DE19758073A1 - Verfahren zur Kryokonservierung menschlicher und tierischer hämatopoetischer Zellen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Cryokonservierung menschlicher und tierischer hämatopoetischer Zellen unter Verwendung des Disaccharids Trehalose als Cryoprotektivum entsprechend dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Damit menschliche und tierische hämatopoetische Zellen tiefgefroren werden können muß diesen ein Cryoprotektivum zugesetzt werden, welches die Zellen und deren Organellen beim Übergang von der flüssigen zur kristallinen Phase vor Membranschädigungen durch Eiskristalle und vor intrazellulärer Dehydratation schützt.

Es ist bekannt, daß abhängig von der Art der tiefgefrorenen Zellen das Einfrier- Auftauverfahren mit einem mehr oder weniger ausgeprägten Vitalitäts- und Funktionsverlust der Zellen verbunden ist. Bei den herkömmlichen Verfahren wird als Cryoprotektivum das Detergenz Dimethylsulfoxid in Konzentrationen bis zu 10% (v/v) entweder allein oder in Kombination mit Stärke eingesetzt (Luo K.H., Shi Y.K., Sun Y., et al.: A practical procedure for the cryopreservation of marrow cells intended for autotransplantation. Leukemia and Lymphoma 1995, 17: 495-499). Dimethylsulfoxid entfaltet seine protektiven Wirkungen vor allem intrazellulär durch eine Senkung des Gefrierpunktes, was zu einer verminderten Wasseraufnahme in Eiskristalle führt und damit die zelluläre Dehydration während des Gefrierens vermindert. Im Gegensatz hierzu entfalten Makromoleküle wie Stärke ihre Wirkung extrazellulär, indem sie eine schützende "Hülle" für die Zellen bilden und somit dem Flüssigkeitsverlust der Zellen während des Gefrierens entgegenwirken.

Dimethylsulfoxid besitzt als Detergenz jedoch bei Raumtemperatur eine direkte chemische Toxizität gegenüber hämatopoetischen Zellen (Douay L., Gorin N.C., David R., et al.: Study of granulocyte-macrophage progenitor (CFUc) preservation after slow freezing of bone marrow in the gas phase of liquid nitrogen. Experimental Hematology 1982, 10: 360-366), so daß, bei der therapeutischen Anwendung kryokonservierter hämatopoetischer Zellen, diese sofort nach dem Auftauen, d. h. mit möglichst niedriger Temperatur, infundiert werden müssen. Darüberhinaus wird Dimethylsulfoxid auch für eine Reihe von Nebenwirkungen (z. B. kardiale Funktionsstörungen) verantwortlich gemacht, die bei der Infusion von kryokonservierten Zellen am Patienten beobachtet wurden (Okamoto Y., Takaue Y., Saito S., et al.: Toxicities associated with cryopreserved and thawed peripheral blood stem cell autografts in children with activecancer. Transfusion 1993, 33: 578-581).

Das Disaccharids Trehalose wird in hohen Konzentrationen bei einer Reihe von Mikroorganismen gefunden, die eine vollständige Dehydratation überleben können. Hohe extrazelluläre Konzentrationen an Trehalose führen aufgrund einer erhöhten Membranper­ meabilität während des Einfriervorgangs zu einer intrazellulären Akkumulation von Trehalose. Intrazellulär kann Trehalose Membranen und Proteine vor Dehydratationsschäden beim Einfrieren schützen (Crowe J.H., Carpenter J.F., Crowe L.M., et al.: Are freezing and dehydration similar stress vectors? A comparison of modes of interaction of stabilizing solutes with biomolecules. Cryobiology 1990, 27: 219-231).

Aufgabe der im Patentanspruch 1 angegebenen Erfindung ist, bei der Kryokonservierung menschlicher und tierischer hämatopoetischer Zellen auf den Einsatz von Dimethylsulfoxid zu verzichten, aber dennoch lebende und funktionstüchtige Zellen nach dem Auftauen zu erhalten.

Dieses Problem wird durch die im Patentanspruch 1 aufgeführten Merkmale, d. h. durch den Zusatz des Disaccharids Trehalose, gelöst.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß kauf Dimethylsulfoxid vollständig verzichtet werden kann. Da Trehalose als Disaccharid keine chemische Toxizität gegenüber hämatopoetischen Zellen besitzt, können die wiederaufgetauten Zellen bei Raumtemperatur infundiert werden. Nebenwirkungen für den Patienten, die durch Kaltinfusion der Zellen hervorgerufen werden können, werden damit vermieden. Auch Nebenwirkungen am Patienten, die direkt durch Dimethylsulfoxid hervorgerufen werden, werden vermieden. Darüberhinaus ergeben sich deutliche logistische Vorteile, z. B. beim Transport der kryokonservierten Zellen. So kann beim Transport der Zellen zum Patienten auf die bei Dimethylsulfoxid-kryokonservierten Zellen notwendige Kühlung in flüssigem Stickstoff verzichtet werden.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird im folgenden näher beschrieben:

Bei der Kryokonservierung menschlicher hämatopoetischer Stammzellen werden diese zunächst entweder nach Stimulation des Spenders mit Wachstumsfaktoren durch Leukapherese oder durch Knochenmarkpunktion auf herkömmliche Weise gewonnen und antikoaguliert. Die durch Knochenmarkpunktion gewonnenen Zellen werden zunächst mittels des Zusatzes von Stärke durch Gravitationskraft von den Erythrozyten getrennt. Die mononukleären Zellen, unter denen sich auch die hämatopoetischen Stammzellen befinden, werden dann auf Eis gekühlt, mit RPM1 1640 Medium auf eine Zellzahl von 1 × 10⁷/ml eingestellt und mit Trehalose (Endkonzentration 0,5 oder 1 M) versetzt und nach Überführung in entsprechende Tiefgefrierbeutel kontrolliert, d. h. mit einem Einfriergerät, welches die entstehende Kristallisationswärme ausgleicht, bis -80°C tiefgefroren und anschließend in flüssigem Stickstoff gelagert. Das Auftauen erfolgt im Wasserbad bei 37°C. Die Vitalität der so tiefgefrorenen und aufgetauten Zellen liegt bei durchschnittlich 30% und ist der von Dimethylsulfoxid-kryokonservierten Zellen (34%) vergleichbar. Zur Beurteilung der Qualität der hämatopoetischen Vorläuferzellen wird die Potenz zur Koloniebildung im Methylzellulose-Assay herangezogen. Bei frischen, d. h. nicht tiefgefrorenen, Zellen findet sich eine Gesamtzahl von meist 400-500 Kolonien. Bei Dimethylsulfoxid-kryokonservierten Zellen können durchschnittlich 100 Kolonien ausgezählt werden. Bei den mit Trehalose tiefgefrorenen Zellen schwankt die Anzahl an Kolonien zwischen 127 und 230, was auf eine höhere Qualität der mit Trehalose kryokonservierten Zellen hinweist.

In einer nicht dargestellten Anwendung wird Trehalose zum Tiefgefrieren von anderen hämatopoetischen Zellen, wie Erythrozyten, Granulozyten oder Thrombozyten eingesetzt.

Claims (2)

1. Verfahren zur Kryokonservierung von menschlichen und tierischen hämatopoetischen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß als Kryoprotektivum das Disaccharid Trehalose verwendet wird

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kryokonservierung ohne die Verwendung von Dimethylsulfoxid durchgeführt wird.