CN111235208B - 一种离子液体对糖代谢影响的评估方法 - Google Patents

一种离子液体对糖代谢影响的评估方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及环境毒理学模型领域，具体涉及一种离子液体对糖代谢影响的评估方法。本发明以HepG2细胞作为实验细胞，离子液体1‑丁基‑3‑甲基咪唑氯盐对其进行多次暴露处理后对HepG2细胞进行糖原含量、糖代谢相关基因的表达进行检测，提供了一种操作简便、周期性短的离子液体对糖代谢毒性评估方法。本发明对糖代谢各个关键阶段中相关限速酶所对应的基因进行检测具有全面性和普遍性。本发明所提供的评估方法能够全面、准确的评价离子液体的糖代谢毒性水平，为生态环境污染物标准的确定提供依据。

Description

一种离子液体对糖代谢影响的评估方法
技术领域
本发明涉及环境毒理学模型领域，具体涉及一种离子液体对糖代谢影响的评估方法。
背景技术
离子液体（Ionic Liquid）是指由有机阳离子和无机或有机阴离子组成的一类液体，相较于传统易挥发的有毒溶剂，离子液体具有良好的化学稳定性、非挥发性、不可燃性、几乎没有蒸汽压等优点，是一种广泛应用于有机合成、生物催化、电化学等领域的“绿色溶剂”。近年来研究人员用细菌、真菌、小鼠、鱼类、哺乳动物细胞系等实验模型研究发现，离子液体存在生物毒性。随着离子液体越来越广泛的应用，它所存在的环境风险也成为一个研究的热点。
人体肝癌细胞（HepG2）是从人类肝脏细胞瘤中分离出的一类细胞株，增殖速度快，便于培养。该细胞保留了正常肝细胞的众多特性，具有人类药物代谢相关的Ⅰ相酶和Ⅱ相酶，并具有较为完整的代谢能力。为了给日益完善的生态环境污染物标准提供依据，环境毒理学的研究者们已经不再满足于研究简单的致死效应，转而关注非致死浓度下污染物对生物的生殖毒性、神经毒性以及代谢毒性等。糖代谢作为生物体能量代谢的重要组成部分，一直以来都是人们所研究的热点。但离子液体对肝脏的糖代谢毒性还有待探究。
发明内容
为了解决上述问题，本发明旨在提供一种简单、周期性短的糖代谢毒性的评估方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种离子液体对糖代谢影响的评估方法，所述方法包括以下步骤：
（1）HepG2细胞培养至贴壁后，换液至暴露溶液中初次暴露培养；
（2）测定初次暴露后HepG2细胞的存活率和暴露前后培养基中葡萄糖的消耗量，取存活率较高且对葡萄糖消耗量影响较大的处理组进行第二次暴露培养；
（3）对步骤（2）中第二次暴露培养后的HepG2细胞进行糖原含量、糖代谢相关基因的表达进行检测；
（4）对步骤（3）中的检测数据进行统计学分析，分析暴露试验后HepG2细胞糖代谢受到的影响，评估不同暴露浓度对糖代谢的毒性影响。
本发明步骤（1）中所述的暴露溶液是浓度为0~32mM的离子液体，所述的离子液体为咪唑类离子液体，离子液体优选为1-丁基-3-甲基咪唑氯盐；
进一步地，所述的暴露溶液的溶剂为暴露培养基，所述的暴露培养基以体积百分比计，每份暴露培养基中含有0.2%的牛血清白蛋白、1%的链霉素、1%的青霉素以及97.8%的DMEM高糖培养基。
步骤（1）中所述的初次暴露培养条件为37 ℃，含有5%CO2的细胞培养箱培养24小时。
步骤（2）中所述的第二次暴露培养条件与初次暴露培养相同。
步骤（3）中所述的糖代谢相关基因为GLUT1、PYGL、GSK3β、GYS2、PKM、PFKFB3、IDH2、PDK1和/或LDHA中的一种或多种。
步骤（4）中所述的统计学分析为使用IBM SPSS Statistic 19对步骤（3）中数据进行分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明以HepG2细胞作为实验细胞，离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐对其进行多次暴露处理后对HepG2细胞进行糖原含量、糖代谢相关基因的表达进行检测，提供了一种操作简便、周期性短的离子液体对糖代谢毒性评估方法。所用HepG2细胞增殖速度快，获取简便，大大缩短了实验周期；与其他癌细胞系相比，其保留有正常肝细胞的代谢相关酶，能够较好的还原外源化学物在人体内代谢影响。检测的各项指标均具有普适性，市场上均有相关的试剂盒，简单、快速并且具有可靠性。本发明对糖代谢各个关键阶段中相关限速酶所对应的基因进行检测，包括葡萄糖吸收的关键基因GLUT1，糖酵解的关键基因PKM和PFKFB3，糖原合成代谢的关键基因GYS2和GSK3β，糖原分解代谢的关键基因PYGL，糖异生的关键基因IDH2，TCA循环的关键基因PDK1和LDHA。更加具有全面性和普遍性。本发明所提供的评估方法能够全面、准确的评价离子液体的糖代谢毒性水平，为生态环境污染物标准的确定提供依据。
附图说明
图1是初次暴露实验后各处理组中HepG2细胞存活率的对比图；
图2是初次暴露实验后各处理组葡萄糖的消耗量的对比图；
图3是第二次暴露后的细胞中糖原含量对比图；
图4是第二次暴露实验后HepG2细胞中糖代谢相关基因的表达情况对比图。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细、完整的说明，以便于更好的体现本发明的目的、技术方案以及优点。以下实例仅用于解释本发明，而不用于限定本发明。
试剂：HepG2细胞来源于上海恒斐生物科技有限公司。
细胞培养基：按体积百分数计，每份细胞培养基中含有10%胎牛血清（fbs）、1%的链霉素、1%青霉素以及88%的DMEM高糖培养基。
暴露培养基：按体积百分数计，每份暴露培养基中含有0.2%的牛血清白蛋白（BSA）、1%的链霉素、1%的青霉素以及97.8%的DMEM高糖培养基。离子液体浓度为以暴露培养基为溶剂先配置成32mM的1-丁基-3-甲基咪唑氯盐母液（0.559g1-丁基-3-甲基咪唑氯盐溶解于培养基并定容至100mL）后逐级稀释。
仪器：CFX96型Real-timePCR仪（美国BioRad）；5804R型低温高速离心机（德国Eppendorf 公司）；Elx800型多功能酶标仪（美国BioTek公司）；ALC-1100.2型电子分析天平（塞多利斯科学仪器有限公司）；XMTD-8222型水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；Vert.A1型倒置荧光显微镜（德国 ZEISS 公司）。
实施例1
一种离子液体对糖代谢影响的评估方法，所述方法包括以下步骤：
取对数增长期的HepG2细胞用胰蛋白酶消解，消解后的HepG2细胞用细胞计数板计数，用细胞培养基稀释至细胞浓度为1×105个/mL。取96孔板，其中，48个孔（随机每6孔为一组共8个处理组）中每孔加入细胞液100μL，另取6个孔仅加入细胞培养基作为对照组，其余孔加入磷酸盐缓冲液（PBS）防止染菌，放入细胞培养箱中培养24h使细胞贴壁。HepG2细胞培养贴壁后，将原有的培养基吸出，每个处理组分别加入100μL暴露浓度分别为0、0.5、1、2、4、8、16、32mM的暴露培养基，对照组为同体积的细胞培养基，37 ℃、5%CO2细胞培养箱中初次暴露培养24h。
采用MTT法测定初次暴露培养后每孔的细胞存活率，葡萄糖氧化酶法测定暴露前后培养基中葡萄糖的消耗量，根据纯培养基组的葡萄糖含量，测定培养基中葡萄糖的消耗量；将存活率较高且对葡萄糖消耗量影响较大的处理组进行第二次暴露培养，第二次暴露培养时培养环境及培养基浓度保持不变；图1是初次暴露实验后各处理组中HepG2细胞存活率的对比图；图2是初次暴露实验后各处理组葡萄糖的消耗量的对比图；由图1可见，暴露浓度为0.5、1、2、4、8mM时HepG2细胞存活率均较高。由图2中可见，暴露浓度为2mM时的葡萄糖消耗量最小，选暴露浓度分别为1、2、4、8mM的培养基中的HepG2细胞进行第二次暴露培养，保持HepG2细胞浓度不变扩大细胞样本量，用6孔板代替96孔板，每孔加入3ml细胞液，每组6个平行，培养条件及时间与初次暴露培养相同。
对第二次暴露培养后的HepG2细胞进行糖原含量以及糖代谢相关生理指标及基因表达进行检测。HepG2细胞破碎后采用蒽酮比色法测定胞内糖原含量并用BCA法测定总蛋白含量使糖原含量标准化至蛋白水平。
图3是第二次暴露后的细胞中糖原含量对比图；由图3所示，相比于空白组，各处理组的糖原含量均显著降低。
检测数据进行统计学分析，用数据统计软件SPSS（IBM SPSS Statistic 19）进行分析均值的标准误差以及统计学差异。* P <0.05为显著差异，**P<0.01为极显著差异。分析暴露试验后HepG2细胞糖代谢受到的影响，评估不同暴露浓度的离子液体对糖代谢的毒性。
测定HepG2细胞与糖代谢相关基因的表达情况。取qPCR样本加入Trizol后放置于-20
Figure DEST_PATH_IMAGE001
冰箱中保存，测定基因的表达时通过NCBI（National Center for BiotechnologyInformation）查询基因序列，使用primer5设计引物，引物设计完成后对其扩增效率进行验证以确保实验的可靠性。所用引物如表1 所示：
表1 糖代谢相关基因引物表
基因 正向引物 反向引物
PYGL 5'-CCTGAGCTGATGAGGATTTTTG-3' 5'-ATGATTTCCAAATGTCGAGGGA-3'
GSK3β 5'-AGGAGAACCCAATGTTTCGTAT-3' 5'-ATCCCCTGGAAATATTGGTTGT-3'
GYS2 5'-GCTACACTACTTGGGAGGTATC-3' 5'-TGCTGTTATTTCAGAAACCGTG-3'
PKM 5'-ACTGGCATCATCTGTACCATTG-3' 5'-AGCCACATTCATTCCAGACTTA-3'
PFKFB3 5'-TTTCGATGCCACCAATACTACT-3' 5'-GACTCGATGAAAAACGCCTTAA-3'
IDH2 5'-GTGGAGACGGTGGAGAGTGGAG-3' 5'-GGTGTTCAGGAAGTGCTCGTTCAG-3'
LDHA 5'-CCCGATTCCGTTACCT-3' 5'-CACCAGCAACATTCATTC-3'
GLUT1 5'-ACTGTGCTCCTGGTTCTG-3' 5'-TCCTCGGGTGTCTTGTC-3'
PDK1 5'-TCACCAGGACAGCCAATA-3' 5'-CCCGAGGTCTCAACACG-3'
β-Actin 5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3' 5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3'
用Trizol法提取RNA并用琼脂糖电泳和超微量紫外分光光度计确定其未被DNA和蛋白污染，并使用cDNA第一链反转录试剂盒（Beyotime）进行反转录。转录完成后，将SYBRGreen I（BIO-RAD）用作DNA结合染料，并将β-肌动蛋白（β-actin）用作内部参考基因进行实时定量PCR（RT-qPCR）实验，测定相关基因的表达情况。扩增程序设定为：预变性95 ℃30 s，变性95 ℃5 s，在52 ℃-57 ℃退火10 s，40 个循环，最后绘制溶解曲线以测试是否存在非特异性产物。
RT-qPCR测定数据2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达率，并用SPSS进行数据分析确定其存在的标准差，用Origin8进行作图。
图4是第二次暴露实验后HepG2细胞中糖代谢相关基因的表达情况对比图；如图4可见，与空白组相比，细胞的GLUT1在暴露后表达有显著下调，这与上述检测的葡萄糖消耗对应。糖酵解作为糖代谢的重要阶段，其关键的限速酶PKM和PFKFB3的表达有相同趋势的变化，基因的表达随暴露浓度的增加而上升，与糖酵解相对应的糖异生途径的相关基因LDHA的表达出现了下调。糖酵解之后的另一重要阶段柠檬酸循环阶段的限速酶IDH2也出现了明显的变化该基因在暴露浓度为8 mM时出现了特别显著的上调。此外还检测了与糖原合成与分解相关的基因PYGL、GYS2的表达情况，PYGL的表达出现剂量依赖式的上升，而GYS2基因在中低剂量暴露时其表达出现下调。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种离子液体对糖代谢影响的评估方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）HepG2细胞培养至贴壁后，换液至暴露溶液中初次暴露培养；
（2）测定初次暴露后HepG2细胞的存活率和暴露前后培养基中葡萄糖的消耗量，取存活率较高且对葡萄糖消耗量影响较大的处理组进行第二次暴露培养；
（3）对步骤（2）中第二次暴露培养后的HepG2细胞进行糖原含量、糖代谢相关基因的表达进行检测；
（4）对步骤（3）中的检测数据进行统计学分析，分析暴露试验后HepG2细胞糖代谢受到的影响，评估不同暴露浓度对糖代谢的毒性影响；步骤（3）中所述的糖代谢相关基因为GLUT1、PYGL、GSK3β、GYS2、PKM、PFKFB3、IDH2、PDK1和/或LDHA中的一种或多种；所述暴露溶液为1-丁基-3-甲基咪唑氯盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述暴露溶液的浓度为0~32mM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的暴露溶液的溶剂为暴露培养基，所述的暴露培养基以体积百分比计，每份暴露培养基中含有0.2%的牛血清白蛋白、1%的链霉素、1%的青霉素以及97.8%的DMEM高糖培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的初次暴露培养条件为37℃，含有5%CO2的细胞培养箱中培养24小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的第二次暴露培养条件与初次暴露培养相同。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的统计学分析为使用IBMSPSS Statistic 19对步骤（3）中数据进行分析。
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