CN114414689A - 一种基于超高效液相色谱高分辨率质谱的全氟化合物非靶向定量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于超高效液相色谱高分辨率质谱的全氟化合物韭靶向定量方法，属于分析化学领域。其步骤为：样品前处理；上机检测：通过超高效液相色谱‑四极杆轨道离子阱质谱对样品进行测定；全氟化合物电离效率值测定；获得全氟化合物的结构表征方法：分子指纹；机器学习建模及评估：建立分子指纹预测电离效率的机器学习模型；模型应用：在实际样品中添加少量不同标准品，检测标准品峰面积、峰面积与浓度比值响应因子RF，拟合logRF与电离效率曲线，根据模型预测电离效率值与未知物峰面积非靶向定量其浓度。本方法通过实际样品的少量标准品进行模型校正，应用于实际环境样品，可以实现全氟化合物的非靶向定量。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域中，具体的说，涉及一种基于超高效液相色谱高分辨率质谱的全氟化合物韭靶向定量方法。
背景技术
PFASs是一类人工合成的包含碳氟骨架(CnF2n+1)和其他亲水官能团的表面活性剂，由于其良好的热稳定性，表面活性和疏水疏油的特性，被广泛应用于消防、皮革，农药及电镀行业，自20世纪50年代开始，PFASs被大量生产。直到2001年，PFASs在动物体内普遍检出，并且发现其持久性和生物蓄积性，PFASs才逐渐引起各国的关注。由于潜在风险，PFOS及其前体化合物于2009年被列入斯德哥尔摩公约，PFOA于2019年纳入斯德哥尔摩公约，以限制他们的使用。随着传统PFOS与PFOA的禁用，其替代品短链PFASs与其他新型PFASs作为替代品进入工业生产。目前针对PFASs的研究主要针对传统的PFOS与PFOA,对新型PFASs替代品的研究较少。非靶向分析技术的发展弥补了这一缺点，可以快速筛选可能存在的全氟化合物。
然而，定性分析结果的量化仍然是一个主要挑战。例如，在人类代谢组数据库的114100种化合物中，只有约21，000已被发现和确认。目前，从液相色谱质谱获得定量信息的能力几乎完全受到标准物质可用性的限制，因为不同的化合物在电喷雾源中电离的程度不同。化合物在液相色谱质谱中的响应受化合物性质、洗脱液组成和仪器的影响。由于大多数化合物都没有标准参考材料(以匹配保留时间、质量碎片模式和提供校准曲线)，用靶向分析方法对所有检测到的化合物进行定量是非常困难的，因为大多数化合物都没有标准参考材料(以匹配保留时间、质量碎片模式和提供校准曲线)。此外，不同实验室进行的大多数液相色谱质谱分析的结果目前只能根据定性数据进行比较，因为所用的测量条件和仪器差异很大，并且没有定量数据。缺乏简便的定量方法也是进一步研究的一大障碍。
发明内容
1.要解决的问题
针对目前环境介质中PFOAs、PFOSs及替代品新检出日益增多，大多数化合物都没有标准参考，采用靶向分析方法对所有检测到的化合物进行定量存在较大困难，本发明提供了一种基于超高效液相色谱高分辨率质谱梯度洗脱进样的全氟化合物非靶向定量模型。本方法通过全氟化合物质谱分析、电离效率值计算、全氟化合物分子表征、机器学习建模与评估建立全氟化合物的非靶向定量模型，通过实际样品的少量标准品进行模型校正，应用于实际环境样品，可以实现全氟化合物的非靶向定量。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供了一种基于超高效液相色谱高分辨率质谱的全氟化合物非靶向定量模型，包括以下步骤：
(A)样品前处理：将全氟化合物标准品配制稀释不同梯度浓度并进样；
(B)上机检测：通过超高效液相色谱-四极杆轨道离子阱质谱对样品进行测定；
(C)全氟化合物电离效率值测定；
(D)获得全氟化合物的结构表征方法：分子指纹；
(E)机器学习建模及评估：建立分子指纹预测电离效率的机器学习模型；
(F)模型应用：在实际样品中添加少量不同标准品，检测标准品峰面积，通过峰面积与浓度标准曲线获得相对电离效率logRF，拟合logRF与模型预测电离效率获得实际样品电离效率校正曲线，根据实际样品目标物质峰面积进行非靶向定量。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤(C)中，利用TraceFinder软件依据母离子精确质量在样品中精准筛查目标化合物，获得定量标准曲线，通过标准曲线斜率计算电离效率值；获得定量曲线，根据线性结果剔除部分线性不好的全氟化合物(R^2<0.95)。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤(C)中，根据响应值大小选取标定化合物，根据待测化合物与标定化合物的标准曲线斜率比值计算相对电离效率值。
具体的，步骤(C)中，使用TraceFinder软件测定目标全氟化合物信号(加合物为[M-H])相对于浓度线性回归的斜率。选取标定化合物，依据相对电离效率，计算其他全氟化合物的电离效率值，进而计算所有化合物的电离效率值。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤(E)中，使用不同的评估方法预测不同机器学习模型的预测误差，选取最优的预测模型作为全氟化合物电离效率模型应用。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤(E)中，所述不同的机器学习模型包括多元线性回归模型、人工神经网络、随机森林模型及支持向量机模型，所述不同的评估方法包括混淆矩阵或AOC-ROC曲线，
作为本发明更进一步的改进，步骤(E)中，利用python3.8建立分子指纹预测电离效率的机器学习模型。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤(B)中使用梯度洗脱进样，与实际环境样品进样方法相同。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤(A)中，将多种全氟标准品在甲醇溶剂配置为各种浓度梯度的混标溶液并进样，同时以相同方法进样纯甲醇溶剂作为空白，便于后续分析。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤(E)之前还包括建模数据预处理步骤：通过统计分析方法剔除相关变量及字符型变量，获得最优预测变量用于机器学习建模。
作为本发明更进一步的改进，在获取分子指纹之前，预先获取全氟化合物的SMILES。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤(B)中，使用ESI电离源在负模式下进行测定。
作为本发明更进一步的改进，本发明提供了一种基于超高效液相色谱高分辨率质谱梯度洗脱进样的全氟化合物非靶向定量方法，包括以下步骤：
(1)全氟化合物样品前处理：全氟标样购买于惠灵顿，包含全氟辛烷磺酸、全氟辛烷羧酸、全氟多醚类及卤代全氟类物质，涵盖非靶向鉴定结果中的大多数全氟类物质。
将49种全氟标准品在甲醇溶剂配制为0.5ppb、1ppb、2ppb、5ppb、10ppb、20ppb、50ppb和100ppb的混标溶液并进样，同时以相同方法进样纯甲醇溶剂作为空白，便于后续分析。
(2)上机检测：通过超高效液相色谱-四极杆轨道离子阱质谱对样品进行测定,使用ESI电离源在负模式下进行测定，数据采集模式为数据依赖采集模式，其他质谱参数如下：
超高效液相色谱仪：Ultimate 3000,Thermo，美国；
高分辨质谱：Q-ExactiveFocus,Thermo，美国；
色谱柱：C18超高效液相色谱柱(ACQUITY UPLC Eclipse BEN C18，2.1×150mm,1.7μm，Waters,美国)；
毛细管温度：320℃；辅助气加热温度：413℃；
喷雾电压：-2.5kV；
鞘气流速：48；辅助气流速：11；吹扫气：2；S-Lens:50；
碰撞能：-35+/-15eV；
柱温：40℃；进样体积：10μL；
流速：0.25ml/min；
流动相：A：2mM乙酸铵水溶液；流动相B：甲醇；
离子源：ESI；
离子模式：负离子模式；
MS扫描范围：m/z 80-1000；
MS/MS扫描范围：m/z 50-1000；
一级分辨率：70000；二级分辨率：17500；
梯度洗脱方法如表1所示：
表1梯度洗脱条件
(3)全氟化合物电离效率值测定：使用TraceFinder软件测定目标全氟化合物信号(加合物为[M-H])相对于浓度线性回归的斜率。相对于其他全氟化合物，全氟辛烷羧酸(PFOA)在质谱中响应较高，设为标定化合物。
首先计算相对电离效率(RIE:relative ionization efficiency)：
RIE(M1/PFOA)＝slope(M1)/slope(PFOA)；
其中M1为待测化合物，slope为化合物标准曲线斜率，slope(M1)为待测化合物斜率，slope(PFOA)为全氟辛烷磺酸的斜率；为了使数据更容易呈现和分析，使用了对数标度(logIE)。
(4)SMILES式获取：SMILES，全称是Simplified Molecular Input Line EntrySystem，是一种用于输入和表示分子反应的线性符号，全氟化合物的SMILES均通过Pubchem网站检索得到。
(5)全氟化合物分子指纹的收集：基于开源软件ChemDes计算全氟化合物的2D&3&分子描述符，以及Pubchem分子指纹、扩展连通性指纹(ECFP)及由MDL开发的化学结构数据库衍生的指纹，检查了166个子结构以及MACCS分子指纹。分子描述符及分子指纹计算软件可通过该网址获取http://www.scbdd.com/chemdes/。
(6)建模数据预处理；通过软件得到的用于建模的分子描述符含有大量空值及字符型变量，分子指纹间某一结构指纹相同值>95％，变量之间有较大的相关性。通过统计分析方法剔除相关变量及字符型变量，获得最优预测变量用于机器学习建模。
(7)机器学习建模及评估：python3.8建立分子描述符(分子指纹)预测电离效率的机器学习模型，使用混淆矩阵及AOC-ROC曲线预测不同机器学习模型(人工神经网络、随机森林模型、支持向量机模型、多元线性回归等)的预测误差，选取最优的机器学习模型作为全氟化合物电离效率模型应用。
(8)模型应用：由于本模型仅在标准品样品进行建模，需要在实际样品中进行模型迁移。在实际样品中添加少量不同标准品，检测标准品峰面积，峰面积与浓度比值响应因子RF，拟合logRF与模型预测电离效率曲线，即可根据模型预测电离效率值与未知物峰面积非靶向定量其浓度。将该模型应用于环境样品，对定性分析得到的全氟化合物进行预测。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明的全氟化合物的非靶向定量方法，根据全氟化合物的标准混合溶液，获得不同全氟化合物在质谱中的电离效率值，并根据电离效率值进行建模，并获取机器学习模型作为全氟化合物电离效率模型应用，能够实现全氟化合物的准确定量。
(2)本发明的全氟化合物的非靶向定量方法，基于全氟化合物的电离效率，利用机器学习预测方式，对全氟化合物的电离效率建模并评估不同模型的优劣，选取解释性最好的多元线性回归模型进行建模。
(3)本发明的全氟化合物的非靶向定量方法，是一种使用化合物的预测电离效率值模型来定量量化实际样品中全氟化合物浓度的通用方法，本发明的方法可以在仪器、液相色谱设置和仪器之间转移，并可用于实际样品的分析，具有高度的准确性。
附图说明
图1为使用Tracefinder获取各物质的标准曲线流程图；
图2为电离效率计算步骤；
图3为实际电离效率与预测电离效率拟合方程。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的详细描述。以下所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员均可能利用以下揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修饰或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1
本实施例提供了一种基于超高效液相色谱高分辨率质谱梯度洗脱进样的全氟化合物非靶向定量模型，包括以下步骤：
(1)全氟化合物样品前处理：全氟标样购买于惠灵顿，包含全氟辛烷磺酸、全氟辛烷羧酸、全氟多醚类及卤代全氟类物质，涵盖非靶向鉴定结果中的大多数全氟类物质。将49种全氟标准品在甲醇溶剂配制为0.5ppb、1ppb、2ppb、5ppb、10ppb、20ppb、50ppb和100ppb的混标溶液并进样，同时以相同方法进样纯甲醇溶剂作为空白，便于后续分析。
(2)上机检测：通过超高效液相色谱-四极杆轨道离子阱质谱对样品进行测定,该步骤中使用梯度洗脱进样，与实际环境样品进样方法相同；使用ESI电离源在负模式下进行测定，数据采集模式为数据依赖采集模式，其他质谱参数如下：
超高效液相色谱仪：Ultimate 3000,Thermo，美国；
高分辨质谱：Q-Exactive Focus，Thermo，美国；
色谱柱：C18超高效液相色谱柱(ACQUITY UPLC Eclipse BEN C18，2.1×150mm,1.7μm，Waters，美国)；
毛细管温度：320℃；辅助气加热温度：413℃；
喷雾电压：-2.5kV；
鞘气流速：48；辅助气流速：11；吹扫气：2；S-Lens:50；
碰撞能：-35+/-15eV；
柱温：40℃；进样体积：10μL；
流速：0.25ml/min；
流动相：A:2mM乙酸铵水溶液；流动相B:甲醇；
离子源：ESI；
离子模式：负离子模式；
MS扫描范围：m/z 80-1000；
MS/MS扫描范围：m/z 50-1000；
一级分辨率：70000；二级分辨率：17500；
梯度洗脱方法如表2所示：
表2梯度洗脱条件
(3)全氟化合物电离效率值测定：利用TraceFinder软件依据母离子精确质量于样品中精准筛查目标化合物，获得定量标准曲线，通过定量标准曲线斜率计算电离效率值。
具体的，使用TraceFinder软件测定目标全氟化合物信号(加合物为[M-H])相对于浓度线性回归的斜率。相对于其他全氟化合物，全氟辛烷羧酸(PFOA)在质谱中响应较高，设为标定化合物。
首先计算相对电离效率(RIE：relative ionization efficiency)：
RIE(M1/PFOA)＝slope(M1)/slope(PFOA)；
其中M1为待测化合物，slope为化合物标准曲线斜率，slope(M1)为待测化合物斜率，slope(PFOA)为全氟辛烷磺酸的斜率；表三为各全氟化合物的电离效率值，图2为电离效率计算步骤；
为了使数据更容易呈现和分析，使用了对数标度(logIE)。所有PFAS的回归曲线均来自TraceFinder软件，通过标准品绘制标准曲线对其进行定量，保留R^2>95的物质用于建模；使用Tracefinder获取各物质的定量标准曲线流程如图1所示，各物质电离效率值如表3所示；
(4)SMILES式的获取：SMILES,全称是Simplified Molecular Input Line EntrySystem,是一种用于输入和表示分子反应的线性符号，全氟化合物的SMILES均通过Pubchem网站检索得到.
表3全氟化合物的电离效率值
(5)全氟化合物的分子指纹的收集：基于开源软件ChemDes计算全氟化合物的2D&3&分子描述符、Pubchem分子指纹、Pybel指纹、扩展连通性指纹(ECFP)及MACCS分子指纹。分子描述符及分子指纹计算软件可通过该网址获取http://www.scbdd.com/chemdes/。
(6)建模数据预处理；通过软件得到的用于建模的分子描述符含有大量空值及字符型变量，分子指纹间某一结构指纹相同值>95％，变量之间有较大的相关性。通过统计分析方法剔除相关变量及空值，获得Pybel的二维分子描述符做为预测变量预测电离效率,原始数据含有24个自变量，去除nan值后保留12个自变量进行模型预测，分别为：TPSA、HBD、nF、logP、MW、bonds、atoms、HBA1、HBA2、sbonds、dbonds、MR，大多数为分子物理化学描述符信息及化学键信息。
(7)机器学习建模及评估：python3.8建立分子描述符(分子指纹)预测电离效率的机器学习模型，使用混淆矩阵及AOC-ROC曲线预测不同机器学习模型(人工神经网络、随机森林模型、支持向量机模型等)的预测误差，选取最优的多元线性回归模型作为全氟化合物电离效率模型应用。
步骤(H)中利用不同机器学习模型建模，通过不同的评估方法(比如混淆矩阵、ROC-AUC曲线)获得电离效率的最优预测模型，由于实验样本较少且变量较多，机器学习方法会产生过拟合现象，选择最优的多元线性回归模型建立电离效率预测模型。
(8)模型应用：将该模型应用于环境样品，由于环境样品存在基质效应，需要进行模型校正，通过向实际水样加入已有标准品，通过检测峰面积/浓度，获得真实电离效率。通过真实电离效率与预测电离效率作图，如图3所示，建立实际电离效率与预测电离效率拟合方程logIEpre＝0.6458*logIEact-0.2476，其中logIEpre为模型预测相对电离效率值，logIEact即为在实际样品中的该物质电离效率值。
对定性分析得到的全氟化合物进行浓度预测，在以该梯度进样方法的实际样品中获得鉴定的全氟化合物峰面积；例如在污水处理厂样本非靶向鉴定中,通过该仪器方法进样鉴定出的不饱和羧酸C11HF19O2峰面积为33879823，通过数据库检索其SMILES为：
C(＝C(F)F)(C(＝O)O)C(C(C(C(C(C(C(C(F)(F)F)(F)F)(F)F)(F)F)(F)F)(F)F)(F)F)(F)F，在http://www.scbdd.com/chemdes/网站获取pybel描述符，通过模型计算如下图所示即为预测相对电离效率(logIEact)为-0.0178392，校正电离效率为0.35577，可根据过程(C)：c＝singal/10^(logIEpre)计算得出结果为1.67ppb。
目前在没有标准品的情况下，常用的半定量方法为相似结构物质定量，即寻找有标准品的相似结构物质进行近似定量。不饱和羧酸C11HF19O2其与C9H2F14O4(不饱和度为均2)结构相似，使用建模过程中所建立的标准曲线，通过相似结构物质的定量，得出其浓度近似为1.6687ppb，误差小于0.1ppb，由此可以证明本发明的模型可用于全氟化合物非靶向准确定量。
Claims (10)
1.一种基于超高效液相色谱高分辨率质谱的全氟化合物非靶向定量模型，其特征在于：包括以下步骤：
(A)样品前处理：将全氟化合物标准品配制稀释不同梯度浓度并进样；
(B)上机检测：通过超高效液相色谱-四极杆轨道离子阱质谱对样品进行测定；
(C)全氟化合物电离效率值测定；
(D)获得全氟化合物的结构表征方法：分子指纹；
(E)机器学习建模及评估：建立分子指纹预测电离效率的机器学习模型；
(F)模型应用：在实际样品中添加少量不同标准品，检测标准品峰面积，通过峰面积与浓度标准曲线获得相对电离效率logRF，拟合logRF与模型预测电离效率获得实际样品电离效率校正曲线，根据实际样品目标物质峰面积进行非靶向定量。
2.根据权利要求1所述的基于超高效液相色谱高分辨率质谱的全氟化合物非靶向定量模型，其特征在于：所述步骤(C)中，利用TraceFinder软件依据母离子精确质量于样品中精准筛查目标化合物，获得定量曲线，根据线性结果剔除部分全氟化合物(R^2<0.95)。
3.根据权利要求1或2所述的基于超高效液相色谱高分辨率质谱的全氟化合物非靶向定量模型，其特征在于：所述步骤(C)中，根据化合物的响应值大小选取标定化合物，根据待测化合物与标定化合物PFOA的定量标准曲线斜率比值取对数计算相对电离效率值，进而计算所有化合物的电离效率。
4.根据权利要求3所述的基于超高效液相色谱高分辨率质谱的全氟化合物非靶向定量模型，其特征在于：所述步骤(E)中，使用不同的评估方法预测不同机器学习模型的预测误差，选取最优的预测模型应用。
5.根据权利要求4所述的基于超高效液相色谱高分辨率质谱的全氟化合物非靶向定量模型，其特征在于：所述步骤(E)中，所述不同的机器学习模型包括人工神经网络、随机森林模型及支持向量机模型及多元线性回归模型，所述不同的评估方法包括混淆矩阵或AOC-ROC曲线，利用python3.8建立分子指纹预测电离效率的机器学习模型比较模型泛化能力。
6.根据权利要求5所述的基于超高效液相色谱高分辨率质谱梯度洗脱进样的全氟化合物非靶向定量模型，其特征在于：所述步骤(B)中全氟化合物标准品使用梯度洗脱进样，与实际环境样品进样方法相同。
7.根据权利要求6所述的基于超高效液相色谱高分辨率质谱梯度洗脱进样的全氟化合物非靶向定量方法，其特征在于：所述步骤(A)中，将多种全氟标准品使用甲醇溶剂配制为各种浓度梯度的混标溶液并进样，同时进样纯甲醇溶剂作为空白。
8.根据权利要求7所述的基于超高效液相色谱高分辨率质谱梯度洗脱进样的全氟化合物非靶向定量方法，其特征在于：所述步骤(E)之前还包括建模数据预处理步骤：通过统计分析方法剔除相关变量及字符型变量，获得最优预测变量用于机器学习建模。
9.根据权利要求1或2所述的基于超高效液相色谱高分辨率质谱梯度洗脱进样的全氟化合物非靶向定量方法，其特征在于:通过全氟化合物的SMILES式获取其分子指纹用于建模。
10.根据权利要求3所述的基于超高效液相色谱高分辨率质谱梯度洗脱进样的全氟化合物非靶向定量方法，其特征在于：所述步骤(B)中，使用ESI电离源在负模式下进行测定。
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