CN105021716A - 一种有机污染物细胞代谢毒性的评估方法 - Google Patents

Abstract

本发明利用HepG2细胞为供试细胞，通过污染物的暴露处理实验，a）建立了快速提取胞内及胞外代谢产物的前处理方法；b)利用UPLC-QTOF及HPLC-MS/MS对细胞的代谢产物进行全景式分析及靶向分析；c)统计学分析对高通量代谢物进行分类及筛选；d）代谢流量分析系统结合路径分析技术分析高关注新型有机污染物影响细胞的代谢路径。该发明前处理方法简单，利用UPLC-QTOF结合HPLC-MS/MS能有效的对细胞的胞内及胞外代谢产物进行分析，结合统计学处理、代谢流量分析及代谢路径分析能直观的分析高关注新型有机污染物影响细胞的代谢路径；具有操作简单，分析时间短，重复性好，获得信息量全面等优点。

Description

一种有机污染物细胞代谢毒性的评估方法

技术领域

本发明是一种环境污染物毒性效应评价的新方法，是基于质谱的代谢组学技术研究高关注新型有机污染物对细胞的毒性效应,具体地说是一种利用质谱分析技术和代谢组学软件相结合评估环境污染物对细胞毒性效应的方法，该方法具有前处理简单，分析时间短，重复性好，获得信息量全面等优点。

背景技术

持久性有机污染物(persistant organic pollutant，POPs)具有毒性高，生物累积性强，远距离迁移的特性，成为典型的全球性污染物。环境介质中普遍存在短链氯化石蜡(short chain chlorinated paraffins,SCCPs)、六溴环十二烷(Hexabromocyclododecanes,HBCDs)、得克隆（Dechlorane Plus,DPs）、(tetrabromobisphenol A,TBBPA)和苯并[a]芘二醇环氧化物(Benzo[a]pyrenediolepoxides,BPDEs)等有机污染物，它们对甲状腺、肝脏、肾脏、肺等器官具有潜在的致癌性，已列入或将被列入POPs候选名单。各种环境介质（土壤、沉积物、大气、水体、生物体）中均已检出该类污染物。因此，针对这些污染物建立快速有效的毒性评价方法并开展相关的污染调查工作迫在眉睫。针对不断涌现的新型有机污染物，寻找一种简单、快速有效的毒性评价技术成了摆在众人面前的难题。目前许多新型有机污染物以及环境中存在的持久性有机污染物可用于人体健康风险评价的基础数据还很少，在毒理学研究中对人体健康影响的相关研究十分薄弱,不足以支持得出有实际意义的结论（杨永滨，生态毒理学报。2006,105-115）,利用代谢组学对细胞毒性评估是污染物毒性研究的新手段（刘鹏，大连医科大学学报。2008,565-569）但是传统的细胞代谢毒性评估方法存在分析周期长，测试方法繁琐，需要多种仪器相结合，且获得的信息量有限等缺点，因此急需发展一种高效快速且信息量丰富的分析手段来评估细胞的代谢毒性，质谱技术的高速发展成了近年来代谢组学研究的主要工具，UPLC-QTOF具有高灵敏度，可全景式分析代谢产物的特点，HPLC-MS/MS存在定量精确，测试范围广的优点（Monique P,Christine V.S,Konstantinos P,et al.Rapid Commun MassSpectrom,2003,17:1297-1311），代谢流量分析系统可以利用细胞外代谢产物的变化量计算相应的胞内代谢物的变化情况（Jens N,Fozia N,Elmar H.ToxicolAppl Pharm,2009,240:327-336），代谢路径分析可以利用胞内的代谢产物对代谢路径进行深入的分析，因此有机的结合质谱技术、统计分析平台及代谢组学软件在一起，对于快速高效的研究环境污染物对细胞的毒性效应具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于发展一种操作简单、周期短、获得信息量丰富的细胞毒性效应评价的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:

利用UPLC-QTOF对全景代谢物进行分析，分析的结果指导HPLC-MS/MS进行胞内及胞外代谢物的靶向分析，利用该流程分析了人肝癌细胞HepG2在污染物暴露下的胞内及胞外代谢物含量，利用统计学分析、代谢路径及代谢流量分析对细胞的毒性评估:

a）供试细胞为人肝癌细胞HepG2，暴露浓度参考环境中污染物的实际浓度，暴露时间为24小时，胞内代谢物的分析采用MTBE/甲醇/水三相系统，使得样品极性代谢物提取、非极性代谢物提取与除蛋白步骤一步完成；

b)建立了细胞2000多种代谢产物(细胞全组分非靶标分析)的UPLC-QTOF的分析方法，同时建立了50种代谢产物（氨基酸、脂肪酸、甘油、尿素、乳酸等）的HPLC-MS/MS定量定性方法；

c）代谢流量分析系统通过胞外的检测结果可以计算胞内的代谢流量，代谢路径分析可以直观的分析胞内的代谢变化，二者的相互佐证可以系统评价环境污染物对细胞的毒性效应。

此方法涉及到的高关注新型有机污染物包括已列入或将被列入POPs候选名单的污染物，如短链氯化石蜡、六溴环十二烷、得克隆和苯并[a]芘二醇环氧化物等；

步骤a中萃取液胞外代谢物的为甲醇/水比例为80:20,胞内代谢物的为MTBE/甲醇/水比列为20:6:7。

步骤b中通过优化色谱分析条件和质谱参数实现了UPLC-QTOF全景式分析2000多种胞外代谢产物，同时利用HPLC-MS/MS对氨基酸脂肪酸等50种靶向代谢物的定量分析；UPLC-QTOF质谱参数为：正离子模式，毛细管电压4000V,裂解电压为175V,喷雾气氮气为45psi,干燥气氮气为9L/min，温度为350℃。中心离子数据设置为m/z80-1100，安捷伦的MassHunter工作站进行后续分析。HPLC-MS/MS的喷雾电压为3000V；辅助气为5psi；鞘气为30psi；毛细管温度和蒸发气的温度均为300℃，此参数设置很适于检测化合物的高灵敏度及稳定性。

步骤c中代谢流量分析及代谢通路分析主要包括了糖代谢，能量代谢、蛋白质合成，氨代谢，氨基酸代谢等步骤。

按照权利要求1所述的毒性效应评估方法，其特征在于：步骤a中的提取溶剂为甲醇/水，此提取溶剂除了可以除去细胞培养液中的大量蛋白外还可以尽可能多的提取代谢产物，提高代谢产物的出峰数量。

步骤b中UPLC-QTOF结合安捷伦MPP软件能有效的进行峰提取及峰定量，MPP的峰设定值为：电荷价态为1，绝对峰高>=1000，ID BROWSER容差为质量10ppm。

步骤c中的代谢路径涵盖了碳代谢、氮代谢及能量代谢途径，尽可能的从物质代谢及能量代谢双向说明污染物的毒性效应。且代谢流量分析和代谢路径分析分别从胞外结果和胞内结果两个方面入手，最终得到共同的结果，更能让最后的结论具有说服性。

本发明具有如下优点：

（1）利用HepG2细胞为供试细胞，将污染物对细胞暴露处理24小时，建立了快速提取胞内及胞外代谢产物的前处理方法；（2）基于质谱技术对细胞的胞内代谢物及胞外代谢进行全景式及靶向分析；（3）代谢流量分析系统结合路径分析系统分析高关注新型有机污染物对细胞影响的代谢路径。

该发明前处理方法简单，利用UPLC-QTOF结合HPLC-MS/MS能有效的对细胞的胞内及胞外代谢产物进行全景式的及靶向的代谢物分析，结合代谢流量分析及代谢路径分析能直观准确的的反映高关注新型有机污染物对细胞的毒性效应；具有操作简单，分析时间短，重复性好，获得信息量全面等优点。

附图说明

图1胞外代谢物UPLC-QTOF的总离子流图；

图2苯并芘对HepG2细胞代谢路径的影响；

图3代谢流量分析苯并芘对细胞各代谢流的影响。

具体实施方式

本发明利用HepG2细胞为供试细胞，建立了基于质谱的代谢组学技术研究苯并芘对细胞的毒性效应。

将苯并芘对HepG2细胞暴露处理，细胞培养条件为DMEM高糖培养基，1%的青链霉素双抗，10%的胎牛血清，对数期后加入的DMSO溶解的苯并芘处理液或者等量的不含苯并芘的DMSO，使溶液中的苯并芘的终浓度为分别为0,5nM,500nM,暴露处理24小时，5%的二氧化碳培养箱内培养，吸取培养24h的细胞培养液10μL至1ml甲醇和水混合液（体积比80:20）中，漩涡震荡2min，然后15000r·min^-1离心5min，上清液过0.22μm针头过滤器。该方法除蛋白与样品稀释一步完成法，取样量仅需10μL。结果表明，该方法的重复性好，回收率高。用细胞刮刀对六孔板中的细胞进行提取，同时加入800μl的MTBE/甲醇/水（20:6:7）三相系统，通过漩涡震荡及高速离心达到了除蛋白、提取极性代谢产物及非极性代谢产物一步完成。各化合物的加标回收率达到了91%—105%之间，回收率良好。

对提取的代谢产物，建立UPLC-QTOF分析方法对胞外代谢产物进行全景式分析，该方法采用Agilent1200液相色谱结合ESI模式，配备Agilent6500Q-TOF质谱系统(Agilent,USA).5μL样品注射入UPLC ACQUITY T3色谱柱(2.1mm×100mm×1.8μm)柱温箱温度为35℃。水和乙腈作为流动相，两相都包含了0.1%的甲酸，流速为0.3mL/min。UPLC-QTOF质谱参数为：正离子模式，毛细管电压4000V,裂解电压为175V,喷雾气氮气为45psi,干燥气氮气为9L/min，温度为350℃。中心离子数据设置为m/z80-1100，安捷伦的MassHunter工作站进行后续分析，该结果鉴定出2000多种细胞代谢物。胞外代谢物UPLC-QTOF的总离子流如图1所示。

建立HPLC-MS/MS分析方法，极性代谢产物液相色谱柱选择Atlantis C18反相色谱柱（waters,150mm×2.1mm,3.0μm）；流动相A为纯水，流动相B为甲醇；总流速为200μL·min^-1，柱温箱温度为20℃，进样量为10μL。非极性代谢产物液相色谱柱选择Ufavour C8反相色谱柱（中谱科技,150mm×2.1mm,3.0μm）；流动相A为1mM乙酸铵水溶液，流动相B为1mM乙酸铵乙腈溶液；总流速为250μL·min^-1，柱温箱温度为40℃，进样量为10μL。HPLC-MS/MS的喷雾电压为3000V；辅助气为5psi；鞘气为30psi；毛细管温度和蒸发气的温度均为300℃，利用该方法，对氨基酸，脂肪酸，甘油尿素50种代谢产物进行了定量定性分析。检测到的标靶向代谢物的峰面积的RSD均小于10%，这说明仪器的精密度比较高。各代谢物色谱保留时间的RSD值均小于3%，这有利于代谢组学数据预处理时的峰对齐。代表性的几种代谢物的检出限、线性范围、相关系数、精密度见表1。

表1典型代谢物的检出限(LOD)、线性范围、相关系数(r2)、精密度(以峰面积的RSD计)和回收

对检测到的胞内代谢产物进行统计分析，可以得到显著性差异大的代谢产物，对代谢产物的分析见图1，图1的结果表明，不同的代谢物变化表现出了不同的变化趋势，但低浓度的处理时，代谢产物的含量显著降低，随着暴露浓度的升高，绝大多数代谢物相对于空白组表现出了显著的上调趋势。

为了进一步的探索苯并芘的毒性机制，将高浓度代谢物的含量代入在线的http://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst进行代谢路径处理，结果表明，苯并芘主要影响的代谢路径分别是蛋白质合成，尿素代谢及一些特定的氨基酸代谢，影响的大小程度和影响的路径如图2所示。同时检测到的高浓度的胞外的代谢物的含量变化代入代谢流量系统，寻找差异性的代谢物及影响的代谢路径，结果如图3所示，图3的结果表明，高浓度的苯并芘通过影响氨基酸的代谢使蛋白合成受到影响，由于尿素很精氨酸代谢的变化导致氨代谢异常，此结果与胞内的代谢路径分析结果相吻合，因此代谢流量系统恶化代谢路径相结合是有效的评价污染物代谢毒性作用的手段。

Claims (7)

1.一种有机污染物细胞代谢毒性的评估方法，其特征在于:

基于质谱的代谢组学技术研究有机污染物对细胞的毒性效应，其操作步骤如下：

a）采用液液萃取法分别对细胞外及细胞内的代谢物进行提取，分别得到胞外及胞内代谢产物提取液；

b)建立了细胞代谢产物的UPLC-QTOF全景式分析方法，包括极性及非极性化合物同时高通量分析，同时利用UPLC-QTOF的检测结果，寻找污染物处理组与未加污染物的对照组比较相对含量变化较大（采用SPSS19.0软件在p=0.05置信水平对检测化合物的含量对进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan’s法对均值进行多重比较，p<0.05、p<0.01分别认为差异显著和极显著）的化合物，对此类化合物（包括氨基酸，脂肪酸，甘油，尿素及糖）建立HPLC-MS/MS的定性及定量分析方法；

c）采用代谢流量分析系统（陈琦,王卓,魏冬，代谢网络流分析进展及应用，2010，55，14：1302-1309）对b)中HPLC-MS/MS检测的胞外代谢物利用外标定量法进行计算分析，污染物处理组与未加污染物的对照组相比较，计算出污染物处理组对细胞显著性影响的代谢路径，并对影响的程度做分析；采用路径分析系统利用对b)中HPLC-MS/MS检测的胞内代谢物进行追踪分析，污染物处理组与未加污染物的对照组相比较，同样计算出污染物处理组对细胞显著性影响的代谢路径，并对影响的程度做分析；代谢流量分析系统和路径分析系统共同计算出的与对照组显著差异的代谢路径（且差异程度一致）既可限定为污染物影响的代谢路径，用此方法可以用于分析高关注新型有机污染物对细胞的毒性效应。

2.按照权利要求1所述的评估方法，其特征在于：

此方法涉及到的有机污染物主要包括一些对甲状腺、肝脏、肾脏、肺等器官具有潜在的致癌性，已列入或将被列入POPs候选名单的污染物中的一种或二种以上，如短链氯化石蜡、六溴环十二烷、得克隆和苯并[a]芘二醇环氧化物等中的一种或二种以上。

3.按照权利要求1所述的评估方法，其特征在于：

步骤a中供试细胞为人肝癌细胞HepG2，暴露浓度参考环境中污染物的实际浓度（不同的污染物的浓度范围不同，例如短链氯化石蜡1-100μg/L），暴露时间为24小时，萃取液胞外代谢物的为甲醇/水（体积比80:20）,萃取液胞内代谢物的为MTBE、甲醇和水（体积比20：6：7）；

步骤b中通过优化色谱分析条件和质谱参数实现了UPLC-QTOF全景式分析2000多种（包括极性的及非极性的化合物，如氨基酸，脂肪酸，脂类等）胞外代谢产物，同时利用HPLC-MS/MS对氨基酸脂肪酸等50种（氨基酸、脂肪酸、甘油、尿素等）靶向代谢物的定量分析；

步骤c中代谢流量分析及代谢通路（路径）分析主要包括了糖代谢，能量代谢、蛋白质合成，氨代谢，氨基酸代谢等步骤中的一种或二种以上。

4.按照权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤a中液液萃取后溶液需要高速离心3-5min，以达到沉淀蛋白的目的。

5.按照权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤b中UPLC-QTOF的流动相为乙腈和水（1%乙腈保留1min,线性增加到40%乙腈从1min到5min,继续到50%乙腈从5min到8min,继续到65%乙腈从8min到10min,到76%乙腈从10min到16min,最后到100%乙腈从16min到20min保持5min）流动相体积比为40:60），相对于甲醇，乙腈能检测到更多的代谢产物，步骤b中HPLC-MS/MS的流动相为：甲醇和水（梯度洗脱程序为：0-2min时甲醇用量为5%；3min后甲醇用量提高到40%，保持5min；在1min内甲醇用量降到5%，然后再保持9min），相对于乙腈，甲醇更有利于同分异构体的分离；

UPLC-QTOF质谱参数为：正离子模式，毛细管电压4000V,裂解电压为175V,喷雾气氮气为45psi,干燥气氮气为9L/min，温度为350℃。中心离子数据数据设置为m/z80-1100，安捷伦的MassHunter工作站进行后续分析；

步骤b中HPLC-MS/MS的喷雾电压为3000V；辅助气为5psi；鞘气为30psi；毛细管温度和蒸发气的温度均为300℃，此参数设置很适于检测化合物的高灵敏度及稳定性。

6.按照权利要求1或5所述的评估方法，其特征在于：步骤b中UPLC-QTOF检测的高通量代谢产物采用安捷伦的MPP软件进行峰提取及定量分析，MPP的峰设定值为：电荷价态为1，绝对峰高>=1000，ID BROWSER容差为质量10ppm。

7.按照权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤c中的代谢流量分析是基于KEGG数据库，步骤c中的路径分析基于KEGG数据库的基础上同时基于在线的http://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst进行处理；

步骤c中的代谢流量是基于拟稳态假设，根据流量平衡及生物化学反应方程，根据胞外的代谢物的含量变化计算胞内的代谢物的变化量；

步骤c中的代谢路径分析是基于统计学分析得到的潜在生物标志物及KEGG数据库进行整个路径的串通；

步骤c中的代谢流量结果和步骤c中的代谢路径结果是相互呼应，相互佐证，相比于单方面的评价结果更具有说服性及准确性。