로 제공할 수 있다.
열 에너지는 요망되는 방향으로부터 적용될 수 있다. 열이 액체의 벌크 자체를 표적화하도록 모세관 채널 또는 멤브레인의 하부 또는 내부로부터 열을 적용하는 것은, 일부 측면에서, 유리질 형태를 달성하기 전에 물질에서 필름 비등을 유발함으로써 해로울 수 있음이 밝혀졌다. 대안적으로, 모세관 채널의 말단에 의해 형성된 메니스커스 위의 방향으로부터 적용된 열은 액체 단독의 또는 감소된 대기압으로의 노출 동안 비등을 유발하지 않으면서 유리화를 촉진한다. 메니스커스 위의 방향은 채널 또는 멤브레인이 유리화 혼합물로 로딩되고 물질의 유리화를 촉진하기 위해 가열 및 대기압 감소에 적용될 때와 같이 모세관 채널의 양단에 있을 수 있다. 열 공급원과 모세관 채널 또는 유리화 멤브레인 표면의 말단 사이에 액체가 없는 공간 (기체 충전 또는 진공)을 허용함으로써, 개선된 유리화가 달성되고 이로써 mRNA의 개선된 생물학적 활성 안정성이 가능해진다.
일부 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물 및 유리화 매질을 포함하는 유리화 혼합물은 낮은 대기압 하에 유리화 동안 그의 극저온 온도 초과의 온도에서 유지된다. 일부 측면에서, 유리화 혼합물은 낮은 대기압 하에 데시케이션 전에 예열된다. 다른 측면에서, 유리화 혼합물은 낮은 대기압 하에 유리화 동안 가열된다. 다른 측면에서, 열은 유리화가 개시되는 시간에 또는 그 즈음에 적용된다. 유리화 혼합물에 적용되는 열 에너지의 양은 낮은 대기압 공정 하에 유리화 동안 달라질 수 있거나 일정할 수 있음이 인식될 것이다. 일부 측면에서, 데시케이션 챔버 내의 낮은 대기압의 도입은 유리화 혼합물의 급속한 온도 강하를 유발할 수 있다. 이러한 측면에서, 열 에너지를 수용할 준비가 되었거나 이미 수용하는 유리화 혼합물을 갖는 것은 온도 강하로부터 회수율을 증가시킬 수 있다 (예를 들어, 도 5 참조).
특정 측면에서는, 일정한 온도를 유리화 혼합물에 적용하고, 그에 따라 유리화 혼합물이, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 및 39℃를 포함한, 유리화 혼합물의 약 Tg (℃) 내지 약 40℃의 온도에서 유지된다. 특정 측면에서는, 유리화 혼합물에 필수적 열 에너지를 제공하기 위해 데시케이션 챔버 또는 다공성 물질에 보다 높은 온도가 적용될 수 있다. 이러한 적용 온도는, 데시케이션 챔버의 크기 및 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, mRNA 백신 조성물 및/또는 유리화 매질로의 효과적 전달을 위해 이용가능한 전도성 수단에 따라, 약 15℃ 내지 약 70℃일 수 있다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 유리화 혼합물은 승온에서 진공 또는 부분 진공에 배치되거나 적용된 대기압에서 유리화 혼합물의 극저온 초과의 온도에서 유지되고, 그에 따라 유리화 혼합물은 대기압의 급속 감소 동안 극저온 온도를 겪지 않는다. 추가의 측면에서, 유리화 혼합물의 온도는 mRNA 또는 그의 조성물의 유리화를 가능하게 하기 위해 유리화 매질의 Tg 미만으로 떨어질 것이다.
일부 경우에, 낮은 대기압의 유지는 데시케이션 챔버와 같은 밀봉된 인클로저 내에 유리화 혼합물을 함유할 것을 필요로 할 수 있다. 유리화 혼합물 주위의 낮은 대기압의 제공 및/또는 유지는 전형적으로, 데시케이션 챔버가 그 안에서 저압을 견딜 수 있을 것을 필요로 할 것임이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다. 이는, 충분한 밀봉 및 충분한 벽 강도를 필요로 하는, 그 안에서 낮은 대기압을 유지하기 위한 요건에 의해 제약되는 임의의 적합한 또는 요망되는 형상 및/또는 물질의 것일 수 있다. 데시케이션 챔버는 그 안의 대기압을 낮추기 위해 진공 공급원에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 추가로 유리화 완료시 공기가 복귀하는 것을 가능하게 할 수 있다. 데시케이션 챔버는 적용된 진공이 데시케이션 챔버 내의 대기압을 요망되는 범위로 효과적으로 낮추는 것을 가능하게 하도록 충분히 밀봉되거나 폐쇄될 수 있다.
모세관-보조 증발
추가의 측면에서, 모세관 네트워크는 감소된 대기압 하에 유리화 혼합물의 비등을 막을 수 있다. 유리화에 사용될 수 있는 모세관 보조 증발 및 장치의 원리는 US 10,568,318에 기재된 바와 같을 수 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 측면에서, 유리화 혼합물이 모세관 네트워크 상에서의 데시케이션 및 유리화를 겪음에 따라 열 에너지가 유리화 혼합물에 적용될 수 있다. 일부 측면에서, 기저에 있는 모세관 네트워크는 유리화 혼합물을 비등으로부터 보호하면서 열 에너지를 수용하는 유리화 혼합물의 균일하고 완전한 유리화 및 데시케이션을 가능하게 할 수 있다. 모세관 네트워크는 모세관의 연속 네트워크일 수 있다. 일부 경우에, 모세관 네트워크는 기저에 있는 다공성 물질, 예컨대 멤브레인, 또는 기저에 있는 윤곽이 있는 또는 융기된 표면에 의해 제공될 수 있으며, 여기서 그의 트로프 및 정점은 모세관의 베드를 제공한다.
모세관 네트워크 상의 유리화 혼합물의 존재는 모세관 작용으로 유리화 혼합물을 끌어냄으로써 빠른 증발을 가능하게 한다. 연속 모세관 네트워크의 존재는 추가로, 유리화 매질의 유체 부피가 균일하게 증발하고 비등을 막으면서 또한 손상을 주는 비등을 겪게 할 수 있는 mRNA 또는 그의 조성물 상의 과도한 유체 축적을 또한 막는 것을 가능하게 한다. 유사하게, 멤브레인 등의 다공성 물질은 기저에 있는 모세관 네트워크를 제공할 수 있다. 이러한 측면에서, 다공성 물질, 예컨대 멤브레인은 mRNA 또는 그의 조성물의 바로 기저에 있고, 그 안에서의 모세관 작용은 향상된 증발을 제공한다. 따라서, 본 개시내용의 일부 측면에서, 유리화 혼합물은 연속 모세관 네트워크 상에 배치된다. 추가의 측면에서, 유리화 혼합물은 연속 모세관 네트워크의 패턴화된 및/또는 융기된 및/또는 윤곽이 있는 다공성 물질 상에 배치된다. 추가의 측면에서, 연속 모세관 네트워크는 데시케이션 챔버의 벽 내 또는 벽 상의 패턴 및/또는 융기 및/또는 윤곽에 의해 형성된다. 다른 측면에서, 모세관 네트워크는 다공성 물질에 의해 제공된다.
도 1a를 참조하면, 유리화 혼합물(20)의 얇은 액체 층의 적용에 의해 커버링된 연속 친수성 베드(10)가 도시되어 있다. 도 1a에 나타낸 바와 같이 친수성 표면 상에 극도로 얇은 액체 필름을 사용하면 감소된 분위기 하에 비등의 방지가 회피되고/거나 감소될 수 있다. 그러나, 비등의 방지는 가능하지만, 이용가능한 표면적은 유리화될 수 있는 액체의 양을 감소시킨다. 도 1b에 나타낸 바와 같은 윤곽이 있는 표면의 존재는 피크에서 우선적인 데시케이션이 일어나고 이로써 유리화 공정 동안 트로프로부터 수분을 끌어올리는 것으로 인해 유리화 혼합물이 모세관 작용에 적용될 수 있는 표면을 효과적으로 제공하고, 이는 유사하게 mRNA 또는 그의 조성물을 비등으로부터 보호할 수 있다. 또한, 샘플이 윤곽의 피크에서 유리화됨에 따라, 모세관 작용은 기저에 있는 트로프로부터 유체를 끌어당김으로써 유리화 혼합물의 탁월한 유리화를 촉진한다. 유사하게, 모세관의 멤브레인의 다공성 물질이 mRNA 또는 그의 조성물을 지지하는 경우, 유리화 혼합물이 그 위에 위치할 때 모세관 작용이 모세관 채널로부터 유체를 끌어당기고 mRNA 또는 그의 조성물의 균일하고 완전한 유리화 및 데시케이션을 제공할 것이다. 그러나, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 지나치게 큰 유체 로딩의 경우와 같이 모세관 작용이 유체를 성공적으로 끌어올릴 수 없는 경우, 액체는 표면 패턴을 충전시키거나 트로프에서 유지되고, 여기서 버블 핵형성 및 비등이 감압 하에 지배적이 되고 이는 그 안에 함유된 민감한 분자의 손상을 초래할 수 있다.
다공성 물질, 예컨대 멤브레인의 또는 기저에 있는 패턴화된 융기된 지지체로부터 형성된 모세관 네트워크는 독성이 아니고 mRNA 또는 그의 조성물에 대해 반응성이 아니고 유리화 매질과 화학적 또는 물리적으로 반응하지 않는 물질로 제조될 수 있다. 물질은 적합한 중합체, 금속, 세라믹, 유리, 또는 이들의 조합의 것일 수 있다. 일부 측면에서, 연속 모세관 네트워크는 다른 것들 중에서도 특히 폴리디메틸실록산 (PDMS), 폴리카르보네이트, 폴리우레탄, 폴리에테르술폰 (PES), 폴리에스테르 (예를 들어 폴리에틸렌 테레프탈레이트)의 물질로부터 형성된다. 본원에 제공된 장치 및 공정에서 표면으로서 적합한 모세관 채널 함유 멤브레인의 예시적 예는 미국 매사추세츠주 벨레리카 소재의 이엠디 밀리포어(EMD Millipore)에 의해 판매되는 것들과 같은 친수성 여과 멤브레인을 포함한다. 특정 측면에서, 다공성 물질은 mRNA 또는 그의 조성물 및/또는 유리화 매질의 성분에 실질적으로 결합하거나, 이를 변경하거나, 또는 달리 그와 화학적 또는 물리적 회합을 생성하지 않는다. 다공성 물질은 임의로 유도체화되지 않는다. 임의로, 모세관 채널은 PDMS 형성 기술, 레이저 드릴링, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 구멍 형성 기술에 의해 요망되는 물질 및 두께의 기판 (예를 들어 데시케이션 챔버 벽)에 형성될 수 있다.
일부 측면에서, 모세관 네트워크는 액체 또는 유체가 그의 표면 상에 축적되는 것을 제한하기에 충분한 두께를 갖는다. 모세관 효과를 실현하기 위해 액체는 멤브레인의 기공 내에 수용되어 메니스커스를 형성할 수 있다. 모세관 계면에서의 액체 분율 (ξ), 즉 액체가 차지하는 부피는 개선된 모세관 증발을 촉진하기 위한 고려사항에 대한 파라미터이다. 모세관 구동 증발은 액체에서의 점성 압력 강하가 액체-증기 계면에서의 최대 모세관 압력을 능가할 때 일어난다. 액체 분율 ξ는 벌크로부터 액체-증기 계면으로의 전체적 압력 강하와 관련된다. 대기압 하에, 또) 적용된 열 유속 없이 (도 4B), 액체는 큰 분율을 커버링하고, 액체 분율, ξ→1이 된다. 이들 조건 하에, 모세관 구동 증발률은 최소이다. 도 4C에 나타낸 바와 같이 주변 압력의 감소는 ξ를 감소시키고 또한 증발률을 증가시킨다. 그러나, 특정 임계 압력 강하를 넘어서면, 바람직하지 않은 핵형성 비등이 일어날 수 있다. 도 4D에 나타낸 바와 같이 적용된 열 유속 Q는 또한 증발률을 향상시킬 수 있지만, 필름 비등의 위험이 존재하고, 이것 또한 바람직하지 않다. 도 4E에 나타낸 바와 같이 모세관 메니스커스의 표면으로부터의 열 유속의 적용은, 필름 비등의 위험을 제거하거나 감소시킨다. 도 4F에 나타낸 바와 같이 카운터 구배 방식으로 적용된 큰 ΔP 및 Q 하에, 기공에 한정된 액체 메니스커스, 즉, 액체 분율 ξ << 1 (~0.25)로 이어지고, 이는 비등을 피하면서 최고 증발률을 제공한다 (ξ=, 여기서 p는 멤브레인의 융기 사이의 거리 또는 높이이고, d는 액체 메니스커스의 형상에 의해 형성된 원의 직경임). 따라서, 표면과 벌크 액체 사이의 온도 구배 유지는 도 4F에 예시된 바와 같이 모세관 증발로 이어지고, 여기서 빠른 증발이 달성될 수 있다. 액체 수준이 모세관 멤브레인으로 후퇴함에 따라, 모세관 증발 현상은 압력 구배 및 온도 구배가 유지되는 한 여전히 실현된다. 일부 측면에서, mRNA 또는 그의 조성물 하에 모세관 네트워크는 데시케이션 동안 증발 과정을 보조할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 기저에 있는 모세관 베드를 효과적으로 제공하도록 데시케이션 챔버의 벽을 패턴화하거나 윤곽화함으로써 (예를 들어, 도 1b 및 6a 참조) 또는 멤브레인 사용과 같이 연속 모세관 네트워크의 다공성 물질을 제공함으로써 (예를 들어, 도 3 참조) 모세관이 제공될 수 있다. 일부 측면에서, 다공성 물질 및/또는 패턴화된 및/또는 윤곽이 있는 표면에 의해 제공된 모세관 네트워크는, 기공이 유리화를 보조하기 위해 기저에 있는 모세관을 제공하도록 약 20 ㎛ 이하의 기공을 특징으로 한다. 일부 측면에서, 기복이 있는 베드에서 기공 또는 피크 대 피크 거리는 약 20 ㎛ 내지 약 0.1 ㎛의 평균 개구를 가질 수 있고, 이는 약 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 및 0.2 ㎛를 포함한다. 모세관 채널은 채널을 형성하는 기판의 두께 또는 하나 또는 복수의 개별 채널 자체에 의해 임의로 정의된 길이를 가질 수 있다. 모세관 채널 길이는 임의로 약 1 밀리미터 이하이지만, 이러한 치수로 제한되도록 해석되어선 안 된다. 임의로, 모세관 채널 길이는 약 0.1 마이크로미터 내지 약 1000 마이크로미터, 또는 임의의 이들 사이의 값 또는 범위이다. 임의로, 모세관 채널 길이는 약 5 내지 약 100 마이크로미터, 임의로 약 1 내지 약 200 마이크로미터, 및/또는 임의로 약 1 내지 약 100 마이크로미터이다. 모세관 채널 길이는 임의로 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 마이크로미터이다. 일부 측면에서, 모세관 채널의 길이는, 임의로 불균일한 변동으로, 복수의 모세관 채널 전반에 걸쳐 달라진다.
모세관 채널(들)의 단면적은 약 2000 ㎛2 이하일 수 있다. 임의로 단면적은 약 0.01 ㎛2 내지 약 2000 ㎛2, 임의로 약 100 ㎛2 내지 약 2000 ㎛2, 또는 임의의 이들 사이의 값 또는 범위이다. 임의로, 모세관 채널(들)의 단면적은 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 ㎛2 이하이다.
모세관 보조 증발률은 하기 둘 다에 의해 영향 받을 수 있다: 대기 요건 (증발 표면에서의 공기/기체의 습도, 온도 및 속도), 및 (i) 구동 모세관력을 생성하는 모세관 채널의 특징, (ii) 액체 메니스커스 깊이, 및 (iii) 모세관을 통한 유동에 대한 점성 저항. 그 결과, 모세관 특성, 수송 공정, 및 경계 조건 사이의 복잡하고 고도로 동적인 상호작용은 폭넓은 범위의 증발 거동을 초래한다. 빠른 건조를 위해, 핵심 파라미터는 하기를 포함할 수 있다: (1) 증발 표면에서 형성을 지지하고 액체 네트워크를 유지하는 조건 및 (2) 증발 표면에서 물을 공급하기에 충분한 유동을 유도하는 모세관 압력의 형성을 촉진하는 특징.
일부 측면에서, 다공성 물질은 융기되고/거나 윤곽이 있을 수 있거나 융기된 및/또는 윤곽이 있는 기저에 있는 지지 기판 상에 배치될 수 있고, 그에 따라 다공성 물질은 그 위에 배치되거나 압착될 때 유사한 형상을 채택한다. 패턴화된 물질의 윤곽 및/또는 융기는 표면적을 증가시켜 증발에 대한 증가된 노출을 제공할 수 있다.
추가의 측면에서, 다공성 물질의 증가된 표면적은 멤브레인의 배열 또는 형상화에 의해 달성될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 윤곽이 있는 벽을 갖는 데시케이션 챔버는 다공성 물질에 대한 증가된 표면적을 제공할 수 있다. 그러나, 다른 방식의 평평한 다공성 물질의 형상화는 효율적인 모세관 보조 증발을 위한 개선된 표면적을 추가로 제공할 수 있다 (예를 들어, 도 6a 및 b 참조).
일부 측면에서, 멤브레인은 친수성이다. mRNA는 물 또는 수계 용액 중에서 가용성일 수 있음이 인식될 것이다. 일부 경우에, mRNA는 본원에 기재된 바와 같은 지질 또는 LNP 또는 유사 기반 비히클의 내부에서 용액 중에 있다. 따라서, 수용액을 밀어내지 않는 모세관 네트워크를 갖는 것이 유리할 수 있다. 데시케이션됨에 따라 mRNA 조성물로부터 배출된 물을 단리하기 위해 친수성 모세관 시스템을 갖는 것이 또한 유리할 수 있다. mRNA 또는 mRNA 조성물 및/또는 유리화 매질로부터의 수용액의 급속한 및/또는 효율적인 흡수는 재가용화에 대한 기회를 막거나 감소시키고/거나 재흡수는 전체 유리화 공정을 개선할 것임이 추가로 인식될 것이다.
일부 측면에서, 모세관 네트워크는 친수성 물질의 것이다. 다른 측면에서, 모세관 네트워크는 소수성 물질의 것이고 성질상 친수성 또는 보다 친수성이 되도록, 플라즈마 처리를 통한 것과 같이 추가로 처리될 수 있다. 도 9에 도시된 바와 같이, 원래 소수성인 멤브레인을 저온 플라즈마로 처리하여 이를 보다 친수성으로 만들었다. 멤브레인 상의 약물 제제 현탁에 따라, 액체는 거의 구형인 액적 (좌측 상단)을 형성한 반면 친수성 멤브레인은 액체가 기저에 있는 모세관 채널 내로 유동할 수 있게 하였다. 유리화 공정 동안, 소수성 멤브레인 상의 액체 액적은 먼저 비등되고 이어서 동결된 반면, 친수성 멤브레인 상의 액체는 급속히 유리화되어 유리질 단일체를 형성하였다. 진공 해제에 따라, 동결된 액적은 다시 액체로 되었지만, 크기가 감소되어 부분적 수분 손실이 있었다. 유리화에 대한 모세관 증발의 효능은 친수성 멤브레인에서 보이는 균일한 유리화에서 명백하다.
유리화 방법
일부 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물은 코팅되고 유리화 매질 중에 침지되고 지지 기판 상에 배치되어 모세관 작용을 제공하여 본원에 기재된 바와 같은 유리화 단계 동안 이를 유지한다. 특정 측면에서, 모세관 네트워크는 유리화 혼합물의 일부를 흡수하면서 유체의 박층이 멤브레인 위에서 유지될 수 있게 한다. 추가의 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물은 압력이 유리화 혼합물 주위에서 낮아짐에 따라 유리화된다. 열의 적용은 mRNA 또는 그의 조성물 또는 유리화 매질의 결정화를 막으면서 모세관 네트워크에 걸친 열 구배의 적용은 비등을 막을 것이며, 이들 모두 총체적으로 mRNA 및/또는 그의 조성물의 균일하고 완전한 유리화를 가능하게 한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물의 유리화 방법에 관한 것이다. 방법은 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물을 제조하는 것을 포함한다. 예를 들어, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물 및 유리화 매질의 유리화 혼합물이 고체 지지 기판 상에 또는 그와 접촉하여 배치된다. 일부 측면에서, 기저에 있는 고체 지지체는 기저에 있는 모세관 네트워크를 제공하도록 윤곽이 있고/거나 융기된다. 일부 측면에서, 기저에 있는 지지체는 데시케이션 챔버의 부분, 예컨대 그의 벽이다. 다른 측면에서, 다공성 멤브레인이 유리화 혼합물과 고체 지지체 사이에 배치될 수 있다. 일부 측면에서, 연속 모세관 네트워크는 유리화 혼합물을 지지하고 그로부터 유체를 끌어들인다. 모세관 네트워크 및/또는 다공성 물질은 모세관 네트워크의 표면 위에 액체의 존재 또는 고임을 피하도록 충분한 두께 또는 양을 가져야 한다.
본 개시내용의 유리화 방법은 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물을 함유하는 유리화 혼합물을 데시케이션 챔버 내에 배치하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 데시케이션 챔버는 그 안의 대기압 감소를 위한 진공 또는 다른 수단에 작동가능하게 연결된다. 특정 측면에서, 유리화 혼합물은 데시케이션 챔버 내의 다공성 또는 윤곽이 있는 물질 상에서 제 위치에서 유지된다. 일부 측면에서, 유리화 혼합물은 데시케이션 챔버의 부분 상에 배치되며, 여기서 부분은 기저에 있는 모세관 네트워크를 제공하도록 패턴화 및/또는 윤곽화된다. 일부 측면에서, 고체 지지 기판, 다공성 물질, 예컨대 멤브레인, 및 유리화 혼합물은 데시케이션 챔버 내에 배치된다.
일부 경우에, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물은 데시케이션 챔버 내에서 유리화 매질로 코팅되고/거나 그와 혼합될 수 있다. 다른 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물은 데시케이션 챔버 내의 배치 전에 유리화 매질과 함께 제조될 수 있다.
일단 조립되면, 본 개시내용의 방법은, 유리화 혼합물 주위의 대기압을 감소시키고/거나, 유리화 혼합물에 모세관-보조 증발을 제공하고/거나, 그 안에서의 비등 유도 또는 유리화 혼합물 또는 그 안에 하우징된 임의의 성분의 동결 없이 유리화 혼합물에 열 에너지를 적용하는 것을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 세 가지 모두의 적용은, 극저온 온도를 겪는 것을 피하고 비등을 피하면서, 유리화 혼합물의 급속하고 균일한 유리화 및 데시케이션을 제공함으로써, 공정 동안 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 그의 mRNA 백신 조성물에 대한 임의의 손상을 현저히 감소시키고, 재구성 후 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물의 활성을 현저히 개선할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 방법은 모세관 네트워크 상의 유리화 혼합물에 대한 낮은 대기압의 적용에 관한 것이다. 일부 측면에서는, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물이 동결 조건을 겪는 것을 피하도록 열을 추가로 제공하면서 저압이 적용된다. 본 개시내용은 유리화 혼합물의 균일하고 급속한 유리화를 달성하도록 낮은 대기압 및 열 에너지를 조합하는 유리화 공정에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 유리화 혼합물에 대한 열 에너지의 적용에 관한 것이며, 유리화는 감소된 대기압 하에 일어난다. 일부 측면에서는, 유리화 혼합물의 결정화를 막기 위해 유리화 혼합물에 열 에너지가 적용된다.
유리화 혼합물이 데시케이션 챔버 내에 배치되면, 그 안의 대기압을 낮춘다. 일부 측면에서는, 대기압이 그 안의 유리화 혼합물 또는 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물의 삼중점의 것 초과의 지점까지 낮아진다. 다른 측면에서는, 물의 삼중점의 것 초과의 지점까지 대기압이 낮아진다. 추가의 측면에서는, 압력이 데시케이션 챔버 내에서 약 0.04 atm까지 낮아진다.
일부 측면에서는, 유리화 혼합물이 모세관 네트워크 상에서 유리화를 겪음에 따라 그에 열 에너지가 적용된다. 일부 측면에서, 기저에 있는 모세관 네트워크는 유리화 혼합물을 비등으로부터 보호하면서 열 에너지를 수용하는 유리화 혼합물의 균일하고 완전한 유리화를 가능하게 할 수 있다. 모세관 네트워크는 모세관의 연속 네트워크일 수 있다. 일부 경우에, 모세관 네트워크는 기저에 있는 다공성 물질, 예컨대 멤브레인, 또는 기저에 있는 윤곽이 있는 또는 융기된 표면에 의해 제공될 수 있고, 여기서 그의 트로프 및 피크는 유리화 동안 액체 유리화 혼합물을 모세관 작용에 적용하기에 충분한 베드를 제공한다.
도 2a는 본 개시내용의 유리화 공정의 예시적 측면의 개요이다. 전형적인 유리화가 경로 1-2-3에 나타나 있고, 여기서는 유리 전이 미만으로의 액체 (생물학적 또는 다른 물질 함유)의 빠른 냉각이 동결 대역을 우회한다. 물질의 총 질량은 공정을 통해 보존된다. 다량 물질의 극저온 유리화는 열 전달 제한으로 인해 도전적일 수 있고, 따라서 일반적으로 상당한 표면/부피 비율을 제공하는 바이알 내에서 수행된다. 물질의 유리화는 또한 경로 1-5-6에서 보이는 데시케이션 (결정화 공정 우회)에 의해 달성될 수 있다. 이러한 측면에서, 상당한 질량 손실 (주로 물)이 나타난다. 생물학적 물질에 대한 전형적인 탈수 접근은 기판 상에 고착성 액적을 확립하고 낮은 습도의 인클로저에서 증발 데시케이션시키는 데 중점을 두었다. 공정은 느린 속도 및 불균일한 데시케이션에 의해 마킹된다. 그 안의 생물학적 물질이 데시케이션됨에 따라 액체와 증기 사이의 계면에 유리질 스킨이 형성된다. 유리질 스킨의 형성은 유리화 혼합물의 추가 데시케이션을 늦추고 궁극적으로 막음으로써, 유리화 혼합물을 샘플에 걸쳐 물 함량의 상당한 공간적 비-균일성을 갖는 특정 수준의 건조로만 제한한다. 그 결과, 일부 영역은 유리화되지 않지만 높은 분자 이동성을 유지함으로 인해 이제 분해될 것이다. 데시케이션율은 큰 표면 대 부피 비율에 의해, 또한 구체적으로 감압에서 촉진될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 도 2a의 경로 1-4-6에 관한 것이며, 여기서 유리화 혼합물의 요망되는 온도 및 저압의 유지는 거의 극저온 온도 및 데시케이션의 하이브리드를 제공한다. 그러나, 보다 낮은 압력에서는 비점이 감소한다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 물의 삼중점 초과의 저압 유지는 유리화 혼합물의 유리화에 대한 동결과 비등 사이의 온도 윈도우를 제공할 수 있다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 적용된 온도는 낮은 적용 압력에서 유리화 혼합물의 극저온점 초과의 온도를 유지한다. 추가로 도 2 및 도 4에 도시된 바와 같이, 적용된 낮은 주변 압력으로부터의 온도 감소는 유리화 혼합물의 온도가 비등 없이 유리 전이 온도 미만으로 떨어지는 것을 가능하게 하여, 유리화 혼합물 전반에 걸쳐 균일한 유리화를 제공한다.
도 4A는, 연속 모세관 채널의 멤브레인의 도입을 통한 것과 같이, 모세관 증발을 용이하게 하기 위해 모세관의 네트워크의 다공성 물질을 배치함으로써 진공 하에 보다 큰 부피의 액체의 빠른 데시케이션이 어떻게 편리하게 달성될 수 있는지를 나타낸다. 그러나, 액체가 모세관 멤브레인의 표면 상에 축적될 때, 축적된 액체에서 비등이 여전히 일어날 수 있고, 이는 본원에 기재된 바와 같이 바람직하지 않을 수 있다. 표면과 벌크 액체 사이의 온도 구배의 존재는 도 4E 및 4F에 예시된 바와 같이 모세관 증발을 가능하게 하고, 여기서 빠른 증발이 달성될 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 일부 측면에서, 유리화 혼합물 중에 존재하는 유체의 부피는, 유체가 표면 상에서의 넘침 또는 고임 없이 모세관 네트워크를 충전시킬 수 있도록 확립될 수 있다.
도 5는 기저에 있는 고체 지지체로서의 와이어 메쉬 및 다공성 물질로서의 그 위의 유리 멤브레인으로부터의 37℃ 열 적용에서 나타난 결과를 도시한 것이다. 도 5는 액체 로딩이 일정하게 유지될 때 압력이 낮아진 후 샘플 온도가 회복되는 속도와 멤브레인 및 부피 크기 사이의 비교를 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 모든 경우에, 진공의 적용은 유리화 혼합물의 온도의 급속한 강하를 초래하지만, 보다 작은 멤브레인은 출발 온도로의 복귀에 의해 관찰되는 바와 같이 보다 빠른 완전한 유리화를 생성하였다. 추가로 도 5를 참조하면, 유리화가 완료되면 샘플의 온도가 정체됨이 보인다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 방법은 유리화 혼합물의 모세관 보조 증발을 제공하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 윤곽이 있는 및/또는 융기된 지지체에 의해 또는 다공성 멤브레인에 의해 제공된 기저에 있는 모세관 네트워크는 증발 향상을 위해 필요한 필수적 특징을 제공할 것이다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 방법은 데시케이션 시간 동안 수행될 수 있다. 데시케이션 시간은 유리화 매질을 유리화하기 위한 적합한 건조를 촉진하기에 충분한 시간이다. 데시케이션 시간은 임의로 약 1초 내지 약 1시간이며, 이는 임의로 약 10 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 40 min, 45 min, 50 min 및 55 min을 포함하나 임의로 이를 초과하지 않는다. 임의로, 데시케이션 시간은 약 1초 내지 약 30 min, 임의로 약 5초 내지 약 10 min이다.
유리화된 조성물
일부 측면에서, 본 개시내용은 유리화된 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물에 관한 것이다. 유리화된 mRNA 백신 조성물은 지질 나노입자 (LNP) 또는 지질-유사-나노입자 내에 캡슐화된 적어도 하나의 단일 가닥 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 유리화된 mRNA 백신 조성물은 그에 안정성을 제공하기 위해 LNP 또는 LLN 내의 mRNA 주위의 또는 그 근처의 및/또는 LNP 또는 LLN 주위의 것과 같은 유리화된 유리화 매질을 추가로 포함할 수 있다. LNP 및/또는 LLN은, 임의로 콜레스테롤, PEG 및/또는 헬퍼 지질, 예컨대 DOTAP, DOPE, DOPC 등과 함께, 이온화성 지질을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 유리화된 mRNA 조성물은 유리화된 또는 데시케이션된 유리화 매질을 통해 모세관 네트워크, 예컨대 멤브레인에 부착될 수 있다.
저장
특정 측면에서, 본 개시내용은 유리화된 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물의 취급 및 저장에 관한 것이다. 활용되는 모든 물질과 같이, 유리화 공정 동안, 또한 그 후에 수행되는 임의의 취급, 저장 또는 재구성 단계에서, RNAse를 포함한 분해 효소의 잠재적 공급원에 유리화 조성물이 노출되는 것을 피하기 위해 주의를 기울일 수 있다.
유리화 단계 후, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물은 모세관 멤브레인 상의 유리화 매질에서 탈수된 상태로 효과적으로 보존될 것이다. 유리화된 분자는 그 위에 남아 밀봉된 환경으로 이동할 수 있다. 유리화 혼합물이 데시케이션 챔버 내에 있는 측면에서는, 모세관 네트워크 또는 데시케이션 챔버 자체가 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물을 습도 및 분해 효소로의 노출로부터 보호하기 위해 밀봉 또는 폐쇄된 환경으로 이동할 수 있다.
일부 측면에서는, 이어서, 유리화된 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물이 임의의 요망되는 온도에서 저장될 수 있다. 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물이 탈수된 상태에 있음에 따라, 이 시점에서 극저온 미만 온도로의 노출은, 결정 구조로 재배열하는 그 안의 분자의 능력이 그 안의 분자의 탈수, 유리화된 상태로 인해 무효화되기 때문에, 유리화 전에 예상할 수 있는 것과 동일한 결정화를 초래하지 않을 것이다. 따라서, 유리화된 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물은 약 -80℃ 내지 약 -20℃ 내지 약 -5℃ 내지 약 0℃에서 저장될 수 있다.
유리화된 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물의 저장은 구조적 온전성 및 활성을 유지하기 위해 0 또는 영하의 온도일 필요가 없다. 본원에서 입증되는 바와 같이, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물은 구조적 온전성 또는 기능적 활성 (예를 들어 mRNA의 번역)의 상당한 손실 없이 적어도 수 개월로 연장되는 기간 동안 실온 (예를 들어 약 20 내지 약 34℃)에서 연장된 기간 동안 저장될 수 있다. 유리화된 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물은 또한 수 주 및 수 개월을 포함한 연장된 기간 동안 최대 약 50, 55, 또는 60℃를 포함한 보다 고온에서 저장될 수 있다.
다른 측면에서, 유리화된 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물은 동결점 미만 내지 40℃ 이상 (최대 60℃ 이상 포함)의 계절 변동을 견디는 것을 포함한 기능적 활성을 유지하기 위해 일정한 또는 거의 일정한 온도에서 저장될 필요가 없다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는, 특히 고온에서, 높은 습도를 갖는 상당한 환경에 대한 노출의 개선 또는 의도적 방지로 저장이 연장될 수 있음을 인식할 것이다. 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물이 유리화된 상태에 있음에 따라, 수분에 대한 노출 방지는 기능적 활성의 손실에 대한 임의의 예상 없이 재구성되는 능력을 연장하고 보존할 수 있다. 유리화된 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물이 주변 대기로부터 더 많이 물을 흡수하도록 허용될수록, 활성 또는 유지된 구조의 절충이 더 빠르게 예상될 수 있다.
일부 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물의 저장은 주변 대기로부터의 임의의 물 흡수를 막는 것을 돕기 위해 밀봉 및/또는 데시케이션제의 포함을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물은 2-20일 동안 극저온 온도 초과에서 저장되면서 생존가능하게 유지될 수 있다. 다른 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물은 10주 동안 극저온 온도 초과에서 저장되면서 생존가능하게 유지될 수 있다. 다른 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물은 최대 1년 동안 극저온 온도 초과에서 저장되면서 생존가능하게 유지될 수 있다. 다른 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물은 최대 10년 동안 극저온 온도 초과에서 저장되면서 생존가능하게 유지될 수 있다.
재구성
일부 측면에서, 본 개시내용은 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물 본원에 개시된 바와 같은 분자 및 조성물을 재구성하고/거나 정제하는 것을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물은 수용액, 예컨대 물 또는 염 및/또는 완충 수용액, 또는 지질 나노입자, 콜레스테롤 등을 형성하기 위한 지질 등의 캡슐화 조성물을 포함하는 용액과의 재구성에 의해 정제될 수 있다. 요망되는 경우, 재구성된 물질의 정제는, 크로마토그래피 방법, 예컨대 mRNA에 결합하기 위한 poly(T) 또는 poly(U) 커플링된 수지의 사용, 그 후 높은 염 및/또는 높은 pH로의 변성 용리를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 모세관 네트워크 또는 멤브레인으로부터 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물을 용리하는 것에 관한 것이다. 용리는, 유리화된 물질이 물을 재흡수하고 네이티브 상태로 복귀되도록 하는 멸균 또는 정제수 또는 멸균/정제 식염수 또는 완충 용액 또는 수성 매질로의 재수화에 의해 달성될 수 있다. 일부 측면에서, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물의 재구성은 재구성 매질 중에 이들이 존재하게 할 것이며, 기저에 있는 모세관 시스템은 그로부터 제거되거나 단리될 수 있다.
본 개시내용은, 일부 측면에서, 재구성된 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물을 추가의 조성물, 예컨대 백신 조성물에 첨가하거나 대상체에 대한 투여를 보조하기 위해 비히클을 그에 첨가하는 것에 관한 것이다. 본 개시내용은 부분적으로 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물의 유리화에 관한 것이지만, 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물을 유리화하고, 재구성 후, 대상체에 대한 투여를 위한 것과 같이, 조성물을 완전히 하기 위해 필요한 추가 성분을 첨가하는 것이 추가의 측면이다. 이러한 추후 단계는 본원에 기재된 바와 같은 조성물 중에서 mRNA를 캡슐화하고/거나 아주반트 등의 추가 비히클을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, mRNA가 재구성되고 이어서 재구성된 mRNA의 캡슐화를 가능하게 하도록 LNP의 지질 또는 성분과 혼합될 수 있다.
재구성된 지질 입자, 하나 이상의 카고 분자를 하우징하는 지질 입자, mRNA, mRNA 조성물, 또는 mRNA 백신 조성물은 외인성 표적에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 대상체에게 전신 또는 국소 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "대상체"는 동물, 임의로 인간, 비-인간 영장류, 말, 소, 쥐, 양, 돼지, 토끼, 또는 기타 포유동물이다. 임의로, 대상체는 인간이다. 유리화된 mRNA는 투여 전에, 임의로 투여 직전에, 임의로 투여 시점에 또는 실질적으로 그 근처에 시린지 또는 다른 투여 장치 내에서 재구성될 수 있다. 투여는 경구, 주사, 비강, 질, 협측, 또는 다른 요망되는 투여 경로일 수 있다. 임의로, 재구성된 mRNA는 주사, 임의로 근육내 주사, 피내 주사, 피하 주사, 복강내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 개시내용의 다양한 측면이 하기 비-제한적 실시예에 의해 예시된다. 실시예는 예시를 위한 것이며 본 발명의 임의의 실행에 대한 제한이 아니다. 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 변동 및 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.
실시예
mRNA 양 및 활성의 검사를 위해, 3' 말단에 5' 캡1 구조 및 poly(a) 테일을 갖는 녹색-형광 단백질 (GFP)을 코딩하는 mRNA를 얻었다 (알데브론(Aldevron, 미국 위스콘신주 매디슨)으로부터의 대셔(Dasher) GFP). GFP는 세포 또는 조직에서 mRNA 전달 및 발현을 쉽게 추적하고 분석하기 위해 밝은 형광을 갖는 26.6kDa 발현 단백질을 제공하기 때문에 이것이 선택되었다.
유리화 공정이 mRNA 양 및 mRNA 활성 둘 다에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 결정하기 위해, 하기 변수 및 대조군을 확립하고 검정하였다:
신선한 mRNA
mRNA 없음/단지 비히클
-20℃에서 저장된 유리화된 mRNA
-20℃에서 저장된 유리화되지 않은 mRNA
28℃에서 저장된 유리화된 mRNA
28℃에서 저장된 유리화되지 않은 mRNA
55℃에서 저장된 유리화된 mRNA
55℃에서 저장된 유리화되지 않은 mRNA.
모든 경우에, mRNA를 (적절한 경우) 식별 조건에서 저장 3, 7 및 14일 후에 검사하였다. RNA를 260/280 nm 광 분광광도법에 의해 정량화하고, 활성을 상대적 형광 단위 검정에 의해 정량적 및 육안 둘 다로 결정하였다. GFP 활성에 대하여, CHO-K1 세포를 수집/제조 후 트랜스펙션시키고, 발현을 위해 24시간 두었다. 도 9는 평가된 저장 및 시간 조건의 개요 뿐만 아니라 비교 및 검증을 위해 포함된 다양한 대조군을 나타낸다.
각 평가일 1일 전에, 세포를 제조하고 확립될 수 있게 하였다. 40,000개의 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 96-웰의 평평한, 투명 저부 조직 배양 플레이팅으로 웰 당 플레이팅하고 2-4℃에서 저장하였다.
샘플에 대하여, 적절한 양의 mRNA 검출을 가능하게 하도록 3 마이크로그램 (μg)의 mRNA를 활용하면서, 하단 양이 적절하게 회수될 수 있는지를 추가로 평가하였다.
유리화 공정을 위해, mRNA를 이전에 0.2 ㎛ PES 멤브레인 필터를 통해 멸균되었던 2x 유리화 매질 (0.454 그램 (g) 트레할로스, 0.023 g 글리세롤 및 724 μL PBS)과 1:1 비율로 혼합하였다. 유리화 혼합물을 안에 와이어 메쉬를 갖는 커버링된 페트리 접시에서 30분 동안 폴리에테르술폰 (PES) 디스크 멤브레인 상에서 무균 조건에서 유리될 수 있게 하였다.
저장을 위해, 유리화되면, 조직 카세트를 안에 데시케이션제를 갖는 호일 파우치 내에 삽입하고, 진공 밀봉하였다.
유리화되지 않은 샘플에 대하여, 스톡 mRNA를 미세원심분리기 튜브에 분배하고, 이를 호일 파우치 내에 배치하고 진공 밀봉하였다.
유리화된 및 유리화되지 않은 그룹 각각을 상이한 저장 조건 (-20, 28 및 55℃)에 대한 그룹으로 나누었고, 이용가능한 샘플을 제0, 1, 3, 7 및 14일에 얻었다.
유리화된 샘플의 재구성을 위해, 50 μL의 플루오로브라이트(Fluorobrite) DMEM을 mRNA에 적용하여 60 ng/μL의 최대 농도를 제공하였다.
이어서, 제조업체의 지시에 따라 제조된 신선한 mRNA 샘플과 함께, 유리화된 및 유리화되지 않은 샘플로부터 mRNA 농도를 측정하였다. 이어서 mRNA를 각각으로 정규화하여 등량의 mRNA의 형질도입을 제공하였다.
mRNA의 형질도입을 위해, 제조업체에 따른 프로토콜을 따랐다 (리포펙타민 메신저 MAX- 써모피셔(ThermoFisher)). 간단히, 1.25 μL의 리포펙타민 메신저 MAX 및 3.75 μL의 매질과 인큐베이션된 1.25 μg의 mRNA를 3.75 μL의 매질과 인큐베이션하고, 이어서 둘을 조합하여 인큐베이션하였다. 이어서 10 μL의 mRNA-리포펙타민 혼합물을 CHO 세포의 웰마다 첨가하였다. 495 nm에서 여기가 제공되고 525 nm에서 검출되는 플레이트 판독기를 사용하여 형질도입 1일 후에 세포를 평가하였다. 이어서 세포를 GFP (녹색) 채널을 사용하여 이미징하였다.
각 시점에, 참조 시점 전날 세포를 플레이팅하고, 세포로의 형질도입 다음날 형광을 검정하였다. 예를 들어, 제0일에 대해서는, 세포를 제-1일에 플레이팅하고 제1일에 형광 검정하였다. mRNA를 호일 파우치 내 밀봉 직후에 재구성하였다. 제1일에 대해서는, 세포를 제0일에 플레이팅하고, 제2일에 형광 검정하였다. 제3일에 대해서는, 세포를 제2일에 플레이팅하고, 제4일에 형광 검정하였다. 제7일에 대해서는, 세포를 제6일에 플레이팅하고, 제8일에 형광 검정하였다. 제14일에 대해서는, 세포를 제13일에 플레이팅하고, 제15일에 형광 검정하였다.
제0일 결과:
재구성 직후, 표준 260/280 UV 프로토콜을 사용하여 유리화된 mRNA 농도를 측정하였다. 표 1은 얻어진 mRNA 농도를 나타낸다 (예상된 것은 50 μL에서 재구성되는 3 μg을 기준으로 하여 60 ng/μL임).
표 1
Figure pct00002
형광으로 얻은 결과는 나타내지 않음.
제3일 결과:
재구성 직후, 표준 260/280 UV 프로토콜을 사용하여 유리화된 mRNA 농도를 측정하였다. 도 10은 얻어진 mRNA 농도를 나타낸다 (예상된 것은 50 μL에서 재구성되는 3 μg을 기준으로 하여 60 ng/μL임). 도 11은 얻어진 형광을 나타내고, 도 12는 관찰된 형광의 캡처 이미지를 제공한다. 둘 다, 저장 3일 후, 55℃에서도, 유리화된 mRNA가 CHO 세포로의 형질도입 후 탁월한 농도 회수 및 기능적 활성을 나타내었음을 보여준다.
제7일 결과.
재구성 직후, mRNA의 농도를 얻고 (도 13), 이어서 전날 플레이팅된 CHO 세포로 형질도입하였다. 인큐베이션 24시간 후, 형광을 검정하였다 (도 14). 55℃에서의 저장에서도, 우수한 mRNA가 회수되었고 탁월한 시험관내 활성을 나타낸 반면, 유리화되지 않은 mRNA는, -20℃에서도 불량한 수율 및 불량한 형광을 나타내었다.
제14일 결과.
제1일에, 얻어진 mRNA의 농도가 도 15에 나타나 있다. 명백히 모든 유리화된 저장 온도에서의 회수는 mRNA의 탁월한 회수를 나타낸 반면, 본원에 제공된 바와 같은 공정에 따른 유리화 없이 mRNA는 급속히 분해되었다. 유사한 결과가 기능적 활성에서 관찰되고, 여기서 유리화는 55℃에서 14일 동안 저장 후에도 mRNA의 기능적 번역 활성이 보존될 수 있게 하였다.
mRNA 백신 안정성
요망되는 항원을 코딩하는 mRNA를, mRNA를 캡슐화하도록 임의로 콜레스테롤, PEG 및 헬퍼 지질과 함께, 이온화성 지질과, 또는 리포펙타민 메신저 MAX (인비트로겐)와 인큐베이션하고, 이어서 유리화 매질과 인큐베이션하고, PES 멤브레인 상에 배치할 수 있다. 멤브레인을 와이어 메쉬 상의 페트리 접시에 배치하여 열을 제공하거나, 또는 지지체 스캐폴드를 갖는 시린지 (실린더형 지지체로서)로 롤링하여 멤브레인이 시린지의 벽 상에 직접 놓이지 않게 하여 열 구배를 가능하게 하였다 (도 7a 및 7b 참조). 이어서 시린지를 가열된 블록 내에 배치하거나 그 안에서 가열 부재를 낮출 수 있다.
PES 멤브레인 상의 유리화 혼합물에 약 55℃의 열을 적용하여 mRNA-LNP 조성물이 동결되지 않도록 함에 따라 시스템의 압력을 약 0.04 atm으로 낮추었다. 도 5는 진공이 적용됨에 따라 초기 강하로부터의 예상되는 온도 회복을 나타낸다. mRNA-LNP의 온도가 정체되면, 유리화가 완료된다. 이어서 유리화된 mRNA-LNP를, 필요시까지 임의로 그 안에 데시케이션제를 갖는 무균 용기 내에 밀봉할 수 있다. 밀봉된 유리화된 생성물을 임의로 실온에서 저장할 수 있다. 재구성되면, mRNA-LNP는 분해가 거의 없거나 없을 것으로 예상될 수 있고, 생체내 투여시 우수한 항원 제시를 나타낼 것이다.
리포펙타민 메신저 MAX (인비트로겐) 캡슐화된 mRNA 유리화/재구성의 mRNA 회수 결과가 도 17에 나타나 있다. 28℃에서 저장시에도 mRNA의 탁월한 회수가 달성된 반면 유리화 없이는 모든 mRNA가 분해된다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 유리화되고 모든 온도에서 저장된 리포펙타민 메신저 MAX (인비트로겐) 캡슐화된 mRNA는 세포의 트랜스펙션 후 GFP를 발현하는 능력에 있어 기능적 활성을 유지하였다.
유리화 공정으로부터 mRNA 샘플을 회수하는 능력을 추가로 평가하기 위해, 작은 부피의 녹색 형광 단백질 (GFP)을 코딩하는 mRNA를 활용하였다. 유리화 공정을 위해, 8 ㎛ PES 멤브레인 (모세관 기판)을 먼저 ¼ 인치 직경 크기로 절단하고 오토클레이빙하였다. PBS 중의 22.7 mg/mL 글리세롤 및 1200 mM (또는 454 mg/mL) 트레할로스를 함유하는 2X 유리화 매질 (VM)을 제조하고 이어서 등부피의 mRNA (대셔 GFP mRNA, 3870FS 알데브론) 스톡과 혼합하였다. 혼합물을 각각의 유리화 모세관 기판에 대한 6 μL 피펫팅 전에 5분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 멤브레인 상에 피펫팅한 후, 샘플을 중합체 뚜껑으로 커버링하고 유리화 챔버 내로 로딩하였다. 각각의 유리화된 샘플에 대하여, 총 6 μL를 유리화 전에 멤브레인으로 로딩하였고, 그 안에 3 μg의 mRNA를 포함하는 3 μL의 네이키드 mRNA 스톡이 존재하였다.
유리화 후, 샘플을 마일라 파우치 내에 밀봉하고 55℃에서 저장 후 시험하였다.
55℃에서의 유리화 저장 100일 후, 샘플을 짧은 와동으로 mRNA를 방출시키며 50 μL의 플루오로브라이트 매질로 재구성하였다. 이어서 바이오텍 시너지(BioTek Synergy) H1 마이크로플레이트 판독기에서 Take3 플레이트를 사용하여 mRNA를 정량화하였다. 표 2는 얻어진 정량화를 나타낸다.
표 2
Figure pct00003
이어서 mRNA의 부분을 트랜스펙션을 위해 또는 아가로스 겔 상에서의 가시화를 위해 사용하였다.
아가로스 겔에 대하여, 1.2% 아가로스 겔의 제1 레인에 3 μL의 염료 및 5 μL의 물을 갖는 3 μL의 밀레니움(Millennium)™ RNA 마커 (AM7150)의 래더를 사용하였다. 포지티브 대조군에 대하여, 스톡 mRNA를 하기 3개의 포지티브 대조군으로 125 ng/μL로 희석하였다: 묽은 mRNA 스톡을 125 ng/μL로, 이어서 1 μL의 묽은 스톡을 3 μL의 염료 및 5 μL의 물과 혼합하였다. 유리화된 샘플에 대하여, 125 ng의 재구성된 mRNA를 3 μL의 염료 및 5 μL의 물과 혼합하였다. 겔을 85V에서 1시간 동안 진행시킨 후, 겔을 SYBR 그린 II로 30 min 동안 진탕기 상에서 염색하였고, 이는 바이오라드(BioRad) 투과조명기로 판독되었다. 도 19A는 겔의 캡처 이미지를 나타내며, 레인 2 및 3은 -80℃에서 저장된 신선한 mRNA이고, 레인 4 및 4는 재구성된 유리화된 mRNA이고, 레인 5 및 6은 55℃에서 저장된 유리화되지 않은 mRNA이다.
트랜스펙션을 위해, 4 μL 리포펙타민 (리포펙타민™ 메신저MAX™ 트랜스펙션 시약, 리포펙타민™ 메신저MAX™ 트랜스펙션 시약)의 포지티브 대조군을 16 μL 매질에 첨가하고, 10분 동안 인큐베이션하였다. 또 다른 튜브에서, 1 μL의 mRNA (신선한 샘플)를 19 μL의 매질에 첨가하고, 10 min 동안 인큐베이션하였다. 이어서 두 용액을 혼합하고, 추가의 5분 동안 인큐베이션한 후 0.9x106 세포/mL CHO (차이니즈 햄스터 난소) 세포로 시딩된 10 μL 세포 플레이트로 옮겼다. 네가티브 대조군 및 유리화된 샘플에 대하여, 정량화 후 mRNA의 부피를 1 μg의 mRNA를 만드는 데 필요한 양으로 정규화하고, 10분 인큐베이션 후 리포펙타민에 첨가하였다. 도 19B는 GFP 발현의 수집된 이미지를 나타내며, 상단 패널은 신선한 mRNA의 포지티브 대조군이고, 중앙 패널은 55℃에서 저장된 유리화되지 않은 mRNA의 네가티브 대조군이고, 저부 패널은 재구성된 mRNA이다. 도 19C는 포지티브 대조군으로 얻은 것에 비해 얻어진 트랜스펙션 효율의 백분율을 나타낸다.
PES 멤브레인 상에서 유리화되고 55℃에서 100일 동안 저장된 mRNA는, -80℃에서 저장된 신선한 액체 mRNA와 유사한 mRNA 온전성, 순도, 및 안정성을 유지한다.
캡슐화된 RNA
다음으로 본원에 기재된 유리화 공정으로부터 재구성시 담체 및 캡슐화된 핵산 둘 다 어떻게 진행될 것인지에 대해 평가하였다. 렌티바이러스의 유리화가, 지질, 탄수화물 및 단백질을 함유하는 캡슐화 멤브레인을 제공할 뿐만 아니라 각각의 비리온 내에 캡슐화된 핵산을 제공하는 것으로 인해 선택되었다.
렌티바이러스 (Lenti-ORF 대조군 입자 (pLenti -C-mGFP), 오리젠(Origene), Cat PS100071V5I)를 사용 직전에 준비하였다. 필터 및 저장 온도의 잠재적인 영향이 해결되었다. 렌티바이러스에 사용된 MOI (감염 다중도)는 4이고, 웰 당 25,000개의 시딩 세포에 대해 웰 당 10 μL 바이러스 스톡이 필요하였다. 렌티바이러스를 1200 mM 트레할로스 및 10% w/v 글리세롤의 유리화 매질과 등부피 (10 μL 및 10 μL)로 혼합하여 각각의 샘플을 제조하였다. 각각의 샘플로부터의 분취량 (10 μL)을 24 hr 실온 물 세척 PES 멤브레인 (10 mm) 또는 멸균수 및 PBST 세척 네이키드 필터 (10 mm)에 제공하였다. PES를 절단하고 (10 mm 직경), RT에서 24h 수 중 세척하고, 37℃에서 1h 동안 건조시키고, 이어서 오토클레이빙함으로써 PES 멤브레인을 제조하였다. 네이키드 필터를 절단하고 (10 mm 직경), RT에서 10 min 수 중 세척하고, 이어서 RT에서 10 min 동안 PBST 0.05% 중에서 세척하고, 37℃에서 1h 동안 건조시키고, 이어서 오토클레이빙함으로써 네이키드 필터를 제조하였다.
가열 베드 온도를 37℃로 설정하여 유리화를 30 min 동안 수행하였다. 유리화 후 24℃ 또는 37℃에서 1, 2 및 3주 동안 저장하였다. 렌티바이러스 단독의 네가티브 대조군은 24℃ 또는 37℃ 둘 다에서 1, 2, 및 3주 동안 저장하였다. 유사하게 유리화 매질 중의 렌티바이러스의 네가티브 대조군 (유리화되지 않음) 또한 24℃ 또는 37℃ 둘 다에서 1, 2, 및 3주 동안 저장하였다.
형질도입을 위해, 1일 전, 25,000 세포 (HEK 293)를 투명한 평평한 저부 검정 플레이트를 갖는 96 웰 코스타(Costar) 블랙 상에 시딩하였다. 형질도입 당일에, 현미경으로 세포 컨플루언시(confluency)를 확인하였다 (70% 이상). 포지티브 대조군에 대하여, 30 μL의 렌티바이러스를 570 μL의 C-EMEM과 혼합하였고, 각각의 웰에 200 μL를 첨가하였다. 유리화된 샘플에 대하여, 2개의 유리화된 샘플을 275 μL의 C-EMEM 중에서 용리하고, 세포를 용리된 용액으로 웰에서 형질도입하였다. 단지 네가티브 대조군에 대하여, 30 μL의 렌티바이러스를 570 μL의 C-EMEM과 혼합한 후, 200 μL의 네가티브 대조군 용액을 각각의 웰에 첨가하여 세포를 형질도입하였다. 유리화 매질을 사용한 네가티브 대조군에 대하여, 30 μL의 렌티바이러스 + 30 μL의 유리화 매질을 540 μL의 C-EMEM에 첨가하고, 이어서 200 μL의 네가티브 대조군 용액을 각각의 웰에 첨가하여 세포를 형질도입하였다. 플레이트를 37℃에서 72 hr 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 형광 현미경을 사용하여 형질도입 후 사진을 얻었고, 플레이트 판독기로 GFP 발현을 측정하였다.
도 20은 렌티바이러스 단독 및 네이키드 또는 PES 필터 상의 유리화 직후에 대한 GFP 발현의 이미지 (도 20A) 및 형질도입의 퍼센트 (도 20B)를 나타낸다. 네이키드 필터 또는 PES 멤브레인 상에서 유리화 후 GFP 발현은 신선한 액체 렌티바이러스 대조군의 것과 유사한 세포 형질도입 효율 (형광 강도 기준)을 가졌다. 세포가 유리화 직후에 형질도입된 경우, 유리화된 렌티바이러스는 사용된 스캐폴드 (네이키드 필터 또는 PES)와 관계없이 -80℃에서 저장된 액체 렌티바이러스만큼 잘 기능하였으며, 이는 유리화 공정이 입자를 손상시키지 않았음을 나타낸다.
도 21은 24℃에서 저장 후 1, 2 및 3주에서의 GFP 발현을 나타낸다. 도 22는 24℃에서 2주 (도 22a) 및 3주 (도 22b) 저장 후 액체 렌티바이러스 포지티브 대조군에 대하여 각각 측정되고 설정된 형광 강도 기반의 형질도입 효율의 백분율을 나타낸다. 유리화된 렌티바이러스는, 사용된 스캐폴드 (네이키드 필터 또는 PES)에 관계없이, 24℃에서 3주 동안 저장에도 불구하고 모든 3개 측정에 의해 그의 기능적 활성을 유지한 반면, 네가티브 대조군은 현저한 기능 감소를 나타내었다.
유사하게, 도 23은 37℃에서 저장 후 1, 2, 및 3주에서의 GFP 발현을 나타내고, 도 24는 37℃에서 2주 (도 24a) 및 3주 (도 24b) 저장 후 액체 렌티바이러스 포지티브 대조군에 대하여 각각 측정되고 설정된 형광 강도 기반의 형질도입 효율의 백분율을 나타낸다. 유리화된 렌티바이러스는, 사용된 스캐폴드 (네이키드 필터 또는 PES)에 관계없이, 37℃에서 3주 동안 저장에도 불구하고 모든 3개 측정에 의해 그의 기능적 활성을 유지한 반면, 네가티브 대조군은 현저한 기능 감소를 나타내었다.
추가예
본 개시내용의 제1 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, a) 유리화 혼합물의 입자 및 유리화 매질을 포함하는 유리화 혼합물을, 모세관 네트워크를 포함하거나 이를 형성하는 기판 내에 또는 기판 상에 배치하고, 상기 기판을 데시케이션 챔버 내에 배치하는 단계; b) 데시케이션 챔버 내의 대기압을 낮추는 단계; c) 유리화 혼합물이 동결 조건을 겪는 것을 막기에 충분한 열 에너지를 지질 입자에 제공하는 단계; 및 d) 유리화 혼합물이 유리질 상태에 진입할 때까지 유리화 혼합물을 모세관 작용에 의해 데시케이션시키는 단계를 포함하는, 극저온 온도 초과에서의 하나 이상의 입자의 유리화 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제2 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 입자가 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 제1 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제3 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 폴리뉴클레오티드가 mRNA를 포함하고, mRNA가 입자 내에 캡슐화된 것인, 제2 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제4 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 입자가 바이러스 캡시드, 바이러스 엔벨로프, 또는 그의 부분을 포함하는 것인, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제5 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 입자가 세포 침투 펩티드 또는 담체 단백질을 추가로 포함하는 것인, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제6 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 세포 침투 펩티드 또는 담체 단백질이 폴리뉴클레오티드에 커플링된 것인, 제5 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제7 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 폴리뉴클레오티드가 양이온성 지질 및/또는 이온화성 지질로 구성된 지질 멤브레인에 의해 캡슐화된 것인, 제2 또는 제3 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제8 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 모세관 네트워크가 기판의 표면을 따르는 윤곽에 의해 제공된 것인, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제9 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 기판이 데시케이션 챔버의 벽이거나 데시케이션 챔버의 벽과 회합된 것인, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제10 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 데시케이션 챔버 내의 모세관 네트워크가 기저에 있는 고체 지지 기판에 의해 지지된 것인, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제11 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화 혼합물의 유리화가 30분 미만 내에 일어나는 것인, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제12 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화 혼합물의 유리화가 10분 미만 내에 일어나는 것인, 제11 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제13 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 열 에너지가 유리화 혼합물의 가열에 의해 제공되는 것인, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제14 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 대기압을 약 0.9 atm 내지 약 0.005 atm의 값으로 낮추는 것인, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제15 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 대기압을 약 0.004 atm으로 낮추는 것인, 제14 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제16 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제공된 열 에너지가 유리화 동안 유리화 혼합물 내의 결정화를 막기에 충분한 것인, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제17 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제공된 열 에너지가 상기 유리화 동안 생물학적 샘플을 약 0℃ 내지 약 40℃의 온도에서 유지하기에 충분한 것인, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제18 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 상기 유리화 매질이 디사카라이드, 임의로 트레할로스, 글리세롤 및 베틴 및/또는 콜린을 포함하는 것인, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제19 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 모세관 네트워크가 친수성인, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제20 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 모세관 네트워크가 연속 모세관 채널을 포함하는 것인, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제21 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 입자 조성물을 유리화 후에 적어도 3주의 기간 동안 60℃ 이하의 온도에서 저장하는 것인, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제22 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 입자가 수성 매질 중에서 재구성되고, 단계 a) 이전의 입자 또는 그의 내용물과 동등한 또는 거의 동등한 활성을 유지하는 것인, 제21 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제23 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화 매질이 세포 매질 중에 현탁된 트레할로스 및 글리세롤을 포함하는 것인, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제24 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화 매질이 세포 매질 중의 500 내지 1500 mM 트레할로스 및 5 내지 20 부피 기준 중량 퍼센트의 글리세롤을 포함하는 것인, 제23 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제25 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 단계 d) 후에 모세관 네트워크를 어두운 환경에 배치하는 것을 추가로 포함하는, 제1 내지 제3 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제26 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 어두운 환경이 5% 상대 습도 (RH) 미만의 대기로 유지되는 것인, 제25 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제27 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 어두운 환경이 2% RH 이하에서 유지되는 것인, 제26 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제28 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, a) 모세관 네트워크 상의 유리화 혼합물에 일정 부피의 용액을 제공하여 용리된 유리화 혼합물을 얻음으로써 제1 내지 제27 측면 중 어느 하나로부터 얻어진 유리화 혼합물을 재구성하는 단계; b) 모세관 네트워크로부터 용리된 유리화 혼합물을 얻는 단계; 및 c) 용리된 유리화 혼합물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 제29 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 입자가 약독화 바이러스를 포함하는 것인, 제28 측면의 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 제30 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 입자가 바이러스 단백질의 적어도 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 임의로 mRNA를 포함하는 것인, 제28 측면의 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 제31 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 폴리뉴클레오티드가 세포 침투 펩티드에 커플링된 것인, 제30 측면의 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 제32 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 폴리뉴클레오티드가 지질 멤브레인에 의해 캡슐화된 것인, 제31 측면의 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 제33 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 지질 멤브레인이 양이온성 지질을 포함하는 것인, 제31 측면의 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 제34 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 지질 멤브레인이 이온화성 지질을 포함하는 것인, 제31 측면의 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 제35 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 입자 내에 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 분자, 및 탈수된 유리화 매질을 포함하는 유리화된 폴리뉴클레오티드 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제36 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 폴리뉴클레오티드 분자의 동결 없이 유리화된, 제35 측면의 유리화된 백신 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제37 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 입자가 약독화 바이러스를 포함하는 것인, 제35 측면의 유리화된 백신 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제38 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 폴리뉴클레오티드 분자가 바이러스 단백질의 적어도 일부를 코딩하는 mRNA를 포함하는 것인, 제35 내지 제37 측면 중 어느 하나의 유리화된 백신 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제39 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 폴리뉴클레오티드 분자가 세포 침투 펩티드에 커플링된 것인, 제35 내지 제37 측면 중 어느 하나의 유리화된 백신 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제40 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 입자가 양이온성 지질을 포함하는 것인, 제35 내지 제37 측면 중 어느 하나의 유리화된 백신 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제41 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제1 내지 제27 측면 중 어느 하나에 의해 제조된 유리화된 혼합물을 포함하는, 대상체에서의 면역 반응 제공을 위한 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제42 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화된 혼합물이 어두운 데시케이션된 용기 내에 저장된 것인, 제41 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제43 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화된 혼합물을 재구성하기에 적합한 멸균 용매를 추가로 포함하며, 여기서 용매는 대상체에 대한 투여에 적합한 것인, 제41 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제44 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 바이알을 추가로 포함하는, 제41 내지 제43 측면 중 어느 하나의 키트에 관한 것이다.
본원에 나타내고 기재된 것들에 추가로, 본 개시내용의 다양한 변형이 상기 설명의 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
달리 명시되지 않는 한, 모든 시약은 관련 기술분야에 공지된 공급원에 의해 수득가능함이 인식된다.
또한, 특정 성분 및/또는 조건은 물론 변할 수 있기 때문에, 본 개시내용은 본원에 기재된 특정 측면 및 방법으로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 본 개시내용의 특정 측면을 설명하기 위한 것이며 어떠한 방식으로든 제한되도록 의도되지 않는다. 또한, 용어 "제1", "제2", "제3" 등이 본원에서 다양한 요소, 성분, 영역, 층, 및/또는 섹션을 설명하기 위해 사용될 수 있지만, 이들 요소, 성분, 영역, 층, 및/또는 섹션이 이들 용어에 의해 제한되어선 안 됨이 이해될 것이다. 이들 용어는 단지 하나의 요소, 성분, 영역, 층, 또는 섹션을 또 다른 요소, 성분, 영역, 층, 또는 섹션과 구별하기 위해 사용된다. 따라서, 하기에서 논의되는 "제1 요소", "성분", "영역", "층" 또는 "섹션"은 본원 교시로부터 벗어나지 않으면서 제2 (또는 다른) 요소, 성분, 영역, 층, 또는 섹션으로 불릴 수 있다. 유사하게, 본원에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는, 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한, "적어도 하나"를 포함한 복수형을 포함하도록 의도된다. "또는"은 "및/또는"을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "및/또는"은 관련 나열 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함한다. 용어 "포함하다" 및/또는 "포함하는" 및/또는 "포함한"은 본 명세서에서 사용시 언급된 특징, 영역, 정수, 단계, 작업, 요소, 및/또는 성분의 존재를 명시하지만, 하나 이상의 다른 특징, 영역, 정수, 단계, 작업, 요소, 성분, 및/또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않음이 추가로 이해될 것이다. 용어 "또는 이들의 조합"은 상기 요소 중 적어도 하나를 포함하는 조합을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 용어 (기술적 및 과학적 용어 포함)는 본 개시내용이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 통상적으로 사용되는 사전에 정의된 것들과 같은 용어는 관련 기술 및 본 개시내용의 맥락에서 그의 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본원에 명시적으로 그와 같이 정의되지 않는 한, 이상적인 또는 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않을 것임이 추가로 이해될 것이다.
본 발명자들에게 현재 공지된 본 개시내용을 실시하는 최선의 모드를 구성하는, 본 개시내용의 예시적 조성물, 측면 및 방법을 상세히 참조한다. 도는 반드시 축척에 따른 것은 아니다. 그러나, 개시된 측면은 다양하고 대안적인 형태로 구현될 수 있는 본 개시내용의 단지 예시임을 이해해야 한다. 따라서, 본원에 개시된 특정 상세사항은 제한적인 것으로 해석되어선 안 되며, 단지 본 개시내용의 임의의 측면에 대한 대표적인 기초 및/또는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 개시내용을 다양하게 사용하도록 교시하기 위한 대표적인 기초로서 해석되어야 한다.
본 명세서에 언급된 특허, 공개, 및 출원은 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 수준을 나타낸다. 이들 특허, 공개, 및 출원은 각각의 개별 특허, 공개, 또는 출원이 본원에 구체적 및 개별적으로 참조로 포함되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
상기 설명은 본 개시내용의 특정 실시양태의 예시이지만, 그의 실행에 대한 제한을 의미하지는 않는다. 그의 모든 등가물을 포함한 하기 청구범위는 본 개시내용의 범위를 정의하도록 의도된다.

Claims (44)

  1. a) 유리화 혼합물의 입자 및 유리화 매질을 포함하는 유리화 혼합물을, 모세관 네트워크를 포함하거나 이를 형성하는 기판 내에 또는 기판 상에 배치하고, 상기 기판을 데시케이션 챔버 내에 배치하는 단계;
    b) 데시케이션 챔버 내의 대기압을 낮추는 단계;
    c) 유리화 혼합물이 동결 조건을 겪는 것을 막기에 충분한 열 에너지를 지질 입자에 제공하는 단계; 및
    d) 유리화 혼합물이 유리질 상태에 진입할 때까지 유리화 혼합물을 모세관 작용에 의해 데시케이션시키는 단계
    를 포함하는, 극저온 온도 초과에서의 하나 이상의 입자의 유리화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 입자가 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 mRNA를 포함하고, mRNA가 입자 내에 캡슐화된 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 입자가 바이러스 캡시드, 바이러스 엔벨로프, 또는 그의 부분을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 입자가 세포 침투 펩티드 또는 담체 단백질을 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 세포 침투 펩티드 또는 담체 단백질이 폴리뉴클레오티드에 커플링된 것인 방법.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 양이온성 지질 및/또는 이온화성 지질로 구성된 지질 멤브레인에 의해 캡슐화된 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 모세관 네트워크가 기판의 표면을 따르는 윤곽에 의해 제공된 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 기판이 데시케이션 챔버의 벽이거나 데시케이션 챔버의 벽과 회합된 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 데시케이션 챔버 내의 모세관 네트워크가 기저에 있는 고체 지지 기판에 의해 지지된 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유리화 혼합물의 유리화가 30분 미만 내에 일어나는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 유리화 혼합물의 유리화가 10분 미만 내에 일어나는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 열 에너지를 유리화 혼합물의 가열에 의해 제공하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대기압을 약 0.9 atm 내지 약 0.005 atm의 값으로 낮추는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 대기압을 약 0.004 atm으로 낮추는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제공된 열 에너지가 유리화 동안 유리화 혼합물 내의 결정화를 막기에 충분한 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제공된 열 에너지가 상기 유리화 동안 생물학적 샘플을 약 0℃ 내지 약 40℃의 온도에서 유지하기에 충분한 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유리화 매질이 디사카라이드, 임의로 트레할로스, 글리세롤 및 베틴 및/또는 콜린을 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 모세관 네트워크가 친수성인 방법.
  20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 모세관 네트워크가 연속 모세관 채널을 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 입자 조성물을 유리화 후에 적어도 3주의 기간 동안 60℃ 이하의 온도에서 저장하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 지질 입자가 수성 매질 중에서 재구성되고, 단계 a) 이전의 입자 또는 그의 내용물과 동등한 또는 거의 동등한 활성을 유지하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유리화 매질이 세포 매질 중에 현탁된 트레할로스 및 글리세롤을 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 유리화 매질이 세포 매질 중의 500 내지 1500 mM 트레할로스 및 5 내지 20 부피 기준 중량 퍼센트의 글리세롤을 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d) 후에 모세관 네트워크를 어두운 환경에 배치하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 어두운 환경이 5% 상대 습도 (RH) 미만의 대기로 유지되는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 어두운 환경이 2% RH 이하에서 유지되는 것인 방법.
  28. a) 모세관 네트워크 상의 유리화 혼합물에 일정 부피의 용액을 제공하여 용리된 유리화 혼합물을 얻음으로써 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항으로부터 얻어진 유리화 혼합물을 재구성하는 단계;
    b) 모세관 네트워크로부터 용리된 유리화 혼합물을 얻는 단계; 및
    c) 용리된 유리화 혼합물을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 입자가 약독화 바이러스를 포함하는 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 입자가 바이러스 단백질의 적어도 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 임의로 mRNA를 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 세포 침투 펩티드에 커플링된 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 지질 멤브레인에 의해 캡슐화된 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 지질 멤브레인이 양이온성 지질을 포함하는 것인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 지질 멤브레인이 이온화성 지질을 포함하는 것인 방법.
  35. 입자 내에 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 분자, 및 탈수된 유리화 매질을 포함하는 유리화된 폴리뉴클레오티드 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자의 동결 없이 유리화된, 유리화된 백신 조성물.
  37. 제35항에 있어서, 입자가 약독화 바이러스를 포함하는 것인 유리화된 백신 조성물.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자가 바이러스 단백질의 적어도 일부를 코딩하는 mRNA를 포함하는 것인 유리화된 백신 조성물.
  39. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자가 세포 침투 펩티드에 커플링된 것인 유리화된 백신 조성물.
  40. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 입자가 양이온성 지질을 포함하는 것인 유리화된 백신 조성물.
  41. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 의해 제조된 유리화된 혼합물을 포함하는, 대상체에서의 면역 반응 제공을 위한 키트.
  42. 제41항에 있어서, 유리화된 혼합물이 어두운 데시케이션된 용기 내에 저장된 것인 키트.
  43. 제41항에 있어서, 유리화된 혼합물을 재구성하기에 적합한 멸균 용매를 추가로 포함하며, 여기서 용매는 대상체에 대한 투여에 적합한 것인 키트.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 바이알을 추가로 포함하는 키트.
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