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ALLGEMEINER
STAND DER TECHNIK
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Blut
besteht aus Plasma und Zellbestandteilen und spielt eine herausragende
Rolle in mehreren physiologischen Schlüsselsystemen des menschlichen
Körpers,
einschließlich
Immunologie, Hämostase
und Gewebesauerstoffversorgung. Der Transport der Atemgase Sauerstoff
(O2) und Kohlendioxid (CO2)
ist die Hauptfunktion der Erythrozyten oder roten Blutzellen. Dieser
erleichterte Transport von O2 und CO2 erfolgt durch Hämoglobin, ein eisenhaltiges,
aus mehreren Untereinheiten bestehendes Protein, das in den roten
Blutzellen enthalten ist. Die Notwendigkeit Hämoglobin in den roten Blutzellen
einzukapseln ist zweifach. Erstens hat Hämoglobin sehr spezifische Bindungsparameter,
um die Abgabe dieser kritischen Moleküle an die passenden Orte sicherzustellen.
Durch die Regulierung der Konzentration von Kofaktoren und freien
Ionen stellt die rote Blutzelle die passende Umgebung für die optimale
Aufnahme und Freigabe von O2 bereit. Zweitens
hat freies Häm
Toxizitätswirkungen
sowohl auf Nieren- als auch auf Lebersysteme und kann zu Leiden
wie etwa Hämoglobinurie
führen.
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Die
Strukturelemente der roten Blutzelle, die das das Hämoglobin
begrenzen, umfassen die Membran-Doppelschicht und das Zytoskelett.
Die Membran selbst enthält
Cholin und Aminophospholipide, Cholesterin und integrale Membranproteine.
Entlang der inneren Oberfläche
der Membran liegt das Zytoskelett. Dieses netzartige Skelett besteht
aus langen, filamentösen
Spektrinmolekülen,
die an Foci von F-Actin- und Protein-4.1-Komplexen miteinander verbunden
sind. Dieses zytoskeletale Netz ist mit der Membran durch Protein-Protein-Interaktionen
verknüpft,
wie etwa der Ankyrin/Protein-4.2-vermittelten
Verbindung von Spektrin und dem integralen Bande-3-Membranprotein und
möglicherweise über direkte
Protein-Lipid-Interaktionen.
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Durch
diese Verbindungen stellt das Zytoskelett die Stabilität und Form
der roten Blutzellen bereit. Fehlt die passende Bindung im zytoskeletalen
Netz oder die Verbindung des Zytoskeletts mit der Membran, führt das
zu einer kritisch geschwächten
roten Blutzelle. Es wurden mehrere menschliche Krankheiten identifiziert,
die entweder auf das Fehlen eines spezifischen Proteins oder eine
mangelhaften Proteininteraktion zurückzuführen sind. Die meisten dieser
Defekte führen
zu morphologisch abnormalen roten Blutzellen und schweren hämolytischen
Anämien.
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Eine
große
Vielzahl von Verletzungen und medizinischen Eingriffen erfordern
die Transfusion von Vollblut oder einer Vielzahl von Blutkomponenten.
Bluttransfusionen werden routinemäßig verwendet, um die Sauerstoffabgabekapazität und das
Kreislaufvolumen von Patienten zu erhöhen. Sicherer, schneller und
einfacher Zugriff auf transfusierbare Einheiten mit roten Blutzellen
ist nicht nur wichtig für
Traumaopfer mit massivem Blutverlust, sondern auch für Patienten,
die sich elektiven Operationen unterziehen, oder die an Krankheiten leiden,
wie etwa mehrere Arten erblicher hämolytischer Anämien, die
zu einem Verlust von zirkulierenden roten Blutzellen führen. Die
Fähigkeit
rote Blutzellen für
längere
Zeiträume
zu lagern, stellt sicher, dass ein Angebot an transfusierbaren roten
Blutzellen verfügbar
ist, wenn es gebraucht wird. Die potentielle Nutzung beinhaltet die
Lagerung von einzigartigen Serotypen, Einheiten, die für die autologe
Transfusion gedacht sind, und Bevorratung von allgemeinen Blutgruppen
für Notfallsituationen.
Beschränkungen
bei den gegenwärtigen
Lagermethoden haben zum Teil zu gelegentlicher Knappheit des Blutangebots
geführt,
was in der Verschiebung von elektiven Operationen und in Aufrufen
zum Blutspenden von Blutbanken und Krankenhäusern resultiert hat.
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Gegenwärtig sind
zwei Verfahren für
die Langzeitlagerung von roten Blutzellen zugelassen. Der Großteil der
Einheiten mit roten Blutzellen wird in Citrat-Phosphat-Dextrose bei 4 °C gelagert.
Wenn zum Beispiel Spenderblut in einem Verarbeitungszentrum erhalten
wird, werden die Erythrozyten separiert und mittels verschiedener
Verfahren gelagert, im Allgemeinen als Einheit von gepackten Erythrozyten
mit einem Volumen von 200 bis 300 ml und einem Hämatokritwert zwischen 70 und
90. Aufgrund von metabolischer Verarmung und der daraus folgenden
physikalischen Degradation können
diese Zellen jedoch nicht länger
als 42 Tage gelagert werden. Zudem wurde, wenn auch 70 % dieser
gelagerten Zellen nach der Transfusion im Kreislauf verbleiben, ein
echtes O2-Abgabevermögen nicht nachgewiesen.
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Während der
Lagerung unterliegen menschliche rote Blutzellen morphologischen
und biochemischen Veränderungen,
einschließlich
der Abnahme des zellulären
Levels an Adenosintriphosphat (ATP) und 2,3-Diphosphoglycerat (2,3-DPG), Veränderungen
der zellulären
Morphologie und progressiver Hämolyse.
Nach einem kurzen anfänglichen
Anstieg nimmt die Konzentration von ATP nach sechswöchiger Lagerung
zunehmend auf 30 bis 40 % ihres Anfangslevels ab. Morphologische
Veränderungen
finden während
der Lagerung statt, führen
letztlich zur Entwicklung von Spicula, die sich als Vesikel vermehren
können,
und können
dabei das Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis der
Zellen und deren Fähigkeit,
sich beim Durchgang durch enge Kanäle zu deformieren, radikal
verändern.
Die Fluidität
der Zellmembran roter Blutzellen, die für den Durchgang roter Blutzellen
durch enge Kanäle
in Milz und Leber entscheidend ist, ist lose mit dem ATP-Level korreliert. Die
Konzentration von ATP und die Morphologie der roten Blutzellen dienen
als Indikatoren für
die Eignung zur Transfusion der gelagerten Zellen.
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Das
zweite Verfahren ist die gefrorene Lagerung bei –80 °C unter Verwendung von 40 %
(w/v) Glycerol als Kryoprotektor. Dieses Additiv dringt jedoch durch
die Membranen vieler biologischer Zellen und besitzt unerwünschte Eigenschaften,
wenn es Menschen mittels Infusion zugeführt wird. Wenngleich dieses
Verfahren für
eine Lagerzeit von bis zu 10 Jahren verwendet werden kann, muss
das Glycerol jedoch vor der Transfusion herausgewaschen werden.
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Für den Waschvorgang
werden teure Geräte
genutzt und er ist zeit- und laborintensiv. Zusätzlich findet ein signifikantes
Hämolyselevel
(typischerweise 10 bis 15 %) während
des Waschvorgangs statt. Da schließlich davon ausgegangen wird,
dass dieser Vorgang die Sterilität
der Einheiten mit roten Blutzellen gefährdet, ist die Lagerung nach
der Wäsche
signifikant begrenzt. Folglich wird dieses Lagerverfahren nur für Blut mit extrem
seltenen Faktortypen und autologen und gerichteten Spendereinheiten
verwendet, die nicht innerhalb eines Zeitraums von 43 Tagen verwendet
werden. Ab 1992, den jüngsten
verfügbaren
Daten, wurden ungefähr 14
% (fast 2 Millionen Einheiten) des verfügbaren Angebots an transfusierbaren
roten Blutzellen weggeworfen. Die Fähigkeit, rote Blutzellen ohne
die zusätzlichen
Kosten und die Zeit für
das Waschen tiefgekühlt
zu konservieren, oder mindestens die Reduzierung der Anzahl der
erforderlichen Waschzyklen, würde
die Rettung eines signifikanten Prozentsatzes dieser weggeworfenen
Einheiten zulassen, und dadurch einen weiteren Puffer gegen die
Knappheit von Blutprodukten bereitstellen.
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Gegenwärtige Theorien
der Kryokonservierung roter Blutzellen erachten die Eisbildung und
-ausbreitung als den primären,
wenn nicht als den einzigen Faktor, der die Wiedergewinnung und
die Lebensfähigkeit der
Zelle nach der Lagerung beeinflusst. Folglich zieht die Untersuchung
der Verfahren zur Kryokonservierung roter Blutzellen nur geringfügige Veränderungen
der traditionellen Kryoprotektor-Methoden in Betracht. Frühere Verfahren
für die
Konservierung, Lagerung und Transfusion roter Blutzellen werden
in Horn, Sputtek, Standl, Rudolf, Kuhnl, and Esch, Transfusion of
Autologous, Hydroxyethyl Starch-Cryopreserved Red Blood Cells, Anesth.
Analg. 1997; 85; 739–745
erklärt.
Die temperaturinduzierte Modulation der zellulären Biochemie ist jedoch für Experten
auf diesem Gebiet ein anerkanntes Phänomen. Diese Beschreibungen
stellen Verfahren zur Nutzung der Biochemie roter Blutzellen bereit,
um die kälteinduzierten
Gleichgewichtsstörungen
zu überwinden,
die normalerweise zu zellulärer
Hämolyse
nach der Kryokonservierung führen würden. Durch
diese Verfahren kann das Level an nicht spezifischer Kryokonservierung
gegen die Eisbildung reduziert werden.
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Es
sind gegenwärtig
zwei allgemeine Vorgänge
für die
Gefrierkonservierung von lebenden Zellen hinsichtlich des verwendeten
Kryoprotektors verfügbar.
Einer nutzt die Zugabe hoher Konzentrationen von penetrierenden
aufgelösten
Stoffen mit niedrigem Molekulargewicht. Aufgrund von Toxizität und osmotischen
Problemen sind Spezialgeräte
und -techniken erforderlich, um die gelösten Stoffe nach dem Auftauen
zu entfernen. Der zweite nutzt Polymere mit hohem Molekulargewicht,
die nicht in die Zellen eindringen. Die Verarbeitung nach dem Auftauen
ist in diesem Fall logistisch einfacher, aber die Lagerung muss
bei einer sehr niedrigen Temperatur, typischerweise in flüssigem Stickstoff,
erfolgen. Die Eisbildung, die eine Hauptsorge bei jedem Verfahren
zur Kryokonservierung von Zellen ist, wird von Eiskristallkernen
ausgelöst.
Wenn die Temperatur sinkt und das Wasser zu Eis kristallisiert,
wird die Zelle zunehmend dehydriert und an einem gewissen Punkt
führt das
zur Schädigung
der Zelle. Es wird angenommen, dass die Natur der Dehydrierungsschädigung das
Ergebnis von Membranbelastungen ist, die zum Reißen der Membran führt. Dieser
Form der Schädigung kann
durch die Zugabe von gelösten
Substanzen in multimolarer Konzentration vorgebeugt werden, so dass die
Menge des gebildeten Eises nicht ausreicht, um zu einer schädigenden
Zelldehydrierung zu führen.
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Seit
vielen Jahren ist bereits bekannt, dass bestimmte Moleküle kryokonservierend
sein können.
Diese penetrierenden Kryoprotektoren müssen die Menge an gebildetem
extrazellulärem
Eis reduzieren und dadurch die Zelldehydrierung reduzieren, während sie
gleichzeitig die intrazelluläre
Konzentration erhöhen
müssen,
um eine intrazelluläre
Kristallisation weniger wahrscheinlich werden zu lassen. Eine derartige
gelöste
Substanz darf, um nützlich
zu sein, bei hohen Konzentrationen nicht toxisch sein und muss die
Zelle leicht penetrieren. Sowohl Glycerol und Dimethylsulfoxid (DMSO)
wurden zu diesem Zweck verwendet. Bemerkenswerterweise ist Glycerol
bei hohen Konzentrationen nicht toxisch, penetriert die Zellmembranen
aber nur langsam und ist daher schwierig einzuführen und zu entfernen. Dimethylsulfoxid
penetriert schnell, aber wird zunehmend toxisch, wenn die Konzentrationen
1 M (etwa 7 %) übersteigen.
Polymere mit hohem Molekulargewicht, wie etwa Polyvinylpyrrolidon
(PVP), Dextran und unlängst
Hydroxyethylstärke
(HES), dringen nicht in die Zelle ein, und die Mechanismen, durch
die sie Kryokonservierung verleihen, waren Gegenstand von Spekulation.
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Wie
oben angegeben, ist es für
die Verlängerung
der Lagerzeit roter Blutzellen notwendig, die Zellen auf eine Art
zu lagern oder zu behandeln, die der Abnahme an ATP, und, wenn möglich, an
2,3-Diphosphoglycerat (2,3-DPG), zusätzlich zum Schutz gegen Schäden durch
Eiskristalle, vorbeugt. Typischerweise enthalten derartige Lösungen Phosphat,
Glucose und Adenin, die die Verlängerung
der Lagerfähigkeit
bewirken, indem sie das ATP-Level in den Zellen erhalten. Zusätzlich wird
die glycolytische Aktivität
in den roten Blutzellen verbessert, wenn der bei 4 °C gemessene,
intrazelluläre
pH-Wert bei etwa 7,4 liegt. Die effektive Osmolalität der suspendierenden
Lösung
ist ein anderer wichtige Faktor bei der Ausdehnung der Lagerdauer
der roten Zellen. Es wurde gezeigt, dass es, wenn eine hypotonisch
induzierte Zunahme an mittlerem Zellvolumen die Hämolyse substanziell
reduziert und die Morphologie der roten Zellen während der Lagerung verbessert.
Obwohl der Mechanismus nicht bewiesen wurde, ist es möglich, dass
osmotisches Anschwellen die Oberflächenspannung der Zelle erhöht, und
dadurch den Formänderungen
entgegenwirkt, die gewöhnlich
mit der Lagerung roter Zellen einhergehen. Obwohl die Hypotonizität der additiven
Lösung
durch die Gefahr der Hämolyse
während
der Zugabe der Lösung
beschränkt
ist, können
rote Zellen, die normalerweise bi-konkave Scheiben sind, bei einer externen
Osmolalität
von ungefähr
170mOsm, auf beinahe das doppelte ihres normalen Volumens anschwellen
bevor sie hämolysieren.
Wenn die additive Lösung
zu hypotonisch ist, werden die roten Zellen platzen (hämolysieren).
Daher können
Lösungen, die
zu hypotonisch sind, nicht verwendet werden. Wenngleich über die Erhaltung
von ATP und 2,3-DPG im Allgemeinen im Hinblick auf eine Lagerung
bei 4 °C
nachgedacht wird, ist die Erhaltung der Konzentration dieser Metaboliten
für die
Lagerung nach dem Auftauen wichtig. Für die Wirkungen von ATP-Level,
Hämolyse,
Kaliumverlust und das Abwerfen von Mikrovesikeln bei der Erhaltung
und Lagerung roter Blutzellen, vergleiche Greenwalt, Rugg, and Dumaswala,
The Effect of Hypotonicity Glutamine, and Glycine on Red Cell Preservation,
Transfusion 1997; 37; 269–276.
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WO9314191
offenbart eine kryokonservierende Zusammensetzung für rote Blutzellen
(RBS), die basische Puffersalze (KH2PO4, Na2HPO4, MgCl2, Inosin,
Adenin, Glutamin, Nicotinsäure,
Glutathion), Glucose, Hydroxyethylstärke und PVP umfasst.
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WO9613158
offenbart Lagerzusammensetzungen für Thrombozyten, die Amilorid,
Natriumnitroprussid, Adenosin, Quinacrin, Dipyridamol, Ticolpidin,
Heparin und DMSO enthalten.
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Das
Ziel der Langzeitlagerung roter Blutzellen ist es, die metabolischen
und morphologischen Eigenschaften zu erhalten, so dass die In-vivo-Parameter
(Sauerstoffabgabekapazität
und Kreislaufhalbwertszeit) mit frischen, nicht gefrorenen roten
Blutzellen vergleichbar sind. Zusätzlich muss das Hämolyselevel
während des
Lagerzyklus innerhalb akzeptabler Level bleiben, um die direkte
Transfusion der aufgetauten Einheit mit roten Blutzellen ohne Komplikationen
aufgrund von Hämoglobintoxizität zu erlauben.
Diese Ziele können
unter Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung erreicht werden.
Das hier beschriebene Verfahren stellt die Vorteile beider gegenwärtig zugelassener
Lagerverfahren – ausgedehnte
Lagerdauer in gefrorenem Zustand und sofortige Verfügbarkeit
wie bei der gefrorenen Lagerung, bereit.
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Krankenhäuser und
Blutbanken würden
großen
Nutzen aus einem direkt transfusierbaren gefrorenen Produkt aus
roten Blutzellen ziehen. Um dies zu erreichen versuchen die meisten
gegenwärtigen
Untersuchungsansätze,
das Glycerol einfach mit einem nicht toxischen, transfusierbaren
Kryoprotektor zu ersetzen. Die Ergebnisse haben jedoch gezeigt,
dass die meisten Kryoprotektoren bei Konzentrationen verwendet werden
müssen,
die nicht transfusiert werden können
oder deren Schutzeigenschaften nicht ausreichen, um die Hämolyse auf
einem für
die Transfusion akzeptablen Level zu erhalten. Zusätzlich erfordern
die meisten Vorgänge
eine Lagerung bei –193 °C in flüssigem Stickstoffdampf.
Dies wäre
teuer und in gegenwärtige
Lagervorgänge
von Blutbanken nur schwer einzubauen, was die Langzeitlagerung bei
Temperaturen unter –80 °C unpraktisch
macht.
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Die
hier beschriebene Erfindung adressiert die festgestellten Probleme
der Lagerung, der morphologischen Veränderungen, der metabolischen
Veränderungen
und der langfristigen funktionellen Wirksamkeit der roten Blutzellen.
Ferner erreicht die vorliegende Erfindung unerwartete und überraschende
Ergebnisse bei der Konservierung roter Blutzellen durch die Behandlung
mit Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung, die zuvor
als unmöglich
erachtet worden wären.
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KURZDARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung stellt ein Verfahren zur Lagerung roter Blutzellen in
gefrorenem Zustand bei Temperaturen unter Null (–10 bis –193 °C) bereit, so dass die resultierenden
aufgetauten Einheiten mit roten Blutzellen lebensfähige Zellen
enthalten. Dies wird insbesondere durch eine Kombination aus biochemischer
Stabilisierung und einer kryokonservierenden Lösung erreicht. Ein biochemisch
stabilisierendes Reagens ist eines, das insofern keine traditionelle
Kryokonservierung bereitstellt, als es die Eisbildung oder Eismenge
während des
Gefrierprozesses bei den verwendeten Konzentrationen nicht alleine verringert.
Für den
Fall, dass die kombinierte kryokonservierende Lösung aus transfusierbaren kryokonservierenden
Reagenzien besteht, ist die resultierende aufgetaute Einheit mit
roten Blutzellen direkt transfusierbar. Unter allen Umständen erlaubt der
Einbau biochemisch stabilisierender Technologie die Kryokonservierung
roter Blutzellen unter Nutzung niedrigerer Kryoprotektorkonzentrationen,
als sie notwendig wären,
wenn die biochemische Stabilisierung fehlen würde.
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Die
biochemische Stabilisierung schließt die Zugabe von Reagenzien
ein, die auf spezifische Komponenten der roten Blutzellen gerichtet
sind, und biochemische Pfade, die für die Schädigung während des Gefrier-Auftau-Zyklus
anfällig
sind. Die Stabilisierung mit diesen Reagenzien macht die Zellen
teilweise resistent gegen Schäden,
die durch das Einfrieren und Auftauen induziert werden, die schließlich zur
Hämolyse
führen. Die
biochemische Stabilisierung kann darauf gerichtet sein, die metabolischen
Komponenten, das Antioxidanspotential, die intrazelluläre Ionenverteilung,
die Membranfluidität
und die Integrität
der zytoskeletalen Struktur zu erhalten. Zusätzlich können spezifische Zweite-Messenger-Pfade,
wie etwa die Cyclooxygenase-, Lipoxygenase-, Hexosemonophosphat-
und Phosphorylierungspfade direkt durch biochemische Reagenzien oder
indirekt durch Regulation der spezifischen Messenger-Moleküle manipuliert
werden, einschließlich
cyclischem Adenosinmonophosphat (c-AMP), cyclischem Guaninmonophosphat
(c-GMP), intrazellulärem
Calcium, Inositoltriphosphat und Diacylglycerol.
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Genauer
gesagt kann eine Kombination von Reagenzien den Einheiten mit den
roten Blutzellen zugefügt
werden, um sich auf jeden der oben genannten Punkte zu richten.
Zum Beispiel können
Reagenzien zugefügt
werden, um die intrazellulären
Konzentrationen von ATP zu erhalten oder zu verbessern, sowie um
die ATP-verbrauchenden ATPasen zu blockieren, wie etwa Amiloridvermittelte
Inhibition des Na+/H+-Austauschers.
Der Schutz der Membran oder des Hämoglobins vor oxidativer Schädigung kann
durch die Zugabe von Antio xidanzien, wie etwa Tocopherol, Ascorbat
und Bioflavonoiden erreicht werden, sowie durch die Stimulation
des Hexosemonophosphatpfads durch Ribose. Die Ionenverteilung kann
durch die Aktivierung oder Inhibition spezifischer Ionenpumpen reguliert
werden. Calcium kann mit Nifedipin oder Verapamil kontrolliert werden,
während
sich Amilorid, wie oben erwähnt,
auf die Natriumregulation auswirkt. Ferner kann die Kalium- und
Chloridionendistribution durch die Inhibition des K+/Cl–-Co-Transporters
mit Bumetanid erhalten werden. Die Cyclooxygenase- und Lipoxygenasepfade
können
durch die Zugabe von Flurbiprofen, Dipyridamol oder Aspirin reguliert
werden, während
Phosphorylierungsereignisse durch die Inhibition durch Kinaseinhibitoren, wie
etwa H7(1-[5-Isoquinolinylsulfonyl]-2-methylpiperazin), Staurosporin
oder Chelerythrin manipuliert oder durch Diacylglycerolpalmitoylcarnitin
stimuliert werden können.
Die Membranstabilisierung und -fluidität wird durch die Zugabe von
Pentoxifyllin, Nicotinamid oder Amantadin kontrolliert, und die
zytoskeletale Struktur kann durch Actinstabilisierung durch die
Verwendung von Taxol, [2aR-[2aα, 4β, 4aβ, 6β, 9α (αR*,βS*, 11α,-12α, 12aα, 12bα]]-β-(Benzoylamino)-α-hydroxybenzenpropionsäure 6,12b-
bis (acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a, 3,4,4a,11,5,6,9, 10,11,12,12a,
12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,11,8,13,-13-tetramethyl-5-oxo-7,11-methano-1H-cyclodeca
[3,4] benz-[1,2-b] oxet-9-yl-ester
oder Cytochalasine oder Spektrinstabilisierung mit Polyaminen erhalten
werden. Spezifische, durch zyklische Nukleotide regulierte, Zweite-Messenger-Pfade können durch
die optionale Verwendung von Adenosin (erhöht c-AMP) und Natriumnitroprussid oder
anderer Stickoxidspender (erhöht
c-GMP) aktiviert werden.
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Zusätzlich zur
biochemischen Stabilisierung werden Kryoprotektoren verwendet, um
die Einheit roter Blutzellen vor Schaden durch die Eiskristallbildung
während
des Gefrier-Auftau-Zyklus zu schützen.
Die Kryoprotektoren können
einzeln oder als Mischungen verwendet werden, die sich aus penetrierenden
und/oder nicht penetrierenden Verbindungen zusammensetzen. Beispiele
für potentielle
Kryoprotektoren beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf,
Dimethylsulfoxid, Polyvinylpyrrolidon, Dextran, Maltodextrine, 2,3-Butandiol, Hydroxyethylstärke, Polyethylenglycol
und Glucose und andere Kohlehydrate.
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In
einer Ausführungsform
zur Konservierung menschlicher roter Blutzellen beinhaltet das Verfahren die
Verstreckung eines Volumens gepackter roter Blutzellen mit ADSOL,
einer gegenwärtig
lizenzierten additiven Lösung,
die von Baxter Travenol verkauft wird, unter Verwendung von Standardprotokollen
zur Bluteinlagerung. Das ADSOL wird durch Zentrifugation entfernt,
und ein Volumen an Konservierungslösung, das die gewünschten
Kryoprotektoren und alle zusätzlichen
biochemischen Reagenzien enthält,
wird zugefügt.
Die roten Blutproben, die die Kryoprotektoren enthalten, werden
zum Gefrieren in flüssigen
Stickstoff getaucht und zur Langzeitlagerung unverzüglich in
einen –80 °C-Gefrierschrank
verlagert. Die biochemische Stabilisierung kann darauf gerichtet
sein, die metabolischen Komponenten, das Antioxidanspotential, die
intrazelluläre
Ionenverteilung, die Membranfluidität und die Integrität der zytoskeletalen
Struktur zu erhalten. Zusätzlich
können spezifische
Zweite-Messenger-Pfade,
wie etwa die Cyclooxygenase-, Lipoxygenase, Hexosemonophosphat- und
Phosphorylierungspfade direkt durch biochemische Reagenzien oder
indirekt durch Regulation der spezifischen Messenger-Moleküle manipuliert
werden, einschließlich
c-AMP, c-GMP, intrazellulärem
Calcium, Inositoltriphosphat und Diacylglycerol. In einer bevorzugten
Ausführungsform
sind die biochemischen Reagenzien in einer Konzentration vorhanden,
die der Hämolyse
der roten Blutzellen während
des Gefrier-Auftau-Zyklus
vorbeugt und haben noch mehr bevorzugt Konzentrationen von 500 μM Nifefipin,
20 μM Cytochalasin
B, 500 μM
Taxol, 5 mM Pentoxifyllin und 25 μg/ml
Flurbiprofen. Die biochemischen Reagenzien sind in 2,5 % DMSO als
Trägersubstanz
vorhanden. Alle Bedingungen enthalten 7,5 % Dextran (Dex; 40.000
MW), 2 % Polyvinylpyrrolidon (PVP; 40.000 MW), 5 % Hydroxyethylstärke und
5 % Polyethylenglycol. Die niedrigen transfusierbaren Konzentrationen
der Kryoprotektoren können
in Kombination arbeiten, um die roten Blutzellen während der
Kryokonservierung besser als jeder einzelne Kryoprotektor allein
schützen. Überdies
wirkt die Zugabe der Reagenzien und die biochemische Modulation
mit niedrigen Konzentrationen transfusierbarer Kryoprotektoren in
Kombination, um die roten Blutzellen während der Kryokonservierung
weiter zu schützen.
Ein alternatives Verfahren ist die Zugabe einer isotonischen Kochsalz-
oder Konservierungslösung,
die die biochemischen Reagenzien und ein Volumen von Glycerolyt
57 (Fenwall), bevorzugt etwa 20 % Glycerol, enthält, und das Einfrieren der
Beutel bei –80 °C. Die verwendeten
Additive beinhalten Nicotinamid, Nikethamid, Nifedipin, Pentoxifyllin
und Flurbiprofen. Das 20%-ige Glycerol mit der Zugabe der biochemischen
Additive reduziert das Hämolyselevel
und hält
die Kriterien für
transfusierbare Bluteinheiten auf der Basis der Gesamthämolyse-
und der restlichen freien Hämolyselevel
ein.
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In
einer derartigen Ausführungsform
sollten die biochemischen Reagenzien in einer Konzentration vorhanden
sein, die geringere Hämolyse
während
des Gefrier-Auftau-Zyklus und erhöhte funktionelle In-vitro-Aktivität im Vergleich
zu roten Blutzellen ermöglicht,
die unter den gleichen Bedingungen, jedoch unter Fehlen der biochemischen
Reagenzien konserviert wurden.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung aus roten Blutzellen
gebildet, die rote Blutzellen, eine Zusammensetzung roter Blutzellen
und biochemischer Reagenzien, wie in Anspruch eins spezifiziert,
und eine Kombination aus einem oder mehreren Kryoprotektionsmitteln
umfasst.
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Eine
weitere Ausführungsform
richtet sich auf eine Zusammensetzung mit menschlichen roten Blutzellen,
die menschliche rote Blutzellen, eine Zusammensetzung roter Blutzellen
und biochemischer Reagenzien umfasst. Reagenzien können zugefügt werden,
um die intrazellulären
Konzentrationen von ATP zu erhalten oder zu verbessern, sowie um
die ATP-verbrauchenden ATPasen zu blockieren, wie etwa Amilorid-Inhibition des
Na+/H+-Austauschers.
Der Schutz der Membran oder des Hämoglobins vor oxidativer Schädigung kann durch
die Zugabe von Antioxidanzien, wie etwa Tocopherol, Ascorbat und
Bioflavonoiden erreicht werden, sowie durch die Stimulation des
Hexosemonophosphatpfads durch Ribose. Die Ionenverteilung kann durch
die Aktivierung oder Inhibition spezifischer Ionenpumpen reguliert
werden. Calcium kann mit Nifedipin oder Verapamil kontrolliert werden,
während
sich Amilorid, wie oben erwähnt,
auf die Natriumregulation auswirkt. Ferner kann die Kalium- und Chloridionendistribution
durch die Inhibition des K+/Cl–-Co-Transporters
mit Bumetanid erhalten werden. Die Cyclooxygenase- und Lipoxygenasepfade
können
durch die Zugabe von Flurbiprofen oder Aspirin reguliert werden,
während
Phosphorylierungsereignisse durch die Inhibition durch Kinaseinhibitoren,
wie etwa H7(1-[5-Isoquinolinylsulfonyl]-2-methylpiperazin), Staurosporin
oder Chelerythrin manipuliert oder durch Diacylglycerolpalmitoylcarnitin
stimuliert werden können.
Die Membranstabilisierung und -fluidität wird durch die Zugabe von
Pentoxifyllin, Nicotinamid oder Amantadin kontrolliert und die zytoskeletale
Struktur kann durch Actinstabilisierung durch die Verwendung von
TAXOL oder Cytochalasinen oder Spektrinstabilisierung mit Polyaminen
erhalten werden. Spezifische, durch zyklische Nukleotide regulierte,
Zweite-Messenger-Pfade
können
durch die optionale Verwendung von Adenosin (erhöht c-AMP) und Natriumnitroprussid oder
anderer Stickoxidspender (erhöht
c-GMP) aktiviert werden. Die biochemischen Reagenzien sind in einer Konzentration
vorhanden, die der Hämolyse
der roten Blutzellen während
des Gefrier-Auftau-Zyklus
vorbeugt.
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BESCHREIBUNG
DER ILLUSTRATIVEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
biochemische Stabilisierung dieser Erfindung basiert auf der Anwendung
spezifischer Effektoren, die sich auf spezifische Aspekte der zellulären Biochemie
richten, um die Zellen gegen spezifische Arten der Schädigung zu
schützen.
Das Verfahren zur Kryokonservierung ist so, dass die gelagerten Zellen
nach dem Auftauen direkt transfusiert werden können, indem biochemische Reagenzien
und geringe Konzentrationen von transfusierbaren Kryoprotektoren
kombiniert werden. Die biochemische Stabilisierung schließt die Regulation
der metabolischen, ionischen, zytoskeletalen Komponenten und der
Membrankomponente ein, und macht die behandelten roten Blutzellen
weniger anfällig
für Schädigungen,
die während
des Einfrierens und des Auftauens bei Temperaturen zwischen –10 °C und –193 °C induziert
werden.
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In
einer Ausführungsform
sind die spezifischen zellulären
Effektoren Nifedipin, Cytochalasin B, Taxol, Pentoxifyllin, Flurbiprofen,
Nikethamid, Ribose und Trehalose. Diese Modifikationsmittel werden
den gepackten roten Blutzellen und der Konservierungslösung zugefügt. Jedes
der Modifikationsmittel beeinflusst unterschiedliche spezifische
zelluläre
Biochemie. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kontrolliert
Nifedipin, ein Inhibitor, der durch die Calciumkaskade agiert, Calcium,
während
Cytochalasin B und Taxol zytoskeletale Modifikationsmittel sind,
und die Stabilisierung der Zelle durch Actinstabilisierung bereitstellen.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die Membranstabilisierung
und -fluidität
durch Pentoxifyllin, einem Membranmodifikationsmittel kontrolliert
werden. Ribose wird zugefügt,
um der oxidativen Schädigung
der Zelle durch die Stimulation des Hexosemonophosphatpfads vorzubeugen.
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Die
Zweiten-Messenger-Effektoren haben nachgewiesen, dass sie in Kombination
mit anderen biochemische Stabilisierung für die roten Blutzellen bereitstellen.
Noch wichtiger ist, dass die Zugabe dieser Reagenzien es der biochemischen
Modulation erlaubt, die Kryokonservierung bei geringeren Glycerolkonzentrationen
bei denen normalerweise fast 100 % der roten Blutzellen während der
Gefrier-Aufau- und Waschzyklen unzureichend geschützt sind,
zu verbessern. Bei der Beschreibung der Chemikalien, die ihre Nützlichkeit
als Effektoren der Zweiten-Messenger-Pfade gezeigt haben, versteht
es sich, dass die tatsächlich
erwähnten
Chemikalien zusammen mit funktionell gleichwertigen Materialien
als im Umfang dieser Erfindung enthalten zu verstehen sind. Den
Anmeldern bekannte Chemikalien, deren Nützlichkeit als Modifikationsmittel
bekannt oder nachgewiesen wurde, wurden in der unmittelbaren Anwendung
spezifisch bekannt gemacht.
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Bestimmte
Chemikalien, von denen angenommen wird, dass sie funktionell gleichwertige
Materialien für
die Modifikationsmittel sind, die durch den Zweiten-Messenger-Pfad agieren,
sind jene, die aus cyclischem Adenosinmonophosphat, c-(AMP), cyclischem
Guaninmonophosphat, c-(GMP), intrazellulärem Calcium, Inositoltriphosphat
und Diacylglycerol ausgewählt
sind. Funktionell gleichwertige Modifikationsmittel, die durch, durch
zyklische Nukleotide regulierte, Zweite-Messenger-Pfade agieren,
sind solche, die aus Adenosin, Natriumnitroprussid und anderen Stickoxidspendern
ausgewählt
sind. Der Schutz der Membran oder des Hämoglobins vor oxidativer Schädigung kann
durch die Zugabe von funktionell gleichwertigen Antioxidanzien,
wie etwa Tocopherol, Ascorbat und Bioflavonoiden erreicht werden,
sowie durch die Stimulation des Hexosemonophosphatpfads durch Ribose.
Die Ionenverteilung kann durch die Aktivierung oder Inhibition spezifischer
Ionenpumpen reguliert werden. Funktionell gleichwertige Modifikationsmittel
von Calcium können
aus Nifedipin oder Verapamil ausgewählt werden, während sich
Amilorid, wie oben erwähnt,
auf die Natriumregulation auswirkt. Ferner kann die Kalium- und
Chloridionendistribution durch die Inhibition des K+/Cl–-Co-Transporters
mit Bumetanid erhalten werden. Die Cyclooxygenase- und Lipoxygenasepfade
können
durch die Zugabe von funktionell gleichwertigen Modifikationsmitteln
von Flurbiprofen, Dipyridamol oder Aspirin reguliert werden, während Phosphorylierungsereignisse
durch die Inhibition durch Kinaseinhibitoren, wie etwa H7(1-[5-Isoquinolinylsulfonyl]-2-methylpiperazin),
Staurosporin oder Chelerythrin manipuliert oder durch Diacylglycerolpalmitoylcarnitin
stimuliert werden können,
die ebenfalls funktionell gleichwertige Reagenzien sind. Reagenzien,
die funktionell gleichwertige Regulatoren zur Membranstabilisierung
und -fluidität
sind, sind Pentoxifyllin, Nicotinamid oder Amantadin, während für die Regulation
der zytoskeletalen Struktur durch Actinstabilisierung die Reagenzien
TAXOL oder Cytochalasine, und für
die Spektrinstabilisierung Polyamine sind. Spezifische, durch zyklische
Nukleotide regulierte, Zweite-Messenger-Pfade können durch die optionale Verwendung
von funktionell gleichwertigem Adenosin (erhöht c-AMP) und Natriumnitroprussid
oder anderer Stickoxidspender (erhöht c-GMP) aktiviert werden.
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Das
Nach-Auftau-Leben der roten Blutzellen nach der Kryokonservierung
kann erfolgreich ausgedehnt werden, indem die Zellen bei –80 °C mit den
biochemischen Reagenzien dieser Erfindung gelagert werden. Wenn
die roten Blutzellen 3 bis 7 Tage in einem –80 °C-Gefrierschrank gelagert, und
bei 37 °C
in einem Wasserbad aufgetaut, und für die Hämolyse nach der Lagerung analysiert
wurden, lautete der Hämolyseprozentsatz
im Vergleich mit roten Blutzellen, die nur in Glycerolkonzentrationen
gelagert wurden, wie folgt: 14,36 % mit Nifedipin, 15,01 % mit Taxol
und Cytochalasin B, 11,46 % mit Nifedipin, Pentoxifyllin und Flurbiprofen
und 11,66 % mit Nifedipin, Cytochalasin und Taxol. Diese Ergebnisse
zeigen einen günstigen
Vergleich bei der Verbesserung der Kryokonservierung, verglichen
mit Glycerolkonzentrationen, die normalerweise dazu führen, dass
fast 100 % der roten Blutzellen während der Gefrier-Auftau- und
Waschzyklen unzureichend geschützt sind.
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Um
den Versuch durchzuführen
wurde eine gepackte Einheit roter Blutzellen in ADSOL unter Verwendung
von Standardprotokollen zur Bluteinlagerung erhalten. Das ADSOL
wurde durch Zentrifugation entfernt und ein Volumen an Konservierungslösung, das
die gewünschten
Kryoprotektoren und biochemischen Reagenzien enthält, wurde
zugefügt.
Die Schlusskonzentrationen der verwendeten Kryoprotektoren waren
7,5 % Dextran, 2 % Polyvinylpyrrolidon, 5 % Hydroxyethylstärke und
2,5 % Dimethylsulfoxid als einem biochemischen Reagenzienträger. Die
verwendeten Reagenzien beinhalteten 500 μM Nifedipin, 20 μM Cytochalastin B,
500 μM Taxol,
5 mM Pentoxifyllin und 25 μM/ml
Flurbiprofen. Nachdem das ADSOL entfernt und die Konservierungslösung zugefügt worden
war, wurden 50 ml roter Blutzellen in Gefrierbeuteln mit einem maximalen Volumen
von 150 ml gegeben. Ein äquivalentes
Volumen wurde jedem der Beutel zugefügt. Die Beutel wurden tauchgefroren
und 2 bis 7 Tage lang bei –80 °C gelagert
und durch 10-minütiges
Eintauchen in ein 37 °C
warmes Wasserbad aufgetaut. Das Level der Auftau-Hämolyse
wurde als das Verhältnis
von freiem Hämoglobin zum
gesamten Hämoglobin
bestimmt. Diese biochemische Reagenzienmischung kann direkt nach
der Lagerung transfusiert werden.
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Die
Lagerung der roten Blutzellen zwischen –10 °C und –193 °C erfordert die Zugabe eines
Kryoprotektionsmittels, wie etwa Dimethylsulfoxid (DMSO). Kryoprotektionsmittel,
wie etwa DMSO, sind polare Moleküle,
die die Zellmembran penetrieren und dazu dienen, die Lebensfähigkeit
der Zellen während
des Kryokonservierungsprozesses zu erhalten. Zusätzlich zu DMSO beinhalten andere
in dieser Erfindung verwendete Kryoprotektionsmittel Polyvinylpyrrolidon,
Dextranmaltodextrine, 2,3-Butandiol, Hydroxyethylstärke, Polyethylenglycol,
Glucose und Kombinationen davon. Über den Erfolg der Kryokonservierung
mit bestimmten wasserlöslichen
Molekülen,
die die Zellen nicht durchdringen, wurde berichtet, der genaue Mechanismus
für diesen Erfolg
ist jedoch unbekannt. Es wurde spekuliert, dass dieses Phänomen beinhaltet,
dass die Polymere Zellen schützen,
indem sie die extrazellulären
Salzkonzentrationen bei Frosttemperaturen verringern, genau wie
es penetrierende Kryoprotektoren tun, oder, dass die Polymere in
Zellen adsorbieren könnten
und somit die Membran auf irgend eine Weise schützen. Es wurde ebenfalls spekuliert,
dass sich während
des Einfrierens ein Elektrolytgradient von der Innenseite zur Außenseite
der Zelle entwickelt, der einen Elektrolytverlust verursacht, der
die osmotische Belastung beseitigt. Die Kryoprotektoren können einzeln
oder als Mischungen in transfusierbaren Konzentrationen verwendet
werden, die sich aus penetrierenden und/oder nicht penetrierenden
Verbindungen zusammensetzen, um die roten Blutzellen vor der Schädigung durch
die Eiskristallbildung während
des Gefrier-Auftau-Zyklus zu schützen.
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Es
kann zum Beispiel durch einen Vergleich der folgenden Prozentwerte
der Auftau-Hämolyse
gezeigt werden, dass Kombinationen transfusierbarer Konzentrationen
von Kryoprotektoren einen höheren
Schutz vor Hämolyse
als ein einzelnes Kryoprotektionsmittel erlauben: 7,5 % Dextran,
11,19 % Hämolyse;
2 % Polyvinylpyrrolidon, 47,39 % Hämolyse; 5 % Hydroxyethylstärke, 43,17
% Hämolyse;
7,5 % Dextran und 2 % Polyvinylpyrrolidon, 6,42 % Hämolyse;
7,5 % Dextran und 5 % Hydroxyethylstärke, 8,56 % Hämolyse;
2 % Polyvinylpyrrolidon und 5 % Hydroxyethylstärke, 23,46 % Hämolyse,
und schließlich
7,5 % Dextran, 2 % Polyvinylpyrrolidon und 5 % Hydroxyethylstärke, 4,44
% Hämolyse.
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Eine
Lagerzusammensetzung für
rote Blutzellen der vorliegenden Erfindung beinhaltet eine Lagerzusammensetzung,
eine Zusammensetzung aus roten Blutzellen und eine Zusammensetzung
biochemischer Reagenzien, wobei die Reagenzien in einer Konzentration
vorhanden sind, um der Hämolyse
der roten Blutzellen während
des Gefrier-Auftau-Zyklus vorzubeugen und in einer Konzentration,
um die funktionelle In-vitro-Aktivität im Vergleich mit roten Blutzellen
zu erhöhen,
die unter den gleichen Bedingungen konserviert wurden, wobei jedoch
die biochemischen Reagenzien fehlten. Der Begriff „Lagerzusammensetzung" wie er hier und
in den Ansprüchen
verwendet wird, soll ein pharmakologisch inaktives Fluid benennen,
in das die roten Blutzellen suspendiert werden können und das die Konservierungsfähigkeiten
der hier offenbarten Zusammensetzungen, zum Beispiel physiologische
Kochsalzlösung,
nicht negativ beeinflusst. Die biochemische Stabilisierung kann
darauf gerichtet sein, die metabolischen Komponenten, das Antioxidanspotential,
die intrazelluläre
Ionenverteilung, die Membranfluidität und die Integrität der zytoskeletalen
Struktur zu erhalten. Zusätzlich
können
spezifische Zweite-Messenger-Pfade, wie etwa die Cyclooxygenase-,
Lipoxygenase, Hexosemonophosphat- und Phosphorylierungspfade direkt
durch biochemische Reagenzien oder indirekt durch Regulation der
spezifischen Messenger-Moleküle manipuliert
werden, einschließlich
cyclischem Adenosinmonophosphat, (c-AMP), cyclischem Guaninmonophosphat,
(c-GMP), intrazellulärem
Calcium, Inositoltriphosphat und Diacylglycerol.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Modifizierungsmittel, die durch den Zweiten-Messenger-Pfad
agieren, ausgewählt
aus cyclischem Adenosinmonophosphat, (c-AMP), cyclischem Guaninmonophosphat,
(cGMP), intrazellulärem
Calcium, Inositoltriphosphat und Diacylglycerol. Reagenzien können zugefügt werden,
um die intrazellulären
Konzentrationen von ATP, wie etwa Glucose, Pyruvat oder anorganische Phosphate,
zu erhalten oder zu verbessern, sowie um die ATP-verbrauchenden
ATPasen zu blockieren, wie etwa Amilorid-Inhibition des Na+/H+-Austauschers.
Der Schutz der Membran oder des Hämoglobins vor oxidativer Schädigung kann
durch die Zugabe von Antioxidanzien, wie etwa Glutathion, Tocopherol,
Ascorbat und Bioflavonoiden erreicht werden, sowie durch die Stimulation
des Hexosemonophosphatpfads durch Ribose. Die Ionenverteilung kann
durch die Aktivierung oder Inhibition spezifischer Ionenpumpen reguliert
werden. Calcium kann mit Nifedipin oder Verapamil kontrolliert werden,
während
sich Amilorid, wie oben erwähnt,
auf die Natriumregulation auswirkt. Ferner kann die Kalium- und
Chloridionendistribution durch die Inhibition des K+/Cl–-Co-Transporters
mit Bumetanid erhalten werden. Die Cyclooxygenase- und Lipoxygenasepfade
können durch
die Zugabe von Flurbiprofen oder Aspirin reguliert werden, während Phosphorylierungsereignisse
durch die Inhibition durch Kinaseinhibitoren, wie etwa H7(1-[5-Isoquinolinylsulfonyl]-2-methylpiperazin),
Staurosporin oder Chelerythrin manipuliert oder durch Diacylglycerolpalmitoylcarnitin
stimuliert werden können.
Die Membranstabilisierung und -fluidität wird durch die Zugabe von
Pentoxifyllin, Nicotinamid oder Amantadin kontrolliert und die zytoskeletale
Struktur kann durch Actinstabilisierung durch die Verwendung von
TAXOL oder Cytochalasinen oder Spektrinstabilisierung mit Polyaminen
erhalten werden.
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Spezifische,
durch zyklische Nukleotide regulierte, Zweite-Messenger-Pfade können durch
die Verwendung anderer Stickoxidspender (erhöht c-GMP) aktiviert werden.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
sind die biochemischen Reagenzien: Nifedipin in einer Konzentration
von 500 μM,
Cytochalasin B in einer Konzentration von 20 μM, Taxol in einer Konzentration
von 500 μM,
Pentoxifyllin in einer Konzentration von 5 mM und Flurbiprofen in
einer Konzentration von 25 μg/ml. Die
Lagerzusammensetzung der Blutzellen der vorliegenden Ausführungsform
kann ferner ein Kryoprotektionsmittel beinhalten, wobei das Kryoprotektionsmittel
ausgewählt
wird aus Dimethylsulfoxid, Polyvinylpyrrolidon, Dextranmaltodextrinen,
2,3-Butandiol, Hydroxyethylstärke,
Polyethylenglycol, Glucose und Kombinationen davon. Bevorzugte Kryoprotektionsmittel
sind: Dextran in einer Konzentration von 7,5 %; Polyvinylpyrrolidon
in einer Konzentration von 2 %; Dimethylsulfoxid in einer Konzentration
von 2,5 %; Hydroxyethylstärke
in einer Konzentration von 5 % und Polyethylenglycol in einer Konzentration
von 5 %. Die verlängerte
Lagerung der roten Blutzellen sollte bei einer Temperatur unter
der normalen physiologischen Temperatur der roten Zellen erfolgen.
In einer Ausführungsform
liegt die Temperatur zwischen –10 °C bis –193 °C. In einer
weiteren Ausführungsform
liegt die Temperatur unter der normalen physiologischen Temperatur
der roten Blutzellen bei –80 °C.
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Die
folgenden Beispiele weisen die Fähigkeit
der biochemischen Stabilisierung nach, die Konservierung roter Blutzellen
bei Temperaturen unter –10 °C zu verbessern.
Es werden sowohl Glycerol-basierte als auch transfusierbare, polymer-basierte
Kryoprotektorlösungen
beschrieben.
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Die
Beispiele sind enthalten, um die bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung nachzuweisen. Fachleute sollten erkennen, dass die
in den folgenden Beispielen offenbarten Techniken, Techniken repräsentieren,
die der Erfinder als in der Praxis der Erfindung gut wirkend entdeckt
hat, und somit kann angenommen werden, dass sie die bevorzugten
Arten für
deren Praxis darstellen. Jedoch sollten die Fachleute im Licht der vorliegenden
Offenbarung erkennen, dass viele Veränderungen in den spezifischen
Ausführungsformen,
die im Beispiel offenbart sind, möglich sind, und dennoch ein
gleiches oder ähnliches
Ergebnis erhalten wird, ohne von Konzept und Umfang der Erfindung,
wie in den beigefügten
Ansprüchen
definiert, abzuweichen.
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BEISPIEL 1
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Das
folgende Beispiel weist die Schädigung
nach, die während
des Gefrier-Auftau-Zyklus
induziert wird, wenn die Glycerolkonzentration gesenkt wird. Es
wird gezeigt, dass ein signifikanter Prozentsatz der hämolytischen
Schädigung
durch die Zugabe einer Konservierungslösung zurückgeht, die Adenin, Glutamin,
Natriumchlorid, Mannitol und Dextrose, wobei das entscheidende Additiv
Dextrose ist, und die Schlusskonzentrationen von 5 mM Pentoxifyllin
und 25 μg/ml
Flurbiprofen in DMSO als Träger
enthält.
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Spezifisch
wurden 50 ml von gepackten roten Blutzellen in einen PVC-Gefrierbeutel mit
einem maximalen Volumen von 150 ml zugefügt. Isotonische Kochsalz- oder
Konservierungslösung,
die die zusätzlichen biochemischen
Reagenzien Pentoxifyllin und Flurbiprofen enthält, wurde mit den roten Blutzellen
gemischt. Ein Volumen von Glycerolyt 57 (Fenwall) wurde langsam
zugegeben bis die Schlusskonzentration von Glycerol erreicht wurde.
Das Gesamtvolumen aller Zugaben betrug 50 ml, so dass die Schlusskonzentration
der Einheit roter Blutzellen 100 ml ausmachte. Die PVC-Beutel wurden
2 bis 7 Tage lang bei –80 °C eingefroren
und durch 10-minütiges
Eintauchen in ein 37 °C
warmes Wasserbad aufgetaut. Das Level der Auftau-Hämolyse wurde als
das Verhältnis
von freiem Hämoglobin
zum gesamten Hämoglobin
bestimmt. Die Level der Auftau-Hämolyse
werden in der folgenden TABELLE 1 gezeigt.
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TABELLE
1 LEVEL
DER AUFTAU-HÄMOLYSE
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Diese
Ergebnisse bestätigen
den Verlust an Schutz der roten Blutzellen bei reduzierten Glycerolkonzentrationen
und die Fähigkeit
der biochemischen Reagenzien, Kryoprotektion bei Glycerolkonzentrationen bereitzustellen,
die allein nicht in der Lage sind, die roten Blutzellen während der
Kryokonservierung vollständig
zu schützen.
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BEISPIEL 2
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Das
folgende Beispiel weist ferner die Schädigung nach, die während des
Gefrier-Auftau-Zyklus induziert wird, wenn die Glycerolkonzentration
verringert wird, nachdem die roten Blutzellen eingefroren und bei –80 °C gelagert
wurden. Fünfzig
ml der gepackten roten Blutzellen wurden dem PVC-Gefrierbeutel zugefügt. Isotonische
Kochsalz- oder Konservierungslösung,
die die zusätzlichen
interessierenden biochemischen Reagenzien enthält, wurde mit den roten Blutzellen
gemischt. Die Proben wurden vor dem Einfrieren bei –80 °C wie folgt
behandelt:
- 1. 40 % Glycerol
- 2. 20 % Glycerol
- 3. Nicotinamid
- 4. Nikethamid, Nifedipin
- 5. Nikethamid, Nifedipin, Pentoxifyllin, Flurbiprofen
- 6. Nicotinamid, Nikethamid, Nifedipin, Pentoxifyllin, Flurbiprofen
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Ein
Volumen von Glycerolyt 57 (Fenwall) wurde langsam zugegeben bis
die Schlusskonzentration von Glycerol erreicht wurde. Das Gesamtvolumen
aller Zugaben betrug 50 ml, so dass die Schlusskonzentration der
Einheit roter Blutzellen 100 ml ausmachte. Die PVC-Beutel wurden
2 bis 7 Tage lang bei –80 °C eingefroren und
durch 10-minütiges
Eintauchen in ein 37 °C
warmes Wasserbad aufgetaut. Das Level der Auftau-Hämolyse wurde
als das Verhältnis
von freiem Hämoglobin
zum gesamten Hämoglobin
bestimmt. Zusätzlich
wurde das Glycerol von den aufgetauten roten Blutzelleneinheiten
durch serielle Dilution mit einer Kochsalzlösung, ähnlich den Blutbankprotokollen,
entfernt. Die Gesamthämolyse
und das finale restliche freie Hämoglobinlevel wurden
ebenfalls bestimmt.
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TABELLE
2 vergleicht 40 % Glycerol mit 20 % Glycerol und 20 % Glycerol mit
den angegebenen Additiven. Die verwendeten Additive beinhalteten
Nicotinamid, Nikethamid, Nifedipin, Pentoxifyllin und Flurbiprofen.
Die Ergebnisse von 20 % Glycerol mit allen Additiven halten die
Kriterien für
eine transfusierbare Bluteinheit auf der Basis der Gesamthämolyse-
und der restlichen freien Hämoglobinlevel
ein. Die Ergebnisse bestätigen
den Verlust an Schutz der roten Blutzellen bei reduzierten Glycerolkonzentrationen
und die Fähigkeit
der biochemischen Reagenzien, Kryoprotektion bei Glycerolkonzentrationen
bereitzustellen, die allein nicht in der Lage sind, die roten Blutzellen
während
der Kryokonservierung vollständig
zu schützen.
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BEISPIEL 3
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Der
folgende Versuch weist die Fähigkeit
der biochemischen Zugabe nach, Schutz gegen Schädigung während der Kryokonservierung
bereitzustellen. Das verwendete Modell ist ein reduziertes Glycerol-Kryokonservierungssystem.
10 % (w/v) Glycerol wird der Einheit vor dem Einfrieren bei –80 °C zugefügt. Ein
signifikantes Hämolyselevel
findet statt, so dass der Schutz durch die zugefügte Reagenz unterschieden werden
kann.
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Eine
einzelne gepackte Einheit roter Blutzellen in ADSOL wurde unter
Verwendung von Standardprotokollen zur Bluteinlagerung erhalten.
Das ADSOL wurde durch Zentrifugation entfernt und ein Volumen an Konservierungslösung wurde
zugefügt
bis der resultierende Hämatokrit
etwa 50 % betrug. Von dieser Einheit mit roten Blutzellen wurden
50 ml rote Blutzellen in jeden von 3 PVC-Gefrierbeutel, mit einem
maximalen Volumen von 150 ml, gegeben. Ein äquivalentes Volumen (50 ml)
wurde jedem der Beutel zugefügt,
bestehend aus der oben genannten Konservierungslösung und den Versuchszugaben.
Die Schlusszusammensetzung des ersten Beutels betrug 10 % (w/v)
Glycerol. Der zweite enthielt 10 % (w/v) Glycerol und 2,5 % DMSO
und 500 μM
Nifedipin. Die Beutel wurden 2 bis 7 Tage lang bei –80 °C eingefroren
und durch 10-minütiges
Eintauchen in ein 37 °C
warmes Wasserbad aufgetaut. Das Level der Auftau-Hämolyse wurde
als das Verhältnis
von freiem Hämoglobin
zum gesamten Hämoglobin
bestimmt. Zusätzlich
wurde das Glycerol von den aufgetauten roten Blutzelleneinheiten
durch serielle Dilution mit einer Kochsalzlösung, ähnlich den Blutbankprotokollen, entfernt.
Die Gesamthämolyse
wurde ebenfalls bestimmt. Die Ergebnisse werden in der folgenden
TABELLE 3 gezeigt.
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Dieses
Beispiel bestätigt
ferner die Fähigkeit
der biochemischen Modulation, die Kryokonservierung bei Glycerolkonzentrationen
zu verbessern, die normalerweise dazu führen, dass fast 100 % der roten
Blutzellen während
der Gefrier-Auftau- und Waschzyklen unzureichend geschützt sind.
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BEISPIEL 4
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Dieses
Beispiel weist die Fähigkeit
der biochemischen Stabilisierung nach, die Kryokonservierung der roten
Blutzellen in Verbindung mit einem Glycerol-basierten Kryoprotektor zu verbessern.
Ein Aliquot von Blut wurde in einen PVC-Lagerbeutel verlagert, dem
alle Versuchsubstanzen zugefügt
werden. Glycerol wurde dann zugefügt, bis der gewünschte Schlussglycerolwert
erreicht wurde. Diese Einheit wurde bei –80 °C eingefroren, gelagert und
bei 37 °C
10 Minuten lang in einem Wasserbad aufgetaut. Das Glycerol wurde
durch serielle Dilution und Zentrifugation mit 12 %, 1,6 % und 0,9
% Kochsalzlösung
entfernt, bis das restliche freie Hämoglobin weniger als 2 % des
gesamten Hämoglobingehalts
beträgt.
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TABELLE
4 zeigt die Ergebnisse gemäß dem gewünschten
Vorgang. Die Werte geben den Prozentsatz der Hämolyse in der aufgetauten Probe,
die Gesamtmenge der Hämolyse
nach der Wäsche,
und den Prozentsatz des restlichen freien Hämoglobins in der Schlussprobe
an. Die Hämolyse
wird als Verhältnis
des freien Hämoglobins
zu dem gesamten Hämoglobingehalt
der Probe berechnet.
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TABELLE
4 BIOMEDIZINISCHE
STABILISIERUNG MIT GLYCEROL-BASIERTEM KRYOPROTEKTOR
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BEISPIEL 5
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Das
folgende Beispiel weist nach, dass biochemische Stabilisierung unter
Verwendung von nicht kryoprotektiven Reagenzien das Hämolyselevel
reduziert, wenn alternative polymerische Reagenzien, wie etwa primäre Kryoprotektoren,
verwendet werden, wenn rotes Blut tauchgefroren und danach bei –80 °C gelagert wird.
Ein Volumen gepackter roter Blutzellen wurde mit einem äquivalenten
Volumen an Konservierungslösung gemischt,
die die gewünschten
Kryoprotektoren enthält,
und jegliches zusätzliche
biochemische Reagens. Die Schlusskonzentrationen der verwendeten
Kryoprotektoren lagen bei 7,5 % Dextran (Dex; 40.000 MW) und 2 %
Polyvinylpyrrolidon (PVP; 40.000 MW). Die Proben roter Blutzellen,
die die Kryoprotektoren enthalten, wurden zum Gefrieren 3 Minuten
lang in flüssigen
Stickstoff getaucht und zur Langzeitlagerung unverzüglich in einen –80 °C-Gefrierschrank
verlagert. Nach einer Lagerung für
3 bis 7 Tage wurden die Proben in einem 37 °C warmem Wasserbad aufgetaut
und das Level der Auftau-Hämolyse
wurde als das Verhältnis
von freiem Hämoglobin
zum gesamten Hämoglobin
bestimmt. Zusätzlich
wurde das Glycerol von den aufgetauten roten Blutzelleneinheiten
durch serielle Dilution mit einer Kochsalzlösung, ähnlich den Blutbankprotokollen,
entfernt. Die Gesamthämolyse
und das finale restliche freie Hämoglobin
wurden ebenfalls bestimmt.
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TABELLE
5 zeigt die biochemische Stabilisierung mit einem polymer-basierten
Kryoprotektor und den resultierenden Hämolyseprozentsatz. Alle Proben
enthielten 7,5 % Dex und 2 % PVP, 2,5 % Dimethylsulfoxid als biochemischem
Träger,
vor der Lagerung bei –80 °C, zusätzlich zu
den folgenden angegebenen Additiven:
- 1. DMSO
- 2. Nifedipin
- 3. Cytochalasin, Taxol
- 4. Nifedipin, Pentoxifyllin, Flurbiprofen
- 5. Nifedipin, Cytochalasin, Taxol
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Die
verwendeten Reagenzien beinhalteten 500 μM Nifedipin, 20 μM Cytochalastin
B, 500 μM
Taxol, 5 mM Pentoxifyllin und 25 μM/ml
Flurbiprofen in mehreren Kombinationen
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Dieses
Beispiel bestätigt
ferner die Fähigkeit
der biochemischen Modulation, die Kryokonservierung bei Glycerolkonzentrationen,
bei denen normalerweise fast 100 % der roten Blutzellen während der
Gefrier-Auftau- und Waschzyklen unzureichend geschützt sind
zu verbessern. Die biochemische Stabilisierung mit einem polymerischen
Kryoprotektor und der resultierende Hämolyseprozentsatz werden in
TABELLE 5 dargestellt.
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BEISPIEL 6
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Das
folgende Beispiel beschreibt einen Versuch, die biochemische Stabilisierung
und die Nach-Auftau-Hämolyse-Läsion nach
Dilution, analog zur Transfusion, zu messen, nachdem die roten Blutzellen
tauchgefroren und bei –80 °C gelagert
wurden. Diese Art von Lagerläsion
wird gewöhnlich
nicht adressiert, wird jedoch bei den meisten nicht Glycerol-basierten
Kryoprotektionslösungen
beobachtet. Ein Volumen gepackter roter Blutzellen wurde mit einem äquivalenten
Volumen an Konservierungslösung
gemischt, die die gewünschten
Kryoprotektoren enthält
und jedes zusätzliche
biochemische Reagens. Unter Verwendung einer additiven Kryoprotektionslösung (CPA),
die 7,5 % Dextran (Dex; 40.000 MW) 2 % Polyvinylpyrrolidon (PVP;
40.000 MW), 5 % Hydroxyethylstärke
(HES) und 5 % Polyethylenglycol (PEG) enthält, wurden die Proben mit den
roten Blutzellen, die die Kryoprotektoren enthalten, zum Gefrieren
3 Minuten lang in flüssigen
Stickstoff getaucht und zur Langzeitlagerung unverzüglich in
einen –80 °C-Gefrierschrank
verlagert. Nach der Lagerung wurden die Auftau-Proben in zwei Aliquots
geteilt. Das erste Aliquot wurde unverzüglich analysiert und das verbleibende
Aliquot wurde 3 Stunden lang bei 4 °C vor der Analyse inkubiert.
Die analysierten Endpunkte beinhalteten die Hämolyse in der Auftau-Probe
und die zusätzliche
Hämolyse,
die bei 1:1 Verdünnung
mit einer von 2 verschiedenen Verdünnungslösung, PBS oder Isotypplasma
stattfindet.
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In
TABELLE 6 wird die Stabilität
der roten Blutzellen nach dem Auftauen gezeigt, wobei die Auftau-Hämolysewerte
und die positive Wirkung einer Inkubation bei 4 °C bei den dilutionsinduzierten
Hämolysewerten beobachtet
wird. Am wichtigsten ist die Fähigkeit
biochemischer Additive, den Schutz während des Protokolls zu verbessern.
Die biochemischen Additive wurden verwendet, um die Zellen nach
dem Auftauen zu stabilisieren und diese Wirkung nachzuweisen, indem
die dilutionsinduzierte Hämolyse
abnimmt. Somit wird hier gezeigt, dass die Schädigung der roten Blutzellen
während
der Kryokonservierung, sowohl teilweise selbstreversibel als auch
entweder vorbeugbar oder durch biochemische Zugaben korrigierbar
ist: Die Behandlungsbedingungen waren folgende:
| 1.
nur CPA | |
| 2.
CPA + | 50
mM Ribose |
| 3.
CPA + 50 | mM
Ribose
50 mM Trehalose
500 μM Nifedipin
5 mM Pentoxifyllin
50 μg/ml Flurbiprofen |
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BEISPIEL 7
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Der
folgende Versuch weist die Fähigkeit
alternativer Kryoprotektoren nach, bei niedrigen transfusierbaren
Konzentrationen in Kombination zu agieren, um den Schutz gegen Gefrier-Auftau-induzierte
Hämolyse zu
verbessern.
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Eine
einzelne gepackte Einheit roter Blutzellen, die ADSOL enthält, wurde
erhalten und unter Verwendung von Standardprotokollen zur Bluteinlagerung
hergestellt. Das ADSOL wurde mittels Zentrifugation entfernt und
ein Volumen an Konservierungslösung
wurde zugefügt.
Ein Volumen der resultierenden Blutzelleneinheit wurde mit einem äquivalenten
Volumen der Konservierungslösung
gemischt, die den (die) gewünschten
Kryoprotektor(en) enthielt. Die Schlusskonzentrationen der verwendeten
Kryoprotektoren betrugen 7,5 % Dextran (Dex; 40.000 MW), 2 % Polyvinylpyrrolidon
(PVP; 40.000 MW) und 5 Hydroxyethylstärke (HES). Die roten Zellblutproben,
die die Kryoprotektoren enthalten, wurden zum Gefrieren drei Minuten
lang in flüssigen Stickstoff
getaucht und zur Langzeitlagerung unverzüglich in einen –80 °C-Gefrierschrank verlagert.
Nach einer Lagerung für
3 bis 7 Tage wurden die Proben in einem 37 °C warmem Wasserbad aufgetaut
und das Level der Auftau-Hämolyse
wurde wie beschrieben als das Verhältnis an freiem Hämoglobin
zum gesamten Hämoglobin
bestimmt. Die Level der Auftau-Hämolyse werden
in der folgenden TABELLE 7 gezeigt:
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TABELLE
7 LEVEL
DER AUFTAU-HÄMOLYSE
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Dieses
Beispiel bestätigt,
dass die extrem niedrigen transfusierbaren Konzentrationen der Kryoprotektoren
in Kombination arbeiten können,
um die roten Blutzellen während
der Kryokonservierung besser als jeder einzelne Kryoprotektor allein
zu schützen.
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Angesichts
der obigen Offenbarung sollte ein Fachmann mit üblichen Kenntnissen verstehen
und erkennen, dass eine illustrative Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung eine Zusammensetzung aus roten Blutzellen beinhaltet,
die eine Zusammensetzung aus roten Blutzellen, eine Lagerzusammensetzung
und eine Kombination der die Biochemie verändernden Reagenzien beinhaltet,
wobei die die Biochemie verändernden Reagenzien
in einer Konzentration vorhanden sind, um den Hämolyseprozentsatz der roten
Blutzellen während
des Gefrier-Auftau-Zyklus unter den des Hämolyseprozentsatzes der roten
Blutzellen beim Fehlen der die Biochemie verändernden Reagenzien zu verringern.
Bevorzugt werden die Reagenzien der vorliegenden illustrativen Ausführungsform
ausgewählt
aus: Modifikationsmittel für
glycolytische/metabolische Komponenten, Modifikationsmittel für Antioxidanspotential,
Effektoren zur intrazellulären
Ionendistribution, Modifikationsmittel für die Membranfluidität, Modifikationsmittel
für die
zytoskeletale Struktur, Effektoren des Cyclooxygenase-Zweiter-Messenger-Pfads, Effektoren
des Lipoxygenase-Zweiter-Messenger-Pfads, Effektoren des Hexosemonophosphat-Zweiter-Messenger-Pfads,
Effektoren des Phosphorylierungs-Zweiter-Messenger-Pfads, Modifikationsmittel
der, durch zyklische Nukleotide regulierten, Zweiten-Messenger-Pfade.
Mehr bevorzugt werden die Reagenzien der vorliegenden illustrativen
Ausführungsform
so ausgewählt,
dass: das Modifikationsmittel für
das Antioxidanspotential ausgewählt
wird aus Tocopherol, Ascorbat, α-Tocopherol,
Bioflavonoiden und Derivaten der Bioflavonoide einschließlich Rutin,
Quercetin und Curcumin; der Effektor der intrazellulären Ionendistribution,
der durch den Zweiten-Messenger-Pfad agiert, ausgewählt wird
aus Nifedipin, Nisoldipin, Benzamil, Glybenclamid, Diltiazem, Clotrimizol,
Tetramethylammoniumdiphenylhydantoin, 4,4'-Diisothiocyanatstilben-2,2'-disulfonsäure, Verapamil,
Amilorid, Bumetanid, N-(6-Aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalensulfonamid und Derivate
davon; das Modifikationsmittel der Membranfluidität ausgewählt wird
aus Pentoxifyllin, Nicotinamid, Amantadin, Carnitin, Palmitoylcarnitin,
Sphingosin, Diethylnicotinamid, (Nikethamid), Trehalose, Valinomycin,
Procain, Tetracain, Rimantadin, Propanolol und Proteaseinhibitoren,
wie etwa Leupeptin; die Modifikationsmittel für die zytoskeletale Struktur
ausgewählt
wird aus TAXOL, Cytochalasinen, Paclitaxel, Okadainsäure und
Polyaminen, wie etwa Spermidin oder Putrecin; die Effektoren der
Cyclooxygenase- und Lipoxygenase-Zweite-Messenger-Pfade ausgewählt werden
aus Flurbiprofen, Salicylsäure
und Indomethacin; die Effektoren der Hexosemonophosphat-Zweite-Messenger-Pfad
ausgewählt
werden aus Ribose oder Pyruvat; der Effektor des Phosphorylierungs-Zweite-Messenger-Pfad ausgewählt wird
aus H7(1-[5-Isoquinolinylsulfonyl]-2-methylpiperazin), Staurosporin, Chelerythrin
und Diacylglycerolpalmitoylcarnitin; und die Modifikationsmittel
der, durch zyklische Nukleotide regulierten, Zweiten-Messenger-Pfade ausgewählt werden
aus Dibutyl-AMP, Dibutyl-GMP.
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Die
illustrative Zusammensetzung kann auch so formuliert werden, dass
die, die Biochemie verändernden
Reagenzien, mit einem oder mehreren Kryoprotektionsmitteln kombiniert
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Kryoprotektionsmittel
ein permanenter Kryoprotektor sein, bevorzugt kann ein permanenter
Kryoprotektor ausgewählt
werden aus Glycerol, Dimethylsulfoxid, 2,3-Butandiol, 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol,
Polypropylenglycol, N, N-Dimentylacetamid und 1,3,5-Trimethylpentanetriol
und Kombinationen davon. Alternativ kann die Zusammensetzung so
formuliert werden, dass das Kryoprotektionsmittel ein nicht permanenter
Kryoprotektor ist, der bevorzugt ausgewählt werden kann aus Hydroxyethylstärke, Dextran, Polyvinylpyrrolidon,
Polyethylen, Polyethylenglycol und Kombinationen davon. Eine Kombination
aus einem oder mehreren permanenten Kryoprotektoren und einem oder
mehreren nicht permanenten Kryoprotektoren können ebenfalls in der Formulierung
der vorliegenden illustrativen Ausführungsform genutzt werden.
Wenn die Formulierung einen nicht permanenten Kryoprotektor beinhaltet,
ist bevorzugt, dass der nicht permanente Kryoprotektor ein Molekulargewicht
von mindestens etwa 5.000 MW hat.
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Die
illustrative Ausführungsform
sollte so formuliert sein, dass die biochemischen Reagenzien in
einer solchen Konzentration vorhanden sind, dass bei einer In-vitro-Konservierung
der roten Blutzellen bei einer Temperatur unterhalb der physiologischen
Temperatur der roten Blutzellen für einen Zeitraum von 2 bis
7 Tagen die roten Blutzellen eine geringere Hämolyse während eines Gefrier-Auftau-Zyklus
und erhöhte
funktionelle In-vitro-Aktivität
im Vergleich mit roten Blutzellen, die unter den gleichen Bedingungen
konserviert wurden, bei denen jedoch die biochemischen Reagenzien
fehlten, zeigen. Somit hat in einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden illustrativen Ausführungsform das Nifedipin eine
Konzentration von 500 μM,
das Cytochalasin B eine Konzentration von 20 μM, das Taxol eine Konzentration
von 500 μM,
das Pentoxifyllin eine Konzentration von 5 mM, das Flurbiprofen
eine Konzentration von 25 μg/ml,
das Nikethamid eine Konzentration von (1 % v/v), die Ribose eine
Konzentration von 50 mM, und die Trehalose eine Konzentration von
50 mM.
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Es
sollte ebenfalls erkannt werden, dass die vorliegende Erfindung
ein Verfahren zur Lagerung menschlicher roter Blutzellen beinhaltet,
einschließlich:
(a) Isolieren roter Blutzellen aus frischem menschlichem Blut; (b)
Bildung einer Zusammensetzung aus roten Blutzellen; und (c) Lagerung
der resultierenden Zusammensetzung der roten Blutzellen bei einer
Temperatur unter normaler menschlicher physiologischen Temperatur,
die bewirkt, dass die Blutzellen für einen ausgewählten Zeitraum
erhalten bleiben. Bevorzugt sollte die Zusammensetzung aus roten
Blutzellen so formuliert werden, dass sie beinhaltet: rote Blutzellen;
eine Lagerzusammensetzung; und eine Zusammensetzung von Reagenzien.
Die Zusammensetzung von Reagenzien sollte ausgewählt sein aus: Modifikationsmittel
für metabolische
Komponenten, Modifikationsmittel für Antioxidanspotential, Effektoren
mit intrazellulärer
Ionendistribution, Modifikationsmittel für die Membranfluidität, Modifikationsmittel
für die
zytoskeletale Struktur, Effektoren des Cyclooxygenase-Zweiter-Messenger-Pfads, Effektoren
des Lipoxygenase-Zweiter-Messenger-Pfads, Effektoren des Hexosemonophosphat-Zweiter-Messenger-Pfads,
Effektoren des Phosphorylierungs-Zweiter-Messenger-Pfads, Modifikationsmittel
der durch zyklische Nukleotide regulierte Messenger-Pfade, und Kombinationen
davon. Bei der Durchführung
des vorliegenden illustrativen Verfahrens, liegt die Temperatur
unterhalb der normalen physiologischen Temperatur, die den Erhalt
der roten Blutzellen für
einen ausgewählten
Zeitraum bewirkt, bevorzugt zwischen –10 °C und –193 °C, und mehr bevorzugt bei –80 °C.
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Alle
Zusammensetzungen und Verfahren, die hier offenbart und beansprucht
werden, können
ohne unzumutbare Versuche im Licht der vorliegenden Offenbarung
gemacht und ausgeführt
werden.
