CN116068117A - 一种基于液相色谱-质谱的烷基间苯二酚同系物高通量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于液相色谱‑质谱的烷基间苯二酚同系物高通量检测方法，包括如下步骤：（1）ARs同系物高分辨质谱鉴定及特异指纹碎片库构建，（2）ARs同系物UPLC‑MS/MS高通量检测方法开发，以及（3）方法验证。本发明采用有机溶剂提取基准物质小麦麸皮，富集浓缩后采用UPLC‑QTOF‑MS对ARs同系物进行鉴定，分析了ARs同系物在质谱中的碎裂模式和碎裂特征，以支持进一步的高通量靶向方法开发。本发明利用液相色谱‑串联四级杆质谱多反应监测模式（UPLC‑MS/MS）建立了全谷物及谷物食品中56种烷基间苯二酚的靶向高通量同时检测方法，利用质谱特征碎片和保留时间精准预测模型实现对目标物的定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种液相色谱-质谱检测领域，特别涉及一种基于液相色谱-质谱的烷基间苯二酚同系物高通量检测方法。
背景技术
近年来，大量的科学研究已经证实全谷物在体重调节、降低2型糖尿病发病风险、降低心血管疾病和癌症发病率等方面具有重要作用，同时逐步形成了全谷物对可持续饮食和地球健康的研究共识。美国谷物化学家协会（AACCI）将全谷物的定义为“全谷物是完整、碾碎、破碎或压片的颖果，其基本的结构组成包括淀粉质胚乳、胚芽和麸皮，各组成部分的相对比例与完整颖果相同”。和全谷物相比，由于全谷物食品中包含有其他非全谷物成分，因此全世界对全谷物食品定义也存在大量差异，目前常用的全谷物食品的判定标准为每份食品中含有至少 51％或 8 g全谷物。
根据2010~2012年中国居民营养与健康状况监测数据显示，我国成年人全谷物（粗杂粮）的摄入量男性为13.9 g/d，女性为14.6 g/d，即便以推荐摄入量最低50g/d为参考值，我国不同人群全谷物摄入量达到或超过该参考值的比例仅为7%~16.7%，即超过80%的成年居民全谷物摄入不足。虽然我国营养监测的结果显示全谷物摄入严重不足，但很多研究在其讨论分析中均提到所使用的回顾性膳食调查方法对于食物真实摄入量的评价存在很大问题，直接导致样本的个体数据差异或标准差过大，以及摄入量数据不能解释样本人群出现的相关疾病状态等。此外，与发达国家相比，目前我国全谷物的标准、标识、监管都不完善，致使市场上全谷物及其相关食品参差不齐，不利于消费者的认知和选择，也不利于全谷物营养膳食的推广。例如，已有调查显示我国全麦面包中全麦粉含量各不相同，各类食品标识不一，甚至存在使用添加剂、可可粉、焦糖色素调配颜色充当全麦面包售卖的情况。
谷物中烷基间苯二酚（Alkylresorcinols，ARs）属于两亲性酚类化合物，主要由一个1,3-二羟基苯环和连接到苯环五号位上的烷基链组成（15-25个奇数碳原子为主）。不同链长ARs同系物构成谱在每种谷物之间存在差异, 其中还含有单不饱和，多不饱和，氧化形式等多种类型的同系物（图1）。ARs主要存在于全谷物麸皮中, 已经在小麦、黑麦、大麦中被检测到。现有的研究结果表明ARs具有抗氧化、抗癌、调节胆固醇水平等生物活性。鉴于在全谷物中的特异性和潜在的生物活性，ARs在全谷物及相关食品质量控制、全谷物营养机制研究以及全谷物膳食摄入量评估等方面的应用前景受到广泛关注。
ARs同系物包括（图1）：
AR X：0（X：15~27）：R=饱和直链碳链，碳链碳原子数为15~27；
AR X：1（X：15~27）：R=单不饱和直链碳链，碳链碳原子数为17~27；
AR X：2（X：15~27）：R=多不饱和直链碳链（不饱和度2），碳链碳原子数为17~27；
AR X：3（X：15~27）：R=多不饱和直链碳链（不饱和度3），碳链碳原子数为15~27；
AR X：0 oxo（X：15~27）：R=氧化态的饱和直链碳链，碳链碳原子数为15~27；
AR X：1 oxo（X：15~27）：R=氧化态的饱和直链碳链，碳链碳原子数为15~27；
AR X：2 oxo（X：15~27）：R=氧化态的多不饱和直链碳链（不饱和度2），碳链碳原子数为15~27；
AR X：3 oxo（X：15~27）：R=氧化态的多不饱和直链碳链（不饱和度3），碳链碳原子数为15~27。
现有的ARs检测方法主要针对谷物类面粉中ARs的含量分析，多采用液相色谱-二极管阵列检测器法（LC-PDA），气相色谱-质谱检测法（GC-MS），以及液相色谱-质谱（LC-MS）。上述检测方法通常灵敏度较低（μg/g水平），重现性差，能检测的目标物仅包括AR19:0和AR21:0等少数几种含量较高的同系物（仅AR17:0，AR 19:0, AR 21:0, AR 23:0等几种饱和ARs有商业化标准品），无法高通量检测ARs的单不饱和、多不饱和、氧化形式等其他同系物类型。此外，由于受灵敏度的限制，现有的方法仅适用于全谷物面粉等基质的检测，而对于符合中国饮食习惯的低全谷成分含量的加工食品来说，实现对ARs的痕量分析的需求则难以满足。此外，以上方法样品预处理繁琐，仪器分析时间较长，不利于大规模样本的测试分析。
针对以上瓶颈问题，本发明提供了一种基于液相色谱-质谱的同时检测56种烷基间苯二酚同系物的方法，意在解决现有检测方法通量低、灵敏度低、分析时间长、样品预处理繁琐的问题，以期为我国全谷物及相关食品的质量控制、市场监管以及全谷物膳食摄入量的准确评估提供技术支撑。
发明内容
本发明采用有机溶剂提取小麦麸皮，样品富集浓缩后利用UPLC-QTOF-MS对ARs同系物进行鉴定，分析了ARs同系物在质谱中的碎裂模式和碎裂特征，在此基础上利用液相色谱-串联四级杆质谱多反应监测模式（UPLC-MS/MS）建立了全谷物及谷物食品中56种烷基间苯二酚的靶向高通量同时检测方法，利用质谱特征碎片和保留时间精准预测模型实现对目标物的定量分析。
本发明提供一种基于液相色谱-质谱的烷基间苯二酚同系物高通量检测方法，包括如下步骤：
（1）ARs同系物高分辨质谱鉴定及特异指纹碎片库构建
1.1取ARs定性分析基准物质，有机溶剂提取后富集浓缩。
所述ARs定性分析基准物质为小麦麸皮；所述有机溶剂为乙腈。
本发明的一个实施例中，将1 g小麦麸皮样品用60 mL乙腈提取，提取液氮吹后定容浓缩，待进行定性分析。
将步骤1.1的浓缩液通过液相色谱高分辨质谱定性分析。
本发明采用超高效液相色谱-飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）分析ARs同系物，并获得特异性指纹碎片信息。
所述液相色谱流动相A为含0.2-0.8v%(体积百分比)乙酸的甲醇，流动相B为含0.2-0.8v%乙酸的水，流速为0.1-0.5 mL/min。流动相的设定：在30 min内将A相从5%增加到50%，然后在15 min内将提高到100%。进样体积2-10μL。
所述质谱通过TOF质谱采集进行全扫描分析，通过信息依赖采集IDA（Informationdependent analysis）进行产物离子扫描。本发明一个实施例中，TOF MS采集的条件设定如下：负离子模式，离子源气1（氮气，55psi），离子源气2（氮气，55psi），帘子气1（氮气，35psi），温度（550℃），离子喷雾电压（-4500V），DP电压（70V），碰撞能量（5V），质量范围（50-1000m/z）。对于IDA模式，碰撞能量（CE）被固定在35V，范围为±15V，即优选20-50V。
本发明在负离子电离条件下，在甲醇和水体系中添加适宜量(0.2-0.8v%)的乙酸可以更有效的改善峰形，提高ARs分析的灵敏度和分辨率。
获得ARs同系物特异性指纹碎片信息。
高分辨质谱定性分析结果显示：提取物浓缩液中的所有饱和ARs、单不饱和ARs和双不饱和ARs都观察到特征碎片m/z81、m/z122和m/z[M-H-C2H2O]-，而氧化态ARs都观察到特征碎片m/z81和m/z123。即饱和ARs、单不饱和ARs和双不饱和ARs特征碎片为m/z81、m/ z122和m/z[M-H-C2H2O]-; 氧化态ARs的特征碎片为m/z81和m/z123（图2-图4）。
本发明的一个实施例中，确定了基准物质小麦麸皮ARs同系物的主要的断裂方式、特征碎片、保留时间以及精确质量数等信息。利用实测精确质量数与理论质量数得到质量偏差，对ARs同系物进行定性判断。
（2）UPLC-MS/MS高通量检测方法开发
2.1待检测目标物提取
将待测样品预处理后，采用溶剂超声提取，离心分离，收集上清液并汇集，过滤。
所述预处理包括：冷冻干燥，研磨、均质、过滤后低温密封保存。
所述过滤为通过0.25-0.5毫米的滤网；所述低温的温度为30℃~-10℃。
本发明的一个实施例中，将全谷物和谷物相关食品冷冻干燥2天，研磨、均质后成通过0.45毫米的滤网，-20℃下密封保存。
所述溶剂选为乙腈，所述超声提取的时间为10-40分钟，共2-4个提取循环。
本发明的一个实施例中，称取密封保存的预处理样品0.5g，用10 mL乙腈进行超声提取30分钟，共3个提取循环。超声提取后于20℃以9000g离心10分钟。收集上清液，并按照同样的程序再提取两次沉淀物，合并上清液，将汇集的上清液通过0.45μM的针孔过滤器过滤。
本发明采用乙腈提取溶剂，能够有效地从不同的食品基质中提取不同理化性质的多种ARs同系物，同时尽量减少提取液中基质干扰。而且乙腈是液相色谱-质谱兼容的有机溶剂，在获得样品的提取液之后可以直接上机检测，将进一步缩短和简化样品的前处理流程。
优化液相和质谱的检测条件并进行检测
将待检测样品提取物，采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测。
由于ARs亲脂性较强，使用传统的C18反相柱很难将富集在色谱柱上的目标物进行洗脱，本发明创新性地选择了BEH C8色谱柱来代替传统的C18固相填料的色谱柱，减少色谱柱对目标物的保留，以方便洗脱ARs并消除批量分析过程中目标物残留带来的交叉污染。
本发明的一个实施例中，采用Waters ACQUITY超高效液相系统，分析柱采用ACQUITY UPLC BEH C8 (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)。
流动相A为含0.2-0.8v%乙酸的甲醇，流动相B为含0.2-0.8v%乙酸的水。
申请人发现，在负离子电离条件下，在甲醇和水体系中添加适宜量的乙酸可以更有效的改善峰形，提高ARs分析的灵敏度和分辨率。
本发明的一个实施例，流动相A为含0.5%乙酸的甲醇，流动相B为含0.5%乙酸水，流速为0.3 mL/min。使用BEH C8色谱柱来实现ARs同系物的高效分离。流动相的设定方案为：在8.5min内将A相从80%增加到100%，维持2.0 min，最后平衡两分钟，进样体积5 μL。
碰撞能量被发现时是质谱参数中关键的影响变量。本发明利用渐进式递增方式对CE参数进行了优化（步长，1eV，范围为40~50eV）。结果表明，ARs的最佳碰撞能量显示出一定的规律性，无论是饱和的还是不饱和ARs，随着碳链的增加，需要更多的碰撞能量来得到更高的响应丰度。
利用步骤（1）得到的特征碎片对步骤2.2的检测结果进行分析，得到典型的高通量ARs同系物检测色谱图（如图5所示）。
建立烷基链长度、不饱和度与保留时间的模型
由于ARs的结构高度相似性、缺乏商业标准品，同时部分同系物、异构体和在实际样品中的含量很低，因此仅依靠质谱特征碎片对目标物进行全面定量仍然具有挑战。
本发明使用有限的5种ARs标准品（AR 17:0，AR 19:0，AR 21:0，AR 23:0，AR 25:0，特征碎片如表1所示）来进一步探索ARs结构特征和其色谱行为之间的关系。本发明发现，保留时间（RT）与烷基链长度之间的相关性很好（R2>0.997）（图6(a)）。
本发明通过多元线性回归构建了包括烷基链长度、烷基链不饱和度和保留时间的三维模型，并得到了一个良好的二元线性回归模型（图6 (b)、图6(c)）。
AR X1:X2 Y=0.389X1-0.540X2-2.558 (R2=0.996) (I)
AR X1:X2 oxo （氧化态） Y=0.387X1-0.567X2-3.681 (R2=0.996) (II)
Y-保留时间，X1-烷基链长度（即饱和烃碳数），X2-烷基链不饱和度(即双键数)。
利用该模型，我们可以准确预测具有不同饱和度和烷基链长度的未知ARs同系物的保留时间。
本发明的一个实施例中，通过保留时间预测模型公式（II），测算出AR21:3 oxo保留时间为2.73min，AR23:3oxo保留时间为3.52min。采用本发明的同系物高通量检测方法，检测得到全谷物小麦样品中痕量AR21:3 oxo保留时间为2.86min，ΔRT=0.11min；AR23:3oxo保留时间为3.58min，ΔRT=0.06min，误差较小。
由此可见，通过模型保留时间预测，两种痕量新型ARs同系物（AR 21:3 oxo, AR23:3 oxo）首次在真实样品中得到了鉴定和定量，这是国内外首次对该新型ARs同系物的定量分析（图7 (a)、图7(b)）。
本发明结合液相和质谱检测结果，并将该模型纳入到高通量ARs的定量分析中，极大地提高了分析物的覆盖率和定量分析的准确性。
（3）方法验证
3.1计算基质效应
在UPLC-MS/MS分析中，不同基质中共提取的其他化学物质可能会影响目标物的电离，导致其信号强度出现抑制或增强（基质效应），从而导致分析精度不足。目前在液相色谱-质谱痕量分析领域最有效的办法是采用同位素标记的目标物对质谱的响应进行矫正。然而对于植物化学物而言，往往无法获得同位素标记的目标化合物。因此，如果能有效降低方法的基质效应，该方法的检测精度和适用范围将显著提高。
本发明评估了该方法的基质效应，取不同的空白基质样品（米粉、玉米粉和燕麦粉）按步骤2.1的方法进行预处理和提取，分别用不同基质的提取液和纯乙腈溶液配置（6个）不同浓度的基质标准溶液。分别将每个浓度的溶剂（纯乙腈）标液和基质标液（不同基质提取液）采用步骤2.2的方法UPLC-MS/MS进样，以浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，分别建立溶剂标准曲线和基质标准曲线。比较两条标准曲线的斜率，评估基质效应。所述基质效应的计算按照公式（III）：
基质效应（%）=（基质标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率-1）×100% （III）
如果基质效应大于0，则代表基质增强；如基质效应小于0，则代表基质抑制；基质效应处于-20%~20%，则可认为基质效应可以忽略。
本发明的一个实施例中，在测试3种不同的空白食物米粉、燕麦粉、玉米粉基质中，5种ARs标准品（AR17:0、AR19:0、AR23:0、AR21:0、AR25:0）的基质效应为-20.0%~15.2%，表明该方法基质效应很低，可忽略不计（如图8所示）。
通过基质效应的计算结果，也证明了本发明采用乙腈溶剂配制的标准曲线对实际样品进行定量分析，在提高了分析效率的同时减少了因合成和购置同位素标品所耗费的高昂经济成本。
3.2计算方法灵敏度，准确度和精密度
首先，对于有标准品的ARs同系物（AR 17:0，AR 19:0，AR21:0，AR 23:0, AR 25:0）检测，计算检出限、定量限回收率和精密度。
采用在空白基质中添加5种饱和直链ARs标准品（AR 17:0， AR 19:0，AR 21:0，AR23:0, AR 25:0）来测定方法的检出限（Limit of detection, LOD）、定量限（Limit ofquantification, LOQ）。
本发明的一个实施例中，采用空白基质玉米粉和米粉，向空白样品中添加不同浓度的5种标准品溶液，按照步骤2.1的方法提取样品溶液，以及步骤2.2进行UPLC-MS/MS检测，比较与空白样品的测量信号，将信噪比（signal/noise, S/N）=3和S/N=10时的标准品溶液浓度分别定义为方法LOD和LOQ。实验结果显示，各目标物LOD和LOQ接近，分别为0.5 ng/g和1.5 ng/g（如表3），显著高于现有技术报道方法（μg/g水平）。
采用不同添加浓度的标准品溶液，设置多组平行试验，测定回收率和相对标准偏差RSD。
本发明的一个实施例中，设立低(10ng/g)、中(200ng/g)、高(2000ng/g)3个添加浓度，每个添加浓度设立6组平行，测定其回收率，计算相对标准偏差（Relative standarddeviation, RSD），用于评价方法的准确度和精密度。
本发明的一个实施例中，在不同样品（玉米粉和米粉）中ARs的回收率均在82.6-117.1%之间， RSD均低于14.4%，表明本发明的检测方法回收率和精密度良好。
进一步地，通过在空白基质中添加ARs定性分析基准物（小麦麸皮）提取液的策略来评估其它无标准品ARs同系物的回收率和精密度。
具体来说，采用空白基质玉米粉和米粉，向空白样品中添加不同浓度的小麦麸皮ARs的提取液，按照步骤2.1的方法进行预处理和样品提取，以及步骤2.2进行UPLC-MS/MS检测，采用不同添加浓度的全谷物小麦麸皮ARs的提取液，设置多组平行试验，测定回收率和相对标准偏差RSD。
本发明的一个实施例中，还表征了部分无标准品ARs同系物在不同基质中的准确度和精密度，结果表明不同样品中ARs的回收率均在78.7–121.3%之间，RSD均低于19.5%，表明回收率和精密度良好。
鉴于ARs同系物相似的方法学验证参数，在后续定量分析过程中，将用饱和直链ARs标准品对相同碳链长度的单不饱和、多不饱和、氧化态的ARs进行定量分析。
本发明的有益效果：
1.本发明采用有机溶剂提取小麦麸皮，样品富集浓缩后利用UPLC-QTOF-MS对ARs进行鉴定，分析了这些同系物在质谱中的碎裂模式和碎裂特征，在此基础上利用液相色谱-串联四级杆质谱多反应监测模式（UPLC-MS/MS）建立了全谷物及谷物食品中烷基间苯二酚的靶向高通量检测方法，可以在12.5分钟内实现56种ARs同系物的定量分析。
2.本发明采用乙腈提取溶剂，能够有效地从不同的食品基质中提取不同理化性质的多种ARs同系物，同时尽量减少提取液中基质干扰。
3.本发明通过多元线性回归构建了包括烷基链长度、烷基链不饱和度和保留时间的三维模型，可以准确预测具有不同饱和度和烷基链长的未知ARs同系物的保留时间，极大地提高了分析物的覆盖率和定量分析的准确性。
4.本发明可以采用饱和直链ARs标准品对相同碳链长度的单不饱和、多不饱和、氧化态的ARs进行定量分析，高通量检测方法基质效应很低，可忽略不计；ARs的回收率和精密度良好，尤其适用于ARs的痕量分析。
5.采用本发明的检测方法，首次对不饱和ARs和氧化态ARs的定量分析，对全谷物的营养机制研究、新型全谷物食品创制以及全谷物膳食评估有重要的应用价值。
附图说明
图1是ARs同系物化学式；
图2是不饱和度为0和1的ARs同系物典型裂解方式及主要特征碎片，其中 (a)为AR19:0典型裂解方式及主要特征碎片；(b) 为AR 19:1典型裂解方式及主要特征碎片；
图3是不饱和度为2和3的ARs同系物典型裂解方式及主要特征碎片，其中(a) 为AR19:2典型裂解方式及主要特征碎片；和(b)为AR19:3 典型裂解方式及主要特征碎片；
图4是氧化态ARs oxo典型裂解方式及主要特征碎片，其中(a)为AR21:0 oxo典型裂解方式及主要特征碎片；和(b)为AR 21:1 oxo典型裂解方式及主要特征碎片；
图5是典型的高通量ARs同系物检测色谱图；
图6是烷基链长度、不饱和度与保留时间的模型，其中(a)为保留时间与烷基链上的碳数（碳数：17~25）的回归分析；(b)为根据保留时间和AR X:0的结构特征，通过多元线性回归拟合的三维模型；(c)为根据保留时间和AR X:0 oxo的结构特征，通过多元线性回归拟合的三维模型；
图7是预测模型的应用图，其中(a)为ARs同系物AR 21:3 oxo (预测RT:2.75 min，△RT=0.11 min)的检测; (b)为ARs同系物AR 23:3 oxo (预测RT:3.52min，△RT=0.06min)的检测；
图8是不同空白食品基质的基质效应；
图9是应用例2中12款面包中ARs指纹图谱及聚类分析。
具体实施方式
采用Waters ACQUITY超高效液相系统，质谱分析采用AB SCIEX公司TripleTOF5600高分辨飞行时间质谱。
实施例1
（1）ARs同系物高分辨质谱鉴定及特异指纹碎片库构建
1.1将1 g小麦麸皮样品用60 mL乙腈提取，提取液氮吹后定容浓缩，待进行定性鉴定。
1.2将步骤1.1的浓缩液通过液相色谱高分辨质谱（UPLC-QTOF-MS）定性分析。
采用Waters ACQUITY超高效液相系统，分析柱采用 Waters ACQUITY HSST3色谱柱 (2.1 mm×100 mm; 1.7 µm)。流动相A为含0.5%乙酸的甲醇，流动相B为含0.5%乙酸的水，流速为0.3 mL/min。流动相的设定：在30 min内将A相从5%增加到50%，然后在15 min内将提高到100%。进样体积5μL。
质谱分析采用AB SCIEX公司TripleTOF 5600高分辨飞行时间质谱，质谱通过TOF质谱采集进行全扫描分析，通过信息依赖采集（Information dependent analysis, IDA）进行产物离子扫描。TOF MS采集的条件设定如下：负离子模式，离子源气1（氮气，55psi），离子源气2（氮气，55psi），帘子气1（氮气，35psi），温度（550℃），离子喷雾电压（-4500V），DP电压（70V），碰撞能量（5V），质量范围（50-1000m/z）。对于IDA模式，碰撞能量（CE）被固定在35V，范围为±15V。IDA设置如下：排除4 Da以内的同位素，质量误差为10 ppm，最大候选离子数8。在IDA高级标签中，启用"动态背景扣除 "并采用CDS校准系统对质量数进行矫正。
1.3获得ARs同系物特异性指纹碎片信息
高分辨质谱定性分析结果显示：提取物中的所有饱和ARs、单不饱和ARs和双不饱和ARs都观察到特征碎片m/z81、m/z122和m/z[M-H-C2H2O]-，通过质谱解析，推测以上特征碎片对应于苯环的重排、芳香基β-断裂和C2H2O的丢失（图2(a)、 图2 (b)、图3 (a)和 图3(b)）。
对于含有3个不饱和度的ARs，特征碎片m/z135（源于γ-断裂）取代[M-H-C2H2O]-成为主要的碎片离子，即m/z81、m/z122和m/z135。因此，进一步地，通过高分辨质谱发现了ARs的氧化形式（AR oxo），其中m/z123代替m/z122成为特征碎片，即m/z81和m/z123，表明在β位（即烷基链上的C2位置）有酮基取代（图4(a)和图4(b)）。其余同系物的主要的断裂方式和特征碎片，精确质量数等如表1所示。
表1 全谷物中ARs同系物UPLC-QTOF-MS/MS ESI (-)鉴定结果及特征碎片
a标准品比对确证。
（2）UPLC-MS/MS高通量检测方法开发
2.1待检测目标物提取
称取密封保存的全谷物（全麦粉1）0.5g，用10 mL乙腈进行超声提取20分钟。超声提取后于20℃以9000g离心10分钟。收集上清液，并按照同样的程序再提取两次沉淀物，合并上清液，将汇集的上清液通过0.45μM的针孔过滤器过滤。
2.2优化液相和质谱检测条件并检测
采用Waters ACQUITY超高效液相系统，分析柱采用 ACQUITY UPLC BEH C8 (100mm × 2.1 mm, 1.7 μm)。
流动相A为含0.5%乙酸的甲醇，流动相B为含0.5%乙酸的水，流速为0.3 mL/min。流动相方案为：在8.5 min内将B相从80%增加到100%，维持2.0 min，最后平衡两分钟, 进样体积5uL。利用渐进式递增方式对CE参数进行优化（步长，1eV，范围为40~50eV）。
检测得到典型的高通量ARs同系物检测色谱图，如图5所示。
建立烷基链长度、不饱和度与保留时间的模型
使用有限的5种ARs标准品（AR 17:0，AR 19:0，AR 21:0，AR 23:0，AR 25:0，特征碎片如表1所示）来进一步探索ARs结构特征和其色谱行为之间的关系:保留时间（RT）与烷基链长度之间的相关性很好（R2>0.997）（图6(a)）。
通过多元线性回归构建了包括烷基链长度、烷基链不饱和度和保留时间的三维模型，并得到了一个良好的二元线性回归模型（图6 (b)、图6(c)）。
AR X1:X2 Y=0.389X1-0.540X2-2.558 (R2=0.996) (I)
AR X1:X2 oxo （氧化态） Y=0.387X1-0.567X2-3.681 (R2=0.996) (II)
Y-保留时间，X1-烷基链长度（即饱和烃碳数），X2-烷基链不饱和度(即双键数)。
利用该模型，我们可以准确预测具有不同饱和度和烷基链长度的未知ARs同系物的保留时间。
通过保留时间预测模型公式（II），测算出AR21:3 oxo保留时间为2.73min，AR23:3oxo保留时间为3.52min。采用本发明的同系物高通量检测方法，检测得到全谷物小麦样品中痕量AR21:3 oxo保留时间为2.86min，ΔRT=0.11min；AR23:3 oxo保留时间为3.58min，ΔRT=0.06min，误差较小。
由此可见，通过模型保留时间预测，两种痕量新型ARs同系物（AR 21:3 oxo, AR23:3 oxo）首次在真实样品中得到了鉴定和定量，这是国内外首次对该新型ARs同系物的定量分析（图7 (a),7(b)）。
本发明结合液相和质谱检测结果，并将该模型纳入到高通量ARs的定量分析中，极大地提高了分析物的覆盖率和定量分析的准确性。
通过步骤（1）-（2），ARs同系物（56种）的UPLC-MS/MS高通量检测质谱参数，如表2所示。
表2 56种ARs的UPLC-MS/MS高通量检测方法质谱参数
a质谱监测时间窗口设置为60s。
（3）方法验证
3.1计算基质效应
取3种不同的空白食物米粉、燕麦粉、玉米粉基质按步骤2.1的方法进行预处理和提取，分别用不同基质的提取液和纯乙腈溶液配置6个不同浓度（0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL）的基质标准溶液。分别将每个浓度的乙腈溶剂和基质提取液标液用UPLC-MS/MS（2.2步骤）进样，以浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，分别建立溶剂标准曲线和基质标准曲线。比较两条标准曲线的斜率，评估基质效应。基质效应的计算如下：
基质效应（%）=（基质标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率-1）×100%
如图8所示，3种不同的空白食物米粉、燕麦粉、玉米粉基质中，5种标准品ARs同系物（AR17:0、AR19:0、AR23:0、AR21:0、AR25:0）的基质效应为-20.0%~15.2%，表明该方法基质效应很低，可忽略不计。
因此本发明采用乙腈溶剂配制的标准曲线对实际样品进行定量分析，在提高了分析效率的同时减少了因合成和购置同位素标品所耗费的高昂经济成本。
3.2方法灵敏度，准确度和精密度
首先，对于标准品ARs同系物（AR 17:0， AR 19:0，AR21:0，AR 23:0, AR 25:0）检测，计算检出限、定量限、回收率和精密度。
采用在空白基质中添加5种标准品（AR 17:0， AR 19:0，AR 21:0，AR 23:0, AR25:0）来测定方法的检出限（Limit of detection, LOD）、定量限（Limitofquantification, LOQ）、不同添加浓度下的回收率和精密度等。
采用空白基质玉米粉和米粉，向空白样品中添加不同浓度的标准品（AR 17:0， AR19:0，AR 21:0，AR 23:0, AR 25:0），按照步骤2.1的方法提取，以及2.2步骤UPLC-MS/MS检测，比较与空白样品的测量信号，将信噪比（signal/noise, S/N）=3和S/N=10时的标准品溶液浓度分别定义为方法LOD和LOQ。实验结果显示，各目标物LOD和LOQ接近，分别为0.5 ng/g和1.5 ng/g，显著高于现有技术报道方法（μg/g水平）。
设立低(10ng/g)、中(200ng/g)、高(2000ng/g)3个标准品溶液浓度，每个浓度设立6组平行，测定其回收率，计算相对标准偏差（Relative standard deviation, RSD），用于评价方法的准确度和精密度。结果显示，在不同样品中ARs的回收率均在82.6–117.1%之间，RSD均低于14.4%，表明回收率和精密度良好（如表3）。
表3 5种ARs在食品基质中的灵敏度、准确度和精密度（n=6）
进一步地，低丰度（即无标准品的）ARs同系物检测，计算检出限、定量限、回收率和精密度。
通过在空白基质中（玉米粉和米粉）添加全谷物ARs的提取液按照步骤2.1的方法提取，以及步骤2.2进行UPLC-MS/MS检测，采用不同添加浓度的全谷物ARs的提取液，设置多组平行试验，评估代表性低丰度ARs的回收率和精密度。由表4可知，在不同样品中ARs的回收率均在78.7–121.3%之间， RSD均低于19.5%，表明回收率和精密度良好。鉴于ARs同系物相似的方法学验证参数，在后续定量分析过程中，将用饱和直链ARs标准品对相同碳链长度的单不饱和、多不饱和、氧化态的ARs进行定量分析。
表4 代表性低丰度ARs（无标准品）在不同基质中灵敏度、准确度和精密度（n=6）a
最终，采用本发明的高通量检测方法，得到全谷物样品（全麦粉1）ARs同系物定量分析结果如下表5所示。
应用例
1.全谷物及相关食品中ARs同系物准确定量分析
根据中国饮食特点，选取日常消费的具有代表性的3种小麦粉和3种全麦粉（包括实施例1的全麦粉1以及其他两种样品：全麦粉2和全麦粉3）利用上述实施例1所建立的高通量分析方法进行分析。
从表5的结果可以看出，小麦粉∑ARs浓度为1.2~7.2 μg/g，远低于为全麦粉中∑ARs含量水平（76.5~226.6 μg/g），证实ARs可以作为全谷物或全谷物食品有效的生物标志物。此外，研究结果显示全麦粉中不饱和ARs的占比为7.0%~9.5%，氧化态ARs的占比为13.5%~21.1%。这是国内首次对不饱和ARs和氧化态ARs的准确定量分析，以上成果对全谷物的营养机制研究、新型全谷物食品创制以及全谷物膳食评估有重要的应用价值。利用本发明的高通量检测方法可以在12.5分钟内实现56种ARs同系物的定量分析。
表5 小麦粉和全麦粉中56种ARs定量分析结果(ng/g)
aND: 未检出，<LOD (0.5 ng/g)；计算∑ARs时，ND赋值为1/2 LOD（0.3 ng/g）；
*全麦粉1为实施例1的待测样品。
2.在全谷物及相关谷物食品质量控制、溯源方面的应用
采集12款市售面包，获取商品的配料信息（表6），利用实施例1所述的检测方法对样品进行定量分析。分析结果显示，各个面包样品均呈现出特异的ARs指纹图谱，从聚类分析结果看（图9），该图谱可以有效区分配料表中含有全麦粉的面包样品（如B1、B2、B5、B6、B8、B11）。以上应用实例表明，该方法在全谷物及相关谷物食品质量控制、溯源方面有重要的应用价值。
表6 采样信息表
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种基于液相色谱-质谱的烷基间苯二酚同系物高通量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）ARs同系物高分辨质谱鉴定及特异指纹碎片库构建
1.1取ARs定性分析基准物质，有机溶剂提取后氮吹浓缩；
1.2将步骤1.1的浓缩液通过液相色谱高分辨质谱UPLC-QTOF-MS定性分析；
1.3获得ARs同系物特异性指纹碎片信息：所述特异性指纹碎片信息包括ARs同系物的主要的断裂方式和特征碎片，精确质量数；
（2）ARs同系物UPLC-MS/MS高通量检测方法开发
2.1提取待检测目标物：将待测样品预处理后，采用溶剂超声提取，离心分离，收集上清液并汇集，过滤；
2.2 优化液相和质谱检测条件并进行检测；
2.3建立不同烷基链长度、不同饱和度的保留时间预测模型：通过多元线性回归构建包括烷基链长度、烷基链不饱和度和保留时间的三维模型。
2.根据权利要求1所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤1.1中，所述ARs定性分析基准物质为小麦麸皮；所述有机溶剂为乙腈。
3.根据权利要求1所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤1.3的特征碎片是指，饱和ARs、单不饱和ARs和双不饱和ARs的特征碎片为m/z 81、m/z 122和m/z [M-H-C2H2O]-；氧化态ARs的特征碎片为m/z 81和m/z 123。
4.根据权利要求1所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤2.1中所述预处理包括：冷冻干燥，研磨、均质、过滤后低温密封保存；所述过滤为通过0.25-0.5毫米的滤网；所述提取溶剂选为乙腈，所述超声提取的时间为10-40分钟，共2-4个提取循环。
5.根据权利要求1所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤2.2中采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测，流动相A为含0.2-0.8v%乙酸的甲醇，流动相B为含0.2-0.8v%乙酸的水，使用BEH C8色谱柱来实现ARs同系物的分离。
6.根据权利要求1所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤2.3所述模型为二元线性回归模型：
AR X1:X2 Y=0.389X1-0.540X2-2.558 (I)
AR X1:X2 oxo Y=0.387X1-0.567X2-3.681 (II)
保留时间，X1-烷基链长度，即饱和烃碳，X2-烷基链不饱和度，即双键数。
7.根据权利要求1所述的高通量检测方法，其特征在于，还包括步骤（3）方法验证：
3.1计算基质效应；和3.2计算方法灵敏度，准确度和精密度；
其中，步骤3.1取不同的空白基质样品按步骤2.1的方法进行空白基质的提取，分别用不同基质的提取液和纯乙腈溶液配置不同浓度的基质标准溶液；
分别将每个浓度的溶剂标液和基质标液采用2.2的UPLC-MS/MS检测方法进样，以浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，分别建立溶剂标准曲线和基质标准曲线，比较两条标准曲线的斜率，评估基质效应；所述基质效应的计算按照公式（III）：
基质效应（%）=（基质标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率-1）×100% （III）。
8.根据权利要求7所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤3.2采用在空白基质中添加5种饱和直链ARs标准品AR 17:0，AR 19:0，AR 21:0，AR 23:0, AR 25:0来测定方法的检出限、定量限、不同标准品浓度下的回收率和精密度。
9.根据权利要求7所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤3.2还包括采用在空白基质中添加ARs定性分析基准物小麦麸皮提取液来测定低丰度ARs同系物的回收率和精密度。
10.根据权利要求1所述的高通量检测方法，其特征在于，所述检测方法用5种饱和直链ARs标准品AR 17:0，AR 19:0，AR 21:0，AR 23:0, AR 25:0 对相同碳链长度的单不饱和、多不饱和、氧化态的ARs同系物进行定量分析。
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