DE102008039734A1 - Stabilisierung von Zellen durch ionische Flüssigkeiten - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von ionischen Flüssigkeiten und/oder kompatiblen Soluten zur Lagerung und Stabilisierung von eukaryontischen Zellen, vor allem Blutzellen wie z. B. Leukozyten, Thrombozyten oder Erythrozyten. Die Erfindung betrifft ferner Zusammensetzungen, die eukaryontische Zellen und ionische Flüssigkeiten und/oder kompatible Solute umfassen, Medizinprodukte mit ionischen Flüssigkeiten und/oder kompatiblen Soluten, sowie ein Verfahren zur Lagerung von eukaryontischen Zellen. Die Zellen können in Zellverbänden (Zellgemische, Gewebe, Organe, Organismen) enthalten sein.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von ionischen Flüssigkeiten und/oder kompatiblen Soluten zur Lagerung und Stabilisierung von eukaryontischen Zellen, vor allem Blutzellen wie z. B. Leukozyten, Thrombozyten oder Erythrozyten. Die Erfindung betrifft ferner Zusammensetzungen, die eukaryontische Zellen und ionische Flüssigkeiten und/oder kompatible Solute umfassen, Medizinprodukte mit ionischen Flüssigkeiten und/oder kompatiblen Soluten, sowie ein Verfahren zur Lagerung von eukaryontischen Zellen in diesen Flüssigkeiten. Die Zellen können in Zellverbänden (Zellgemische, Gewebe, Organe, Organismen) enthalten sein.
  • 1. Hintergrund der Erfindung
  • 1.1 Blut
  • Blut (lat. sanguis) ist ein spezielles, flüssiges Gewebe, das mit Unterstützung des Herz-Kreislauf-Systems die Funktionalität der restlichen Körpergewebe über vielfältige Transport- und Verknüpfungsfunktionen sicherstellt. Das Gefäßsystem des erwachsenen menschlichen Körpers enthält etwa 70 bis 80 mL Blut pro kg Körpergewicht, dies entspricht ca. 5 bis 6 L Blut. Blut besteht aus zellulären Bestandteilen (ca. 44%) und Plasma (ca. 55%), einer wässrigen Lösung (90% Wasser) aus Proteinen, Salzen und niedrig-molekularen Stoffen, wie z. B. Monosacchariden. Die im Blut enthaltenen Zellen werden unterschieden in Erythrozyten (rote Blutkörperchen), Leukozyten (weiße Blutkörperchen, z. B. Granulozyten) und Thrombozyten oder Blutplättchen. Die Erythrozyten (griech. erythros für ”rot” und kytos für ”hohl” oder ”Zelle”) machen ca. 43% des gesamten Blutvolumens aus. Sie erfüllen im Organismus die lebenswichtige Aufgabe des Gastransportes, indem sie (1) den Sauerstoff von den Lungen zu den Organen und Körperzellen und (2) einen Teil des Kohlendioxides von den Organen und Körperzellen zurück zur Lunge transportieren. Erythrozyten zeichnen sich durch ihre charakteristische bikonkave Scheibenform aus, welche eine deutliche Oberflächenvergrößerung bewirkt und zudem zu der enormen Verformbarkeit der Zellen beiträgt. Der Durchmesser eines roten Blutkörperchens beträgt beim Menschen etwa 7,5 μm bei einer Dicke von 2 μm. Erythrozyten bestehen zu 90% der Trockenmasse aus dem Sauerstoff-bindenden Protein Hämoglobin. Der Häm-Anteil dieses Proteins verleiht den Erythrozyten und somit auch dem Blut die rote Farbe (1). Der Sauerstofftransport mit Hilfe von Hämo globin ist ein energieunabhängiger Vorgang. Im Rahmen der sog. Erythropoese verlieren Erythrozyten bis zur Reifung sowohl den Zellkern als auch die Ribosomen und Mitochondrien. Sie sind somit weder zur DNA-Replikation oder de-novo-Proteinbiosynthese, noch zur Energiegewinnung mit Hilfe der Enzyme der Atmungskette, der oxidativen Phosphorylierung, des Citratzyklus oder der Betaoxidation befähigt. Da die Erythrozyten keine Mitochondrien mehr besitzen, wird Energie über die anaerobe Glykolyse hergestellt.
  • Die metabolische Aktivität des Erythrozyten entspricht einem spezialisierten Erhaltungsstoffwechsel, bei welchem Glukose das obligate Substrat darstellt. Die Ziele dieses Erhaltungsstoffwechsels sind die Aufrechterhaltung der Zellstruktur, die Bereitstellung funktionstüchtigen Hämoglobins, die Synthese von Glutathion und des Energielieferanten Adenosintriphosphat (ATP), sowie die Aufrechterhaltung bestehender Konzentrationsdifferenzen von Natrium- und Kalium-Ionen zwischen Intra- und Extrazellulärraum. Für die Affinität des Sauerstoffs am Hämoglobin ist der Gehalt von 2,3-Diphosphoglycerat (2,3-DPG) wesentlich (”respiratorische Motilität”), die es umgekehrt proportional zu seiner intra-erythrozytären Konzentration beeinflusst. Bindet 2,3-DPG an Desoxyhämoglobin, stabilisiert es dies dadurch in einem Zustand niedriger Sauerstoffaffinität. Eine erhöhte 2,3-DPG-Konzentration führt somit bei gleich bleibendem pH und pO2 zu verminderter Sauerstoffaffinität und gesteigerter Sauerstofffreisetzung, es wird von einer „Rechtsverschiebung der Sauerstoffdissoziationskurve” gesprochen. Des Weiteren stellt 2,3-DPG sowohl eine Energie- als auch eine Phosphatreserve dar, welche bei erhöhtem Energiebedarf mobilisiert werden können.
  • 1.2 Bluttransfusionen
  • Der Begriff Bluttransfusion bezeichnet die Übertragung von Blut oder Blutbestandteilen vom Spender (Donor) zum Empfänger (Rezipient). Die Entdeckung des Blutkreislaufes durch W. Havery (1578–1657) im Jahre 1628 war die physiologische Grundlage für erste Überlegungen und experimentelle Versuche zu Blutübertragungen und wird als Beginn der Entwicklung der Transfusionsmedizin angesehen (Greenwalt, 1997; Ryser, 2000). Nachdem in der Vergangenheit insbesondere Vollblutkonserven verwendet wurden, liegt heute der Schwerpunkt in der gezielten Therapie durch einzelne Blutkomponenten in Form von Blutzell- und Plasmapräparaten. Dies sind im Wesentlichen das Erythrozyten-Konzentrat (EK), das Thrombozyten-Konzentrat (TK, PLT), das Granulozytenkonzentrat (GK), Stammzellkonzentrate (SK) z. B. aus peripheren Stammzellspenden, aber auch aus Knochenmarksspenden und das Fresh Frozen Plasma (FFP). Akuter Volumenmangel und Blutverlust, seien sie traumatisch oder aber operationstechnisch bedingt, werden entweder mit Volumen-Expandern oder mit gelagerten Erythrozyten-Konzentraten therapiert. Die Volumen-Expander (z. B. Ringer-Lösung, HAES (Hydroxyaethylstärke, auch HES, in unterschiedlicher Kettenlänge, Vernetzungsgrad und Konzentration, z. B. HES 200/0,5 6%) sind jedoch nicht in der Lage, Sauerstoff zu transportieren, sondern dienen nur zur Beseitigung des bestehenden Volumenmangels, d. h. zur Kreislaufstabilisierung, z. T. auch zur Gewinnung der Blutzellen (z. B. Granulozytenkonzentrate). Heutzutage ist der Einsatz von gelagerten Erythrozyten-Konzentraten ein standardisiertes und routinemäßig durchgeführtes Verfahren zur Erythrozytensubstitution bei Blutverlust. Das Erythrozyten-Konzentrat stellt eine Blutkonserve dar, welche weitestgehend von Blutplasma und Buffy coat (Leukozyten und Thrombozyten) befreit wurde. Somit werden überwiegend Erythrozyten transfundiert. Hauptsächliches Anwendungsgebiet der Erythrozyten-Konzentrate ist einerseits die Therapie von Anämien und andererseits – in Kombination mit dem Plasmaersatz – die Therapie des akuten Blutverlusts.
  • Bei der Herstellung und anschließenden Lagerung der Erythrozyten-Konzentrate kommt es zu Veränderungen der biochemischen und auch der den Sauerstofftransport betreffenden Parameter. Dieses Phänomen wird als Lagerungsschaden bezeichnet. Der Erythrozyten-Stoffwechsel unterscheidet sich unter Lagerungsbedingungen aufgrund eines komplexen Zusammenspiels verschiedener veränderter Bedingungen und deren Auswirkungen vom Erythrozyten-Stoffwechsel unter physiologischen Bedingungen. Ausschlaggebende Veränderungen sind die niedrigere Temperatur und das geschlossene System. Diese Tatsachen haben maßgeblichen Einfluss auf die Haltbarkeit von sowohl Vollblutkonserven als auch Erythrozyten-Konzentraten. In vivo beträgt die Erythrozytenlebensdauer 100–120 Tage, unter Konservierungsbedingungen in Abhängigkeit von der erfolgten Lagerung bis zur Transfusion 32–49 Tage. Sie ist insbesondere vom pH-Wert, der Temperatur und der zur Verfügung stehende Glukose abhängig. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Lagerungsschaden des Erythrozyten mehrere Punkte betrifft: Im Rahmen eines morphologischen Formenwandels bilden sich Sphärozyten, Stechapfelformen und Mikrovesikel, dies geht insgesamt mit verminderter Deformabilität bzw. erhöhter Rigidität einher. Es kommt zu funktionellen Beeinträchtigungen, welche sich in einer Linksverschiebung der Sauerstoffdissoziationskurve sowie in einer verminderten osmotischen Resistenz der roten Blutzellen widerspiegeln. Die mögliche Bildung von Mikroaggregaten hat nach der Transfusion eine erhöhte Gefahr der Entstehung von Mikroembolien zur Folge. Zudem führt der Lagerungsschaden zur Freisetzung intra-erythrozytärer Stoffe, wie beispielsweise Kalium, Laktatdehydrogenase und Hämoglobin. Um die beschriebenen Auswirkungen der Lagerung auf den Erythrozytenstoffwechsel, insbesondere das Abfallen der Konzentrationen an ATP und 2,3-DPG um einige Wochen hinauszuzögern und damit die Haltbarkeit der Blutkonserven zu verlängern, bedient man sich des Hinzufügens von Stabilisatoren und additiven Lösungen.
  • 1.3 Stabilisatoren und additive Lösungen für die Lagerung von Blutkonserven
  • Blutkonserven enthalten neben Blut bestimmte Konservierungslösungen. Hierbei unterscheidet man zwischen Stabilisatoren und additiven Lösungen, welche heutzutage beide in Kombination zur Erythrozytenkonservierung verwendet werden. Die Stabilisatoren dienen einerseits der Antikoagulation, andererseits auch der Aufrechterhaltung des Zellstoffwechsels. Die additiven Lösungen haben die Aufgabe, den Zellstoffwechsel zusätzlich zu stabilisieren und dadurch zu einer Verbesserung von Überlebensrate und Überlebenszeit der Erythrozyten zu führen. Als wichtiges Kriterium für den Konservierungserfolg gilt dabei die Überlebensrate der Erythrozyten im Empfängerorganismus, gemessen 24 Stunden nach der Transfusion. Sie sollte mindestens 75% betragen. Der Anteil des extrazellulären Hämoglobins am Gesamthämoglobin stellt als „Indikator” der Hämolyse ein weiteres wichtiges Kriterium dar und sollte am Ende der Lagerungszeit nicht mehr als 1% betragen.
  • 1.3.1 Stabilisatoren
  • Die Zusammensetzung der Stabilisatoren-Lösung ist prinzipiell so gewählt, dass mit Hilfe von Citrat-Ionen die Gerinnung verhindert, durch Zugabe von Dextrose der Zellstoffwechsel der Erythro zyten aufrechterhalten und durch Hinzufügen von Adenin der intrazelluläre Adenosin-phosphorsäure-Pool angehoben werden. Einer der ersten entwickelten Stabilisatoren ist der ACD(Acid.citr.-Citrat-Dextrose)-Stabilisator. Er besteht aus Zitronensäure, Citrat und Dextrose, und wurde 1943 von Loutit et al. konzipiert. Die durchschnittliche Überlebensrate 24 Stunden nach der Transfusion liegt nach dreiwöchiger Lagerzeit bei 70%. Der heute zumeist verwendete Stabilisator ist der CPD (Citrat-Phosphat-Dextrose)-Stabilisator. Er stellt in seiner ursprünglichen Zusammensetzung eine Weiterentwicklung des ACD-Stabilisators dar und enthält neben Zitronensäure, Citrat und Dextrose zusätzlich Phosphat, welches für den intrazellulären Erhalt organischer Phosphatverbindungen und für bessere Pufferungsverhältnisse innerhalb des Stabilisators sorgt. Durch letzteres bedingt kommt es zu einer Anhebung des pH-Wertes des Stabilisators selbst auf 5,6–5,8. Nach Vermischen mit Blut hat die Blutkonserve einen pH-Wert von etwa 7,2. Dieser im Vergleich zum ACD-Stabilisator alkalischere pH-Wert führt dazu, dass die 2,3-DPG-Konzentration langsamer sinkt. Auch am Ende der Konservierungszeit ist noch ausreichend Glukose vorhanden. Die durchschnittliche 24-Stunden-Überlebensrate liegt nach dreiwöchiger Lagerzeit bei 72%. Durch Zugabe des Purins Adenin wird aus dem CPD-Stabilisator der CPD-A(denin)-Stabilisator gebildet. Der Zusatz von Adenin hat eine Verlängerung der Konservierungszeit zur Folge.
  • 1.3.2 Additivlösungen
  • Diese proteinfreien Konservierungslösungen enthalten die für die Erythrozytenkonservierung notwendigen Substanzen, welche zur Aufrechterhaltung des Energiehaushalts sowie der Membranstabilität der Erythrozyten während der Lagerung führen. Eine längere Verwendbarkeit der Erythrozyten-Konzentrate wird ermöglicht. Die Additivlösung wird den Erythrozyten nachträglich, d. h. nach Entfernen des Plasmas, im Rahmen einer Resuspendierung hinzugefügt. Heutzutage werden in Deutschland zumeist die additiven Lösungen SAG-M, PAGGS-S und PAGGS-M verwendet. SAG-M besteht neben physiologischer Kochsalzlösung aus Adenin, Glukose und Mannit. Der Zusatz von Mannit führt aufgrund osmotisch stabilisierender Eigenschaften zu einer geringeren spontanen Hämolyserate während der Lagerungszeit. Durch Verwendung von SAG-M in Kombination mit dem CPD-Stabilisator ist eine Lagerung von 5–6 Wochen möglich, wobei die Überlebensrate der Erythrozyten 24 Stunden nach der Transfusion bis auf 77% angehoben wird. PAGGS(Phosphat-Adenin-Glukose-Guanosin-Sorbit)-S(orbit) und PAGGS-M(annit), bestehen aus physiologischer Kochsalzlösung, Phosphat, Adenin, Glukose, Guanosin und Sorbit bzw. Mannit. Bei einer Lagerzeit von 7 Wochen werden 24-Stunden-Überlebensraten von 78 erreicht. Im Vergleich zu SAG-M bleiben sowohl das zelluläre ATP als auch der Adenylatpool (ATP + ADP + AMP) besser erhalten, was für die Überlebensfähigkeit der Erythrozyten nach Transfusion von großer Bedeutung ist. Teilweise ist dies zurückzuführen auf das in dieser Additivlösung neben Adenin zusätzlich vorhandene Guanosin, welches den Nukleotid-Pool in Form von Guanosintriphosphat (GTP) erweitert.
  • Zusammenfassend lässt sich sagen, dass auch nach Zugabe von Stabilisatoren und additiven Lösungen zu den Blutkonserven die Erythrozyten-Lebensdauer unter Konservierungsbedingungen weiter unter der in vivo zu erwartenden Lebensdauer liegt und somit den begrenzenden Faktor für die Haltbarkeit der Konserven darstellt.
  • Ähnlich ist die Lage bei Thrombozytenkonzentraten und Granulozytenkonzentraten. Während Erythrozyten bei Anämie und Thrombozyten bei Thrombopenie mit Blutungsgefahr gegeben werden, ist das Einsatzgebiet von Granulozytenspenden der Granulozytenmangel (im Extremfall Agranulozytose) zur Behandlung neutropener Infektionen. Durch die Einführung von Steroid- bzw. G-CSF-induzierten Granulozytenkonzentraten mit hoher Zellzahl wurden die klinischen Ergebnisse bei Granulozytentransfusion verbessert.
  • Diese Konzentrate sind noch viel kürzer lagerbar als Erythrozytenkonzentrate und haben daher ein noch größeres Optimierungspotential.
  • 1.4 Zielsetzung
  • Die Haltbarkeit von Erythrozyten-Konzentraten ist in Abhängigkeit von der Konservierungslösung auf bis zu 49 Tage begrenzt. Tag für Tag werden in Deutschland jedoch zahlreiche Blutkonserven benötigt. Erythrozyten-Konzentrate sind ein wichtiges Notfallmedikament nach Unfällen und bei akuten Erkrankungen, für die es bis heute keinen adäquaten Ersatz (”Kunstblut”) gibt. Kurzfristige Einflüsse führen dabei immer wieder eine Knappheit der Erythrozyten-Konzentrate herbei. Beispiele für solche Faktoren sind z. B. (1) eine Grippewelle, da nur gesunde Menschen spenden dürfen, (2) Urlaubszeit, da sich viele ”Stammspender” im Ausland aufhalten, (3) zufällig zusammenfallende schwere Unfälle und Operationen, bei denen hoher Blutbedarf besteht, (4) der Trend zu Fernreisen, da Personen, die sich in Tropengebieten aufgehalten haben, längere Zeit nicht spenden dürfen. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Erythrozyten-Konzentraten könnte durch eine weitere Erhöhung der Stabilität von Erythrozyten und somit eine Verlängerung der Lagerzeit ein großer Beitrag zur Sicherung einer adäquaten Versorgung von Patienten, welche eine Transfusion benötigen, geleistet werden.
  • Auch die Lagerung anderer eukaryontischer Zellen, z. B. Granulozyten-Konzentraten, Thrombozyten-Konzentraten oder von anderen Zellen aus Blut, Zelllinien, die z. B. in der Forschung verwendet werden, oder von Probenmaterial, z. B. Biopsien oder Knochenmarksspenden, ist noch verbesserungsbedürftig.
  • 2. Beschreibung der Erfindung
  • Dem gegenüber stellt sich dem Fachmann das Problem, eine alternative Möglichkeit zur Lagerung von eukaryontischen Zellen, insbesondere von Erythrozyten, Thrombozyten oder Granulozyten zur Verfügung zu stellen.
  • Dieses Problem wird von der vorliegenden Erfindung, insbesondere vom Gegenstand der Ansprüche, gelöst.
  • Es wurde im Rahmen der Erfindung erstmals festgestellt, dass ionischen Flüssigkeiten zur Lagerung und Stabilisierung von Zellen, insbesondere eukaryontischen Zellen verwendet werden können.
  • Ionische Flüssigkeiten (kurz ILs: „ionic liquids”) sind Ionenpaare mit Schmelzpunkten unter 100°C. In den letzten Jahren haben sie sich zunehmend als neuartige Lösungsmittel für eine Vielzahl von Reaktionen etabliert, da sie variierbare Lösungseigenschaften mit einem kaum nachweisbaren Dampfdruck und exzellenten thermischen und chemischen Stabilitäten kombinieren. Durch eine geeignete Wahl von Kationen und Anionen ist eine stufenweise Einstellung der Polarität und damit eine Abstimmung der Löslichkeitseigenschaften möglich. Die Bandbreite reicht dabei von wassermischbaren ionischen Flüssigkeiten über wassernichtmisch bare bis hin zu solchen, die selbst mit organischen Lösungsmitteln zwei Phasen bilden. Ionische Flüssigkeiten, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise in den Publikationen (BRANCO ET AL. (2002); CHEM. EUR. J. 8 No. 17, 3865–3871; BRANCO, L. C. ET AL. (2002); ANGEW. CHEM. INT. ED. 41 No. 15, 2771–2773; ANDERSON, J. L. ET AL.; (2002); J. AM. CHEM. SOC. 124, 14247–14254; H. ZHAO; (2003); PHYSICS AND CHEMISTRY OF LIQUIDS 41 No. 6, 545–557; D.-Q. XU; (2003); SYNTHESIS No. 17, 2626–2628) genannt, auf die hierin ausdrücklich Bezug genommen wird. Ferner wird noch auf die Datenbanken von Merck (www.ionicliquidsmerck.de) und von Solvent Innovation (www.solvent-innovation.com) verwiesen.
  • Es wurde bereits belegt, dass ionische Flüssigkeiten für die Stabilisierung von Enzymen verwendet werden können (Lozano et al., 2001; Fujita et al., 2005). Die Möglichkeit zur Katalyse mit ganzen Zellen in Gegenwart von ionischen Flüssigkeit wurde bis heute nur von wenigen Forschungsgruppen untersucht. Cull et al. (2000) berichteten als erstes über die Verwendung eines Zweiphasen-Systems aus 1-Butyl-3-methylimidazoium hexafluorophosphat (BMIM PF6) und wässrigem Puffer für die Biotransformation von 1,3-Dicyanobenzen zu 3-Cyanobenzamid durch ganze Zellen von Rhodococcus R312. Die ionische Flüssigkeit zeigte einen geringeren negativen Einfluss auf die mikrobiellen Zellen als Toluen, welches normalerweise als Cosolvenz verwendet wird. Immobilisierte Zellen von Saccharomyces cerevisiae wurden von Lou et al. (2006) in Gegenwart der ionischen Flüssigkeiten BMIM PF6 und BMIM BF4 für die asymmetrische Reduktion von Acetyltrimethylsilan zu enantioreinem (S)-1-Trimethylsilylethanol eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die ionischen Flüssigkeiten die Aktivität und Stabilität der immobilisierten Zellen stark erhöhten.
  • Pfründer et al. (2004) untersuchten den Einfluss verschiedener ionischer Flüssigkeiten auf die Zellmembran von Lactobacillus kefir. In Anwesenheit von 20% (v/v) der ionischen Flüssigkeiten wurde die Membranintegrität im Vergleich zum Zusatz verschiedener organischer Lösungsmittel untersucht. Für die Verwendung organischer Lösungsmittel gilt allgemein, dass die Toxizität von organischen Lösungsmitteln eine starke Abhängigkeit von deren Hydrophobizität zeigt, welche im log P-Wert ausgedrückt wird, dem Logarithmus des Verteilungskoeffizienten des Lösungsmittel in 1-Octanol und Wasser. Die Membranintegrität von Lactobacillus kefir wurde mit n-Decan (logP = 5,0) auf 52,7% herabgesetzt. Mit MTBE (logP = 0,9), Diisopropylether (logP = 1,5), n-Octanol (logP = 3,0) und n-Decanol (logP = 4,6) betrug die Membranintegrität nur noch 10% oder weniger. Pfründer et al. statuieren weiterhin, dass die ILs selbst nicht die Zellmembran von L. kefir schädigen. Sie konnten sogar eine Verbesserung der Membranintegrität feststellen, ein Effekt, der erklärt wird durch eine Veränderung in der Morphologie ähnlich zu der in wachsenden Zellen. Im Gegensatz zum wässrigen System wurde bei einem Zusatz von 20% OMA Tf2N (=Oc3NMe BTA) die Membranintegrität auf über 175%, bei Zusatz von 20% BMIM Tf2N auf über 125% und bei Zusatz von 20% BMIM PF6 auf über 130% nachgewiesen.
  • Insbesondere werden im Rahmen der Erfindung ionische Flüssigkeiten verwendet, die einen Schmelzpunkt von unter 37°C aufwiesen, insbesondere einen Schmelzpunkt von unter etwa 20°C, unter etwa 10°C oder unter etwa 4°C, so dass die Flüssigkeiten etwa bei der gewünschten Lagerungstemperatur bevorzugt flüssig sind. In einer Ausführungsform werden die Zellen trocken gelagert, mit einer trockenen „Hülle” aus ILs. Dabei wird ein IL benutzt, das z. B. bei 4° oder 25° fest ist und nur bei höheren Temperaturen flüssig.
  • Durch den Einsatz ionischer Flüssigkeiten und deren überraschende Eigenschaften zur Stabilisierung von eukaryontischen Zellen wird z. B. die Möglichkeit eröffnet, die Erythrozyten-Konzentrate oder andere Zellkonzentrate auch bei höheren Temperaturen ohne Verluste in der Qualität der Zellen zu lagern. Es entfallen zum einen der große Aufwand und die hohen Kosten zur Erhaltung der Kühlkette und zum anderen die Notwendigkeit, Erythrozyten-Konzentrate, deren Kühlkette unterbrochen wurde, entsorgen zu müssen.
  • Im Rahmen der Erfindung ist es umfasst, dass die Zellen in einer reinen ionischen Flüssigkeit (100%) gelagert werden, oder in einer ionischen Flüssigkeit, die weitere Additive oder Stabilisatoren (z. B. die oben genannten) enthält, oder in einer Flüssigkeit, die 1%–99% ionische Flüssigkeit umfasst, insbesondere 2%–80%, 3%–60%, 5%–50%, 6%–40%, 10%–38%, 20%–35% oder 25%–30%. % bezieht sich im Rahmen der Erfindung, wenn nicht anderes erwähnt, auf Volumenprozent.
  • Besonders günstige Ergebnisse haben sich gezeigt, wenn hierbei eine nicht-wassermischbare ionische Flüssigkeit in Kombination mit einer wässrigen Lösung, insbesondere einem wässrigen Puffer, verwendet wird. Bevorzugt umfasst die wässrige Lösung/der Puffer bekannte Additive oder Stabilisatoren, bei Lagerung von Erythrozyten kann es sich z. B. um ACD, CPD oder CPD-A-Lösung, bevorzugt in Kombination mit SAG-M, PAGGS-S und PAGGS-M-Additiven handeln. Ohne an die Hypothese gebunden zu sein, wird vorgeschlagen, dass die positive Wirkung eines solchen Systems darauf beruht, dass eine äußere Phase aus ionischer Flüssigkeit eine innere Phase aus wässriger Lösung und Zellen umhüllt. Es kann auch eine Mischung mit einem klassischen Zellkulturmedium verwendet werden, z. B. RPMI oder MEM, gegebenenfalls mit Serum, z. B. Humanem Serum, Pferdeserum oder Fötalem Kälberserum. Der Serumanteil kann dabei z. B. 1–15% betragen, bevorzugt 5–10%.
  • Als nicht-wassermischbare ionische Flüssigkeiten werden im Rahmen der Erfindung ionische Flüssigkeiten bezeichnet, die hydrophobe Kationen oder/und Anionen besitzen (Weingärtner, 2008). Auch wassermischbare ionische Flüssigkeiten können verwendet werden.
  • Im Rahmen der Erfindung können auch kompatible Solute zur Lagerung von eukaryontischen Zellen, insbesondere von Erythrozyten verwendet werden. Kompatible Solute sind kleine organische Moleküle, die von mikrobiellen Organismen synthetisiert werden, um sich vor hohen Salz- und/oder Zuckerkonzentrationen im extrazellulären Milieu zu schützen. Die Präsenz von Salz kann sich auf zweierlei Weise negativ auf Zellen auswirken: zum einen durch einen nichtspezifischen osmotischen Effekt, zum anderen durch die spezifische Toxizität der Ionen für bestimmte zelluläre Strukturen wie Proteine und Membranen. Für die Schaffung eines osmotischen Gegendrucks besitzen viele Mikroorganismen die Fähigkeit, kompatible Solute zu bilden, welche eine hohe Wasserlöslichkeit besitzen, bei physiologischen pH-Werten keine Nettoladung aufweisen und in der Regel keinen oder einen nur geringen Einfluss auf den Stoffwechsel der Zellen haben. Die hauptsächlichen kompatiblen Solute in Mikroorganismen und Pflanzen sind Polyole (Glycerol, Sorbit und Mannit), nicht-reduzierende Zucker wie Saccharose und Trehalose, Aminosäuren (Glutamat, Prolin und Betain) und die Tetrahydropyrimidinderivate Ektoin und Hydroxyektoin. Sie sind nicht nur kompatibel mit den nativen Zuständen von Proteinen und Membranen, sondern sie stabilisieren deren Strukturen auch gegen Dehydratation, Hitzeschock und denaturierende Reagenzien. Insbesondere wird eine Flüssigkeit zur Lagerung verwendet, welche kompatible Solute und ionische Flüssigkeiten umfasst. Es können Flüssigkeiten verwendet werden, die etwa 1–99%, 2%–80%, 3%–60%, 5%–50%, 6%–40%, 10%–38%, 20%–35% oder 25%–30% kompatible Solute umfassen.
  • Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung gelagerten eukaryontischen Zellen können z. B. Blutzellen, insbesondere Erythrozyten, Leukozyten (z. B. Granulozyten oder Thrombozyten), Zellen einer Zelllinie oder Zellen in einem Zellverbund (z. B. Gewebe, Organ oder Organismus) sein. Die Zellen können z. B. von einer Biopsie eines Patienten abgeleitet sein, oder die Biopsie kann als Gewebeprobe in der Flüssigkeit gelagert werden. Es kann sich auch um ein Gewebe zur Transplantation handeln. Bevorzugt handelt es sich um Sängerzellen, insbesondere humane Zellen. Die Zellen können auch Stammzellen sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die eukaryontischen Zellen Erythrozyten und/oder Granulozyten.
  • Die Erfindung umfasst bevorzugt die Lagerung bei Temperaturen bis etwa 37°C. Bevorzugt werden die Zellen bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 37°C gelagert, insbesondere bei Raumtemperatur, z. B. 15–15°C oder bis 30°C. Auch eine gekühlte Lagerung bei z. B. 4°C ist möglich. Die Zellen können jedoch auch bei Temperaturen unter 0°C gelagert werden, z. B. bei –15 bis –30°C, –65 bis –90°C oder unter –130°C. Zur Kryokonservierung kann ein Zusatz von bekannten Kryoprotektoren, z. B. Serum, HAES und/oder Dimethylsulfoxid (DMSO), hilfreich sein.
  • Es hat sich im Rahmen der Erfindung herausgestellt, dass überraschenderweise die Zellen bei einer Lagerung bei einer Temperatur von mehr als 4°C stabiler sein können als bei 4°C. Daher werden die Zellen bevorzugt bei mehr als 4°C, mehr als 8°C, etwa 10°C–37°C oder etwa 15°C–25°C, insbesondere bei etwa 20°C bis etwa 25°C (Raumtemperatur) gelagert.
  • Bevorzugt ist die ionische Flüssigkeit eine nicht-wassermischbare ionische Flüssigkeit, wie z. B. EMIM PF6, BMIM PF6, HMIM PF6, HMIM BTA oder Oc3NMe BTA. Im Rahmen der Erfindung kann selbstverständlich auch eine Mischung von mehreren ionischen Flüssigkeiten (gegebenenfalls mit kompatiblen Soluten und/oder wässrigen Puffern, z. B. wie oben beschrieben) verwendet werden. Bevorzugt ist die ionische Flüssigkeit (die kompatiblen Solute) biologisch verträglich, d. h. sie stört in den verwendeten Konzentrationen nicht die Vitalität der Zellen oder ist sogar ohne wesentliche unerwünschte Wirkungen, z. B. toxischer Art, einem Patienten (bevorzugt einem menschlichen Patienten) verabreichbar. Biokompatible ionische Flüssigkeiten können beispielsweise N-Butyl-N-methylpyrrolidinium dicyanamid, 1-Butyl-3-methylimidazolium dighydrogenphosphat, N-Butyl-N-methylpyrrolidinium dihydrogenphosphat, Cholin dihydrogenphosphat oder 1-Isobutyl-3-methylimidazoium hexafluorophosphat (Fujita et al., 2005; Shan et al., 2008). Weitere biokompatible ionische Flüssigkeiten könnten Triethylsulfonium bis(trifluoromethylsulfonyl)imid, 1-Butyl-3-methyl-pyrrolidinium bis(trifluoromethylsulfonyl)imid, 1-Butyl-3-methyl-imidazolium dicyanamid, Triisobutylmethyl-phosphonium tosylat, 1-Ethyl-3-methyl-imidazolium trifluoro-methansulfonat, N-Butyl-N-trimethylammonium bis(trifluoromethyl-sulfonyl)imid, Ethanolammonium formiat, Ethylammonium nitrat, 1-Ethyl-3-methyl-imidazolium ethylsulfat sein (www.iolitec.de).
  • Abhängig vom Zelltyp zeigten in Experimenten unterschiedliche ILs verschieden gute stabilisierende Eigenschaften. Die Ursache liegt wahrscheinlich in den großen Unterschieden zwischen den Eukaryontenzellen in Bezug auf Zusammensetzung und Rigidität der Zellmembran, Stoffwechselaktivität, Zellform und -größe.
  • Deshalb kann es im Rahmen der Erfindung sinnvoll sein, sowohl die Art als auch die Konzentration der ionischen Flüssigkeit auf den konkreten Zelltyp abzustimmen. Teil der Erfindung ist damit auch ein Test zur Bestimmung der Eignung einer ionischen Flüssigkeit oder einer ionische Flüssigkeit umfassenden Flüssigkeit zur Lagerung eines bestimmten Zelltyps, bei dem man Zellen dieses Zelltyps in der Flüssigkeit lagert und die Vitalität der Zellen, ihre Funktionsfähigkeit oder z. B. die Freisetzung von Enzymen wie LDH untersucht.
  • Im Rahmen der Erfindung können auch Kombinationen von verschiedenen ILs untereinander und mit kompatiblen Soluten, selbstverständlich auch in Mischung mit einer anderen Flüssigkeit, wie einem Zellkulturmedium (z. B. mit Serum) oder einem wässrigen Puffer, in einer Ausführungsform mit konventionell zur Lagerung z. B. von Erythrozyten verwendeten Stabilisatoren, verwendet werden.
  • Überraschenderweise hat sich im Rahmen der Erfindung herausgestellt, dass die Zellen nach der Lagerung in ionischen Flüssigkeiten oder diese umfassenden Flüssigkeiten noch vital sind, und dass dieses Lagerungsverfahren die Zellen stabilisiert.
  • Ferner kann bei Verwendung von wassermischbaren ionischen Flüssigkeiten deren Löslichkeits-vermittelnde Wirkung ausgenutzt werden, um z. B. hydrophobe Substanzen/Substrate/Arzneimittel in höheren Konzentrationen zu lösen und mit den Zellen in Kontakt zu bringen.
  • Im Rahmen der Erfindung wird ferner auch eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, welche ionische Flüssigkeiten und eukaryontische Zellen und optional kompatible Solute umfasst. Diese Zusammensetzung kann ein Medizinprodukt oder eine pharmazeutische Zusammensetzung sein. Die Zusammensetzung ist z. B. zur Transfusion oder Transplantation geeignet, ggf. nach vorbereitenden Schritten wie Waschen und Aufnehmen in einem geeigneten Puffer. Sofern die ionischen Flüssigkeiten biologisch verträglich sind, ist jedoch auch eine direkte Transfusion/Transplantation möglich. Bevorzugt werden die oben genannten Zellen und ionischen Flüssigkeiten bzw. Flüssigkeiten, die einen Anteil einer ionischen Flüssigkeit umfassen, verwendet.
  • Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von ionischen Flüssigkeiten zur Herstellung eines Medizinprodukts oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung/eines Arzneimittels. Diese Definition kann sich abhängig von nationalen Regeln unterscheiden und die Begriffe werden daher hier austauschbar verwendet. Bevorzugt handelt es sich um eine pharmazeutische Zusammensetzung/ein Arzneimittel oder ein Medizinprodukt zur Transplantation oder Transfusion, vor allem, falls es sich bei den Zellen um Blutzellen wie Erythrozyten handelt, zur Bluttransfusion. Krankheiten, bei denen eine Transfusion benötigt wird, sind im Stand der Technik bekannt, z. B. Anämien, Blutverlust z. B. nach Unfall, Operation, Leberversagen, Nierenversagen oder schweren Infektionen.
  • Damit wird erstmalig ein Medizinprodukt/Arzneimittel bereitgestellt, das ionische Flüssigkeiten und optional kompatible Solute umfasst, insbesondere ein Medizinprodukt/Arzneimittel welches ferner Zellen, insbesondere eukaryontische Zellen, bevorzugt Erythrozyten und/oder Granulozyten, umfasst. Bevorzugt wird dieses Medizinprodukt/Arzneimittel zur Transplantation oder Transfusion verwendet.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Lagerung von Zellen, insbesondere eukaryontischen Zellen, bei dem man die Zellen mit einer Flüssigkeit in Kontakt bringt, welche ionische Flüssigkeiten und optional kompatible Solute umfasst oder daraus besteht. Bevorzugt werden die oben genannten Zellen, ionischen Flüssigkeiten und Lagerungsbedingungen verwendet.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Zellen komplett in ionischen Flüssigkeiten und optional kompatiblen Soluten bzw. diese umfassende Flüssigkeiten aufgenommen und (fast vollständig oder vollständig) getrocknet. Hierbei ist eine Kombination aus ILs/kompatiblen Soluten (z. B. Ektoinen) besonders vorteilhaft, da kompatible Solute durch hygroskopische Wirkungen das Wasser innerhalb der Zelle halten, und die ILs/Ektoine eine wasserundurchlässige Schutzschicht bilden. Die Zellen werden also sozusagen „verkapselt” und trocknen deshalb nicht völlig aus. Vor der weiteren Verwendung werden die Zellen bevorzugt wieder in einem wäßrigen Puffer aufgenommen.
  • Allgemein ist es bevorzugt, nach der Lagerung einen Wasch- und/oder Äquilibrierungsschritt durchzuführen, insbesondere vor einer Infusion oder Transplantation. Dabei werden die ionischen Flüssigkeiten bevorzugt zu einem großen Anteil (z. B. 80–90% oder bis 100%) entfernt, und die Zellen in einem geeigneten Puffer aufgenommen. Dabei können auch mehrere Waschschritte vorgenommen werden, wobei eine Inkubation in einem geeigneten Puffer (z. B. einem konventionellen, zur Lagerung und/oder Infusion von Zellen geeigneten Puffer) stattfinden kann, bei der die ionischen Flüssigkeiten wieder aus dem Zellinneren herausdiffundieren.
  • Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen illustriert, die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
  • Legende
  • 1(A) Erythrozyten unter dem Lichtmikroskop (1024×), (B) Häm-Gruppe: Porphyrinring, (C) 3-dimensionale Struktur des Hämoglobin (aus http://upload.wikimedia.org)
  • 2(A) Wellenlängen-Scan von Hämoglobin in Puffer, (B) Kalibrierung zur Messung der Hämoglobin-Konzentration über die Extinktion von Häm (405 nm)
  • 3 Kalibrierung zur Quantifizierung von Hämoglobin mittels Drabkins-Assay
  • 4 Lagerung von Vollblutspenden in CPD-Puffer bei unterschiedlichen Temperaturen. Bestimmung des freien Hämoglobin-Gehaltes im Überstand über Extinktion bei 405 nm
  • 5 Lagerung von Vollblutspenden in CPD-Puffer bei unterschiedlichen Temperaturen. Bestimmung des prozentualen Anteils des freien Hämoglobins am Gesamthämoglobin durch den Drabkins-Assay.
  • 6 Grundkörper der gängigsten Kationen, aus denen ionische Flüssigkeiten zusammengesetzt sind
  • 7 Screening des Zusatzes verschiedener ionischer Flüssigkeiten zu Vollblutspenden. Photometrische Untersuchung des Überstandes bei 405 nm. Reaktionsbedingungen: 1,5 mL EK; 0,1 mL IL, Temp: 25°C, Zeit: 10 min, je 6,25% IL (V/V)
  • 8(A) Beispiel: Amoeng 100. (B) Screening des Zusatzes der ionischen Flüssigkeiten der Ammoeng-Serie zu Vollblutspenden. Photometrische Untersuchung des Überstandes bei 405 nm, Reaktionsbedingungen: 1,5 mL EK; 0,1 mL IL; Temp: 25°C; Zeit: 10 min,, je 6,25% IL (V/V)
  • 9 Inkubation der Vollblutspenden unter Zusatz verschiedener Additive bei (A) 15°C und (b) 25°C, auf dem Schüttler bei 1000 rpm (zusätzlicher Stress), je 6,25% IL (V/V)
  • 10 Zusatz verschiedener organischer Lösungsmittel (je 6,25% (V/V)) zu den Vollblutspenden
  • 11 Zusatz verschiedener ionischer Flüssigkeiten (je 6,25% (V/V)) zu den Vollblutspenden
  • 12 Anteil des extra-erythrozytären Hämoglobin nach Inkubation der Vollblutspenden mit verschiedenen Anteilen der Lösungsmittel n-Decan, HMIM PF6 und Oc3NMe BTA über (A) 3 h und (B) 21 h. (Temp: 20°C; Schüttler: 1000 rpm)
  • 13 Einfluss des Zusatzes biokompatibler ionischer Flüssigkeiten auf die Form von Erythrozyten (Mikroskopische Aufnahme (40× Vergrößerung))
  • 14 Einfluss des Zusatzes kompatibler Solute auf die Form von Erythrozyten
  • 15 Hemmung der Freisetzung von LDH aus Erythrozyten durch [BMIM] [PF6]
  • Beispiele
  • 1. Material und Methoden
  • 1.1 Erythrozyten-Konzentrate und Vollblutspenden
  • Um zu klären, inwieweit sich die Zugabe von ionischen Flüssigkeiten auf Erythrozyten auswirkt, wurde die Hämolyse der Zellen als „Indikator” für die Zellstabilität untersucht. Als Hämolyse wird die Zerstörung der roten Blutkörperchen bezeichnet, bei welcher Hämoglobin aus den Zellen freigesetzt wird. Über die Bestimmung des freien Hämoglobins kann somit ein erster Anhaltspunkt über den Einfluss von ionischen Flüssigkeiten auf die Erythrozyten gefunden werden. Es wurde eine Vollblutspende in CPD-Puffer, Blutgruppe AB, Rhesus negativ verwendet. Diese Vollblutspende wurde portioniert und bis zum Einsatz im Experiment kühl gelagert. Zur Herstellung von Erythrozyten-Konzentraten wurde die Vollblutspende entsprechend Standardverfahren mit einem einem Leukozytenfilter Leukozyten-depletiert und in SAG-M aufgenommen.
  • 1.2 Quantifizierung von Hämoglobin durch Messung der Extinktion von Häm bei 405 nm
  • Es wurde die Hämoglobin-Konzentration im Überstand der Vollblutspende durch die Extinktion des Häms bei 405 nm bestimmt. Hierzu wurden 1,5 mL der Vollblutspende zweifach für 10 min bei 14.000 rpm und 4°C zentrifugiert und der Überstand nach geeigneter Verdünnung im Photospektrometer vermessen. Zur Darstellung einer Kalibierungsfunktion wurden definierte Mengen eines Standard-Hämoglobins aus Rinderblut in Puffer gelöst und die Extinktion bei 405 nm bestimmt (2).
  • 1.3 Drabkins-Assay zur Quantifizierung von Hämoglobin
  • Das Drabkins Reagenz wird für die quantitative, colorimetrische Bestimmung von Hämoglobin-Konzentrationen bei 540 nm eingesetzt. Klassische Methoden zur Bestimmung von Hämoglobin in Blut basieren auf der Determination von Sauerstoff- und Kohlenmonoxid-Aufnahmefähigkeit oder dem Eisengehalt des Blutes. Diese Assays haben sich jedoch aufgrund der heterogenen Natur des Hämoglobins als unzuverlässig herausgestellt. Daher wurde eine colorimetrische Cyanmethämoglobin-Methode etabliert, mit welcher das Gesamthämoglobin bei basischem pH schnell zum Cyanoderivat konvertiert wird. Die Absorption der Cyanoderivate wird bei 540 nm bestimmt. Durch die Kombination der verschiedenen Recktanten alkalisches Ferricyanid und Cyanid in einem einzigen Reagenz wurde diese Methode noch weiter vereinfacht. Diese sog. Drabkins-Lösung reagiert mit allen Formen von Hämoglobin außer Sulfhämoglobin, einem Pigment, das normalerweise nur in sehr geringen Konzentrationen in Blut vorkommt. Die Methode basiert auf der Oxidation von Hämoglobin und seinen Derivaten zu Methämoglobin in Anwesenheit von basischem Kaliumferricyanid. Methämoglobin reagiert mit Kaliumcyanid und bildet Cyan-methämoglobin, welches ein Absorptionsmaximum bei 540 nm aufweist. Die Farbintensität, die bei 540 nm gemessen wird, ist proportional zur totalen Hämoglobinkonzentration.
  • Zur Hämoglobin-Quantifizierung mittels des Drabkin-Assays wurden 20 μL der Vollblutspende bzw. des zentrifugierten Überstandes mit 5 mL Drabkins-Reagenz versetzt und für 15 min bei Raumtemperatur belassen. Anschließend wurden die Proben bei 540 nm im Photometer vermessen. Zur Erstellung der Kalibrierungsfunktion diente wieder das Standard-Hämoglobin aus Rinderblut (3).
  • 1.4 Zusatz verschiedener Lösungsmittel und ionischer Flüssigkeiten zum Erythrozyten-Konzentrat
  • Dem Blut wurden verschiedene Lösungsmittel und ionische Flüssigkeiten (0,1 g) (1,5 g) in Eppendorf-Gefäßen zugesetzt. Die Inkubation der Ansätze erfolgte bei unterschiedlichen Temperaturen im Thermomixer (mit oder ohne Schütteln bei 1000 rpm), über verschiedene Zeiträume. Zusätzlich wurde ein Ansatz mitgeführt, zu welchem kein Additiv zugesetzt wurde. Die Analyse der Proben auf den extrazellulären Hämoglobin-Gehalt erfolgte nach den beiden oben beschriebenen Methoden zur Hämoglobin-Bestimmung. Hierzu wurden die Ansätze zweifach bei 14 000 rpm zentrifugiert (entspricht ca. 14 000 g, Eppendorfzentrifuge, 10 s) und der Hämoglobin-Gehalt im Überstand durch die Kalibrierungsfunktion berechnet. Bei Untersuchung durch den Drabkins Hämoglobin-Assay wurde neben der Quantifizierung der Hämoglobin-Konzentration im Überstand auch die insgesamt in der Vollblutspende vorhandene Hämoglobin-Konzentration bestimmt, so dass der prozentuale Anteil des freigesetzten Hämoglobins festgestellt werden konnte.
  • 2 Ergebnisse
  • 2.1 Stabilität von Erythrozyten-Konzentraten und Vollblutspenden
  • Klassische Vollblutspenden (1,5 mL in Eppendorf-Gefäßen in CPD-Puffer) wurden bei 4°C im Kühlschrank bzw. bei 25°C im Wasserbad gelagert und täglich eine Probe entnommen, um den Fortgang der Hämolyse zu untersuchen. Die Proben wurden zentrifugiert und der Überstand mittels der photometrischen Messung des Häms bei 405 nm und der Durchführung des Drabkin's Hämoglobin-Bestimmungsassays auf die freigesetzte Konzentration von Hämoglobin und somit die Stabilität der Erythrozytenmembran untersucht. Der Verlauf der Hämoglobin-Freisetzung ist in 4 dargestellt.
  • Die graphische Darstellung verdeutlicht, dass die Freisetzung von Hämoglobin aus den Erythrozyten bei 25°C im Vergleich zur Hämolyse bei 4°C stark beschleunigt ist. Nach einer Lagerzeit von 17 Tagen bei 25°C beträgt die Konzentration des extrazellulären Hämoglobins bereits ca. 23 mg/mL, während nach einer Lagerung über den gleichen Zeitraum bei 4°C nur 0,5 mg/mL freies Hämoglobin nachgewiesen werden können. Wird der prozentuale Anteil des freigesetzten Hämoglobins im Verhältnis zum Gesamt-Hämoglobin dargestellt, so wird deutlich, dass nach ca. 3 Wochen Lagerzeit im Kühlschrank bei 4°C der Anteil des freigesetzten Hämoglobins in Bezug auf das Gesamthämoglobin bei 0,6 (1,2 mg/mL) liegt. Wird die Vollblutspende jedoch bei 25°C gelagert, so steigt die Hämolyserate dramatisch an und es sind nach 20 Tagen bereits 14 des Gesamthämoglobins im Überstand nachzuweisen (5). Das Absenken der Temperatur für die Lagerung von Vollblutspenden führt zu einer Verlangsamung des Stoffwechsels einschließlich der Alterungsprozesse der konservierten Zellen. Eine Minderung der Temperatur von 37°C auf 4°C beispielsweise verursacht eine Verringerung der Stoffwechselrate auf 1/20 bis 1/30. Nach Studien von Bartel et al. (1974) sowie Ruddell et al. (1998) entspricht eine eintägige Lagerung menschlicher Blutkonserven bei 25°C etwa der sieben- bis zehntägigen Lagerung bei einer Temperatur von 4°C. Dementsprechend muss für die Lagerung und den Transport von klassischen Vollblutspenden oder Erythrozyten-Konzentraten eine strenge Kühlkette eingehalten werden.
  • 2.2 Zusatz verschiedener ionischer Flüssigkeiten
  • Das Ziel der Versuche lag in der Untersuchung des potentiellen Einsatzes ionischer Flüssigkeiten zur Aufrechterhaltung von Lebensfähigkeit und Funktionalität von Erythrocyten. In Abhängigkeit von der gebräuchlicherweise verwendeten additiven Lösung beträgt die maximale Lagerungsfähigkeit bei 4°C für Erythrozyten-Konzentrate bis zu 49 Tage. Der Anteil des extrazellulären Hämoglobins am Gesamthämoglobin stellt als Indikator für die Hämolyse ein wichtiges Kriterium für die Haltbarkeit dar.
  • Durch den Zusatz von ionischen Flüssigkeiten zu den Erythrozyten-Konzentraten bzw. Vollblutspenden soll untersucht werden, ob diese eine stabilisierende Wirkung auf die Zellen haben und somit die Hämolyse-Rate herabgesetzt werden kann.
  • In einem ersten Screening zur Untersuchung der Auswirkung des Zusatzes ionischer Flüssigkeiten (Ils) wurden den Vollblutspenden 6% (v/v) der verschiedenen ILs zugesetzt. Zum Einsatz kamen dabei ionische Flüssigkeiten mit unterschiedlichen Kationen und Anionen. Die Grundkörper der gängigsten Kationen sind in 6 dargestellt.
  • Die verwendeten ionischen Flüssigkeiten enthielten unterschiedliche substituierte Imidazolium-, Ammonium- und Pyridinium-Kationen mit verschiedenen Anionen (Tabelle 1). Tabelle 1: Untersuchte ionische Flüssigkeiten
    Ionische Flüssigkeit Bezeichnung Abkürzung
    1,3-Dimethylimidazolium methyl sulfate [MMIM] [MeSO4]
    1-Ethyl-3-methylimidazolium bromide [EMIM] [Br]
    1-Butyl-3-methylimidazolium chloride [BMIM] [Cl]
    1-Butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborat [BMIM] [BF4]
    1-Butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphat [BMIM] [PF6]
    1-Butyl-3-methylimidazolium bis(trifluorosulfonyl)imide [BMIM] [BTA]
    1-Butyl-3-methylimidazolium Ecoeng41M
    1-Butyl-3-methylimidazolium n-octylsulfate Ecoeng 418/[BMIM] [OcSO4]
    1-Methyl-3-pentylimidazolium tetrafluoroborate [PMIM] [BF4]
    1-Hexyl-3-methylimidazolium chlorid [HMIM] [Cl]
    1-Hexyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphat [HMIM] [PF6]
    1-Hexyl-3-methylimidazolium bis(trifluorosulfonyl)imide [HMIM] [BTA]
    1-Methyl-3-octylimidazolium chloride [OMIM] [Cl]
    N,N-Dimethylethanolammonium acetate [Me2NEt] [Ac]
    N-Butyldiethanolammonium methanesulfonate [Et2NBu] [MeSO4]
    Trioctylmethylammonium bis(trifluoromethylsulfonyl)imide [Oc3NMe] [BTA]
    3-Methyl-1-octylpyridinium tetrafluoroborate [3-MOP][BF4]
    1-Butyl-4-methylpyridinium bis(trifluorosulfonyl)imide [MBP] [BTA]
    Ammoeng100 A100
    Ammoeng101 A101
    Ammoeng102 A102
    Ammoeng110 A110
    Ammoeng111 A111
    Ammoeng120 A120
    Ammoeng130 A130
    Ammoeng520 A520
    1-Ethyl-3-methyl-imidazolium ethylsulfat [EMIM] [EtSO4]
    1-Ethyl-3-methyl-imidazolium trifluoromethanesulfonat [EMIM] [TMS]
    Ethylammonium nitrate [EtNH3] [NO3]
    1-Butyl-3-methyl-imidazolium dicyanamid [BMIM] [DCA]
    1-Butyl-1-methyl-pyrrolidinium bistrifluoromethylsulfonylimid [MBP] [BTA]
    Butyl-trimethyl-ammonium bistrifluoromethylsulonylimid [Me3NBu] [BTA]
    2-Hydroxyethylammonium formiat [HAF]
    Triisobutylmethylphosphonium tosylat [MePiBu3] [Tos]
    Triethylsulfunoium bistrifluoromethylsulfonylimid [Et3S] [BTA]
    1-Methyl-3-octyl-imidazolium tetrafluoroborate [OMIM] [BF4]
    N-Methyl-N-trioctylammonium-bis(trifluoromethylsulfonyl)imide [Oc3NMe] [BTA]
    1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetat [EMIM] [Ac]
    1-butyl-1-methylpyrrolidinium bis(trifluoromethylsulfonyl)imide [BMPL] [BTA]
    1-Ethyl-3-methylimidazolium 2(2-methoxethoxy)ethylensulfate [EMIM] [MeEtEtSO4]
  • Die Vollblutspenden wurden nach Zusatz der ionischen Flüssigkeiten für 10 min bei 25°C inkubiert und anschließend zentrifugiert. Der Überstand wurde photometrisch auf die extrazelluläre Hämoglobin-Konzentration untersucht. Das Experiment wurde im zweifachen Ansatz durchgeführt und der Mittelwert dieser Messungen ist in 7 dargestellt.
  • Bereits nach einer Inkubationszeit von 10 min waren deutliche Unterschiede in der Hämolyse-Rate der Erythrozyten zu erkennen. Bereits mit bloßem Auge konnte anhand der rötlichen Färbung des Überstandes beobachtet werden, dass Unterschiede in der Wirkung der verschiedenen ionischen Flüssigkeiten bestehen. Eine besonders geringe Hämolyse-Rate zeigte sich bei Zusatz der ionischen Flüssigkeiten Oc3NMe BTA, PMIM BF4 und HMIM PF6 (Extinktion 405 nm). Ein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Art des Kations oder Anions und der Wirkung ist schwer fassbar, allerdings scheint die Mischbarkeit der ionischen Flüssigkeiten mit Wasser einen Einfluss auf die Hämolyse der Erythrozyten zu haben. Die Untersuchungen gaben insgesamt einen Anhaltspunkt, welche der ionischen Flüssigkeiten am sinnvollsten zu weiteren Untersuchungen eingesetzt werden sollten. Neben den in 7 dargestellten ionischen Flüssigkeiten wurden zusätzlich auch die ionischen Flüssigkeiten der Ammoeng®-Serie (Solvent Innovation, Köln) untersucht, welche Kationen mit Ethylenglykol-Einheiten enthalten (8). Die besten Ergebnisse wurden hier mit Ammoeng 130 erhalten.
  • Beispielhaft wird die Formel von Ammoeng 100 wiedergegeben (Formel I):
    Figure 00290001
  • Anhand der oben dargestellten Ergebnisse wurde zunächst die ionische Flüssigkeit Oc3NMe BTA ausgewählt, um bei verschiedenen Temperaturen und zu unterschiedlichen Zeitpunkten den Verlauf der Hämolyse des Erythrozyten-Konzentrates unter Zusatz dieser IL zu untersuchen (9). Zum Vergleich wurde zu einem Ansatz der Vollblutspenden das organische Lösungsmittel n-Decan zugesetzt, welches nach Pfründer et al. (2004) aufgrund seines hohen logP-Wertes eine im Gegensatz zu anderen organischen Lösungsmitteln niedrige Zell-schädigende Wirkung besitzt. Die Membranintegrität von Lactobacillus kefir wurde mit n-Decan auf 52,7% herabgesetzt.
  • Interessanterweise konnte in diesem Versuch festgestellt werden, dass die Inkubation bei 25°C für den Zusatz von Oc3NMe BTA einen positiveren Einfluss auf die Hämolyse hatte als die Inkubation bei 15°C. Bemerkenswert ist die geringe Hämolyse-Rate bei Verwendung der ionischen Flüssigkeit Oc3NMe BTA, welche deutlich niedriger war als nach Zusatz von n-Decan.
  • Um die Ergebnisse mit den von Pfründer et al. (2004) publizierten Daten vergleichen zu können, wurden in weiteren Versuchen verschiedene organische Lösungsmittel als Additive verwendet und die Auswirkung auf die Membranintegrität der Erythrozyten über die extrazelluläre Hämoglobin-Konzentration untersucht (10). Wiederum wurden 6,25% (v/v) der organischen Lösungsmittel zu den Konzentraten zugesetzt und die Ansätze bei 10°C und 20°C auf dem Thermoschüttler (1000 rpm) inkubiert. Durch die Untersuchung des Gesamthämoglobin-Gehaltes im Ansatz und der freien Hämoglobin-Konzentration im Überstand wurde der prozentuale Anteil des extra-erythrozytären Hämoglobins über den Drabkins-Assay bestimmt.
  • Die Ergebnisse zur Auswirkung des Zusatzes verschiedener organischer Lösungsmittel zeigen, dass von allen organischen Lösungsmitteln eine mehr oder weniger starke Erythrozyten-schädigende Wirkung ausgeht. Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Pründer et al. (2004) ist jedoch kein direkter Zusammenhang zwischen dem logP-Wert der organischen Lösungsmittel und dem Einfluss auf die Membranintegrität zu erkennen. Jedoch ist eindeutig, dass mit erhöhter Temperatur (20°C) auch die Hämolyse-Rate der Erythrozyten zunimmt und dass das Lösungsmittel n-Decan die Vollblutspenden am wenigsten schädigt.
  • Zusätzlich wurden die ionischen Flüssigkeiten BMIM PF6, PMIM BF4, HMIM PF6, HMIM Cl und Oc3NMe BTA nach dem gleichen Schema wie die organischen Lösungsmittel als Zusatz zu den Vollblutspenden untersucht. In 11 wird der Verlauf der Hämoglobin-Freisetzung aus den Vollblutspenden über die Zeit dargestellt.
  • Die besten Ergebnisse wurden mit den ionischen Flüssigkeiten Oc3NMe BTA und HMIM PF6 erhalten. Für diese ionischen Flüssigkeiten war dabei wiederum festzustellen, dass die Hämolyse bei 20°C stärker unterdrückt ist als bei 10°C (Tabelle 2). Tabelle 2: Anteil des extra-erythrozytären Hämoglobins-Gehaltes in Anwesenheit verschiedener Zusätze zum EK
    Zusatz Inkubation: 10°C, 3 h Anteil freies Hämoglobin [%] Inkubation: 20°C, 3 h Anteil freies Hämoglobin [%]
    Organische Lösungsmittel MTBE 78,7 89,5
    Diisopropylether 51,7 90,1
    n-Octanol 95,7 95,1
    n-Decan 1,4 4,3
    Ionische Flüssigkeit BMIM PF6 9,4 14,5
    PMIM BF4 28,0 23,7
    HMIM PF6 3,6 3,1
    HMIM Cl 60,4 76,8
    Oc3NMe BTA 6,5 1,9
  • Zusätzlich wurde untersucht, ob der Einfluss der ionischen Flüssigkeit auf die Hämolyse der Erythrozyten auch eine Konzentrations-Abhängigkeit aufweist. Dementsprechend wurden die ionischen Flüssigkeiten HMIM PF6 und Oc3NMe BTA und das organische Lösungsmittel n-Decan ausgewählt und der Vollblutspende in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Nach einer Inkubation über 21 h bei 1000 rpm und 20°C wurde der prozentuale Anteil an extra-erythrozytärem Hämoglobin im Verhältnis zum Gesamthämoglobin bestimmt (12). Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die Erythrozyten durch das Lösungsmittel n-Decan am stärksten geschädigt werden, während die Zugabe der ionischen Flüssigkeit HMIM PF6 die Zellen weniger schädigt als das organische Lösungsmittel. Für die ionische Flüssigkeit Oc3NMe BTA konnte bei allen Konzentrationen eine vergleichbare oder geringere extra-erythrozytäre Hämoglobin-Konzentration festgestellt werden als in der unbehandelten Vollblutspende.
  • Die geringste Hämolyse konnte nach einem Zusatz von 38% Oc3NMe BTA nach 21 h festgestellt werden. Während sich zu diesem Zeitpunkt in der unbehandelten Vollblutspende ca. 5 freies Hämoglobin nachweisen lassen, sind im Ansatz mit 38% Oc3NMe BTA nur 4% extrazelluläres Hämoglobin vorhanden.
  • In einem Screening-Experiment wurde weiterhin der Einfluss des Zusatzes biokompatibler ionischer Flüssigkeiten auf die Form der Erythrozyten untersucht. Dafür wurden die Erythrozyten in einen Tropfen ionischer Flüssigkeit überführt und unter dem Mikroskop auf ihre Zellform untersucht. 13 zeigt die mikroskopischen Aufnahmen der Erythrozyten in Anwesenheit der verschiedenen ionischen Flüssigkeiten. Das erste Bild zeigt zum Vergleich die Lagerung der Erythrozyten in einer physiologischen Ringer-Lösung. Die Aufnahmen machen deutlich, dass einige der biokompatiblen ionischen Flüssigkeiten, wie z. B. 1-Butyl-1-methylpyrrolidinium bistrifluoromethylsulfonylimid, Triethylsulfonoium bistrifluoromethylsulfonylimid und 2-Hydroxyethylammonium formiat die Zellform der Erythrozyten erhalten und somit für die Lagerung der Erythrozyten in Frage kommen.
  • Entsprechend den im Vorherigen durchgeführten Versuchen zur Untersuchung des Einflusses der ionischen Flüssigkeiten auf die Erythrozytenstabilität, wurden die Zellen unter Zugabe von jeweils 500 mM kompatibler Solute für 3 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Aus 14 wird anhand der mikroskopischen Aufnahmen ersichtlich, dass die kompatiblen Solute Acetyl-L-Lysin, Betain und Ektoin einen positiven Einfluss auf die Stabilisierung der Erythrozyten-Zellform haben.
  • In weiteren Experimenten wurde mit Standardverfahren die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) aus Erythrozyten untersucht. Hierdurch kann ähnlich wie bei der Messung des freien Hämoglobins sehr sensitiv eine Zellmembranschädigung detektiert werden.
  • 15. zeigt die geringere LDH-Freisetzung bei Zugabe von BMIM-PF6, vor allem im Konzentrationsbereich von 1%–20% Volumenanteilen zu Erythrozyten eines Erythrozytenkonzentrats, das vor dem Experiment mit Blutgruppengleichem Plasma im Verhältnis 40:60 (entspricht einem normalen Hämatokrit von 0,40) gemischt wurde, um ausreichend Überstand zur LDH-Bestimmung zu haben.
  • 3. Stabilität von Zellen und Zelllinien
  • Das Ziel der weiteren Versuche lag in der Untersuchung des potentiellen Einsatzes ionischer Flüssigkeiten zur Aufrechterhaltung von Lebensfähigkeit und Funktionalität von undifferenzierten und differenzierten Zellen, die anders als Erythrozyten über einen Zellkern verfügen und mehr Zellfunktionen zeigen. Diese Zellfunktionen können Stoffwechsel, Energiegewinnung durch Mitochondrien sowie z. T. auch die Fähigkeit zur Zellteilung umfassen (keine abschließende Aufzählung). Die Lagerfähigkeit von Zellen ist sehr unterschiedlich. Während Stammzellen zumindest theoretisch unbegrenzt in Zellkultur gehalten werden können, haben beispielsweise Granulozyten nur eine kurze Lebensdauer von 1–2 Tagen. Granulozytenkonzentrate müssen deshalb sofort nach der Präparation aus dem Blut des Spenders transfundiert werden. Als maximale Lagerzeiten werden 6–24 h angegeben. Leberzellen werden als kaum lagerbar angesehen. Lediglich in hochkomplexen Bioreaktorsystemen können sie für einige Tage am Leben gehalten werden. Viele, jedoch nicht alle Zellarten können aber bei sehr tiefen Temperaturen unter Zusatz von z. B. DMSO eingefroren werden und zumindest ein Teil der Zellen ist nach dem Auftauen rekultivierbar.
  • Zelllinien haben sich in der Wissenschaft bewährt, da sie einerseits gut charakterisierte Untersuchungsobjekte darstellen und andererseits unkompliziert zur Verfügung stehen, ohne dass eine Blut- oder Gewebespende erfolgen müsste.
  • Deshalb wurden in den Versuchen folgende Zelllinien stellvertretend als Modellzellen eingesetzt, alle genannten Zelllinien oder Zellgruppen können erfindungsgemäß vorteilhaft gelagert werden: Tabelle 3: Untersuchte Zellarten
    Zelllinie Zellgruppen Charakteristische Merkmale Beispiel für folgende Zellgruppen
    undifferenzierte HL-60 Promyelozyten eukaryonte Zellen Stammzellen, Vorläuferzellen, hämatopoetische Stammzellen, Leukozyten, Blutzellen, Knochenmarkzellen, ektodermale und mesodermale Zellen, Suspensionszellen
    durch all-trans-Retinsäure zu granulozytären Zellen ausdifferenzierte HL-60 Granulozyten, Phagozyten eukaryonte Zellen, Granulozyten, Phagozyten, Zellen des Retikulo-Endothelialen Systems, Leukozyten, Blutzellen, ausdifferenzierte Zellen, Suspensionszellen
    C3A Hepatozytenzellinie, die je nach Zellkulturbedingungen Stammzell-/Vorläuferzellstatus oder die Eigenschaften von reifen Leberzellen haben kann eukaryonte Zellen, undifferenzierte und differenzierte Zellen der inneren Organe, Leberzellen, Hepatozyten, Leberstammzellen, endodermale und mesodermale Zellen, mesenchymale Zellen, adhärente Zellen
  • Durch den Zusatz von ionischen Flüssigkeiten zu den Zellen soll untersucht werden, ob die ILs eine stabilisierende Wirkung auf die Zellen haben und somit die Zell-Absterbe-Rate herabgesetzt werden kann.
  • Die verwendeten ionischen Flüssigkeiten enthielten unterschiedliche substituierte Imidazolium-, Ammonium- und Pyridinium-Kationen mit verschiedenen Anionen (Tabelle 1). Beispielartig werden Ergebnisse mit folgenden ILs gezeigt:
    • – 1-Methyl-3-octyl-imidazolium tetrafluoroborate ([OMIM] [BF4]),
    • – Dimethylethanolammoniumacetat ([Me2NEt] [Ac])
    • – N-Methyl-N-trioctylammonium-bis(trifluoromethylsulfonyl)imide ([Oc3NMe] [BTA]),
    • – 1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetat ([EMIM] [Ac]),
    • – 1-Ethyl-3-methylimidazolium 2(2-methoxethoxy)ethylesulfate ([EMIM] [MeEtEtSO4]).
  • Die Zellen wurden in einer Konzentration von 0,5 × 106/ml eingesät in 24 Well Platten (jeweils 500 μl/well), mit unterschiedlichen Konzentrationen von ILs für verschieden Zeiten inkubiert. Anschließend wurde in den Zellüberständen das zytosolische Enzym Laktatdehydrogenase (LDH) gemessen, das in praktisch allen Zellen vorkommt und eine Schädigung der Zellen sehr sensitiv anzeigt. Die in Tabelle 4 gezeigten LDH-Konzentrationen wurden nach Inkubation bei 37°C unter Standard-Zellkulturbedingungen in einer 6%igen IL-Lösung in Zellkulturmedium erhoben. Die Ergebnisse zeigen eine deutlich bessere Zellstabilität in 1-Methyl-3-octylimidazolium tetrafluoroborate und N-Methyl-N-trioctylammonium-bis(trifluoromethylsulfonyl)imide als bei Zusatz der anderen getesteten ILs. Die Verwendung dieser IL zur Lagerung von Zelllinien ist daher bevorzugt. Interessant und unerwartet sind dabei die deutlichen Unterschiede zwischen den verschiedenen getesteten Zellen. Von Interesse ist ferner, dass z. B. C3A-Zellen in 10% FCS deutlich unempfindlicher sind als die sich vergleichsweise schnell teilenden Zellen in 15% FCS (Exp. 1 und 2). Differenzierte granulozytäre HL-60 waren deutlich empfindlicher als undifferenzierte Zellen (Exp. 3 und 4). Tabelle 4: Anteil des extrazellulären LDH-Gehaltes in Anwesenheit verschiedener Zusätze zu den zellhaltigen Kulturen (U/l) Experiment 1
    Zellen Ionic Liquids 30 min 60 min 120 min
    C3A 15%FCS 1-Methyl-3-octyl-imidazolium tetrafluoroborate 5 5 5
    Dimethylethanolammoniumacetat 42 264 175
    N-Methyl-N-trioctylammonium-bis(trifluoromethylsulfonylimide 41 60 61
    EMIM Acetat 312 345 516
    1-Ethyl-3-methylimidazolium 2(2-methoxethoxy)ethylensulfat 360 290 460
    Exeriment 2
    Zellen Ionic Liquids 30 min 60 min 120 min 180 min
    C3A 10%FCS 1-Methyl-3-octyl-imidazolium tetrafluoroborate 5 7 5 3
    Dimethylethanolammoniumacetat 62 75 75 82
    N-Methyl-N-trioctylammonium-bis(trifluoromethylsulfonyl)imide 42 41 48 52
    EMIM Acetat 87 152 153 207
    1-Ethyl-3-methylimidazolium 2(2-methoxethoxy)ethylensulfat 168 166 225 225
    Experiment 3
    Zellen Ionic Liquids 60 min 120 min 180 min
    differenzierte HL-60 1-Methyl-3-octyl-imidazolium tetrafluoroborate 5 5 n. d.
    Dimethylethanolammoniumacetat 177 299 n. d.
    N-Methyl-N-trioctylammonium-bis(trifluoromethylsulfonyl)imide 106 109 118
    EMIM Acetat 215 292 n. d.
    1-Ethyl-3-methylimidazolium 2(2-methoxethoxy)ethylensulfat 272 320 165
    Experiment 4
    Zellen Tonic Liquids 15 min 60 min 120 min 48 Std.
    HL-60 1-Methyl-3-octyl-imidazolium tetrafluoroborate 5 5 5 5
    Dimethylethanolammoniumacetat 32 166 276 370
    N-Methyl-N-trioctylammonium-bis(trifluoromethylsulfonyl)imide 31 56 54 403
    EMIM Acetat 52 139 80 351
    1-Ethyl-3-methylimidazolium 2(2-methoxethoxy)ethylensulfat 56 93 107 316
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Claims (15)

  1. Verwendung von ionischen Flüssigkeiten zur Lagerung eukaryontischer Zellen.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in einer Flüssigkeit gelagert werden, die 1%–99% (V/V) ionische Flüssigkeit umfasst.
  3. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eukaryontischen Zellen Blutzellen, Zellen einer Zelllinie oder Zellen in einem Zellverbund sind.
  4. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eukaryontischen Zellen Erythrozyten, Thrombozyten, Lymphozyten, Stammzellen oder Granulozyten sind.
  5. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen bei einer Temperatur von 4°C bis 37°C gelagert werden, insbesondere bei einer Temperatur von mehr als 4°C, insbesondere bei 20°C bis 25°C.
  6. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die ionische Flüssigkeit nicht mit Wasser mischbar ist.
  7. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die ionische Flüssigkeit PMIM BF6, HMIM PF6, HMIM Cl, MBP BTA, Et3S BTA, HAF, Oc3NMe BTA oder OMIM BF4 ist.
  8. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in einer Flüssigkeit gelagert werden, die ferner kompatible Solute umfaßt.
  9. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen vital sind.
  10. Zusammensetzung, welche ionische Flüssigkeiten und eukaryontische Zellen umfasst.
  11. Verwendung von ionischen Flüssigkeiten zur Herstellung eines Arzneimittels, welches eukaryontische Zellen umfasst, zur Transplantation oder Transfusion.
  12. Arzneimittel, umfassend ionische Flüssigkeiten.
  13. Arzneimittel nach Anspruch 12, welches ferner eukaryontische Zellen, insbesondere Erythrozyten, umfasst.
  14. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 12 oder 13 zur Transplantation oder Transfusion.
  15. Verfahren zur Lagerung und/oder Stabilisierung von eukaryontischen Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellen mit einer Flüssigkeit in Kontakt bringt, welche ionische Flüssigkeit umfasst.
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